PL158548B1 - Sposób wytwarzania zasadniczo czystej sekwencji zasad DNA i c DNA PL - Google Patents
Sposób wytwarzania zasadniczo czystej sekwencji zasad DNA i c DNA PLInfo
- Publication number
- PL158548B1 PL158548B1 PL1986260930A PL26093086A PL158548B1 PL 158548 B1 PL158548 B1 PL 158548B1 PL 1986260930 A PL1986260930 A PL 1986260930A PL 26093086 A PL26093086 A PL 26093086A PL 158548 B1 PL158548 B1 PL 158548B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- dna
- cdna
- self
- probes
- clones
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 30
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims abstract description 67
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 62
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 30
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims abstract description 18
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 claims abstract description 13
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 15
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 13
- 210000003739 neck Anatomy 0.000 claims description 13
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 11
- 208000007256 Nevus Diseases 0.000 claims description 6
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 6
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 claims description 4
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 claims 2
- 108020005120 Plant DNA Proteins 0.000 claims 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 24
- 238000010367 cloning Methods 0.000 abstract description 9
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 abstract description 7
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 abstract description 7
- 244000005700 microbiome Species 0.000 abstract description 4
- 101710157078 S-locus-specific glycoprotein Proteins 0.000 abstract description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 abstract description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 29
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 29
- 241000219198 Brassica Species 0.000 description 15
- 235000011331 Brassica Nutrition 0.000 description 13
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 12
- 240000007124 Brassica oleracea Species 0.000 description 10
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 10
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 9
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 9
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 8
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 7
- 235000011303 Brassica alboglabra Nutrition 0.000 description 7
- 235000011302 Brassica oleracea Nutrition 0.000 description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 7
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 7
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 230000005849 recognition of pollen Effects 0.000 description 6
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 101150044929 SLSG gene Proteins 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 4
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 206010027145 Melanocytic naevus Diseases 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 3
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- CIMULJZTTOBOPN-WHFBIAKZSA-N Gly-Asn-Asn Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O CIMULJZTTOBOPN-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- KJJROSNFBRWPHS-JYJNAYRXSA-N Phe-Glu-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O KJJROSNFBRWPHS-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 description 2
- SNICXCGAKADSCV-JTQLQIEISA-N (-)-Nicotine Chemical compound CN1CCC[C@H]1C1=CC=CN=C1 SNICXCGAKADSCV-JTQLQIEISA-N 0.000 description 1
- 101150096316 5 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000023308 Acca Species 0.000 description 1
- AXTCFXUJNPBCDB-UHFFFAOYSA-N Agarol Chemical compound CC(C)C1CC(=O)C2=COC3=C2C1CCC3O AXTCFXUJNPBCDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VIULXZNWHKRQPB-KSQLKPTDSA-N Agarol Natural products O=C1c2c3[C@@H]([C@@H](C(C)C)C1)C[C@H](C)[C@H](O)c3oc2 VIULXZNWHKRQPB-KSQLKPTDSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- SKHCUBQVZJHOFM-NAKRPEOUSA-N Ala-Arg-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O SKHCUBQVZJHOFM-NAKRPEOUSA-N 0.000 description 1
- SGYSTDWPNPKJPP-GUBZILKMSA-N Arg-Ala-Arg Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O SGYSTDWPNPKJPP-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- PQWTZSNVWSOFFK-FXQIFTODSA-N Arg-Asp-Asn Chemical compound C(C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N)CN=C(N)N PQWTZSNVWSOFFK-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- HQIZDMIGUJOSNI-IUCAKERBSA-N Arg-Gly-Arg Chemical compound N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O HQIZDMIGUJOSNI-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- WVNFNPGXYADPPO-BQBZGAKWSA-N Arg-Gly-Ser Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O WVNFNPGXYADPPO-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- RYQSYXFGFOTJDJ-RHYQMDGZSA-N Arg-Thr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O RYQSYXFGFOTJDJ-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- OGZBJJLRKQZRHL-KJEVXHAQSA-N Arg-Thr-Tyr Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 OGZBJJLRKQZRHL-KJEVXHAQSA-N 0.000 description 1
- SJUXYGVRSGTPMC-IMJSIDKUSA-N Asn-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O SJUXYGVRSGTPMC-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- VDCIPFYVCICPEC-FXQIFTODSA-N Asn-Arg-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O VDCIPFYVCICPEC-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- PPMTUXJSQDNUDE-CIUDSAMLSA-N Asn-Glu-Arg Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N PPMTUXJSQDNUDE-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- DXVMJJNAOVECBA-WHFBIAKZSA-N Asn-Gly-Asn Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O DXVMJJNAOVECBA-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 235000021537 Beetroot Nutrition 0.000 description 1
- 206010004950 Birth mark Diseases 0.000 description 1
- 241000167854 Bourreria succulenta Species 0.000 description 1
- 235000005156 Brassica carinata Nutrition 0.000 description 1
- 244000257790 Brassica carinata Species 0.000 description 1
- 235000003351 Brassica cretica Nutrition 0.000 description 1
- 244000178993 Brassica juncea Species 0.000 description 1
- 235000011332 Brassica juncea Nutrition 0.000 description 1
- 235000014698 Brassica juncea var multisecta Nutrition 0.000 description 1
- 235000014700 Brassica juncea var napiformis Nutrition 0.000 description 1
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 description 1
- 235000011293 Brassica napus Nutrition 0.000 description 1
- 235000006008 Brassica napus var napus Nutrition 0.000 description 1
- 240000000385 Brassica napus var. napus Species 0.000 description 1
- 235000011291 Brassica nigra Nutrition 0.000 description 1
- 244000180419 Brassica nigra Species 0.000 description 1
- 235000003899 Brassica oleracea var acephala Nutrition 0.000 description 1
- 235000012905 Brassica oleracea var viridis Nutrition 0.000 description 1
- 235000006618 Brassica rapa subsp oleifera Nutrition 0.000 description 1
- 235000003343 Brassica rupestris Nutrition 0.000 description 1
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 description 1
- 101100366936 Caenorhabditis elegans sto-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 208000035240 Disease Resistance Diseases 0.000 description 1
- 239000003109 Disodium ethylene diamine tetraacetate Substances 0.000 description 1
- ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L EDTA disodium salt (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108010093031 Galactosidases Proteins 0.000 description 1
- XRTDOIOIBMAXCT-NKWVEPMBSA-N Gly-Asn-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)CN)C(=O)O XRTDOIOIBMAXCT-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 1
- YYPFZVIXAVDHIK-IUCAKERBSA-N Gly-Glu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CN YYPFZVIXAVDHIK-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- 241000132456 Haplocarpha Species 0.000 description 1
- FBVHRDXSCYELMI-PBCZWWQYSA-N His-Thr-Asn Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)N)O FBVHRDXSCYELMI-PBCZWWQYSA-N 0.000 description 1
- TZCGZYWNIDZZMR-UHFFFAOYSA-N Ile-Arg-Ala Natural products CCC(C)C(N)C(=O)NC(C(=O)NC(C)C(O)=O)CCCN=C(N)N TZCGZYWNIDZZMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PWKSKIMOESPYIA-BYPYZUCNSA-N L-N-acetyl-Cysteine Chemical compound CC(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O PWKSKIMOESPYIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- LZDNBBYBDGBADK-UHFFFAOYSA-N L-valyl-L-tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)C(N)C(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 LZDNBBYBDGBADK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000801118 Lepidium Species 0.000 description 1
- 241000880493 Leptailurus serval Species 0.000 description 1
- YOKVEHGYYQEQOP-QWRGUYRKSA-N Leu-Leu-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O YOKVEHGYYQEQOP-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- OTXBNHIUIHNGAO-UWVGGRQHSA-N Leu-Lys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN OTXBNHIUIHNGAO-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 1
