DD278362A1 - Verfahren zur gewinnung von 2-oxogluconsaeure mittels bakterien - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft die Gewinnung von 2-Oxogluconsäure mittels Bakterien und gehört in das Gebiet der mikrobiellen Produktsynthesen. Sie kann bei Prozessen angewendet werden, bei denen Kohlenstoffquellen in gelöster Form mit Hilfe von Bakterien umgesetzt werden.{2-Oxogluconsäure, Bakterien, Kultivierung, Fermentationsmedium, Glucoseoxidation, methylotroph, Mikroorganismus, Gluconsäureherstellung, Immoblisierung, Produktsynthese}
Description
Anwendungsgebiet der Erfindung
Die Erfindung gehört in das Gebiet der mikrowellen Produktsynthesen. Sie kann bei Prozessen angewendet werden, bei denen Kohlenstoffquellen in gelöster Form mit Hilfe von Bakterien umgesetzt werden.
Die mikrobiologische Bildung von 2-Oxogluconsäure ist bereits seit langem bekannt und ausführlich beschrieben worden. Es sind dazu eine Reihe von Mikroorganismen in der Lage, wie z. B. Acetobacter sp., Gluconbacter spec, Pseudomonas spec. u. a.
(Ind. Eng. Chem. 1626-31,32 [12], Appl. Microbiol. Bioiechnol. 20,400-405).
Bekannt ist neben der direkten Herstellung aus Glucose (J. Agr. Chem. Soc. Japan 24,58-59 [19501; JP 62-166893) auch ein Verfahren, bei dem durch kombinierte mikrobiologische und chemische Schritte mit dem Stamm Acetobacter cerinus aus Glucose 2,5-Dioxoglucopsäure gebildet wird, die durch eine selektive Reduktion in einem zweiten Schritt zu 2-Oxo-D-Gluconsäure überführt wird (DD-PS 140459).
Die Oxidation von Glucose führt im Metabolismus aller untersuchten Mikroorganismen über die Gluconsäure zum Oxogluconat.
Dementsprechend ist auch die Verwendung von Gluconaten als Ausgangsstoff für die 2-Oxogluconsäure möglich und in der Literatur beschrieben. So wandelt der Stamm Cyanonoccus chromospirans Gluconsäure zu 2-Oxogluconat um (GB-PS 659947).
Ebenso wird Ca-Gluconat durch Acetobactor suboxidans zu 2-Oxogluconat gewandelt (Biochem. Z., 303,1940,308).
Die Nachteile aller bekannten Verfahren zur 2-Oxogluconsäureherstellung sind darin zu sehen, daß die eingesetzten Mikroorganismen der bekannten Gattungen Pseudomonas, Gluconobacter, Acetobacter, Serratia u.a. ausnahmslos einen sehr hohen Bedarf an Supplinen haben und sehr langsam wachsen. Im allgemeinen werden komplexe Medien mit einem Gehalt an Hefeautolysat, Pepton oder anderen komplexen organischen Nährmedien von 10—20g/l angegeben. Damit wird die Ökonomie der Verfahren entscheidend im negativen Sinne beeinflußt.
Weiterhin wird durch diese Zusätze die Infektionsgefahr im Fermentationsprozeß wesentlich vergrößert.
Nachteilig ist auch die Tatsache, daß Glucosekonzentrationen über 100g/l die Geschwindigkeit der Produktbildung und die Ausbeute stark vermindern. Durch Feeding-Techniken kann dieser Mangel zwar gemindert werden, doch erfordert die Einhaltung der entsprechenden Verfahrensbedingungen einen erhöhten Aufwand an Meß- und Regeltechnik.
Ziel der Erfindung ist deshalb ein einfaches und ökonomisches Verfahren zur 2-Oxoglucons,iureherstellung, das nur einen geringen Aufwand an Meß- und Regelungstechnik erfordert.
