DD279548A1 - Verfahren zur quantitativen bestimmung von human-interferon-alpha-1 - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Human-Interferon-alpha-1. Das Ziel der Erfindung ist die Entwicklung eines Testsystems, das die quantitative Bestimmung von natuerlichem und rekombinantem Human-Interferon-alpha-1 mit Hilfe eines immunchemischen Verfahrens rationell und sicher moeglich macht. Das erfindungsgemaesse Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass ein erster Antikoerper gegen Human-Interferon-alpha an eine feste Phase adsorbiert wird, man die zu bestimmende interferonhaltige Loesung zugibt und nach einer gewissen Inkubationszeit einen zweiten, mit einem Enzym markierten Antikoerper hinzufuegt und schliesslich die am Immunkomplex gebundene Enzymaktivitaet misst. Anwendungsgebiet der Erfindung sind die Biotechnologie und Medizin.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Durchführung von quantitativen Bestimmungen von Human-lnterferon-alpha-1, das bei der biotechnologischen Interferonherstellung, für die medizinische Diagnostik und die biomedizinische Grundlagenforschung eingesetzt werden kann.
Interferone (ΙΓΝ) sind körpereigene Stoffe, die im Rahmen der Abwehrreaktion des Organismus gegen virale Infektionen gebildet werden und eine Infektionsausbreitung verhindtr >. Die IFNe haben großes medizinisches und biologisches Interesse auf sich gezogen, weil sie neben ihrer antiviralen Wirksamkeit auch proliferationshemmend wirken sowie eine immunodulatorische Aktivität aufweisen. Die Heterogeniiät dieser Stoff klasse macht die Verfügbarkeit molekularspezifischer Bestimmungsmethoden notwendig.
Bisher erfolgt auch in internationalem Maßstab der quantitative Nachweis von Interferonen über die Bestimmung ihrer antiviralen Aktivität. Gemessen wird hierbei die Hemmung einer Infektionsausbreitung in einer in vitro-Zellkultur, d. h. die Unterdrückung des durch das infizierende Virus hervorgerufenen cytopathischen Effektes (CPE). Die Resultate werden in internationalen Einheiten (IU) angegeben. Eine Einheit ist definiert als der reziproke Wert jener IFN-Verdünnung, die entweder die Virusplaque-Bildung zu 50% hemmt oder 50% des Zellrasens schützt. Eine TU entspricht 1-5pg Human-Interferon-alpha. Diese Methode der Konzentrationsbestimmung von IFN ist sehr zeitaufwendig, arbeitsintensiv und erfordert eine kostspielige, störanfällige Zellkultur. Da dieser Test auf einem Titrationsverfahren beruht, bei dem eine mehr oder weniger subjektive Titererfassung die Grundlage für die Konzentrationsangabe in einer untersuchten IFN-Lösung darstellt, ergeben sich große Fehlermöglichkeiten, die bi.5 zu 100% betragen können. Seit der Verfügbarkeit von monoklonalen Antikörpern (mAK) gegen Human-Interferon-alpha (z. B. Secher, D. S. and D. C. Burke, Nature 285,446-450/1980 + US-PS 4423147) wurden mehrere immunchemische Methoden beschrieben, um schneller, sricherer und genauer als mit dem biologischen Test IFN-Konzentrationen in Lösungen bestimmen zu können.
Dabei gelangten mehrere Testprinzipien zur Anwendung: (a) immunradiometrische Methoden „IRMA" (D. S. Secher, Nature 290, 501-502/1981/; Horovitz et al., in: Immuncenzymatic Techniques, ed. S. Avrameas, Elsevier, Amsterdam, 1983, p. 193; Staehelin, T. et al., Methods Enzymol. 79,589 [1981 j), (b) kompetetive Bindungstests als Radioimmunoassays (Meurs, E. et al., Infect. Immun. 37,919-926 [1982]; Trotta, P. et al., J. Biol. Resp. Modif. 2,348-359 [1983]; Bernier, J. et. al., J. Nucl. Medicine 25, 765-772 [1984I) und (c) Inzymimmunoassays (Gallati, H., J. Clin, Chem. Clin. Biochem. 20, 907-914 [1982]; Berthold, W. et al.. Arzneimittelforsch. 35,364-369 [19851).