- AIRZWUMAHCDDHR-KKUMJFAQSA-N Lys-Leu-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O AIRZWUMAHCDDHR-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- 244000141359 Malus pumila Species 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 101100019753 Mus musculus Kcnu1 gene Proteins 0.000 description 1
- YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010066427 N-valyltryptophan Proteins 0.000 description 1
- 108020004485 Nonsense Codon Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 240000007377 Petunia x hybrida Species 0.000 description 1
- 241000209504 Poaceae Species 0.000 description 1
- 108091036407 Polyadenylation Proteins 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- LTFSLKWFMWZEBD-IMJSIDKUSA-N Ser-Asn Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O LTFSLKWFMWZEBD-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- 241000207763 Solanum Species 0.000 description 1
- 235000002634 Solanum Nutrition 0.000 description 1
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 235000016639 Syzygium aromaticum Nutrition 0.000 description 1
- 244000223014 Syzygium aromaticum Species 0.000 description 1
- TWLMXDWFVNEFFK-FJXKBIBVSA-N Thr-Arg-Gly Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O TWLMXDWFVNEFFK-FJXKBIBVSA-N 0.000 description 1
- SKHPKKYKDYULDH-HJGDQZAQSA-N Thr-Asn-Leu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O SKHPKKYKDYULDH-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- BECPPKYKPSRKCP-ZDLURKLDSA-N Thr-Glu Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O BECPPKYKPSRKCP-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- DVLHKUWLNKDINO-PMVMPFDFSA-N Trp-Tyr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O DVLHKUWLNKDINO-PMVMPFDFSA-N 0.000 description 1
- YCQKQFKXBPJXRY-PMVMPFDFSA-N Trp-Tyr-Lys Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC3=CC=C(C=C3)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N YCQKQFKXBPJXRY-PMVMPFDFSA-N 0.000 description 1
- UGFOSENEZHEQKX-PJODQICGSA-N Trp-Val-Ala Chemical compound CC(C)[C@H](NC(=O)[C@@H](N)Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O UGFOSENEZHEQKX-PJODQICGSA-N 0.000 description 1
- YFOCMOVJBQDBCE-NRPADANISA-N Val-Ala-Glu Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N YFOCMOVJBQDBCE-NRPADANISA-N 0.000 description 1
- LZDNBBYBDGBADK-KBPBESRZSA-N Val-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 LZDNBBYBDGBADK-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 235000021016 apples Nutrition 0.000 description 1
- 108010069926 arginyl-glycyl-serine Proteins 0.000 description 1
- 108010077245 asparaginyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 230000010165 autogamy Effects 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- QKSKPIVNLNLAAV-UHFFFAOYSA-N bis(2-chloroethyl) sulfide Chemical compound ClCCSCCCl QKSKPIVNLNLAAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 1
- RYYVLZVUVIJVGH-UHFFFAOYSA-N caffeine Chemical compound CN1C(=O)N(C)C(=O)C2=C1N=CN2C RYYVLZVUVIJVGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000020289 caffè mocha Nutrition 0.000 description 1
- 235000019693 cherries Nutrition 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 208000031513 cyst Diseases 0.000 description 1
- 238000000151 deposition Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 235000019301 disodium ethylene diamine tetraacetate Nutrition 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 1
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 1
- 229940087559 grape seed Drugs 0.000 description 1
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 108010051673 leucyl-glycyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010034529 leucyl-lysine Proteins 0.000 description 1
- 108010057821 leucylproline Proteins 0.000 description 1
- 108010054155 lysyllysine Proteins 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 235000010460 mustard Nutrition 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 238000011587 new zealand white rabbit Methods 0.000 description 1
- 229960002715 nicotine Drugs 0.000 description 1
- SNICXCGAKADSCV-UHFFFAOYSA-N nicotine Natural products CN1CCCC1C1=CC=CN=C1 SNICXCGAKADSCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 235000021018 plums Nutrition 0.000 description 1
- 230000010152 pollination Effects 0.000 description 1
- 229920000058 polyacrylate Polymers 0.000 description 1
- -1 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 235000012015 potatoes Nutrition 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000005204 segregation Methods 0.000 description 1
- 238000011451 sequencing strategy Methods 0.000 description 1
- 238000003307 slaughter Methods 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 239000004575 stone Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000012549 training Methods 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Botany (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
1. Sposób wytwarzania zasadniczo czystej sekwencji zasad D N A kodujacej specyficzna glikoproteine S-locus z roslin z cecha samo-niezgodnosci, której to sekwencji niekodujaca, kom plem entarna nic D N A korzystnie ma sekwencje zasad przedstawiona na rys., fig.2, oraz dowolnego fragmentu tej sekwencji zasad D N A unikal- nego dla tej sekwencji jak równiez dow olnego rów now a- znika funkcjonalnego tej sekwencji zasada D N A lub jego fragm entu, znamienny tym, ze tworzy sie bank cD N A z klonów zawierajacych cD N A kom plem entarny dla poli A + RN A pochodzacego ze znam ion lub szyjek slupków roslin z cecha sam oniezgodnosci; hybrydyzuje sie D N A z tych klonów z sondam i cD N A ze znam ion lub szyjek slupków roslin z cecha samoniezgodnosci i z sondami cD N A pochodzacego z sadzonek; prowadzi sie selekcje podzbioru klonów posiadajacych D N A , który hybrydy- zuje z sondami cD N A z tych znam ion lub szyjek slupków natom iast nie hybrydyzuje z sondam i cD N A z sadzonek, preparuje sie i amplifikuje D N A wektora transferowego zawierajacego D N A z tego podzbioru klonów i ten DN A w ektora transferowego poddaje sie trawieniu w celu oddzielenia D N A wektora transferowego od D N A z tego podzbioru klonów. 2. Sposób wytwarzania zasadniczo czystej sekwencji zasad cD N A , korzystnie o sekwencji przedstawionej na rys., fig.2, odpowiadajacej m R N A kodujacem u specyfi- czna glikoproteine S-locus z roslin z cecha sam o- niezgodnosci oraz dowolnego fragm entu . .. . Fig.2 Fig 2 PL
Description
Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania zasadniczo czystej sekwencji zasad DNA i cDNA .
Wynalazek rozwiązuje sposób wytwarzania nowego, klonowanego odcinka DNA, zwłaszcza klonowanego odcinka DNA zawierającego sekwencję zasad kodującą specyf iczną gl ikoprot ei^nę 3-locus roślin posiadających cechę samo-niezgodności. Ten klonowany DNA jest użyteczny do produkcji nasion mieszańcowych /hybrydowych/.
U ponad 300 gatutkeów reprezentujących bardzo odmienne rodziny okΓytrzlląΣkowych, samozapłodnienie jest blokowane mechanizmem znanym pod nazwą samo-niezgodności /Kast E.M., Proc.Am.Phil.Soc. 82, 449-518 /1940/4 W wyniku samozappyenia, wzajemne oddziaływanie pomiędzy znamieniem lub szyjką słupka i pyłkiem wywołuje zdecydowaną odpowiedź moo:fologiczną, zapobiegającą normalnemu wzrostowi łagiewki pyłkowej. Zapłodnienie staje się niemożliwe, gdyż łagiewki pyłkowe są niezdolne do wniknięcia do całej długości znamienia i szyjki słupka. Specyficzność tego wzajemnego oddziaływania jest zdeterminowana Jednym lub większą liczbą loci genetycznych i wymaga identyczności alleli wnoszonych przez męskie i żeńskie rośliny rodzicielskie.
158 548
Układy niezgodność i dzielą się na dwie większe grupy: układy gamtof ityczne, w których fenotyp ziarna pyłku jest zdeterminowany hapl oidalnyn genotypem pyłka i układy sporofityczne, w których fenotyp pyłka jest zdeterminowany genotypem diploidalnej rośliny raa^cznej. Λ' nie zgodno iści typu sporoi itycznego, przyk ładem której są rośliny krzyżowe z rodzaju Brassica, reakcja saeo-niezgodności jest lokalizwwana na powierzchni znamienia słupka i pojawia się w ciągu kilku minut pierwszego kontaktu pyłku z komórkami brodawkowymi na zewnętrznej powierzchni znamienia słupka. W tym rodzaju, samo-niezgodnością kieruje pojedynczy locus genetyczny, S-locus, charakteryzujący się wysoką poiimorricznością. .V naturalnych populacjach zidentyfikowano w nim 50 lub większą icezbę alleli /Thompson K.F. i wsp., Heredity 21, 345-542 /1968/, Cckendon D.J. Heredity 22, 159-171 /1974//.
Sugeruje się, że prawdopodobnie najłatwiejszą eksperymennalnie drogą do przeprowadzenia analizy mooekularnej genetycznej kontroli zjawiska niezgodność i jest wykrycie antygenów specyficznych w stosurku do różnych alleli S-locus w homogenatach znamion słupków pochodzących z różnych szczepów Brassica /Nasrallah -.E. i wsp., Heredity 22, 519-527 /1967//· Okazało się, że antygeny te odpowiadają glkkoproteńnom, które można rozdzielić w różnych układach elektroforetycznych /Nasrallah M.S. i wsp., Heredity 25, 23-27 /1979/., Nasrallah Μδ. i wsp., Genet. Rs. 20, 151-160 /1972/, Nishio T. i wsp., Heredity 38, 391 -396 /1977/, Nasrallah M.E. i wsp., Exp»rientia 40, 279-281 /19£4ł/7.