Aufgabe der Erfindung ist ein Verfahren zur 2-Oxogluconsäureherstellung, bei dem die kultivierten Mikroorganismen keine zusätzlichen Suppline oder Hilfsstoffe benötigen und eine hohe Substratkonzentration im Nährmedium tolerieren. Erfindungsgemäß wurde die Aufgabe so gelöst, daß Bakterien, die zur 2-Oxogluconsäure befähigt sind, auf Fermentationsmedien, die der Glucoseoxidation mittels methylotropher Mikroorganismen entstammen, kultiviert werden. Besonders vorteilhaft ist es, Fermentaiionsmedien, die der Gluconsäureherstellung mittels Acetobacter methanolicus IMET B346 entstammen, einzusetzen, da durch die Verwendung von Methanol als Wachstumssubstrat der Prozeß unsteril geführt werden kann. Es werden hohe Umwandlungsgeschwindigkeiten bei sehr hohen Ausbeuten und Endkonzentrationen an 2-Oxogluconsäure erreicht.
Die Fermentationsmedien können Abläufe, Permeate oder Mutterlaugen der Gluconsäureherstellung sein, die Gluconsäure und/oder Gluconate in hohen Konzentrationen enthalten.
Die auf den genannten Fermentationsmedien kultivierten Bakterien sind Stämme der Gattungen Serratia, insbesondere Serratia marcescens IMET 11312, Gluconobacter, Pseudomonas u.a..
Weiterhin können die Mikroorganismenzellen fixiert oder in eine Matrix eingeschlossen werden. Auf diese Weise ist eine kontinuierliche Prozeßführung mit einer langen Nutzungsdauer der aktiven Zellen möglich.
Durch Einbettung der Mikroorganismen in bekannte Trägermaterialien wird der Umwandlungsschritt Glur.onat zu 2-Oxogluconat in einem durch einen Luftstrom bewegten Wirbelbettreaktor realisiert.
Der genannte Stamm Serratia marcescens IMET 11312 wurde in der Hinterlegungsstelle der ZIMET-Kulturensammlung im Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie der Akademie der Wissenschaften der DDR hinterlegt und unter der Nummer IMET 11312 registriert.
Der Stamm ist durch folgende Merkmale charakterisiert:
- gramnegative bewegliche Stäbchen, 0,5 χ 0,8 χ 1,0 - 2,0Mm
- nach 24 Stunden Wachstum bei 3O0C auf Pepton-Glucose-FE-HE-Agar runde, glattrandige, glänzende, konvexe Kolonien schmieriger Konsistenz, Durchmesser etwa 1 mm
nach 48 Stunden Bebrütung Durchmesser 2-3mm mit erhabenem Koloniezentrum
- Kolonien bei Wachstum bei 30°C mit rotem Farbstoff, keine Farbstoffbildung bei 37°C
- anaerobes Wachstum in Nährbouillon I mit mit 0,1 % KNO3 und auf der Fortner-Platte
- Oxidase -
- Katalase stark +
- Methylrot-Reaktion +
- Voges-Prosbauer-Reaktion +
- Ornithindecarboxylase +
- Lysindecarboxylase +
- Arginindihydrolase -
- Urease (nach Christensen, Preuß) -
- Indol -
- Citratverwertung (nach Simmons) +
- H2S aus Cystein ( + )
- Phenylalanindesaminase -
- Wachstum in KCN-Medium + Säurebildung aerob und anaerob (ohne Gasl) aus:
- D-Glucose +
- L-Arabinose
- L-Rhamnose -
- Saccharose +
- Lactose -
- Maltose +
- Cellobiose +
- D-Mannit +
- Inosit +
- D-Sorbit - (Abweichungl).