Die beschriebenen Verfahren nutzen mAK bzw. polygonale Antikörper (aus Antiseren) gegen Hun ian-lnterferon-alpha in unterschiedlichen Kombinationen und Testverfahren, wobei Festphasensysteme und Verfahren in Lösung angewendet werden. Die erreichten Testparameter variieren hinsichtlich der Empfindlichkeit, der Zeitdauer, des Arbeitsaufwandes und des Detektionssystems (Radioaktivität, Enzymaktivität). Bei den beschriebenen Festphasensystemen werden meist Polystyrol-Kugeln in en'spr'jchenden Reagenzgläsern oder PVC- bzw. Polystyroltestplatten als feste Phase eingesetzt. Die Beschichtung der festen Phase mit Antikörpern erfolgt durch Benetzen der Oberfläche des Plastmaterials mit der Antikörper-haltigen Lösung für eine gewisse Zeit.
Die bisher veröffentlichen Verfahren betreffen entweder HulFN-alpha-2 oder Leukozyten-IFN (HulFN-aipha). Für HulFN-alpha-1 gibt es bisher keine publizierte immunchemische Bestimmungsnvjthode. Die Firma Cell Tech verkauft einen Testkit mit dem mAK „JOK", mit dem es möglich sein könnte, HulFN-alpha-1 zu bostimmen; ohne daß dies im Prospekt ausgewiesen wäre ( ). Dk% Testempfindlichkeit der einzelnen vorgeschlagenen Verfahren wird unterschiedlich angegeben und hängt in erheblichem Maße von den Testbedingungen ab. Mit extrem langen Testzeiten, die für Routinebestimmungen nicht akzeptabel sind, sollen für HulFN-alpha-2 noch 5IU/ml nachweisbar sein. Die Nachteile der bisher bekannten immunchemischen Verfahren zum quantitativen Nachweis von Human-Interferon-alpha sind in der Art und Weise der Beschichtung der Plastmaterialien, der z.T. sehr langen Reaktionszeiten, der langen Meßzeiten und der in einigen Fällen beschriebenen komplizierten Technik zur Trennung von freien und gebundenen Radioaktivitäten (bei den auf kompetitiver Bindung beruhenden Radioimmunoassays) begründet.
Die Erfindung hat das Ziel, Human-lnterferon-alpha-1 mit Hilfe eines immunenzymometrischen Testes unter Verwendung des Zwei-Seiten-Systems in rationeller Weise quantitativ, schnell und sicher bestimmen zu können, wobei wegen der Vermeidung des Einsatzes von Radioaktivität ein umweltfreundliches Verfahren zur Anwendung kommen soll.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Human-lnterfeion-alpha-1 mit Hilfe eines immunchemischen Verfahrens in Form eines immunenzymometrischen Assays ist dadurch gekennzeichnet, daß der erste Antikörper an die Oberfläche der Näpfe von Mikrotestplatten aus Polystyrol oder einem anderen Material wie z. B. PVC als Trägermaterial für den Festphasen-Immunoassay angetrocknet wird. Solche Antikörper-beschichteten Platten sind bei 40C in trockenem Zustand für mehrere Wochen haltbar. In die Reaktionsnäpfe der mit Antikörpern zuerst die zu messende IFN-haltige Lösung, dann der 2. Antikörper (monoklonaler Antikörper), der mit Meerrettich-Peroxydase nach bekanntem Verfahren markiert ist, eingefüllt und inkubiert. Ein bevorzugt eingesetzter mAK ist HM-IIG11 (ZIM-Liste 1986: 0087). Nach gründlichem Waschen der Reaktionsgefäße wird eine Substratlösung (Farbstoff) zugegebe und nach angemessener Reaktionszeit die Reaktion durch Zugabe einer Säure gestoppt. Die entstandene Färbung in den einzelnen Näpfen der Mikrotiterplatte wird schließlich durch photometrische Messung der Extinktion an einem entsprechend geeigneten Photometer quantifiziert.