Na fakt, że te gl ktoproOeiny odgrywa ją w niezgodności ważną rolę wskazuje szereg dowodów, a mianowicie:
/1/ ruchliwość tych cząsteczek jest różna w ekstraktach znamion słupków pochodzących od szczepów Brassica o różnych allelach S-locus, /2/ cząsteczki te znajduje się wyłącznie w znamionach słupków , a szczególnie w powierzchniowych komórkach brodawkowych, a więc w miejscu początkowego kontaktu pyłku ze znamieniem słupka, /3/ występuje korelacja między większą szybkością syntezy tych specyficznych glikoprotein S-locus /SLSG/ w rozwijającym się znamieniu słupka i początkiem reakcji niezgodności w znamieniu słupka /Nasrallah J.B. 1 wsp., Experientia, 40,279-2181 /1984//.
/4/ najważniejszym dowodem jest to, że dziedziczność różnych form SLSG jest w ścisłej korelacji z rozdziałem /segregacją/ alleli S w pokoleniach F^ i F-, cc wskazuje na Oo, że gen odpowiedzialny za ten polimorfizm musi być genetycznie wyjątkowo ściśle związany z S-locus /Nasrallah M.B., Genet. Rs., 20, 151-160 /1972/, Hinata K. i wsp., HerediOy 41, 93-100 /197«//.
Wyoorębnienie klonu cDNA kodującego specyficzną glikoproteinę S-locus jest sprawą bardzo istotną, gdyż klon ten umerliwiłby identyfikację genów samo-niezgodność i w hodowlach, identyfikację stabilnych S-alleli z sinnymi promotorami, jak również wprowadzenie genów samo-niezgodności do odpowiednich szczepów rośliny przez transformację. Ponadto, oransoommowane szczepy posiadające S-allele mogłyby być Osadzane do szczepów posiadających różne S-allele, co dałoby zbiory nasion całkowicie mieszańcowych. Takie odmiany mieszańcowe są pożądane, gdyż uzyskuje się z nich wyższe plony. Wyddje się ponadto, że szczepy takie bardziej nadają się do wprowadzania cechy odporność i na chorobę i łatwiej przystosowują się do ekstremalnych warunków środowiska ^^r^o^tou. Frzykładowo, w rośinnach ozdobnych odmiany z samo-niezgodnością odznaczają się wytrzymywaniem dłuższego okresu składowania i kwitnieńeem przez dłuższy okres czasu w sezonie.
Zgodnie z powyższym, jednym z celów wynalazku jest ułatwienie produkcji nasion mieszańcowych poprzez wydajniejsze przeniesienie stabilnych S-alleli do hodowanych roślin.
Następnym celem wynalazku jest przełamanie samo-niezgodności w drzewach owocowych, co dałoby plony wyższe i lepszy zbiór owoców w ogródkach domowych, gdzie hoduje się tylko jedno drzewo owocowe.
Kolejnym celem wynalazku jest zastąpienie utrzymywania linii wsobnych z cechą samo-niezgodności przez zapylenie ręczne.
15Ó 548
Celem wynalazku jest ponadto umożliwienie międzyr odzs jowej hybrydyzacji pomięcz;. rodzajami z cechą sano-niezgodnośc i i bez tej cecn.y, w celu założenia szerszej puli genćw służącej do ulepszania roślin.
Te i inne cele osiągnięto przy zastosowaniu niniejszego wynalazku.
Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania zasadniczo czystej sekwencji zasad DKA kodującej specyficzną gl ikcoproteinę S-locus z roślin z cechą samo-niezgodności, której to sekwencji niekodująca, kom^lemi^tarna nić DKA korzystnie ma sekwencję zasad przedstawioną na rys., fig. 2, oraz dowolnego fragmentu tej sekwencji zasad DNA unikalnego dla tej sekwencji jak również dowolnego równoważnika funkcjonalnego tej sekwencji zasad DNA lub jego fragmentu polegający na tym, że tworzy się bank cDNA z klonów zawierających cDNA komplementarny dla poli. A + RNA pochodzącego ze znamion lub szyjek słupków roślin z cechą samo-niezgodności; hybrydyzuje się DNA z tych klonów z sondami cDNA ze znamion lub szyjek słupków roślin z cechą samo-niezgodności i z sondami cDNA pochodzącego z sadzonek; prowadzi się selekcję podzbioru klonów posiadających DNA, który hybrydyzuje z sondami cDNA z tych znamion lub szyjek słupków, natomiast nie hybrydyzuje z sondami cDNA z sadzonek, preparuje się i amplifikuje DNA wektora transferowego zawierającego DNA z tego podzbioru klonów i ten DNA wektora transferowego poddaje się trawieniu w celu oddzielenia DNA wektora transferowego od DNA z tego podzbioru klonów.
Ponadto, przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania zasadniczo czystej sekwencji zasad cDNA, korzystnie o sekwencji przedstawionej na rys., fig. 2, odpowiadającej mRNA kodującemu specyficzną glikoproteinę S-locus z roślin z cechą samo-niezgodności oraz dowolnego fragmentu tej sekwencji zasad cDNA unikalnego dla tej sekwencji zasad cDNA jak również dowolnego równoważnika funkcjonalnego tej sekwencji cDNA lub jej frag^ntu, polegający na tym, że tworzy się bank cDNA z kl^c^nć^w zawierających cDNA komplementarny do poli A+RNA ze znamion lub szyjek słupków roślin z cechą samo-niezgodności; hybrydyzuje się DNA z tych klonów z sondami cDNA pochodzącego ze znamion lub szyjek słupków roślin z cechą samo-niezgodności i z sondami cDNA pochodzącego z sadzonek; prowadzi się selekcję podzbioru klonów posiadających DNA, który hybrydyzuje z sondami cDNA ze znamion lub z szyjek słupków, natomiast nie hybrydyzuje z sondami cDNA z sadzonek; preparuje się i amU-^fiku je się DNA wektora transferowego zawierający DNA z tego podzbioru klonów i poddaje się trawieniu ten DNA welrtora transferowego w celu oddzielenia tego DNA wektora transferowego od DNA z podzbioru klonćw .
Wektor przenoszący rekombinowany DNA zawiera sekwencję zasad DNA kodującą specyficzną glkkoproteinę S-locus z rośliny z cechą samo-niezgodności lub sekwencję zasad cDNA odpowiadającą sekwencji mRNA kodującej specyficzną glikoproteinę S-locus z roślin z cechą samoniezgodności. Talki wektor transferowy służy do transfrr mowa nia mikroorganizmu za pomocą DNA zawartego w tym welrtorze. Przy zastosowaniu DNA otrzymanego sposobem według wynalazku można wytworzyć gen chlnierowy zawiera jący gen lub część genu specyficznej glkkoproteiny Slocus oraz inny gen lub jego część, jak również białko fuzyjne zawierające specyficzną glktoproteinę S-locus lub jego część z rośliny z cechą samo-niezgodności.To białko fuzyjne, lub jego część, zdolne jest do reagowania z antysurowicą przeciw specyficznej glikoproteinie S-locus z roślin z cechą samo-niezgodności.
Sekwencję cDNA kodującą przynajmniej część specyficznej glkcoproteiny S-locus z rośliny z cechą samonii^i^i^odt^ości z rośliny Brassion można klonować.
Na rysunku, fig. 1 przedstawia mapę restrykcyjną i strategię sekwencjonowania DKA insertu cDNA z Brassica w plazmidzie pBOS5. Mapę restrykcyjną sporządzono na podstawie analizy metodą elektroforezy żeloweji produktów trawienia pBOS5 jednym i dwoma enzymami. Grubą linią oznaczono region kodujący specyficzną glkioproteinę S-locus, a cienką linią oznaczono niekodujący region-3'sekwencji cDNA. Strzałki pod m pą wslkazują kierunek i zasięg sekwencji subklonowanych do wektorów M13 i odczyt z każdego miejsca restrykcyjnego.