Zusammenfassend können die Vorteile der Erfindung wie folgt dargestellt werden:
- Es ist möglich, aus Fermentationsmedien, die dem Prozeß der Glucoseoxidation zu Gluconsäure mittels methylotropher Mikroorganismen entstammen, mit Hilfe von Mikroorganismen ohne jeden Supplinzusatz 2-Oxogluconsäure in hohen Ausbeuten und Geschwindigkeiten zu bilden.
- Da kein meßbarer Sauerstoffbedarf besteht, können aufwendige Belüftungseinrichtungen entfallen.
- Es können Gluconatlösungen bis zu etwa 200g/l Gluconat ohne Veränderungen der Umwandlungsgeschwindigkeit und Ausbeute umgesetzt werden, so daß die Endkonzentration an 2-Oxogluconsäure in einem einfachen satzweisen Fermentationsverfahren im Vergleich zu reiner Glucose um das Doppelte gesteigert werden kann.
- Von besonderem Vorteil ist die Verwendung eingebetteter oder anderweitig immobilisierter Zellen der 2-Oxogluconsäurebildner, die eine kontinuierliche Prozeßführung über einen langen Zeitraum erlaubt.
Anhand von Ausführungsbeispielen soll die Erfindung näher erläutert werden.
Der Stamm Gluconobacter oxidans CCM 1804 wurde nach der Abimpfung vom Schrägagarröhrchen in einem Medium der folgenden Zusammensetzung kultiviert: 10g/l Hefeextrakt (Bramsch), 20g/l CaCO3,100g/l Glucose pH-Wert 6,0.
Zur Kultivierung wurden 100-ml-Schüttelkolbon mit einem Arbeitsvolumun von 20ml benutzt. Die Kultur wurde bis zum Verbrauch der Glucose bei 30°C geschüttelt (Rotationsschüttler 160U/min).
Ausgehend von dieser Vorkultur wurde im Verhältnis 1:10 eine weitere Passage in 500-ml-Schüttelkolben (Erlenmcyerkolben, Weithais) mit dem gleichen Medium wie beschrieben angeimpft. Bei ausschließlicher Schüttelkolbenkulliviorung erfolgte eine Nachdosierung von Glucose bis zu einer Konzentration von 50g/l im Medium. Der pH-Wert wurde durch Zugabe von CaCO3 reguliert, wobei nach 8 Stunden 0,5g pro Kolben, nach 24 Stunden weitere 1 g pro Kolben nachdosiert wurden.
Fermentorkultivierungen erfolgten in Laborfermentoren mit pH-Wert-Re^lation, Temperierung und Belüftung. Die pH-Wert Regulation wurde mit 40%iger NaOH vorgenommen. Die Animpfung erfolgte ebenfalls im Verhältnis 1:10 von Schüttelkolben.
Die Temperatur betrug 30°C, die Belüftung 1-i,-! VVM, die Rührgeschwindigkeit 1000-1500U/min, die Gelöstsauerstoffkonzentration 40-100% der Luftsättigung. Nach 30 Stunden Fermentationszeit hatten sich 85g 2-Oxogluconsäure gebildet. Daraus errechnet sich eine produktbezogene Ausbeute von 85% und eine Produktivität von 2,8g/l-h.
Bei einer Kultivierung entsprechend dem Beispiel 1 wurden 180g/l Glucose vorgegeben. Nach einer Gesamtfermentationszeit von 70 Stunden hatten sich 120g/l 2-Oxogluconsäure gebildet. Es errechnet sich daraus eine Ausbeute von 66,6% bei einer Produktivität von 1,7 g/l-h.
Die Kultivierung des Stammes Gluconobacter oxidans CCM 1804 wurde nach der im Beispiel 1 beschriebenen Weise vorgenommen. 100ml der Bakteriensuspension wurden in 11 einer sterilisierten Nagluconat-Lösung (Handelsprodukt 99,5% Reinheit) mit einem Gehalt von 98g/l Gluconat gegeben. In einem Fermentor wurde diese Lösung bei einer Belüftung von 0,1 l/min für 200 Stunden gerührt. Nach dieser Zeit hatten sich 12g/l 2-Oxogluconsäure gebildet. Daraus errechnet sich eine Ausbeute von 12,2% und eine Produktivität von 0,06g/l'h.
