DD280787A5

DD280787A5 - Ein cdna-klon, welcher fuer ein s-locusspezifisches glycoprotein codiert

Info

Publication number: DD280787A5
Application number: DD86293412A
Authority: DD
Inventors: June B Nasrallah; Mikhail E Nasrallah; Michael L Goldberg
Original assignee: Cornell Research Foundation,Inc.,Us
Priority date: 1985-08-05
Filing date: 1986-08-04
Publication date: 1990-07-18
Also published as: PL158548B1; DK371086A; PL260930A1; DK371086D0; JPS62143688A; EP0212385A2; EP0212385A3; DD284691A5

Abstract

Es werden Verfahren zur Herstellung einer DNA-Basensequenz und ihre Verwendung beschrieben. Es wird auch ein Verfahren fuer die Herstellung eines rekombinanten DNA-Transfervektors beschrieben. Weiterhin werden beschrieben: ein Verfahren fuer die Herstellung eines Mikroorganismus, der durch irgendeinen der oben erwaehnten DNA-Transfervektoren transformiert ist; ein Verfahren fuer die Herstellung eines chimaeren Gens und ein Verfahren fuer die Verwendung dieses Gens unter Bildung von Fusionsproteinen; ein Verfahren fuer die Herstellung eines Fusionsproteins, ein Verfahren fuer die Herstellung eines Fusionsproteins, welches mit Antiserum zu S-locusspezifischem Glycoprotein aus selbstunvertraeglichen Pflanzen reagieren kann, und Verfahren fuer die Verwendung dieser Fusionsproteine als Antigene. Es wird weiterhin ein Verfahren fuer die Klonierung einer cDNA-Sequenz beschrieben. Die klonierte DNA und die Fusionsproteine sind industriell nuetzlich fuer die Hybridsamenproduktion und um die Selbstunvertraeglichkeit bei Pflanzen zu beseitigen.

Description

Hierzu 3 Seiten Zeichnungen

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft allgemein ein neues Verfahren zur Herstellung eines klonierten DNA-Fragments und Verfahren für die Verwendung des Fragments. Die Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zur Herstellung eines klonierten DNA-Fragments mit einer Basensequenz, die für ein S-Iocusspezifisches Glyroprotein von einer selbstunverträglichen Pflanze codiert, und Verfahren für die Verwendung der geklonten DNA. Die geklonte DNA ist idustriell für die Hybridsamenproduktion und zur Beseitigung der Selbstunverträglichkeit in Pflanzen nützlich. Die Monierte DNA ist ebenfalls industriell als Probe nützlich, um S-Gene in Züchtungsma'erialien bzw. Samenmaterial zu identifizieren und um stabile S-AIIeIe mit starken Promotern zu identifizieren.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

In über 3000 Spezies, die die diversen angispermen Familien repräsentieren, ist die Selbstbefruchtung durch einen Mechanismus, welcher ais „Selbstunverträglichkeit" (self-incompatibility) bezeichnet wifi, blockiert (East, E. M. Proc. Am. Phil. Soc. 62 449-518 [1940]). Nach der Selbstbestäubung ruft die Zwischenwirkung zwischen dom Stigma oder Griffe! und dem Pollen eine definierte morphologische Antwort hervor und verhindert das normale Pollenschlauchwachstum. Die Befruchtung wird verhindert, da diese Pollenschläuche nicht in der Lage sind, in die volle Länge des Stigma und Griffels zu penetrieren. Die spezifische Eigenschaft dieser Zwischenwirkung wird durch eine oder mehrere genetische loci bestimmt und erfordert die Identität von Allelen, die von den männlichen und weiblichen Elternteilen getragen werden.

Die Unverträglichkeitssysteme wurden in zwei Hauptgruppen eingeteilt. Die gametophytischen S/steme, in denen der Phenotyp eines Pollenkorns durch den haploiden Pollengenotyp bestimmt wird und die sporophytischen Systeme, in denen der Pollenphenotyp durch den Genotyp der diploiden Elternteilpflanze bestimmt wird. Bei der sporophytischen Art der Unverträglichkeit, für die ein Beispiel die crucifere Brassica ist, ist die Selbstunverträglichkeitsreaktion an der Stigmaoberfläche lokalisiert und tritt innerhalb von Minuten nach dem Anfangskontakt zwischen dem Pollen und den papillaren Zellen an der Außenoberfläche des Stigmas auf. In diesem Genus ist die Selbstunverträgiichkeit unter der Kontrolle eines einzigen genetischen Locus, des S-Locus, welcher stark polymorph ist, so daß 50 oder mehr AIIeIe in natürlichen Populationen identifiziert wurden (Thompson, K.F. et al., Heredity 21: 345-362 [1966]; Ockendon, DJ., Heredity 33: 159-171 [1974]). Vielleicht wird die experimentell am besten nachweisbare Route hinsichtlich der molekularen Analyse der genetischen Kontrolle der Unverträglichkeit durch den Nachweis von Antigenen nahegelegt, die für die verschiedenen S-Locus-Allele in Stigmahomogenaten von unterschiedlichen Brasslca-Stämmen spezifisch sind (Nasrallah, M. E. et al., Heredity 22,519-527 [1967]). Es wurde gezeigt, daß diese Antigene Glycoproteinen entsprechen, die in verschiedene elektrophoretische Systeme aufgespalten werden können (Nasrallah, M. E. et al.. Heredity, 25,23-27 [19701; Nasrallah, M. E. et al.. Genet. Rs. 20,151-160 [1972]; Nishio, T. et al., Heredity 38,391-396 [1977]; Nasrallah, M. E. et al., Experlentia 40,279-281 [1984]). Verschiedene Beweisreihen zeigen, daß diese Glycoproteine eine wichtige Rolle bei der Unverträglichkeit spielen können: (1) Die Mobilitäten dieser Moleküle variieren in Stigmaextrakten, die sich von Brasslca-Stämmen ableiten, mit unterschiedlichen S-Locus-Allelen. (2) Diese Moleküle wurden exklusiv in dem Stigma und spezifisch in den Oberflächen-Papillarzellen des Stigmas gefunden, die Stelle des ursprünglichen Kontaktes zwischen dem Pollen und dem Stigma. (3) Eine erhöhte Rate der Synthese dieser S-Iocusspezifischen Glycoproteine („SLSGs") in dem entwickelten Stigma steht gut in Übereinstimmung mit dem Beginn der Unverträglichkeitsreaktion in dem Stigma (Nasrallah, J.B. et al., Experlentia 40, 279-281 [1984]). (4) Die wichtigste Eigenschaft, die Erbeigenschaften der verschiedenen Formen von SLSG, stehen mit der Segregation der S-Allelen in den F₁- und F₂-Generationen in perfekter Korrelation, was anzeigt, daß das für diesen Polymorphismus verantwortliche Gen genetisch extrem eng an den S-Locus gebunden sein muß (Nasrallah, M. E. Genet. Rs. 20,151-160 (1972); Hinata, K. et al., Heredity 41, 93-100(1978]).