Fig. 2 przedstawia sekwencję nukleotydową insertu cDNA w plazmidzie pB0S5. Naszkicowa15« 548 ny Jest również zarys sygnalnej sekwencji poliadenylacji, 5 - AATAA-3. Z sekwencji nukl-ectydowej tu przedstawionej wydsdukowanc następującą sekwencję aminokwasów®:
Nl-Gly Ser Val Val Leu Ile Leu Phe Cys Pro Ala Phe Sar
| Ile | Asa | T'ar | 50 Leu Ser Ser | Thr | Glu | Ser | Leu | Arg | ile | Ser | Ser Asn | |
| Arg | Thr | Leu | Val | i uy Ser Pro | Gly | Asn | Asn | Phe | Glu | Leu | Gly | Phe |
| Fhe | Arg | Tór | Asn | Ser Ser | 150 Ser Arg | Trp | Tyr | Leu | Gly | ile | 'Trp | |
| Tyr | Lys | Lys | Leu | Leu As p Arg | Thr | Tyr | Val | 200 Trp | Val | Ala | Asn |
250
| Arg | Asp | Asn | Pro | Leu | Ser | Asn | Ala | Ile | Gly | Tór | Leu Lys | Ile |
| 300 | ||||||||||||
| Ser | Gly | Asn | Asn | Leu | Val | Leu | Leu | Gly | His | Thr | Asn Lys | Ser |
| Val | Trp | Ser | Thr | Asn | Leu | Thr | Arg | GLy | Asn | Glu | Arg Leu | Pro |
| 350 | ||||||||||||
| Val | Val | Ala | Glu | Leu | Leu | Ser | Asn | Gly | Asn | Phe- | -COOH. |
Fig. 3 przedstawia proces subklonowania insertu cDNA-pB0S5 do serii wektorów ekspresji ρ'Ό?59θ· · W procesie tym /A/ przedstawia wytwarzanie odcinków L i S p30S5 przez trawienie enzymami Bemi-Xhol. Strzałki otrzymany kierunek trenskrypcji w plazmidzie cbimerowym; /B/ przedstewia mapę pTO59O. Strzałki wskazują na kierunek transkrypcji. Lac z'oznacza skrócony gen lac i kodujący około 590 aminokwasów. Region rozciągający się za genem lac z'zawiera sekwencję poliłącznika; /0/ przedstawia sekwencje nukleotydowe wektorów ekspresyjnych w mcejscu połączeń fuzyjnych oraz spodziewane produkty translacji. Skrót nucs oznacza nukleotydy a skrót aas oznacza aminokwasy.
Strategię izolacji sekwencji DNA kodujących SLSC opracowano opierając się na odkryciu, że w pewnych szczepach z cechą samo-niezgodności takich jak szczepy Brassica, 1-5% syntezy białka w pączkach znamienia słupka z cechą samo-niezgodnnści jest przeznaczone na syntezę tej właśnie makr occąstecz ki (Nasrollah J.B. i wsp., Ksper ientia 40, 279-281 /1984/). A więc., wydawało się joraw^podobne, że <iuża częsc Iklonów w banku cDNA złożonym z poli. A+
RNA z dojrzałych znamion słupków z cechą samo-niezgodność i powinna zawierać sekwencje SLSC. Wcceśniej już zaobserwowano, że cząsteczki SLSC pojawiają się w znamionach słupków, ale nie występują w liściach ani w sadzonkach ( Nasreallah J.B. i wsp., Sxpeenentia 40, 279-281 /1984/). Twórcy wynalazku wysunęli zatem hipotezę, że lolony SLSG-cDMA mogłyby być wzbogacone w tę właśnie frakcję w takim banku, który silnie hybrydyzowałby z raddorktywnym cDNA odpowiadającym mRNA z dojrzałych znamion słupków, a nie hybrydyzowałby ze znaczonym cDNA specyficznym dla ilości i sadzonek.
Bank cDNA otrzymuje się przez wytworzenie cDNA z poli A+ RNA pocoddzącegd ze znamion słupków z cechą samo-niezgodności,zebranych w czasie, kiedy zachodzi największa synteza SLSG, na drodze łączenia z primerem oUgo/dT/i2_i8» stosując enany sposób ( Maniatis T. i wsp., Molecular Cloning: A Laboratory Manuał /1982/).
Jako surowce roślirnie służące do otrzymywania znamion słupków z niezgodnością stosuje się naturalna populacje roślin oraz rośliny wyhodowane w ramach progrmmów hodowlanych na uniwersytetach, w stacjach badawczych i w przedsiębiorstwach nasienniczych. Przykładami odpowiednich roślin z naturalnych populacji są Lycopaareicon peruvinnum i solanum. Przykłady odpowiednich roślin uzyskiwanych z programów hodowlanych obejmują warzywa, takie jak ziemniaki, pomidory, rzepak, buraki, rośliny ozdobne, takie jak petunia, nikotyna, zboża i trawy, takie jak żyto, owoce pestkowe, takie jak wiśnie, śliwki i jabłka oraz zbiory roślin takich jak goździk korzenny, kapusta włoska i gorczyca, nasiona oleiste, takie jak nasiona winogron, zwłaszcza Brassica napus. Szczególnie korzystne są rośliny Brassica oleracea obdarzone cechą samor^l.ezgoćd^c^i^c^i, homozygotyccie w stosirnku do różnych S-iaLleli takich jak Sę, S-ą i S.ą oraz 47 inny chi dotychczas znanych alleli ( Thompson KF. i wsp., Hr^dity, 21, 345-362 /1966/, Ockendon KJ., Heredity, 33, 159-171 /1974/).
158 548
W celu uzyskania homozygotyczności w Brassica oleracea, nakłada się dojrzałe pyłki na niedojrzałe, a zatem samo-zgodne znamiona słupków tej samej rośliny.
Przykładami odpowiednich S-homozygot są wszystkie stabilne S-homczygoty spośród pięćdziesięciu znanych. Korzystnymi homozygotami są homozygoty Sg i e Brassica oleracea.
Poli A RNA m^żns wyodrębnić znanymi sposobami, takimi jak oligo/dT/chromatografia/ Aviv H. i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci.. USA 69, 1408 /1972//.
cDNA otrzymanym z poli A+ RNA ze znamion słupków z cechą niezgodności traktuje się nukleazą S1, po czym m^ddyiiku je się fragmentem Klanowa polimerazy DNA 3.coli w celu otrzymania cDNA z tępymi końcami /Maniatis T. i wsp., Molecular Cloni-ng: A Laboratory Manuał /1982//. Taki cDNA z tępymi końcami poddaje się ligaćji z łącznikami odpowiednimi dla endonukleazy restrykcyjnej i wyczerpująco trawi się endonukLeazą restrykcyjną /Maniatis T. i wsp., Mdecular Clonino: A Laboratory /1982//. Odcinki cDNA o długości większej niż 500 par zasad izoluje się w znany sposób, na przykład metodą elektroforezy w żelu agarzoowym i klonuje w odpowiednim miejscu rββtgyCcyigym w plazmidzie. Plazmidy te stosuje się następnie do -transformacj klm^l'ek dowol^m znanym sposobem, takim jak metoda Hanahan'a D., J. Mo. Mol., 166,557-580 /1983/
Odpowiednimi dla endtnuld.eayg restrykcyjnej łącznikami są łączniki zawierające miejsca restyykcyjne korespondujące z unikalnymi miejscami restyykcynnymi w plazmidzie. Przykładwu można wymienić łączniki BcoRI, łączniki Batóll, szczególnie korzystrymi łącznikami dla endonukleazy restrykcyjnej w odniesieniu do Brassica oleracea są łączniki BamHI.
Odpowiednimi st03(3718^^ plazmidami są dowolne plazmidy zawierające unikalne miejsca restyykcyjne dla insercji obcego DNA, na przykład pBR322 i pK07. Korzystnie stosuje się plazmid pBR322.
St(^ElOTamg^i odpowiednim mikrolrganyimθm stanowiącym komórkę gospodarza może być każda komórka, która zapewni replikację rekombinant twego plazmidu. Przykładami takich mikroorganimnt^w są szczepy Lcoli KB101, JM101 i SF8. Korzystnie stosuje się szczep E.coli SP8.
Sondy cDNA ze znamion słupków i sadzonek wytwarza się w znany sposób, na przykład ^^tndą jurowadzonej lo^(^ol odwrotnej -trans kr^cji poli A+ RNA /Taylor J.M. i osp., Mochem. Biophys. Acta 442, 324 /1976//. Sondy pochodzące ze znamion słupków wytwarza się z poli A+ RNA wypreparowanego ze znamion z cechą samo-niezgodności, a soidg pochodzące z sadzonek otrzymuje się z poli A* RNA wyodrętinione^ z etio^ian;/^ /wypłonion^ch/ saMonek.