Die Kultivierung des Stammes Gluconobacter oxidans CCM 1804 wurde nach der im Beispiel 1 Geschriebenen Weise durchgeführt.
Mit dieser Fermentationslösung (100ml) wurde 11 eines sterilisierten Ablaufes der Gluconsäurefermentation mit dem Stamm Acetobacter methanolicus IMET B 346 versetzt und in einem Rührgefäß mit einer Luftmenge von 0,1 l/min belüftet. Der Gehalt an Gluconat zum Beginn der Umsetzung betrug 180g/l, der an abgetöteter Biomasse 1,8g/l.
Nach einer Reaktionszeit von 40 Stunden ist die Gluconsäure vollständig zum 2-Oxogluconat umgewandelt worden. Es wurde eine Konzentration von 171 g/l 2-Oxogluconsäure bestimmt, daraus errechnet sich eine Ausbeute von 95%, bezogon auf das eingesetzte Gluconat, und eine Produktivität von 4,2g/l-h.
Nach der im Beispiel 1 beschriebenen Anzucht wurde der Stamm Serratia marcescens IMET 11312 gezüchtet.
Nach dem im Beispiel 4 dargestellten Verfahren wurden 100ml dieser Bakteriensuspension in einen sterilisierten Fermentationsablauf der Gluconatherstellung mit Acetobacter methanolicus IMET B346 (Gehalt 192g/l Gluconsäure) gegeben und gerührt. Nach 36 Stunden war die Gluconsäure umgesetzt. Es hatten sich 185g/l 2-Oxogluconat gebildet. Daraus errechnet sich eine Ausbeute von 96% und eine Produktivität von 5,1 g/l-h. Eine Kultivierung des Stammes nach den Bedingungen des Beispieles 3 erbrachte nur eine Umsetzung des eingesetzten Gluconats von 14%.
Nach der im Beispiel 1 beschriebenen Methode der Anzucht wurde ein Stamm Pseudomonas putida gezüchtet und nach den im Beispiel 4 genannten Bedingungen zum sterilisierten Ablauf eine/ Gloconatfermentation mit Acetobacter methanolicus gegeben. Auch hier erfolgte eine Umsetzung zu Oxogluconaten, wobei jedoch nach 60 Stunden Reaktionszeit eine Mischung von Oxogluconaten entstanden war (120g/l). Eine unter gleichen Bedingungen vorgenommene Umsetzung einer Gluconatlösung aus einem käuflichen Produkt entsprechend den Bedingungen dss Beispiels 3 erbrachte einen um 12% erniedrigten Gluconatgehalt.
Nach den im Beispiel 1 genannten Methoden wurde der Stamm Gluconobacter oxidans CCM 2371 gezüchtet und entsprechend dem Beispiel 4 mit einer Gluconatlösung aus dem Fermentationsprozeß der Gluconsäu -eherstellung umgesetzt. Nach 47 Stunden hatte sich aus 173g/l Gluconat 59g/l 2-Oxogluconsäure gebildet. Daraus errechnet sich eine Ausbeute von 92% und eine Produktivität von 3,38g/l-h für Jie Bildung von 2-Oxogluconat. Die Kontrollreaktion mit einer Gluconatlösung aus einem käuflichen Produkt ergab nach 180 Stunden eine Umsetzung von 13%.
Nach den in Beispiel 1 beschriebenen Methoden wurde eine Kultur des Stammes Serratia marcescens IMET 11312 gezüchtet. Nach den Methoden des Beispiels 4 wurde eine sterilisierte Lösung eines gluconathaltigen zellfreien Permeates, das auf einen Gluconatgehalt von 150g/l verdünnt worden war, umgesetzt. Nach 30 Stunden Reaktionszeit wurde kontinuierlich mit der Zugabe des Permeates begonnen, das 480g/l Gluconat enthielt, die Zudosierungsgeschwindigkeit betrug 10 ml/h. Nach 70 Stunden hatten sich in der Fermentationslösung 210g/l 2-Oxogluconat gebildet.