Die Isolierung eines cDNA-Klons, welcher an S-Iocusspezifisches Glycoprotein codiert, ist vnn großem Interesse, da ein solcher Klon die Identifizierung der Selbstunverträglichkeitsgene beim Züchten eines Stocks bzw. beim Züchten von Pflanzenmaterial, die Identifizierung stabiler S-Allelen mit starken Promotern, wie auch die Einführung von Selbstunverträglichkeitsgenen in die geeigneten Pflanzenstämme durch Transformation, erlauben würde. Zusätzlich können transformierte Stämme, welche S-AIIeIe tragen, mit Stämmen, die unterschiedliche S-AIIeIe tragen, intergepflanzt werden, so daß der Samen, der geerntet wird, vollständig hybrid ist. Es besteht ein Bedarf nach solchen Hybridarten, da höhere Ausbeuten bzw. Ernten erzeugt werden. Soiche Stämme sind ebenfalls besser für die Einführung von Resistenz gegen Krankheit geeignet, und sie besitzen eine bessere Anpassungsfähigkeit für extreme Umgebungswachstumsbedingungen. Beispielsweise besitzen bei ornamentalen Nutzpflanzen selbstverträgliche Arten eine längere Haltbarkeitsdauer und blühen während einer längeren Saison.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist es, die Hybridsamenproduktion zu erleichtern durch einen wirksamen Transfer von stabilen S-Allelen in aufzuziehendes bzw. zu züchtendes Material.

Erfindungsgemäß soll weiterhin die Selbstunverträglichkeit von Fruchtbäumen beseitigt werden, wodurch höhere Ernten und bessere Früchte erhalten werden. Dies gilt insbesondere für Bäi:me in Obstgärten, wo oft nur ein Fruchtbaum vorhanden ist.

Erfindungsgemäß soll das Auftreten von Selbstunverträglichkeits-Inzuchtlinien durch Handbefruchtung vermieden werden können.

Erfindungsgemäß soll die interspezifische Hybridisierung zwischen selbstverträglichen und selbstunverträglichen Spezies aktiviert werden, wodurch ein größerer Genpool für die Pflanzenverbesserjng erhalten wird.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Möglichkeit zur Verfügung zu stellen, mit der die Hybridsamenproduktion verbessert wird, die Unverträglichkeit in Pflanzen beseitigt wird, wodurch höhere Ernten erzeugt werden und die interspezifische Hybridisierung zwischen selbstunverträglichen und selbstverträglichen Spezies aktiviert wird.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer DNA-Basensequenz, das dadurch gekennzeichnet ist, daß eine im wesentlichen reinu DNA-Basensequenz, die für ein S-Iocusspezifisches Glycoprotein codiert, aus einer selbstunverträglichen Pflanze oder irgendein Fragment einer DNA-Basensequenz, das für die DNA-Basensequenz einzigartig ist, oder irgendein funktionelles Äquivalent der DNA-Basensequenz oder ein Fragment der DNA-Basonsequenz isoliert wird.

Die Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren für die Herstellung einer DNA-Basensequenz, d=i s dadurch gekennzeichnet ist, daß eine im wesentlichen reine DNA-Basensequenz, die einer cDNA-Sequenz entspricht, welche einer mRNA-Sequenz entspricht, welche für ein S-Iocusspozifisches Glycoprotein codiert, aus einer selbstunverträglichen Pflanze isoliert wird. Die Erfindung betrifft weiterhin Verfahren für die Verwendung dieser DNA-Basensequenzen.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren für die Herstellung eines rekombinanten DNA-Transfervektors, der eine DNA-Basensequenz enthält, welche für ein S-Iocusspezifisches Glycoprotein aus einer selbstunverträglichen Pflanze codiert oder welche eine cDNA-Basensequenz enthält, die der mRNA-Sequenz entspricht, und für ein S-Iocusspezifisches Glycoprotein aus selbstunverträglichen Pflanzen codiert. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines Mikroorganismus, der durch irgendwelche der oben erwähnten DNA-Transfervektoren transformiert ist, ein Verfahren für die Herstellung eines Chimären Gens, welches ein Gen oder ein Teil davon für ein S-Iocusspezifisches Glycoprotein und ein anderes Gen oder ein Teil davon enthält, und ein Verfahren für die Verwendung dieses Gens zur Herstellung von Fusionsproteinen. Die Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren für die Herstellung eines Fusionsproteins, welches ein S-Iocusspezifisches Glycoprotein oder ein Teil davon aus selbstunve^rträglichen Pflanzen und ein anderes Protein oder ein Teil davon enthält; ein Verfahren für die Herstellung eines Fusionsproteins, welches mit dem Antiserum für das S-Iocusspezifische Glycoprctein aus selbstunverträglichen Pflanzen reagieren kann, und Verfahren für die Verwendung dieser Fusionsproteine als Antigene.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Klonierung einer cDNA Sequenz, welche für mindestens einen Teil des S-Iocusspezifischen Glycoproteins codiert, aus der selbstunverträglichen Pflanzenfamilie Brasslca. Figur 1 ist eine Restriktionskarte bzw. -bank und zeigt die DNA-Sequenzstrategie von Brasslca cDNA-lnsert auf pBOS 5. Die Restriktionskarte wird durch gelelektrophoretische Analyse von einfachen und doppelten Enzymdigesten von pBOS5 konstruiert. Die dicke Linie zeigt den Codierungsberoich für das S-Iocusspozifische Glycoprotein, und die dünne Linie zeigt den 3'-Nichtcodierungsbereich der cDNA-Sequenz. Pfeile unterhalb der Karte zeigen die Richtung und das Ausmaß der Sequenzen, die in M 13-Vektoren subkloniert sind und von jeder Restriktionsstelle abgdosen werden.

Figur 2 ist ein Nucleotid und leitet sich von der Aminosäure-Sequenz des cDNA-lnserts von pBOS 5 ab. Die Restriktionsstellen, die in der Figur 1 aufgeführt sind, sind gezeigt. Der Kasten umrahmt die Polyadenylierungssignal-Sequenz 5'-AATAA-3'. In Figur 3 wird die Subklonierung von pBOS5 cDNA-lnsert in pWR590-Reihen der Expressionsvektoren beschrieben, wobei

(A) die Zeugung der pBOS 5 L- und S-Fragmente durch Bam H1 -XhoI-Digestion bedeutet. Die Pfeile zeigen die entstehende Richtung der Transkription in dem Chimärenplasmid;

(B) ist die Karte von ρWR5SO. Die Pfeile zeigen die Richtung der Transkription. Lacz' bebeutet ein verkürztes lacz-Gen, welches für etwa 590 Aminosäuren codiert. Die expandierte Region, die auf das lacz'-Gen folgt, enthält die Polylinker-Sequenz; und

(C) ist die Nucleotid-Sequenz der Expressionsvektoren an den Fusionsverbindungen und die erwarteten Translationsprodukte, „nucs" bedeutet Nucleotide, „aas" bedeutet Aminosäuren.

Verfahren zur Herstellung des Klons Die Strategie für die Isolation von SLSG-codierenden DNA-Sequenzen wurde aufgrund der Entdeckung vorausgesagt, daß in

einigen selbstunverträglichen Stämmen, wie Bras3lca-Stämmen, 1 bis 5% der Proteinsynthese in dem selbstunverträglichen

Keimstigma der Synthese dieses Makromoleküls gewidmet sind (Nasrallah, J. B. et al., Experientia 40,279-281 [1984]). Es

erscheint daher wahrscheinlich, daß ein hoher Anteil der Klone in der cDNA-Bank, die mit polyA+ RNA aus dem reifenunverträglichen Stigma konstruiert sind, SLSG-Sequenzen enthalten. Es wurde bereits in der Vergangenheit beobachtet, daß

SLSG-Moleküle in dem Stigma, jedoch nicht im Blatt oder im Samengewebe, auftreten (Nasrallah, J. B. et al., Experientia 40,

279-281 [1334]). Die Anmelderin hat daher die Hypothese aufgestellt, daß SLSG cDNA-Klone in der Fraktion der Klone in einerselchen Bank angereichert sein würden, welche stark die radioaktive cDNA, welche der reifen Stigma-mRNA entspricht,hybridisieren, jedoch nicht in markierter Blatt- oder samenspezifischer cDNA.