Skrining re kombinowanych klonów przeprcwadza się dowolnym znanym sposobem, na przykład metodą hybrydyzacji kolonii, Grunetein^a i Mgness^a /Grunstein M.I. i wsp., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 72, 3961 /1975//. Po otrzymaniu banku cDNA pobiera się z niego losowo oddzielne klony i charakteryzuje się DNA z tych kolonii znanymi sposobami, na przykład przenosząc na dwa filtry nitroceUuOolowθ i hybrydyzując z odpowiednimi sondami. Kolonie otrzymane z Brassica, które wykazują silną hybrydyzację z sondą cDNA otrzymaną ze znamion słupków, lecz nie dają reakcji z sondą cDNA pochodzącą z sadzonek, selekcjonuje się do dalszego stosowania. Plazmidem, który zawiera DNA pochodzący ze znamion, homoOogicyng do DNA z Brassica oleracea, jest plazmid pB0S5 posiadający numer akcesyjny ATCC4O191.
Po wyselekcjonowaniu kolonii, z każdej kolonii preparuje się plazmidowy DNA i poddaje go trawieniu odpowiednią endlnulkLeayą restrykcyjną. Powstałe inserty cDNA wydziela się z wektora plazmidtwego metodą elektroforezy żelowej.
Ammlifikację i izolację plazmid twego DNA prowadzi się znanymi sposobami (Maniatis T. i wsp., Molacular CIuIio: A Laboratory Manuał /1982/). Inserty wyodrębnia się z plazmidu przez trawienie odpowiednią endonukLeazą restrykcyjną, po czym prowadzi się elektroforezę v żelu agarolowym i elektroelutwanie /McDonald M.W. i wsp., J. Md. Biol. 110,
119 /1977//.
Produkty trawienia poddaje się próbom hybrydyzacji krzyżowej w celu określenia, czy odcinki DNA z plazmidów są homologicyle z odcinkami DNA pochodzącymi z oryginalnego surowca roślinnego. 'V ten sposób oznacza się plazmidy zawierające homologiczny DNA.
158 548
W celu oznaczenia sekwencji nukleotydowej w insercie cDNA, odcinki otrzymane po trawieniu insertu plazmidowego endonukleazą restrykcyjną, subklonuje się do odpowiednich wektorów i otrzymany jednoniciowy DNA poddaje się analizie sekwencji, stosując znane techniki, tskie jak technika Sanger^a /1979/ /Sanger ?. i wsp., J. Mooec. Biol., 143,161-173 /1980//.
Wektory nadające się do subklonowania są łatwo dostępne i ogólnie znane. Dla insertu pB0S5 szczególnie korzystne są wektory M1j - mp10 impTI /Messing J.I. i wap., Gene 19, 269-278 /1982//.
Mapa restrykcyjna i strategia sekwencjonowania DNA insertu cDNA z Bcassica w pB0S5 jest przedstawiona na rysunku, fig. 1.
Mapę restrykcyjną sporządzono opierając się na analizie metodą elektroforezy żelowej różnych produktów trawienia pB0S5 jedrym i dwoma enzymami. Grubą linią oznaczono region ^dującyw a cienką linią oznaczono niek^ujący region 3'sekwencji cDNA. Strzałki. pod mapą wskazują na kierunek i zasięg sekwencji subklonowanych do wektorów M13 oraz odczyt z każdego miejsca restrykcyjnego.
Oznaczono sekwencję nukleotydową w insercie pB0S5 BamH1 subklonwanym do M13mp10 i M13mp11. Jakkolwiek pięć z sześciu możliwych faz odczytu jest zablokOTanych przez wielokrotne kodony typu nonsens wzdłuż całego insertu o długości 1283 par zasad, to pozostała faza odczytu jest zdolna do translacji polipeptydu o długości 123 aminokwasów. Sekwencja nukleotydcwia AATAAA, której przypisuje się znaczenie sekwencji sygnalnej dla poliadenylacji m5NA /Proudfoodt N.J. i wsp., Naturę 263, 211-214 /1976//, jest usytuowana za rsgionsm kodu jącym SLSG, 11-16 par zasad od końca insertu cDNA. Przypuszcza się, że pochodzi ona z końca 3'πΛΝΑ. Ta sekwencja cDNA nie zawiera ogona poli/A/, który zwyke znajcluje się w odległości 11-30 par zasad od sygnału poliaderylacji. Wyjaśnienie nieobecności szlaku poli/A/ stało się możliwe dzięki odkryciu, że sekwencje BamHI flankujące obydwie strony insertu cDNA nie są podobne do sekwencji łącznika BamHI stosowanej w konstrukcji klonu cDNA. Przypuszcza się, że miejsce rozpoznawane przez BamHI jest zlokalizowane w pełnej długości sekwencji cDNA pomiędzy sygnałem poliadenylacji a ogonem poli/A/ sekwencji informacyjnej, a zatem, to miejsce rozpoznawane przez BamHI mogłoby wejść uo wektora pBR322, zamiast końca dosterrczonsgo przez sekwencję łącznika.
Wektorami ekspresyjrymi odpowiednimi do stosowania są wektory, które zawierają sekwencje DNA wymagane do transkrypcji klonowanych kopii genów i do translacji ich mRNA w 8.coli. Przykładem! takich wektorów są gt11, puc8, puc9, pTO59O, pWR59CO1, pTO55<O2. Korzystnie, dla insertu pB0S5 stosuje się trzy wektory ekspresyjne pTO-590, pTO59%1 i pW.55<O2, opisane ostatnio /Guo L.H. i wsp., Gsne 29, 251-254 /1984//. W wektorach tych obcy DNA może byó włączony do regionu poliłącznika tak, że te egzogenne sekwencje mogą podlegać w komórkach 8.coli translacji na białko fuzyjne, w którym pieiwszych 590 aminokwasów pochodzi ze ściętego genu^S-galaktozydazy E.coli /Guo L.H. i wsp., Gene 29, 251-254 /1984//i fig. 5a/.
Przez zastosowanie wszystkich trzech wektorów można łączyć odcinek obcego DNA z genem /3 galaktozydazy we wszystkich trzech możliwych tranelacyjnych fezach odczytu.
Przypuszczalny region kodujący insertu cDNA z Brasaica oleracea jest całkowicie zawarty w odcinku DNA /odcinek L na fig. 3b/ ograniczonym miejscami rθsttykcyOnymi enzymów BamHI /w pozycjach 1-6/ i Xhol /nuklsotydy 740-745/. A zatsm, jak podano na fig. 3c, odcinek L z pB0S5 mógłby teoretycznie kodować białko fuzyjne zawierające determinanty kodowane przez długą, otwartą ramę odczytu, przewidzianą na podstawie danych dotyczących sekwencji DNA jedynie wówwzas, gdy byłby włączony do wektora pTO59O-1. Jeśli odcinek L znajdowałby się w pozostałych dwu wektorach, pTO59O i p'.W59Co2, mógłby on znajdcwać się w fazie odczytu niewłaściwej względem genu β -galaktozydazy, a zatem, nie mógłby kiercwać syntezą białka fuzyjnego charakterystycznego dla DNA Brasaica. '
Tak więc, można skonstuuOTiać sześć plazmidów ekspresyjnych, przykładcwo ze szczepów
Brasaica L i S. Sześć tak otrzymanych konstruktów można osobno wprowadzać do odpowiednich komórek przez trcnisformacje 1 można oznaczać plazmidy w koloniach wyhodowanych z każdaj
158 5*8 transformacji poprzez trawienie odpowiednimi endonukleazami restrykcyjnymi.
Komórkami odpowiednimi do transformacji plazmidem ekspresyjnym są szczepy pozwalające na jego replikacja i translację. Przykłady stanowią z.coli, szczepy KBH , J..11O1 i SFb. Szczególnie Korzystny jest szczep E.coli SF8.
Σ każdej próby wyselekcjonowano jedną kolonię, która cawała spodziewany układ fragmentów. Spodziewanym układem dla Brassica jest układ dwócn fragmentów, przy czym jeden odpowiada wielkością odcinkowi L lub odcinkowi S, a drugi fragment mii taką samą długość jak wektor.
