DD280977A1 - Verfahren zur herstellung von alpha-ergokryptin und ergosin - Google Patents
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Abstract
Um alpha-Ergokryptin und Ergosin in ausreichenden Mengen fuer die Therapie und fuer partialsynthetische Arbeiten zur Verfuegung zu stellen, wurde die Aufgabe gestellt, diese Alkaloide durch saprophytische Kultur eines Pilzstammes zu produzieren. Die Aufgabe wurde geloest, indem man zur Herstellung von alpha-Ergokryptin und Ergosin den Stamm Claviceps purpurea (Fr.) Tul. IBP 84, ZIMET 43 768, oder eine seiner Mutanten oder Varianten einsetzt. Der Stamm wird in aerober submerser Fermentation unter Verwendung von Naehrmedien, die assimilierbare Kohlenstoff-, assimilierbare Stickstoffquellen und Mineralsalze enthalten, bei einer Temperatur von 20-30C und einem p H-Wert von 4,0-6,4 kultiviert. Der Stamm bildet nach 7-14 Tagen Hauptkultur ein Gesamtalkaloidgemisch von 700-1 400 g/ml Kultursuspension, von denen 200-400 g/ml Kultursuspension Cyclolalkoloide sind. Mindestens 90% der Alkaloide sind aus dem Kulturfiltrat isolierbar. Die erhaltenen Cyclolalkaloide sind alpha-Ergokryptin/alpha-Ergokryptinin (80%) und Ergosin/Ergosinin (20%). Das Verhaeltnis ist durch Zufuetterung der fuer den jeweiligen Cyclolteil spezifischen Aminosaeure, Valin oder Alanin, steuerbar.
Description
Von den mehr als 50 bisher in der Natur gefundenen Mutterkornalkaloide!! besitzen die Alkaloide, bei denen an der Lysergsäure Cyclolstrukturen amidartig gebunden sind, die bisher größte Bedeutung in der Medizin. Zu den Vertretern dieser Gruppe gehört auch das alpha-Ergokryptin, dessen Cyclolteil von den Aminosäuren L-Prolin, L-Leucin und L-Valin gebildet wird, sowie das Ergosin, bei dem sich der Cyclolteil aus den Aminosäuren L-Alanin, L-Leucin und L-Prolin zusammensetzt. Beide Alkaloide sind von therapeutischem Interesse, wobei das alpha-Ergokryptin vor allem in seiner Dihydroform in verschiedenen Arzneimitteln enthalten ist. Alpha-Ergokryptin und Ergosin werden auch als Ausgangsprodukt für Partialsynthesen anderer medizinisch wertvoller Wirkstoffe, wie beispielsweise 2-Brom-alpha-ergokryptin und 2-Bromergosin eingesetzt.
Alpha-Ergokryptin ist Bestandteil des Alkaloidgemisches, das von einer Reihe von parasitisch wachsenden Stämmen der Art Claviceps purpurea (FR.) TuI. gebildet wird. Saprophytisch alpha-Ergokryptin bildende Stämme sind bisher nur wenige bekannt.
Ein Stamm, der Ergokryptin bildet, ist von italienischen Autoren beschrieben worden (z. B. CHPatent 485020). Er bildet 1100-1500mg Ergokryptin/I Kultursuspension. Angaben über das Verhältnis der beiden Isomeren alpha- und beta-Ergokryptin zueinander fehlen.
Einen Stamm mit der Fähigkeit, ein Gemisch aus Ergotamin und Ergokryptin zu bilden, beschreiben ebenfalls italienische Autoren (z. B. CH-Patent 489606). Ergotamin und Ergokryptin sind zu etwa gleichen Teilen in dem Alkaloidgemisch enthalten. Für die Alkaloidausbeuten sind bis zu 3800mg/l Kultursuspension angegeben. Das gebildete Ergokryptin ist eine Mischung der beiden Isomeren alpha- und beta-Ergokryptin.
Ungarische Autoren beschreiben zwei Verfahren, bei denen neben Ergometrin und Ergocornin bzw. neben Ergocornin Ergokryptin mit Anteilen von nur 20 bzw. 30% gebildet wird (z. B. HU-Patent 150631, DD-Patentschrift 105460). Auch hitr ist nicht angegeben, welchen Anteil am Ergokryptingemisch das alpha-Ergokryptin hat.
Durch Zufütterung der Vorstufen-Aminosäure L-Leucin in Mengen von mehr als 2-3 g/l Suspension ist es möglich, die Anteile an alpha-Ergokryptin zu ungunsten des beta-Ergokryptins und teilweise auch der anderen Cyclolalkaloide zu erhöhen (siehe z. B.
CS-Urheberschein 202613; H. Kobel und J. J. Sanglier bzw. C. Spalla und M. P. Mai nati in: „Antibiotics and other secondary metabolites, biosynthesis and production", eds.: R. Hütter, T. Leisinger, J. Nüesch, W. Wehrli, Academic Press 1978, pp. 233-242.
bzw. pp. 219-232; M. L. Bianchi et al., in: „Overproduction of microbial products", eds. V. Krumphanzl, B. Sikyta, Z. Vanek, Academic Press 1982, pp. 235-242).
Alle bisher genannten Verfahren besitzen den Nachteil, daß neben dem gewünschten alpha-Ergokryptin weitere schwer abtrennbare Cyclolalkaloide der Ergotoxingruppe, wie beispielsweise beta-Ergokryptin und Ergocornin gebildet werden, deren Anteil höher als 15-20% liegt. Dies erfordert einen verhältnismäßig hohen Aufwand bei der Isolierung und Reinigung des alpha-Ergokryptins.