Eine erfindungsgemäße cDNA-Bünk kann gebaut werden bzw. aufgestellt werden, indem man cDNA aus polyA+ RNA von

unverträglichen Stigmas zu dem Zeitpunkt herstellt, wenn die Maximalsynthese von SLSG auftritt, indem man mit oligo(dT)_l2-isentsprechend dem zuvor beschriebenen Verfahren primiert bzw. eine Primerreoktion durchführt (Maniatis, T. et al.. Molecular

Cloning: A Laboratory Manual [1982]). Als Pflanzenquellen für die Erhaltung unverträglicher Stigmas können natürliche Populationen und Pflanzen, die aus Züchtungsprogrammen in Universitäten, Versuchsstationen und Samenherstellungsfirmen erhalten werden, verwendet

werden. Beispiele geeigneter Pflanzen von natürlichen Populationen umfassen Lycopertlcon peruvlanum und solanum.

Beispiele für geeignete Pflanzen aus Züchtungsprogrammen umfassen Gemüsenutzpflanzen, wie Kartoffeln, Tomaten, Kohlnutzpflanzen, Beetenutzpflanzen, Ornamentnutzpflanzen, wie Petunia, Nicotiana, Getreidnnutzpflanzen und Gräser, wie Roggen, Steinobst, wie Kirschen, Pflaumen und Äpfel, Futternutzpflanzen, wie Klee, Khaki bzw. Kohl und Senf, Ölsamen, wie Traubensamen, insbesondere Brassica napus. Besonders bevorzugt sind selbstunverträgliche Brassica oleracea-Pflanzen,

welch J für verschiedene S-AIIeIe, wie S₈, S₁₃ und S_u> und 47 anderer bis heute bekannter AIIeIe homozygot sind (Thompson, K. F.

otal., Heredity, 21: 345-362 [1966]; Ockendon, D. J., Heredity, 33,159-171 [1974]).

Damit eine Homozygotie von Brassica oleracea erhalten wird, können reife Pollen auf unreife und damit selbstverträgliche Stigmas der gleichen Pflanze angewendet werden. Beispiele von geeigneten S-Homozygoten umfassen alle stabilen S-Homozygoten unter den fünfzig bekannten. Bevorzugte Homozygoten sind die S₆- und S₁₄-Homozygoten von Brassica oleracea. PoIyA+ RNA kann nach per se bekannten Verfahl en, wie durch oligo(dT)-Chromatographie isoliert werden (Aviv, H. et al., Proc. Natl Acad. Sei. USA 69,1408 [1972]). Die aus polyA+ RNA aus unverträglichen Stigmas hergestellte cDNA wird mit S,-Nuclease behandelt und anschließend mit dem Klenow-Fragment von E. coil DNA-Polymersse zur Erzeugung von cDNA mit glatten Enden repariert (Maniatis, T. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual [1982]). Die cDNA mit glatten Enden kann an Restriktions-Endonucleaselinker ligicrt werden und

zur Vervollständigung mit der Rdstriktions-Endonuclease digeriert werden (Maniatis, T. et al.. Molecular Cloning: A1 aboratory

Manual [1982]). Fragmente von cDNA größer als 500 Basenpaaren („bp") können nach an sich bekannten Verfahren

einschließlich der Elektrophorese an Agarosegel isoliert und in die geeignete Restriktionsstelle eines Plasmids kloniert werden.

Die Plasmide werden dann zur Transformierung von Zellen nach an sich bekannten Verfahren, wie oem Verfahren von Hanahan, D., J. Mol. BIoI. 166,557-580 (1983) verwendet. Geeignete Restriktions-Endonucleaselinker umfassen irgendwelche Linker, welche Restriktionsstellen enthalten, die den

einzigartigen Restriktionsstellen in dem Plasmid entsprechen.

Beispiele umfassen Eco R,-Linker, Hin D-Linder und Bam H1-Linker, und besonders bevorzugte Restriktions-Endonucleaselinker

für Brassica oleracea sind Bam H 1-Linker.

Geeignete Plasmide umfassen irgendwelche Plasmide, welche die einzigen Restriktionsstellen für den Einsatz fremder DNA enthalten. Beispiele sind pBR322 und pKC7. Das Plasmid pBR322 ist bevorzugt.

Geeignete Mikroorganismen-Wirtszellen umfassen irgendwelche Zellen, welche die Vervielfältigung der Recombinantplasmide unterstützen. Beispiele sind E.coll HB101-, JM101- und SF3-Stamme. E. coil SF8 ist bevorzugt. Stigma- und Samen-cDNA-Proben können nach an sich bekannten Verfahren, wie nach der Random-Primer-Umkehrtranskription von polyA+ RNA (Taylor, J.M. et al., Blochim. Blophys., Act a 442,324 [1976]) erhalten werden. Stigma-Proben werden aus polyA+ RNA hergestellt, welche durch Reinigung von selbstunverträglichem Stigma erhalten wurden, und Samenproben werden aus polyA+ RNA hergestellt, welche durch Reinigung aus etiolierten Sämlingen erhalten wurden. Recombinant-Klone können nach irgendwelchen bekannten Verfahren gescreened werden einschließlich des Colony-Hybridisierungsvenahrens von Grunstein & Hogness (Grunstein, M. et al., Proc. Natl Acad. Sei. USA 72,3961 (1975]). Nachdem einmal die cDNA-Bank konstruiert worden ist, können unabhängige Klone randomartig aus der Bank herausgegriffen werden, und die DNA dieser Kolonien kann nach an sich bekannten Verfahren charakterisiert werden, wie durch Übertragung auf jedes von zwei Nitrocellulosefiltern und Hybridisierung mit den geeigneten Proben. Bei ßrassica können Kolonien, die mit von Stigma abgeleiteten cDNA-Proben stark hybridisieren, jedoch nicht mit Samen-cDNA-Proben reagieren, für die weitere Verwendung ausgewählt werden.

Ein solches Plasmid, welches Stigma abgeleitete DNA-Homologe zu der von Brassica oleracea enthält, ist pBOS5 mit der ATCC-Hinterlegungsnummer 40191.

Nachdem die Kolonien einmal ausgewählt wurden, kann Plasmid DNA aus jeder der Kolonien hergestellt werden, und Zersetzungen (digests) mit der geeigneten Restriktions-Endonuclease können durchgeführt werden, so daß die cDNA-lnserts von dem Plasmidvektor durch Gelelektrophoresa abgetrennt werden können.

Die Amplifikation und Isolierung von Plasmid DNAs kann unter Verwendung von Standardverfahren (Maniatis, T. et al.. Molecular Cloning a Laboratory [1982]) durchgeführt werden. Die Inserts können von dem Plasmid durch Digestion mit geeigneter Restriktions-Endonuclease und anschließender Agarose-Gelelektrophorese und Elektroelution abgetrennt werden (McDonald, M. VV. et al., J. Mol. Biol. 110, [1977]).