Z hodowli wyselekcjonowanych transformantów sporządza się ekstrakty i poddaje je frakcjonowaniu a znany sposób, na przykład przez elektroforezę w żelu poiaakyylomrndowwyrn SDS. Białka zanalizowane w ten sposób przenosi się elektroforetycznie na filtry nitroceluoooowe i poddaje reakcji z przeciwciałami przeciw SLSG w znany sposób. Przyłączony do wektora plazmid zawierający fragment L, kierujący syntezą polipeptydów pokrewnych do SLSG miżna zidentyfkkować poprzez dodatnią reakcję z antysurowicą przeciw SLSG albo innym dogodnym sposobem. Dla Brassica, wyróżniające się pasmo powinno mieć rozmiary takie, jakie są spodziewane dla białka fuzyjnego składającego się z aminokwasów powstałych w wyniku ekspresji plazmidu i regionu poliłącznika oraz 125 aminokwasów kodowanych przez klon cDNA Brassica.
Jak wspomiano, niniejszy wynalazek ma wiele zastosowań. Jednym z nich jest identyfikacja genów - S w hodcwlach, na przykład przez analizę genomowego DNA metodą Southeon^a. Następnym zastosowaniem wynalazku jest identyfikacja stabilnych 3-alleli z sinnymi promotorami przez, na przykład, ogniskowanie w punkcie lzoelekOyyzotym lub transforrncję. Transformowane szczepy posiadające S-allele można ponadto dosadzać do szczepów posiadających odmienne S-allele, zbierając nasiona całkowicie mieszańcowe. Do dalszych zastosowań wynalazku należą: ulepszanie produkcji mieszańcowych nasion przez wydajniejsze przeniesienie stabilnych S-alleli do hodowwi, na przykład przez transformację, przezwyciężenie cechy sJmOjniezgodności u drzew owocowych przez, na przykład, mutagenezę 5-genów in vitro albo przez chemiczne lub lrmutoothmiczne blokowanie samo-nlezgodności w liniach wsobnych, na przykład metoda transformacji lub mutageoezt in vitro.
Wynnaazek zilusroMano przykładami nie ograniczającymi jego zakresu.
Przykład I. Wytwiαzanle klonu zawierającego cDNA z Brassica oleracea, oznaczenie sekwencji nukleotydowej i zastosowanie do wytwarzania białek fuzyjnych.
W opisanym poniżej doświadczeniu użyto rośliny Brassica oleracea z cechą samo-niezgodności, homonygotyczne w stosutku do alleli Sg, S^, 5^ otrzymane w Uniwersytecie Stanowym w Nowym Jorku, Cortland.
Homrnytonycznoέć osiągnięto przez nałożenie dojrzałych pyłków na niedojrzałe, a zatem samozgodne znamiona słujków w tej samej roślinie.
cDNA z Brassica oleracea otezymano z poli. A+ RNA ze znamion słujków zeboJntch na dzień przed pełnym rozkwitem, przez łączenie z primerem ol igo/dT/^^g znaną metodą /Mannitis T. i wsp., jilooecular Cloning: A Laboratory Manuał /19482//·
Fo traktowaniu nukleazą S^ /Bethesda Research Laboraaories, BRL/ i nastęjniym przyłączeniu fragmentu Klenowa z polimerazy DNA i E.coli /BRL,/ i.IIaOatis T. i wsp., Mooeculao Cloning: A Leboratory Manuał /1982//, wytworzony cDNA z tępymi końcami poddano libacji z łącznikami dla BamHI /BRL/ znanym sposobem i następnemu wyczerpującmrau trawieni, u BamHI znanym sposobem /Mannitis T. i wsp., Mooeculao Cloning: A Laboratory /1982/. Odcinki cDNA dłuższe niż 500 par zasad wyodrębniono metodą elektroforezy w 1%, nisko topiącym się żelu sgarozowym, w 0,089 mlarnej zasadzie Tris, 0,089 molaonym kwasie borowym, 0,002 mooarnej soli dwusodowej EDTA i znanym sposobem klonowano do miejsca BanHl w plazmidzie pBR322 /Janiatis T. i wsp., Ι^β^^ο Cloning: A Laboratory Manuał /1982//. Transformację ogólnie dostępn^h temórek E.coli SFB powadzono metodą Hanahanza /Bananan D., J. Biol., 166,
557—580 /1982//.
Z banku cDNA pobrano losowo około 2000 odddzielnych klonów 1 DNA z tych kolonii prze158 548 niesiono na filtry nitrocelulozowe, prowadząc hybrydyzację z cDK« ze znamion słujków i cDNA z sadzonek.
Sondy cDNA ze znamion słujków i z ssazonek wytworzono przez prowadzoną losowo odwrotną transkryptjję poli. A+ rpa /Taylor J.M. i wsp., Si.ochem. Biophys. Acca 442, 324 /1976//. Sondy ze znarni.on słujków wytworzono z poli A+ RNA wy izolowanego ze słujków Brassica z cechą samoniezg°dnośc i, a sondy sadzonek trzymano z poli A + RN'A oczyszczonego z et^rtwan^h sadzonek Brassica.
Rekombinowane klony poddano skriningowi metodą hybrydyzacji kolonii Grunsteina i Hognessa /Grunstein M. i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72, 3961 /19715///« Otrzymano osiem kolonii, które silnie hybrydyzowały z sondą cDNA pochodzącego ze znamion, lecz nie reagowały z sondą cDNA pochodzącego z sadzonek. Z każdej z tych ośmiu kolonii wytworzono plazmidowy DNA w znany sposób /Maniatis T. i wsp., Mooecular Cloning: A Laboratory Manuał /1982/,/. Ten plazmidowy DNA strawiono następnie endonukleazą restrykcyjną BamHI /Manńatis T., Mooecular Cloning: A Laboratory Manuał /1982//.
Z wektora plazmidowego wydzielono inserty cDNA metodą elektroforezy na żelu agarozwwym i elektroelucji /McDonald M..V. i wsp., J. Ml. Biol. 110, 119 /1977/ i za pomocą translacji typu nick znakowano je 5<^p /Righy P.W .J. i wsp^ J.Mol. .Biol. 113» 237-251 /1977///·
Następnie prowadzono próby hybrydyzacji krzyżowej pomiędzy różnymi wy izolowanymi plazmidami, stosując znane techniki /Maniatis T. i wsp., Mooecular Cloning: A Laboratory Manuał /1982//. Fróby hybrydyzacji krzyżowej wykazywały wzajemmą homooogię pomiędzy wszystkimi ośmioma rekombinowanymi plazmidami. Plazmid zawierający największy insert cDNA oznaczono symbolem pB0S5 i nadano mu numer akcesyjny ATCC 40191.
Odcinki insertu pBCS5 pochodzące z trawienia endonukleazą restrykcyjną subklonowano do wektorów M13-mp10 i mp11 /Messing J. i wsp., Gene 19» 269-27 6 /1982//, jak to przedstaw iono na fig. 1.
W otΓzemanye jednonicoowym DNA sekwencjonowania DNA prowadzono metodą zakańczania łańcucha didezoksynukleotydowego /Sanger F. i wsp., J. Mo. Biol, 143, 161-178 /1980//stosując jako primer 17-mer /New England Biolabs/ o następującej sekwencji: 5*-CTTTTCCCAGTCACGAC -3*.W5niki oznaczenia sekwencji nukleotydowej podano na fig. 2· Na ich podstawie określono sekwencję aminokwasową.
Plazmidy pWR59O, pMW!59O-1 1 pWRR9<O-2 są rodziną wektorów ekspresyjnych zaprojektowanych w celu ekspresji genów w każdej z trzech możliwych ram translacji /Gup L. H. i wsp., Gune, 29 , 251-254 /1984/7« W celu konstrukc j i plazmidów ekspresyjnych dla sekwencji cDNA Brassica wy izolowano odcinki o długości 745 par zasad /L/ i 558 par zasad /S/ otrzymane po trawieniu pB0S5 enzymami Bami-Xhol, stosując technikę elektroforezy w 1% nisko topiąyym się żelu agarozowym i w roztworze o podanym powyżej składzie. Odcinki te poddano lgacji z plazmidami p'/W?59O, pWRR9O-1 i pWRR50-2 poddanymi uprzedniej obróbce enzymiami BamHI i Sali, stosując znane techniki /Mannitis T. i wsp., Moe^cular Cloning: A Laboratory Manuał /19&2//· Sześć otrzymanych konstrukcji plazmidowych, oznaczonych jako pWR90-L, p'WR90-1L, p'.VR59<O2L, plVRR9COS, pW?59O-1S i p'TO59O-2S użyto do tr^anisfom^owania komórek E.coli SF8.