AIIo Arbeiten lassen sich bei Zimmertemperatur durchführen. Der Test läuft als „one-tube-assay " und ist damit sehr einfach und handhabbar. Die Testanordnung gestattet die gleichzeitige Bestimmung von vielen Proben durch eine Person in weniger als 5 Stunden. Der Test ist sowohl für natürliches wie für rekombinantes Human-IFN-alpha-1 geeignet, darüber hinaus auch für die Bestimmung von Hybrid-IFN-Molekülen, die Epitope enthalten, mit denen mAK gegen Human-IFN-alpha-1 reagieren. Die Erfindung soll an einem Ausführungsbeispiel noch näher erläutert werden.
Als Reaktionsgefäße werden die Näpfe von 96er-Mikrotestplatten verwendet. In die einzelnen Näpfe werden je 200 μΙ des ersten Antikörpers (polyklonaleanti-Human-lnterferon-alpha-Antikörper vom Schaf; 25pg/ml Beschichtungspufferder Zusammensetzung 0,015M Na2CO3 - 0,035M NaHCO3 - 0,02% NaN3-pH9,6; 5000 Neutralisationseinheiten/ml) einpipettiert und über Nacht bei 370C angetrocknet. Anschließend werden die Näpfe der Mikrotestplatten je mit 200μΙ TBS (Tris-gepufferte Salzlösung: 0.05M Tris-0,2M NaCI, pH7,4 - 0,1 % Tween 20) oder mit 200μΙ einer proteinhaltigen Lösung in TBS gefüllt und zwecks Blockierung der noch freien proteinbindenden Stellen für 1 Stunde bei Zimmertemperatur inkubiert und dann wieder ausgegossen. Danach werden ΊΟΟμΙ einer IFN-Standard-Lösung bzw. der zu untersuchenden Probe verschiedenen Verdünnungsgrades eingefüllt und für 3 Stunden inkubiert (Schütteln in feuchter Kammer). Nach 3maligem Waschen mit Wasser werden 50μΙ des mit Peroxydase markierten mAK ZIM-IIG11 eingefüllt und für 1 Stunde bei Zimmertemperatur inkubiert (Schütteln in feuchter Kammer). Nach gründlichem Waschen (5x) mit H2O werden 240μΙ einer Substratlösung z. B.
o-Phenylendiamin 0,4pl/ml
H2O2 0,015%ig
Phosphat-Zitrat-Puffer 5,0
einpipettiert und für einige Minuten (z. B. 15 Minuten) inkubiert. Mit 60 μΙ 2,5 NH2SO4 pro Napf wird die Farbreaktion gestoppt. Die Farhintensität in den einzelnen Näpfen wird schließlich photometrisch bei 492 nm gemessen.
Au*, der Extinktion kann anhand der Standardkurve der IFN-alpha-1-Gehalt einer Lösung ermittelt werden.
Claims (2)
1. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Human-lnterferon-alpha-1 mit Hilfe eines immunchemischen Tests in Form eines immunenzymometrischen Assays, dadurch gekennzeichnet, daß der erste Antikörper ein polyklonaler Antikörper eines Vertebratenorganismus gegen HulFN-alpha oder ein monoklonaler Antikörper, der mit HulFN-alpha-1 reagiert, ist und der zweite Antikörper mit einem Enzym markier.1 ist und entweder polyklonaler oder monoklonaler Herkunft ist.
2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß der erste Antikörper entweder angetrocknet oder durch feuchte Beladung an die Wände des Reaktionsgefäßes absorbiert wird.
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