Die Cross-Hybridisierungsversuche können mit diesen Digests (Abbaumaterialien) durchgeführt werden, um festzustellen, ob die DNAs aus den Plasmiden homolog zu der DNA der ursprünglichen Pflanzonquelle sind. Es werden so die Piasmide, welche homologe DNA enthalten, bestimmt

Bestimmung dor Nucleotld-Sequenz von dem cDNA-lnsert (Einsatz) In pBOS5 Zur Bestimmung der Nucleotid-Sequenz des cDNA-lnserts können Fragmente des Plasmid-Inserts, welche durch Restriktions-Endonuclease erzeugt wurden, in geeignete Vektoren subkloniert werden, und die entstehendei einsträngigen DNAs können der Sequenzanalyse nach an sich bekannten Verfahren, wie nach dem Sanger-Verfahren (1979) unterworfen werden (Sanger, F. et al., J. Molec. Biol., 143 161-178 [1980]).

Geeignete Vektoren für die Subklonierung sind leicht verfügbar und dem Fachmann geläufig. Besonders bevorzugte Vektoren für den pBOS5-lnsert sind M 13-Vektoren mp 10 und mp 11 (Messing, J. et al., Gene 19, 269-2766 [1982]). Die Restriktionsbank und die DNA-Sequentierungsstrategie von Brassica cDNA-lnsert von pBOS5 ist in Figur 1 dargestellt. Die Restriktionsbank wurde durch gelelektrophoretische Analyse verschiedener einsträngiger und doppelsträngiger Enzym-Digests von pBOS 5 konstruiert. Die dicke Linie stellt den Coddierungsbereich, und die dünne Linie stellt dun 3'-Nichtcodierungsboreich von der cDNA-Sequenz dar. Pfeile unterhalb der Karte zeigen die Richtung und das Ausmaß der Sequenzen, welche in M 13-Vektoren subkloniert sind und von jeder Restriktionsstelle abgelesen werden. Die Ergebnisse der Nucleotid-Sequenzbestimmung an einem pBOS5 BamH 1 -Einsatz, subkloniert in M 13mp10 und M13mp 11, sind in Figur 2 dargestellt. Obgleich fünf der sechs möglichen Leseraster durch mehrfache Nonsense Codons innerh?!u des gesamten 1283-Basenpaar- („bp") Einsatzes blockiert sind, translated das verbleibende Leseraster in ein ^Dolvncptid mit einer Länge von 123 Aminosäuren, wie es in Figur 2 dargestellt wird. Die Nucleotid-Sequenz AATAAA, welche eis Signal für die Polyadenylierung von mRNA angenommen wird (Proudfoodt, N. J. et al.. Nature 263,211-214 [1976J), ist stromabwärts von dem SLSG-Codierungsbereich 11 bis 16bp vom Ende descDNA-tiinsatzes lokalisiert, von dem man annimmt, daß er von dem 3'-Ende von mRNA stammt. Die cDNA-Sequenz enthält keinen poly(A)-Schwanz, welchar normalerweise 11 bis 30 bp von dem Polyadenylierungssignal entfernt ist. Eine Erklärung für die Abwesenheit des poly(A)-Trakts ist die, daß die BamH 1-Sequonzen, die beide Seiten des cDNA-Einsatzes flankieren, nicht der BamH 1-Linker-Sequenz, die bei der Konstruktion von cDNA alleine verwendet wird, ähnelt. Man nimmt an, obgleich dies hypothetisch ist, daß eine BamH 1-Erkennungsstelle in der vollen Länge der cDNA-Sequenz zwischen dem Polyadenylierungssignal und dem poly(A)-Schwanz des Messengers lokalisiert ist, so daß diese BamH 1-Stolle in den pBR322-Vektor anstelle des Endes, das durch die Linker-Sequenz geliefert wird, eingesetzt werden kann.

Konstruktion der Expressionsplasmide

Geeignete Expressionsvektoren sind Vektoren, welche Sequenzen der DNA enthalten, die für die Transkription ihrer mRNAs in E.coil erforderlich sind. Beispiele sind gt 11, puc8, puc9, pWR590, pWR590-1, pWR590-2. Bevorzugte Vektoren für den pBOS5-Insert sind die drei Expressionsvektoren pWR590, pWR590-1 und pWR590-2, welche kürzlich beschrieben wurden (Guo, L. H. et al., Gene 29,251-254 (1984)). In diesen Vektoren kann fremde DNA in dun Poly-Linkerbereich eingesetzt werden, so daß diese exogenen Sequenzen durch E. coli-Zellen in ein Fusionsprotein translatiert werden können, von denen die ersten 590 Aminosäuren durch ein abgestumpftes E.coliß-Galactosidasegen geliefert worden (Guo, L.H. et al., Gene 29,251-254 [1984] und Figur 5a). Unter Verwendung aller drei Vektoren kann ein Fragment fremder DNA an das ß-Galactosidasegen in allen drei möglichen Translations-Leserastern gebunden werden.

Der angenommene Codierungsbereich von dem cDNA-lnsert aus Brassica oleracea ist vollständig innerhalb eines Fragments aus DNA (Fragment L in Figur 3 B) enthalten, welches durch Recognitionsstellen für die Enzyme BamH 1 (an den Stellen 1-€)und XHoI (Nucleotide 740-745) abgegrenzt ist. Wie in Figur 3C erläutert wird, kann das Fragment L aus pBOS5 theoretisch für ein Fusionsprctein, welches Determinanten, die für ein langes offenes Leseraster codieren, das durch DNA-Sequenzdaten vorgesehen wird, codieren, nur wenn es in den Vektor pWR 590-1 eingesetzt ist. Wenn es in irgendeinem der verbleibanden zwei Vektoren, pWR 590 und pWR 590-2, eingesetzt wird, wäre das Fragment L nicht in dem korrekten Leseraster, bezogen auf das ß-Galactosidasegen, und würde die Synthese eines Fusionsproteins, das im wesentlichen durch Brassica DNA spezifiziert wird, nicht dirigieren.

Es können so sechs Expressionsplasmide konstiuiert werden, wie beispielsweise die sechs Expressionsplasmide, die aus dun L- und S-Strängen von Brasslca konstruiert werden. Die entstehenden sechs konstruierten Stränge können Individuell in geeignete Zellen durch Transformation eingearbeitet werden, und die Plasmide in verschiedenen Kolonien, die aus jeder der Transformation hervorgehen, können durch Digestion mit geeigneten Restriktiuns-Endonucleasen geprüft werden. Geeignete Zellen für die Transformation des Expressionsplasmids umfassen irgendwelche Stämme, welche seine Vervielfältigung bzw. Vermehrung und Translation erlauben. Beispiele sind E.coli-Stämme HB101, JM101 und SF8. Besonders bevorzugt ist E.coll SF8.

Eine Kolonie aus jedem Versuch, welche das erwartete Muster von Fragmenten ergibt, wurde ausgewählt. Aus Brasslca besteht das erwartete Muster aus zwei Fragmenten, wovon eines in seiner Größe entweder dem Fragment L oder dem Fragment S entspricht und das andere Fragment identisch mit der Länge zu dem Vektor ist.