Nach den in Beispiel 1 aufgeführten Bedingungen wurde zuerst in Schüttelkolben, danach in einem 1-l-Fermentor eine Kultur von Serratia marcescens IMET 11312 gezüchtet. Die Fermentationslösung wurde zentrifugiert und die gewonnene Biomasse zur Einbettung in eine Matrix verwendet. Als Beispiel für eine Anwendung fixierter Mikroorganismen wurde die Einbettung in Polygalskiuronat gewählt. Es wurden 3g Galakturonsäure in 60 ml Wasser gelöst. Nach dem über Nacht erfolgten Quellen wurde in 2NNaOH ein pH-Wert von 7 eingestellt. Die einzubettende Biomasse wurde in 20ml aufgenommen und mit der Galakturonatlösung auf 100ml aufgefüllt. Über eine Kapillare wurde unter Druck (N2 = 0,05MPa) die Lösung in 400ml CaCI2-Lösung eingepreßt. Von den entstandenen Perlen wurden je 25g in Schüttelkolben (500ml) gegeben und 100ml einer Gluconatlösung aus dem Acetobacter methanolicus-Prozeß mit einem Gehalt von 30g/' Gluconsäure hinzugegeben. Bei 30°C wurde der Kolben bei einer Frequenz von 60 pro Minute geschüttelt. Nach 64 Stunden hatten sich 37cj/l 2-Oxogluconsäure gebildet.
Die Anzucht von Zellen des Stammes S. marcescens IMET 11312 erfolgte analog den im Beispiel 8 aufgeführten Bedingungen, ebenso erfolgte die Einbettung der Zellen in Galakturonat wie dort beschrieben. Die Perlen mit den eingebetteten Zellen wurden in einen Wirbelbettreaktor von 200ml Arbeitsvolumen mit einer Vorrichtung zum Betreiben in kontinuierlicher Prozeßführung gegeben. Die Perlen wurden durch einen Luftstrom von 30l/Stunde bewegt. Die Zudosierung der Gluconatlösung aus dem Acetobacter methanolicus-Prozeß erfolgte so, daß sich eine Durchflußrate von D = 0,024l/h ergab. Nach 4 Tagen war ein Maximum von 50g/l 2-Oxogluconsäure erreicht worden. Der Prozeß wurde bereits 10 Tage aufrecht erhalten, dabei betrug die im Auslauf bestimmte 2-Oxogluconsäuremenge zwischen 4O-5Og/l.
Claims (5)
1. Verfahren zur Gewinnung von 2-Oxogiuconsäure mittels Bakterien, gekennzeichnet dadurch, daß die zur 2-Oxogluconsäureproduktion fähigen Bakterien auf Fermentationsmedien, die der Glucoseoxidation mittels methylotropher Mikroorganismen entstammen, kultiviert werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß Fermentationsmedien, die der Gluconsäureherstellung mittels Acetobacter methanolicus IMET B346 entstammen, verwendet werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß Bakterien der Gattungen Serratia, Gluconobacter, Pseudomonas u.a. eingesetzt werden.
4. Verfahren nach Punkt 1 bis 3, gekennzeichnet dadurch, daß der Stamm Serratia marcescens IMET 11312 kultiviert wird.
5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, gekennzeichnet dadurch, daß die Mikroorganismenzellen fixiert oder in eine Matrix eingeschlossen werden.
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| DD32356788A DD278362B5 (de) | 1988-12-21 | 1988-12-21 | Verfahren zur Gewinnung von 2-Oxogluconsaeure mittels Bakterien |
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