Transfominowane szczepy E.coli SF8 poddano jednodniowθmu wzrostowi w obecność i 1 mŁl -PTC. Ekstrakty sporządzono przez działanie ultradźwiękami w 7 M chlorowodorku guanidyny /Guo L.H. 1 wsp., Gene 29, 251-254 /1984//, po czym ilości równoważne 500 ^ul hodowli poddano elektroforezie w 1C% żelu akrnloemddwwye SDS /Lesmaai U.K., Naturę 227 , 680-685 /1970//. Rozdzielone białka przeniesiono elektroforetycznie na błony nitrocelułozowe metodą Towbin'a H. i wsp., /Pm. Acad. Sci. ^^^, 76 , 435°-4354 /19797.
-mmunoznakowanie plam nitrocelułołwwych wykonano metodą opisaną przez Symingt on^a J.
/Two-dlmentlmal Electrophoresis of Proteins, Academis Press /19837. Antysurowicę do pierwszego etapu uzyskano z hodowli białych królików nowooelandzkich, którym wielokrotnie wstrzykówano śródskórnle Sg-specyf lczną glUs^^teinę oczyszczoną przez ogniskowanie w .putkcie izoelekryyzinym w granulowanych złożach. // drugim etapie jako sondę zastołowaπo
158 548 białko A koniugowane z peroksydazą.
Przyk lać II. Genomowy DNA wy izolowany z różnych gaturków Brassica, to jest Brassica oleracea, Brassica camppeStis, 3rassica napus, Brassica juncea, Brassica nigra i Brassica carinata oraz z innych rodzajów tej samej rodziny C,u(^iierae znanej również jako Brassicaceas/, takich jak Kaphanus, Lepidium i Hi^tere poddano analizie Soutnerna /Southern E., J. :.'ol. Biol., 98, 503-517 /19757. Krążki nitroceluozoowe z naniesionymi produktami trawienia DNA enzymami restyykcyjnymi. taybrydyzowano ze znaczonym ^p pB0S5. We wszystkie przypadkach wykrywano sekwencje hybrydyzujące z p30S5, a więc, homooogiczne do pB0S5·
Pomimo, że wynalazek opisano szczegółowo w odniesieniu do specyficznych jego aspektów, dla specjał isóww jest zrozuń^te, że bez naruszenia jego istoty i zakresu można dokonywać różnych zmian i mooyffkaaji.
15« 548 pWR 590/L
582 583 Sac I
GGC AAC CGG GCG AGC TCG AAT TCG AGC TCG CCCGly Asn Arg Ala Ser Ser Asn Ser Ser Ser ProBam HI
-GGG GAT CCG TCG TCT TGA
-Gly Asp Pro Ser Ser Stop pWR 590-1/L
582 583 Sac I
GGC AAC CCG GGC GAG CTC GAA TTC GAG CTC GCC Gly Asn Pro Gly Glu Leu 'Gu Phe Glu Leu Ala
Bam HI
CGG GGA TCC GTC GTC (357 nucslTGA Arg Gly Ser Val Val (119 aas) Stop
1) Fig. 3c d.c pWR 590-2/L
598 599 Sac I
GAT CGC GCG GGA GCT CGA ATT CGA GCT GGC CCGAsp Arg Gly Arg Ala Arg Ile Arg Ala Arg ProBam HI
-GGG ATC CGT CGT CTT (54nucs) TAG
-Gly Ile Arg Arg Leu (18 aas) Stop
2)Fig.3c
BamHI Xhol h»
BamHI
B
Cal
Fig. 3
SacI
- EcoRI
- SacI
- Smal
- BamHI
- Xbal Sali
H PtfI Hindlll
158 548
| 5' - | GGA | TCC | GTC | GTC 50 | TTG | ATT | CTA | TTT | TGT | CCT | GCC | TTT | TCG | |
| ATC | AAC | ACT | TTG | TCG | TCT | ACA | GAA | TCT | CTT | AGA | ATC | TCA | AGC | |
| 100 | ||||||||||||||
| AAC | AGA | ACA | CTT | GTA | TCT | CCA | GGT | AAT | AAC | TTC | GAA | CTG | GGC | |
| 150 | ||||||||||||||
| TTC | TTC | CGA | ACC | AAC | TCA | AGT | TCT | CGT | TGG | TAT | CTC | GGG | ATA | TGG |
| 200 | ||||||||||||||
| TAC | AAG | AAA | TTG | CTC | GAC | AGA | ACC | TAT | GTA | TGG | GTT | GCC | AAC | AGA |
| 250 | ||||||||||||||
| GAT | AAC | CCA | CTC | TCC | AAT | GCC | ATT | GGA | ACC | CTC | AAA | ATC | TGA | GGC |
| AAT | AAT | CTT | GTC | CTC | CTT | GGT | CAC | ACC | AAT | AAA | TCT | GTT | TGG | TCG |
| ACG | AAT | CTT | ACT | AGA | GGA | AAT | GAG | AGA | CTT | CCG | GTG | GTG | GCA | GAG |
| 350 | ||||||||||||||
| CTT | CTC | TCT | AAT | GGA | AAC | TTC | GTG | ATG | CGA | GAC | TCC | AGT | AAC | AAC |
Fig. 2 (i) AOO
| GAC | GCA | AGT | GAA A 50 | TAC | TTG | TGG | CAA | AGT | TTC | GAT | TAC | CCT | ACG | GAT |
| ACT | TTG | CTT | CCA | GAG | ATG 500 | AAA | CTG | GGT | TAC | GAC | CTC | AAA | ACA | GGG |
| TTG | AAC | AGG | TTC | CTT | ACA | TCA | TGG | AGA | AGT | TCA | GAT | GAT | CCA | TCA |
550
| AGC | GGG | GAT | TTC | TCG | TAC | AAG | CTC | GAA ACC 600 | CGA | AGC | CTT | CCT | GAG |
| TTT | TAT | CTA | TGG | CAT | GGG | ATC | TTT | CCA ATG | CAT | CGG | AGT | GGT | CCA |
| 650 | |||||||||||||
| TGG | AAT | GGA | GTC | CGA | TTT | AGT | GGC | ATA CCA | GAG | GAC | CAA | AAG | CTG |
700
| AGT | TAC | ATG | GTG | TAC | AAT | TTC | ACA | GAG | AAT | AGT | GAA | GAG | GTC | GCT |
| TAT | ACA | TTC | CGA | ATG | ACC | AAC | AAC | AGC | ATC | TAC | TCG | AGA | 750 TTG ACA | |
| CTA | AGT | TCC | GAA | GGG | TAT | TTT | CAG | CGA | CTT | ACG | TGG | AAT | CCG | TCA |
| 800 ATA | GGG | ATA | TGG | AAC | AGG | TTC | TGG | TCT | TCT | CCA | GTG | GAC | CCC | CAG |
Fig. 2 (2)
850
| TGC | GAT | ACA | TAC | ATA 900 | ATG | TGC | GGG | CCT | TAC | GCT | TAC | TGT | GGC | GTG |
| AAC | ACA | TCA | CCT | GTT | TGT AAC 950 | TGT | ATC | CAA | GGG | TTC | AAT | CCC | CGG | |
| AAT | ATA | CAG | CAG | TGG | GAT | CAG | AGA | GTC | TGG | GCA | GGT | GGG | TGT | ATA |
| AGG | AGG | ACG | CGG | CTT | AGC | TGC | AGT | GGA | GAT | GGT | TTT | ACA | AGG | ATG |
1050
| AAG | AAC | ATG | AAG | CTG | CCA | GAA | ACT | ACG | ATG | GCG 1100 | ATT | GTC | GAC | CGC |
| AGT | ATT | GGT | GTG | AAA | GAA | TGT | GAG | AAG | AGG | TGC | CTT | AGC | GAT | TGT 1150 |
| AAT | TGT | ACT | GCT | TTT | GCA | AAT | GCA | AAT | GCG | GAT | ATC | CGG | AAT | GGT |
| GGG | ACG | GGT | TGT | GTG | ATT | TGG | ACC | GGA | CGG | CTT | GAC | GAT | ATG | CGG |
1200
| AAT | TAC | GTT GCT 1250 | CAC | GGT | CAA | GAT | CTT | TAT | GTC | AGA | TTG | GCT | GTT |
| GCT | GAC | CTT GTT | TAG | CTC | TTT | CTC | TTA | AAA | TAA | AGC | ACG | GAT | CC-3 |
Fig .2 m
158 548 <=> γ BamHI
ΓΟ ο
ο
-Sali σ' ο
ο fig.4 oo •ο o
rx)
-Xhol
-PttI
-Sali
-BglK ‘'o LBamH1
Zakład Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 5000 zł.