Extrakte können aus Kulturen der ausgewählten Transformanten hergestellt werden, und nach geeigneten Verfahren, wie gemäß einer Polyacrylamid-Gelelektrophorese, fraktioniert werden. Die auf diese Art analysierten Proto r,e können elektrophoretisch auf Nitrocellulosefilter übertragen werden und mit Antikörpern gegenüber SLGS naci, er: lieh bekannten Verfahren analysiert werden. Das Plasmid, welches das Fragment L gebunden an den Vektor enthält, der die Synthese von SLGS-verwandten Polypeptiden dirigiert, kann durch positive Reaktion mit SLSG-Antiserum oder nach einem anderen geeigneten Verfahren identifiziert werden. Für Bra-slca sollte die Größe der prominenten Bande so sein, wie man sie für ein Fusionsprotein erwartet, welches aus den Aminosäuren des Expressionsplasmids und dem Poly-Linkerbereich und den 123 Aminosäuren, die durch Brassica cDNA-Klon codiert werden, bestellt.

Wie bereits erwähnt, besitzt die vorliegende Erfindung zahlreiche Anwendungen. Eine davon besteht darin, S-Gene in Samenmaterial, beispielsweise gemäß der Southern-blot-Analyse, genomischer DNA zu identifizieren. Eine andere Anwendung besteht in der Identifizierung stabiler S-AIIeIe mit starken Promotern, beispielsweise durch isoelektrische Fokussierung oder Transformation. Zusätzlich können transformierte Stämme, welche die S-AIIeIe tragen, in Stämme, die unterschiedliche S-AIIeIo tragen, eingepflanzt werden, so daß der Samen, welcher geerntet wird, ein vollständiges Hybrid ist. Weitere Anwendungen umfassen: eine Erleichterung der Hybridsamenproduktion durch einen wirksameren Transfer stabiler S-AIIeIe in Samenmaierialien, beispielsweise durch Transformation, das Brechen bzw. Aufhören der Selbstunverträglichkeit in Frucht- bzw. Obstbäumen, beispielsweise die In-vltro-Mutagenese von S-Genen, oder durch chemische und immunochomische Blockierung der selbstunverträglichen Inbred-Linien, beispielsweise durch Transformation oder In-vitro-Mutagenese.

Ausführungsbeispiele Die folgenden Ausführungsbeispiele erläutern die Erfindung. Ausführungsbeispiel 1 Herstellung eines Klons, welcher Brasslca oleracea cDNA enthält Brasslca oleracea selbstunverträgliche Pflanzen, welche für die S₆-, S_n- und S₁₄ AIIeIe, die in der State University New York, Cortland, gehalten wurden, homozygot sind, wurden für das folgende Experiment verwendet. Homozygotie wurde erhalten, indem man reife Pollen auf unreife und somit selbstverträgliche Stigmas der gleichen Pflanze

anwendete.

Brasslca oleracea cDNA wurde aus polyA+ RNA aus Stigmas einen Tag vor der Anthese hergestellt, indem man mit

ologo(dT)₁₂-it entsprechend dem zuvor beschriebenen Verfahren eino Primer-Reaktion durchführte (Maniatis, T. et al., Molecular

Cloning a Laboratory Manual (1982)). Nach der Behandlung mit S,-Nuclease (Bethesda Research Laboratories, BRL) und der darauffolgenden Reparatur mit dem Klenow-Fragment von E.coll DNA-Polymerase I (BRL) (Maniatis, T. et al., Molecular Coling: A Laboratory Manual (1982)) wurde

diecDNA mit glatten Enden an BamH 1 -Linker (BRL) nach an sich bekannten Verfahren ligiert und zur Vervollständigung mit Barn

H1 nach an sich bekannten Verfahren digeriert (Maniatis, T. ot al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982)). cDNA- Spezies, die größer sind als 500bp, wurden dutch Elektrophorese an einem 1%igen niedrigschmelzenden Agnrose-Gel in

0,089molarer Tris-Base, 0,089molare'· Borsäure, 0,002 molarer Ethylendiamintetraessigsäure (Dinatriumsalz) isoliert und in die8am H 1-Stelle von Plasmid pBR322 nach an sich bekannten Verfahren (Maniatis, T. et al., Molecular Cloning: A Laboratory

Manual [1982]) kloniert. Die Transformation von E.coll-SF8-Zellen, die im Handel erhältlich sind, erfolgt nach dem Verfahren von Hanahan, D₁J. Mol. Biol. 166, 557-580 [1982)). Ungefähr 2000 unabhängige Klone wurden randomurtig aus der cDNA-Bank herausgenommen, und die DNA dieser Kolonien

wurde dann auf jedes von zwei Nitrocellulosefiltern transferiert und mit Stigma-cDNA- und Samen-cDNA-Proben hybridisiert.

Die Stigma- und Samen-cDNA-Proben wurden durch Random-Primer-Umkehrtranskription von polyA+ RNA hergestellt (Taylor, J.M. et al., Blochlm. Biophyv Acta 442, 32Ί [1976)). Die Stigmaprohen wurden aus polyA+ RNA durch Reinigung von Brassica

selbstunverträglichen Stigmas hergestellt. Samenproben wurden aus polyA+ RNA durch Reinigung von Brassica etiolierten

Sämlingen hergestellt. Die recombinanton Klone werden nach dem Kolonie-Hybridisierungsverfahren von Grunstein & Hogness (Grunstein, M. et al., Proc. Natl Acad. ScI. USA 72, [1975]) gescreened. Es wurde gefunden, daß acht Kolonien stark mit der sich von Stigma ableitenden cDNA-Probe hybridisieren, jedoch nicht mit der

sich von Samen ableitenden cDNA-Probe reagieren.

Plasmid DNA wurde aus jeder der acht Kolonien nach an sich bekannten Verfahren hergestellt (Maniatis, T. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual [1982]). Das Plasmid DNA wurde mit Restriktions-Endonuclease Bam H1 digeriert (Maniatis, T. et al., Molecular Cloning: A Laboratory

Manual [1982]).

Die cDNA-lnserts wurden aus dem Plasmidvektor durch Agarose-Gelelektrophorese und Elektroelution hergestellt (McDonald, M.W. et al., J. Mol. biol. 110, |1977|) und würden mit ³²P gemäß der Nick-^ranslation (Rigby, P.W. J. et al., J. Mol. Biol. 113,

237-251 11977]) markiert.

Cross-Hybridisierungsversuche zwischen den verschiedenen isolierten Plasmiden wurden dann nach an sich bekannten Verfahren durchgeführt (Maniatis, T. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982]).

Die Cross-Hybridisierungsversuche zeigen, daß alle acht Recombinant-PlasTiide zueinander homolog sind. Das Plasmid, welches den größten cDNA-Einsatz enthält, wird als pBOS5 bezeichnet und besitzt die ATCC-Hinterlegungsnummer 40191.

Ausführungsbeispiel 2

Determination der Nucleotid-Sequenz von Brass)ca cDNA-lnsert in pBOS5

Durch Restriktions-Endonuclease gebildete Fragmente von pBOS5-lnsert wurden in M13-Vektoren mp 10 und mp 11 subklmiert (Messing, J. et al., Gene 19,269-2766 [1982]), vergleiche Figur 1.

Die DNA-Sequentierung erfolgte mit der entstehenden einsträngigen DNA nach dem Dideoxvnucleotid-Kettenterminationsvsrfahren (Sanger, F. at al., J. Mol. Biol. 143,161-178(1980]) unter Verwendung von synthetischem 17-mer als Primer (New England Biolabs). Der 17-mer-Primer besitzt die folgende Sequenz:

5'-GTTTTCCCAGTCACGAC-3^I

Die Ergebnisse der Nucleotid-Sequenzdetermination längs einer projizierten Aminosäure-Sequenz sind in Prjur 2 dargestellt.

Alisführungsbeispiel 3 Herstellung von Fusionsproteinen

Die Plasmide pWR 590, pWR 590-1 sind eine Familie von Expressionsvektoren, die dazu geschaffen wurden, daß sie in jeder der drei möglichen Translationsraster Gene verdeutlichen (Guo, L. H. et al., Gene 29,251-254 (1984]). Zur Konstruktion von Expressionsplasmiden von der Brassica cDNA-Sequenz werden die 745bp (L) und d>e 538pB (S) Bam H 1-Xhol-Fragmente von pBOG5 aus einem 1%igen niedrigschmelzenden Agarose-Gel der gleichen Zusammensetzung, wie oben beschrieben, isoliert und mit Bam H1 - und SaI I-Digests von pWR 590, pWR 590-1 und pWR 590-2 nach an sich bekannten Verfahren ligiert (Maniatis, T.

et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual [1982]). Die entscheidenden sechs Plasmidkonstruktionen, die als pWR590-L, pWR 590-1L, pWR 590-2 L, pWR 590-S, pWR 590-1 Sund pWR 590-2 S bezeichnet wurden, werden zur Transformierung von E. coli SF8-Zellen verwendet.

Transformierte E. coli SF8-Stämme werden über Nacht in Anwesenheit von 1 mM IpTG gezüchtet. Die Extrakte werden durch Beschallung in 7 M Guanidinhydrochlorid (Guo, L. H. et al., Gene 29,251-254 [1984]) hergestellt, und aliquote Äquivalente zu 500μΙ der Kultur werden der Elektrophorese an 10%igen SDS-Acrylamidgelen (Laemnli, U. K., Nature 227,680-685 [1970]) unterworfen. Die abgetrennten Proteine werden elektrophoretisch auf Nitrocellulosemembranen entsprechend Towbin, H. et al., Proc. Natl Acad. Sei. USA 76,4350-^1354 (1979) trancferiert.

Die Immunomarkierung der Nitrocellulose-Flecken erfolgt wie von Symington, J., „Two-dimensional Electrophoresis of Proteins", Academic Press (1983) beschrieben. Das Antiserum der ersten Stufe wird in einem Neuseeland-Wtißen-Kaninchen durch mehrfache intradermale Injektionen von S₆-spezifischem Glycoprotein, gereinigt durch präparative isoelcktrische Fokussierung, in granulierten Schichten gezüchtet. Die Probe der zweiten Stufe ist ein peroxidasekonjugiertes Protein A.

Ausführungsbeispiel 4

Genomische DNAs, isoliert aus verschiedenen Brassica-Spezies, beispielsweise Brassica oleracea, Brassica campestris, Brassica napus, Brassica juncea, Brassica nigra und Brassica carlnata, und von anderen Arten der gleichen Familie von Cruciferae (ebenfalls bekannt als Brassicaceae), wie Raphanus, Lbpidium und Histera, werden der Southern-Analyse (Southern, E. J. Mol. BIoI., 08,503-517 (1975] unterworfen. Di»; Nitrocellulose-Flecken der Restriktions-Digests von diesen DNAs werden mit "P-markiertem pBOS 5 analysiert. In allen Fällen werden Sequenzbindungen, die zu pBOS 5 hybridisieren und daher homolog zu pBOS5 sind, nachgewiesen.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung einer DNA-Basensequenz, dadurch gekennzeichnet, daß

Λ) eine im wesentlichen reine DNA-Basensequenz, die für ein S-Iocusspezif isches Glycoprotein aus selbstunverträglichen Pflanzen codiert, oder irgendein Fragment dieser DNA-Basensequenz, welches für die DNA-Basensequenz einzigartig ist, oder irgendein funktionelles Äquivalent der DNA-Basensequenz oder eines seiner Fragmente isoliert wird, oder

B) Eine im wesentlichen reine DNA-Basensequenz, die der cDNA-Basensequenz entspricht, welche der mRNA entspricht, die für ein S-Iocussp«zif isches Glycoprotein aus selbstunverträglichen Pflanzen codiert, oder die einem irgendeinem funktionellen Äquivalent dereDNA-Basensequenzoderdes Fragmentsäquivalents ist, isoliert wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1 A), dadurch gekennzeichnet, daß die isolierte DNA-Basensequenz zu der folgenden nichtcodierenden DNA-Basensequenz komplementär ist:

5'- GGA TCC GTC GTC TTG ATT CTA TTT TGT CCT GCC TTT TCG

50
ATC AAC ACT TTG TCG TCT ACA GAA TCT CTT AGA ATC TCA AGC

100
AAC AGA ACA CTT GTA TCT CCA GGT AAT AAC TTC GAA CTC GGC

150 TTC TTC CGA ACC AAC TCA AGT TCT CGT TGG TAT CTC GGG ΑΤΑ

200

TGG TAC AAG AAA TTG CTC GAC AGA ACC TAT GTA TGG GTT GCC AAC AGA GAT AAC CCA CTC TCC AAT GCC ATT GGA ACC CTC AAA 250

ATC TGA GGC AAT AAT CTT GTC CTC CTT GGT CAC ACC AAT AAA TCT GTT TGG TCG ACG AAT CTT ACT AGA GGA AAT GAG AGA CTT

350
CGG TGG TGG CAG ACG TTC TCT CTA ATC GGA ACT TCG TGA

400
TGCGAGACTCCAGTAACAACGACGCAAGTCAATACTTGTGGCAAAGTTTCGATTA

450
CCTACGGATACTTTGCTTCCAGAGATGAAACTGGGTTACGACCTCAAAACAGGGT

500
TGAAGAGGTTCCTTACATCATGGAGAAGTTCAGATGATCCATCAAGCGGGGATTT

550
CTCGTACAAGCTCGAAACCCGAAGCCTTCCTGAGTTTTATCTATGGCATGGGATC 600

TTTCCAATGCATCGGAGTGGTCCATGGAATGGAGTCCGATTTAGTGGCAACCAGA 650 700

GGACCAAAAGCTGAGTTACATGGTGTACAATTTCACAGAGAATAGTGAAGAGGTC

750 GCTTATACATTCCGAATGACCAACAACAGCATCTACTCGAGATTGACACTAAGTT

8CO CCGAAGÜTATTTTCAGCGACTTACGTGGAATCCGTCAATAGGGATATGGACAGGT

850
CTGGTCTTCTCCAGTGGACCCCCAGTGCGATACATACATAATGTGCGGGCCTTAC

900
GCTTACTGTGGCGTGAACACATCACCTGTTTGTAACTGTATCCAAGGGTTCAATC

950

CCCGGAATATACAGCAGTGGGATCAGAGAGTCTGGGCAGGTGGGTGTATAAGGAG GACGCGGCTTAGCTGCAGTGGAGATGGTTTTACAGGATGAAGAACATGAAGCTGC

1050
CAGAAACTACGATGGCGATTGTCGACCGCAGTATTGGTGTGAAAGAATGTGAGAAGA

1100
GGTGCCTTAGCGA'ITGTAATTGTACTGCTTTTGCAAATGCAAATGCGGATATCCG

1150

GAATGGTGGGACGGGTTGTGTGATTTGGACCGGACGGCrrGACGATATGCGGAAT 1200 1250

TACGTTGCTCACGGTCAAGATCTTTATGTCAGATTGGCTGTTGCTGACCTTGTTT AGCTCTTTCTCTTAAAATAAAGCACGGATCC-a'

oder zu irgendeinem Fragment der nichtcodierenden DNA-Basensequenz, welches für die nichtcodierende DNA-Basensequenz einzigartig ist, komplementär ist oder zu irgendeinem funktionellen Äquivalent der nichtcodierenden DNA-Basensequenz oder zu dem Fragment komplementär ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 B, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Basensequenz die folgende Sequenz aufweist:

5'- GGA TCC GTC GTC TTG ATT CTA TTT TGT CCT GCC TTT TCG ATC

50
AAC ACT TTG TCG TCT ACA GGA TCT CTT AGA ATC TCA AGC AAC

100
AGA ACA CCT GTA TCT CCA GGT AAT AAC TTC GAA CTC GGC TTC

150 TTC CGA ACC ACC TCA AGT TCT CGT TGG TAT CTC GGG ATA TGG

200

TAC AAG AAA TTG CTC GAC AGA ACC TAT GTA TGG GCC GTT AAC

250

AGA GAT AAC CCA CTC TCC AAT GCC ATT GGA ACC CTC AAA ATC TCA GGC AAT AAT CTT GTC CTC CTT GGT CAC ACC AAT AAA TCT GTT TGG TCG ACG AAT CTT ACT AGA GGA AAT GAG AGA CTT CGG

350
TGG TGG TGG CAG ACG TTC TCT CTA ATC GAA ACT TCG TGA

400
TGCGAGACTCCAGTAACAACGACGCAAGTCAATACTTGTGGCAAAGTTTCGATTA

450
CCTACGGATACTTTGCTTCCAGAGATGAAACTGGGTTACGACCTCAAAACAGGGT

500
TGAACAGGTTCCTTACATCATGGAGAAGTTCAGATGATCCATCAAGCGGGGATTT

550
CTCGTACAAGCTCGAAACCCGAAGCCTTCCTGAGTTTTATCTATGGCATGGGAAT 600

CTTTCCAATGCATCGGAGTGGTCCATGGAATGGAGTCCGATTTAGTGGCAACCAG 650 700

AGGACCAAAAGCTGAGTTACATGGTGTACAATTTCACAGAGAATAGTGAAGAGGT

750 CGCTTATACATTCCGAATGACCAACAACAGCATCTACTCGAGATTGACACTAAGT

800 TCCGAAGGTATTTTCAGCGACTTACOTGGAATCCGTCAATAGGGATATGGACAGG

850 TTCTGGTCTTCTCCAGTGGACCCCCAGTGCGATACATACATAATGTGCGGGCCTT

900
ACGCTTACTGTGGCGTGAACACATCACCTGTTGTAACTGTATCCAAGGGTTCAAT

950

CCCCGGAATATACAGCAGTGGGATCAGAGAGTCTGGGCAGGTGGGTGTATAAGGA GGACGCGGCTTAAGCTGCAGTGGAGATGGTTTTACAAGGATGAAGAACATGAAGC

1050
TGCCAGAAACTACGATGGCGATTGTCGACCGCAGTATTGGTGTGAAAGAATGTGA

1100
GAAGAGGTGCCTTAGCGATTGTAATTGTACTGCTTTTGCAAATGCAAATGCGGAT

1150
ATCCGGAATGGTGGGACGGGTTGTGTGATTTGGACCGGACGGCTTGACGATATGC

G G AATTACGTTG CTCACG GTCAAG ATCTTTATGTCAG ATTG G CTGTTG CTGACCTT 1250
GTTTAGCTCTTTCTCTTAAAATAAAGCACGGATCC-S'

oder irgendein Fragment der DNA-Basensequenz, welches für die DNA-Basensequenz einzigartig ist, oder irgendein funktionelles Äquivalent der DNA-Basensequenz oder des Fragments. 4. Verfahren nach Anspruch 1 B, dadurch gekennzeichnet, daß die cDNA-Basensequenz wie folgt ist:

5'- GGA TCC GTC TTG ATT CTA TTT TGT CCT GCC TTT TCG ATC

50
<\AC ACT TTG TCG TCT ACA GAA TCT CTT AGA ATC TCA AGC AAC

100
AGA ACA CTT GTA TCT CCA GGT AAT AAC TTC GAA CTC GGC TTC

150
TTC CGA ACC AAC TCA AGT TCT CGT TGG TAT CTC GGG ATA TGG

200

TAC AAG AAA TTG CTC GAC AGA ACC TAT GTA TGG GTT GCC ACC

350
TGG TGG CAG ACG TTC TCT CTA ATC GAA ACT TCG TGA TGCGAGA

400
CTCCAGTAACAACGACGCAAGTCAATACTTGTCCGAAAGTTTCGATTACCTACGG

450
ATACTTTGCTTCCAGAGATGAAACTGGGTTACGACCTCAAAACAGGGTTGAACAG 500

GTTCCTTACATCATGGAGAAGTTCAGATGATCCATCAAGCGGGGATTTCTCGTAC 550 600

AAGCTCGAAACCCGAAGCCTTCCTGAGTTTrATCTATGGCATGGGATCTTTCCAA

650 TGCATCGGAGTGGTCCATGGAATGGAGTCCGATTTAGTGGCAACCAGAGGACCAA

700 AAGCTGAGTTACATGGTGTACAATTTCACAGAGAATAGTGAAGAGGTCGCTTATA

750
CATTCCGAATGACCAACAACAGCATCTACTCGAGATTGACACTAAGTTCCGAAG

800
GTATTTTCAGCGACTTACGTGGAATCCGTCAATAGGGATATGGACAGGTTCTGGT

850
CTTCTCCAGTGGACCCCCAGTGCGATAACATACATAATGTGCGGGCCTTACGCTT

900
ACTGTGGCGTGAACACATCACCTGTTTGTAACTGTATCCAAGGGTTCAATCCCCG

950

GAATATACAGCAGTGGGATCAGAGAGTCTGGGCAGGTGGGTGTATAAGGAGGACG CGGCtTAGCTGCAGTGGAGATGGTTTTACAAGGATGAAGAACATGAAGCTGCCAG

1050
AAACTACGATGGCGATTGTCGACCGCAGTATTGGTGTGAAAGAATGTGAGAAGAG

1100
GTGCCTTAGCGATTGTAATTGTACTGCTTTTGCAAATGCAAATGCGGATATCCGG

1150 1200

AATGGTGGGACGGGTTGTGTGATTTGGACCGGACGGCTTGACGATATGCGGAATT

1250

ACGTTGCTCACGG rCAAGATCTTTATGTCAGATTGGCTGTTGCTGACCTTGTTTA GCTCTTTCTCTTAAAATAAAGCACGGATCC-S'

odar irgendein Fragment der cDNA· Basensequenz, welches für die cDNA-Basensequenz einzigartig ist, oder irgendein funktionelles Äquivalent der cDNA-Basensequenz oder von dem Fragment aufweist.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die cDNA-Basensequenz des nichtcodierenden DNA-Strangs des ersten Gens oder eines Teils davon unter Bildung eines Chimären Gens, enthaltend ein erstes Gen oder ein Teil davon und ein zweites Gen oder ein Teil davon, eingesetzt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 4, Jadurch gekennzeichnet, daß die cDNA-Basensequenz zur Bildung eines Fusionsproteins, dasgegabenenfalls mit Antiserum reagieren kann, v/obei das Fusionsprotein (1) ein Glycoprotein, ein einzigartiges Fragment des Glycoproteins oder irgendein funktionelles Äquivalent des Glycoproteins oder ein Glycoproteinfragment, welches aus einem Gen oder einem Teil davon mit der cDNA-Basensequenz als nichtcodierender Strang hergestellt worden ist, und (2) ein anderes Protein oder ein Fragment davon enthält, eingesetzt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die cDNA-Basensequenz als Probe zur Identifizierung oder Isolierung einer DNA-Basensequenz eingesetzt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die cDNA-Barensequenz als Piobe zur Identifizierung oder Isolierung von S-Genen in einem Züchtungsstock bzw. Züchtungsmaterial eingesetzt wird.

9. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die cDNA-Basensequenz zur Transformierung von Pflanzenzellen oder Geweben durch Einführung der cDNA-Basensequenz in die Zellen oder die Gewebe eingesetzt wird.

10. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die cDNA-Basensequenz zur Bildung eines Hybridsamens

a) durch Transformierung von Pflanzenzellen oder Geweben mit der cDNA-Basensequenz, Regenerierung der gesamten Pflanzen und Bildung eines Hybridsamens aus den regenerierten Pflanzen oder

b) du.· cn Transformierung von Pflanzenzellen oder Geweben mit der cDNA-Basensequenz, Regenerierung der gesamten Pflanze unter Bildung einer ersten Pflanzenlinie, Zusammenpflanzen der ersten Pflanzenlinie mit einer zweiten Pflanzenlinie und Erzeugung eines Hybridsamens aus den zusammengepflanzten ersten und zweiten Pflanzenlinien, eingesetzt wird.

11. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die cDNA-Basensequenz für die Herstellung eines rekombinanten DNA-Transvektors durch Einsetzen einer cDNA-Basensequenz in einen Vektor eingesetzt wird.

12. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die cDNA-Basensequenz zur Abtrennung eines genetischen Merkmals in einer Pflanze durch Isolierung einer DNA-Basensequenz aus Pflanzenzellen oder Geweben unter Verwendung der cDNA-Basensequenz als Probe, Änderung der isolierten DNA-Basensequenz durch Modifizierung, Zuführung oder Wegnahme von einer oder mehreren Basen, Transformierung der Pflanzenzellen oder der Gewebe mit der geänderten DNA-Basensequenz und Regenerierung von Pflanzen mit der geänderten DNA-Basensequenz eingesetzt wird.

13. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die cDNA-Basensequenz zur Herstellung eines transformierten Mikroorganismus durch Einsetzen eines Transvektors, welcher eine cDNA-Basensequenz enthält, in den Mikroorganismus eingesetzt wird.

14. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß das S-Iocusspezifische Glycoprotein die folgende Aminosäure-Sequenz aufweist:

NH- GIy Ser VaI Va! Leu He Leu Phe Cys Pro AIa Phe Ser

50

Ne Asn Thr Leu Ser Ser Thr GIu Ser Leu Arg Ne Ser Ser

100

Asn Arg Thr Leu VaI Ser Pro GIy Asn Asn Phe GIu Leu GIy

150

Phe Phe Arg Thr Asn Ser Ser Ser Arg Trp Tyr Leu GIy He

200

Trp Tyr Lys Lys Leu Leu Asp Arg Thr Tyr VaI Trp VaI AIa

Asn Arg Asp Asn Pro Leu Ser Asn Ala He GIy Thr Leu Lys

lie Ser GIy Asn Asn Leu VaI Leu Leu GIy His Thr Asn Lys Ser VaI Trp Ser Thr Asn Leu Thr Arg GIy Asn GIu Arg Leu

350
Arg Trp Trp GIn Thr Phe Ser Leu Met GIy Thr Ser -COOH

15. Verwendung einer DNA-Basensequenz, die für ein S-Iocusspezifisches Glycoprotein aus selbstunverträglichen Pflanzen codiert, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Basensequenz

a) als Codierungsstrang des ersten Gens oder eines Teils davon zur Herstellung eines Chimären Gens, welches ein erstes Gen und ein Teil davon und ein zweites Gen oder ein Teil davon enthält, oder

b) zur Herstellung eines Fusionsproteins, enthaltend (1) ein Glycoprotein, ein einzigartiges Fragment des Glycoproteins oder irgendein funktionelles Äquivalent des Glycoproteins oder ein Glycoproteinfragment, codiert durch einen DNA-Strang mit einer DNA-Basenfrequonz, und ein (2) anderes Protein oder ein Fragment davon, welches gegebenenfalls mit Antiserum reagieren kann, oder

c) als erste DNA· Basensequenz, als Probe zur Identifizierung oder Isolierung einer zweiten DNA-Basensequenz, oder

d) als erste DNA-Basensequenz, als Probe zur Identifizierung oder Isolierung von S-Genen im Züchtungsmaterial bzw. Züchtungsstock, oder

e) zur Transformierung von Pflanzenzellen oder Geweben, wobei man die DNA-Basensequenz in die Zellen oder das Gewebe einführt,

f) unter Bildung eines Hybridsamens, wobei Pflanzenzellen oder Gewebe mit der DNA-Basensequenz transformiert werden, die Gesamtpflanzen regeneriert werden und aus den regenerierten Pflanzen ein Hybridsamen erzeugt wird oder

g) unter Bildung eines Hybridsamens, wobei man Pflanzenzellen oder Gewebe mit der DNA-Basensequenz transformiert, die ganzen Pflanzen unter Bildung einer ersten Pflanzenlinie regeneriert, die erste Pflanzenlinie mit einer zweiten Pflanzenlinie zusammenpflanzt und einen Hybridsamen aus den zusammengepflanzten ersten und zweiten Pflanzenlinien erzeugt oder

h) als erste DNA-Basensequenz zur Entfernung eines genetischen Materials in einer Pflanze durch Isolierung einer zweiten DNA-Basensequenz aus den Pflanzenzellen oder dem Gewebe unter Verwendung der ersten DNA-Basensequenz als Probe, Änderung der isolierten DNA-Basensequenz durch Modifizierung, Zufügen oder Entfernen von einer oder mehreren Basen, Transformierung dei Pflanzenzellen oder Gewebe mit der geänderten DNA-Basensequenz und Regenerierung der Pflanzen mit der geänderten DNA-Basensequenz, eingesetzt wird.

16. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Basensequenz zur Herstellung eines rekombinanten DNA-Transvektors durch Einsetzen einer DNA-Basensequenz in einen Vektor eingesetzt wird.

17. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Basensequenz für die Herstellung eines transformierten Mikroorganismus durch Einsetzen eines Transvektors in den Mikroorganismus, welcher eine DNA-Basensequenz enthält, eingesetzt wird.

Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Basensequenz als nichtcodierender DNA-Strang des ersten Gens oder eines Teils davon für das S-Iocusspezifische Glycoprotein oder ein Teil davon aus einer selbstunverträglichen Pflanze zur Herstellung eines chimären Gens eingesetzt wird.