Claims (2)
- Zastrzeżenia patentowe1. Sposób wytwarzania zasadniczo czystej sekwencji zasać DNA kodującej specyficzną glkioproteinę S-locus z roślin z cechą samo-niezgodności, której to sekwencji niekodująca, komplementarna nić DNA korzystnie ma sekwencję zasad przedstawioną na rys., fig. 2, oraz dowolnego fragmentu tej sekwencji zasad DNA unikalnego dla tej sekwencji jak również dowolnego równoważnika funkcjonalnego tej sekwencji zasad DNA lub jego fragmentu, znamienny t y m, że tworzy się bank cDNA z klonów zawierających cDNA komplementarny dla poli. A+ RNA pochodzącego ze znamion lub szyjek słupków roślin z cechą samo-niezgodność i, hybrydyzuje się DNA z tych klonów z sondami cDNA ze znomoo luo szyjek słupków roślin z cecną samo-niezgodności i z sondami cDNA pochodzącego z sadzonek; prowadzi, się selekcję podzbioru klonów posiadających DNA, który hybrydyzuje z sondami cDNA z tych znamion lub szyjek słupków natomiast nie hybrydyzuje z sondami cDNA z sadzonek, preparuje się i amplifikuje DNA wektora transferowego zawierającego DNA z tego podzbioru klonów i ten DNA wektora transferowego poddaje się trawieniu w celu oddzielenia DNA wektora transferowego od DNA z tego podzbioru klonów .
- 2. Sposób wytwarzania zasadniczo czystej sekwencji zasad cDNA korzystnie o sekwencji przedstawionej na rys., fig. 2, odpowiadającej mRNA kodującemu specyficzną glikoproteinę S-locus z roślin z cechą samo-niezgodności oraz dowolnego fragmentu tej sekwencji zasad cDNA unikalnego dla tej sekwencji zasad cDNA jak również dowolnego równoważnika funkcjonalnego tej sekwencji cDNA lub jej fragmentu, znamienny tym, że tworzy się bank cDM-A z .klonów zew iera jących cDNA komplementarny do puli. A+ RNA ze znamion l.ub szyjek s3^upków roślin z cechą samo-niezgodności; hybrydyzuje się DNA z tych klonów z sondami cDNA pochodzącego ze znamion lub szyjek słupków roślin z cechą samo-niezgodności i z sondami cDNA pochodzącego z sadzonek; prowadzi się selekcję podzbioru klonów posiadających DNA, który hybrydyzuje z sondami cDNA ze znamion lub z szyjek słupków, natomiast nie hybrydyzuje z sondami cDNA z sadzonek; preparuje się i ampUfikuje się DNA wektora transferowego zawierający DNA z tego podzbioru klonów i poddaje się trawieniu ten DNA wektora transferowego w celu oddzielenia tego DNA wektora transferowego od DNA z podzbioru klonów.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US76224585A | 1985-08-05 | 1985-08-05 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL260930A1 PL260930A1 (en) | 1987-04-06 |
| PL158548B1 true PL158548B1 (pl) | 1992-09-30 |
Family
ID=25064505
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL1986260930A PL158548B1 (pl) | 1985-08-05 | 1986-08-05 | Sposób wytwarzania zasadniczo czystej sekwencji zasad DNA i c DNA PL |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0212385A3 (pl) |
| JP (1) | JPS62143688A (pl) |
| DD (2) | DD284691A5 (pl) |
| DK (1) | DK371086A (pl) |
| PL (1) | PL158548B1 (pl) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NZ217916A (en) * | 1985-10-29 | 1990-03-27 | Lubrizol Genetics Inc | Recombinant vector including a self-incompatibility gametophytic plant gene and relevant dna |
| AU603778B2 (en) * | 1985-10-30 | 1990-11-29 | University Of Melbourne, The | Self-incompatibility gene |
| DK111089A (da) * | 1988-03-08 | 1989-09-09 | Kingroup Inc | Fremgangsmaade til fremstilling af plantecellelinier og plantehybrider |
| EP0436467A3 (en) * | 1989-12-29 | 1992-10-21 | Ciba-Geigy Ag | Expression of s-locus specific glycoprotein gene in transgenic plants |
| US5821094A (en) * | 1992-03-03 | 1998-10-13 | University Of Guelph | S-locus receptor kinase gene in a self-incompatible brassica napus line |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3485646D1 (de) * | 1983-05-27 | 1992-05-21 | Lubrizol Genetics Inc | Selbstunvereinbarkeits-glykoprotein. |
| NZ217916A (en) * | 1985-10-29 | 1990-03-27 | Lubrizol Genetics Inc | Recombinant vector including a self-incompatibility gametophytic plant gene and relevant dna |
-
1986
- 1986-07-31 EP EP86110620A patent/EP0212385A3/en not_active Withdrawn
- 1986-08-04 DD DD86332136A patent/DD284691A5/de not_active IP Right Cessation
- 1986-08-04 DD DD86293412A patent/DD280787A5/de not_active IP Right Cessation
- 1986-08-04 JP JP61184095A patent/JPS62143688A/ja active Pending
- 1986-08-04 DK DK371086A patent/DK371086A/da not_active Application Discontinuation
- 1986-08-05 PL PL1986260930A patent/PL158548B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK371086A (da) | 1987-02-06 |
| JPS62143688A (ja) | 1987-06-26 |
| EP0212385A2 (en) | 1987-03-04 |
| DD284691A5 (de) | 1990-11-21 |
| DK371086D0 (da) | 1986-08-04 |
| PL260930A1 (en) | 1987-04-06 |
| DD280787A5 (de) | 1990-07-18 |
| EP0212385A3 (en) | 1988-03-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Rotino et al. | Genetic engineering of parthenocarpic plants | |
| AU2011336603B2 (en) | Synthetic clonal reproduction through seeds | |
| Tsai et al. | Sequence of an S-protein of Lycopersicon peruvianum and comparison with other solanaceous S-proteins | |
| CA2213394C (en) | Method to obtain male sterile plants | |
| EP2517552B1 (en) | Improved pepper plant | |
| JPH10504706A (ja) | 雄性不稔植物の維持のためのアントシアニン遺伝子の使用 | |
| US5981833A (en) | Nuclear restorer genes for hybrid seed production | |
| US5053331A (en) | Self-incompatibility gene | |
| ES2243932T3 (es) | Secuencias de nucleotidos mediadores de la fertilidad masculina y procedimientos de utilizacion correspondientes. | |
| US5684242A (en) | Nuclear restorer genes for hybrid seed production | |
| Newton et al. | Involvement of S2 episomal sequences in the generation of NCS4 deletion mutation in maize mitochondria | |
| PL158548B1 (pl) | Sposób wytwarzania zasadniczo czystej sekwencji zasad DNA i c DNA PL | |
| AU671272B2 (en) | Regulation of plant genes | |
| EP1123977B1 (en) | GENES ENCODING PROTEINS REGULATING pH OF VACUOLES | |
| US11840693B2 (en) | Restorer plants | |
| US11312967B2 (en) | Restorer plants | |
| CN111087455B (zh) | 一种水稻育性相关蛋白OsSMARCAL1及其编码基因与应用 | |
| CN113943356A (zh) | 蛋白质phd11、其编码基因以及它们在选育玉米雄性不育系中的应用 | |
| CN112625099A (zh) | 油菜矮杆基因bnd2及其在油菜杂交育种中的应用 | |
| CN111875689A (zh) | 一种利用番茄绿茎紧密连锁标记创制雄性不育系的方法 | |
| US12281318B1 (en) | Tomato plants comprising transgenic event Del/Ros1-N | |
| CN114853856B (zh) | ClZISO基因在制备黄瓤西瓜中的应用以及在鉴定黄瓤西瓜中的应用 | |
| CN109371038A (zh) | 一个控制亚非稻杂种不育的基因s1a4及应用 | |
| Zhu et al. | Sequence analysis of a specific fragment associated with ogura cms in kale ('Brassica oleracea'var.'Acephala') | |
| WO2025151507A1 (en) | Compositions and methods for low glucosinolate brassica |