Zur Herstellung von Ergosin sind folgende saprophytische Verfahren bekannt:
In einem britischen Patent ist beschrieben, daß durch Claviceps purpurea OKI88/72 neben Ergokryptin, Ergocornin und Ergometrin als Hauptalkaloide (30%, 28% bzw. 22%) auch Ergosin in Mengen von 5% gebildet wird IBrit. Patent 1401406).
In anderen Patenten wird die gleichzeitige Gewinnung von Ergocornin und Ergosin nebeneinander geschützt. Der geschützte Stamm bildet beide Alkaloide bzw. ihre Isomeren Ergocorninin und Ergosinin in etwa gleichen Mengen bei einem Gesamtalkaloidgehalt von etwa 900-1100Mg/ml Nährlösung (Brit. Patent 1184039).
In zwei weiteren Patenten ist die mikrobiologische Gewinnung eines von anderen Cyclolalkaloiden freien Ergosins beschrieben.
Als Begleitalkaloide treten Clavinalkaloide auf (etwa 10% der Gesamtalkaloide gegenüber 90% Ergosin/Ergosinin), die leicht abtrennbar sind (DD-Patentschriften 129801 und 151964).
Da Ergosin im Verhältnis zum alpha-Ergokrpytin nur in geringen Mengen zur Verfügung stehen muß, wäre es zweckmäßig, dieses Alkaloid mit Hilfe eines Stammes herzustellen, der das in großem Umfang benötigte alpha-Ergokryptin als Hauptalkaloid und Ergosin als Nebenalkaloid bildet, denn die erforderlichen kleineren Mengen an Ergosin rechtfertigen ökonomisch nicht die Gewinnung durch zusätzliche Fermentation eines speziellen Ergosin-Stammes. Ein Stamm, der alpha-Ergokryptin und Ergosin als einzige Cyclolalkaloide produziert, ist jedoch bisher nocht nicht bekannt.
Es ist das Ziel der Erfindung, die therapeutisch wichtigen Alkaloide alpha-Ergokryptin und Ergosin ökonomisch vorteilhaft zu produzieren, um sie für die medizinische Praxis sowie für Partialsynthesen in ausreichenden Mengen zur Verfügung zu stellen.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, ein Verfahren zu entwickeln, nach dem durch saprophytische Kultivation eines Pilzstammes gleichzeitig alpha-Ergokryptin und Ergosin herstellbar sind, wobei das Verfahren durch folgende Parameter charakterisiert sein soll:
1. alpha-Ergokryptin und Ergosin sind die einzigen produzierten Cyclolalkaloide.
2. Das Mengenverhältnis dieser Alkaloide beträgt bei einer Fermentation ohne spezifische Aminosäurezusätze durchschnittlich 80:20.
3. Dieses Verhältnis ist zugunsten des alpha-Ergokryptins oder des Ergosins steuerbar.
Erfindungsgemäß wird zur Herstellung von alpha-Ergokryptin und Ergosin der Stamm Claviceps purpurea (Fr.) TuI. IBP 84 oder eine seiner Mutanten oder Varianten verwendet.
Der Stamm Claviceps purpurea (Fr.) TuI. IBP 84 ist beim Zentralinstitut für Mikrobiologie und Experimentelle Therapie der Akademie der Wissenschaften der DDR in Jena unter der Bezeichnung ZIMET 43 768 hinterlegt. Er wächst auf bzw. in Modien, die assimilierbare C- und N-Quellen sowie Mineralsalze enthalten.
Die Kultivation zur Charakterisierung von Claviceps purpurea (Fr.) TuI. IBP 84, ZIMET 43768, erfolgt beispielsweise auf bzw. in den in Tabelle 1 zusamengestellten Medien. Der Stamm besitzt die folgenden makroskopischen und mikroskopischen Eigenschaften: Makroskopisches Aussehen: Alter der Kulturen: 4 Wochen Agarmedium: NL868
Rasen erhaben, meist gekräuselt, hellgrau bis grauviolett Einzelkolonien klein bis mittelgroß, etwa 5 mm hoch, scharf aufgesetzt, rund und napfkuchenförmig, hell bis hellbraun. Fluoreszenz im UV-Licht
Der Stamm bildet auf festen Medien keine Sektoren, da er homokaryotisch ist. Mikroskopisches Aussehen: Vorkultur NL849,7 Tage alt:
Lange, verzweigte Hyphen, septiert, Plasma gekörnelt, zentral oder wandständig. Durchmesser der Hyphen: 4-7Mm
Hauptkultur NL833,7 Tage alt:
Mycel mit langen, verzweigten Hyphen. Die Hyphen sind septiert, erscheinen körnig und haben zentral- oder wandständiges Plasma. Am Hyphenende treten gelegentlich blasige Anschwellungen auf. Durchmesser der Hyphen 5-7 μηη, der blasigen Anschwellungen 8-10pm.
Das Mycel enthält Lipidtröpfchen, deren Anteil in Produktionskulturen besonders hoch ist. Die Alkaloidsynthese erfolgt z. B. in aerober, submerser Kultur. Nach 7-14 Tagen bildet der Stamm 700-1400pg Gesamtalkaloidgemisch/ml Kultursuspension, von denen 200-400pg/ml Suspension Cycloalkaloide sind. Das alpha-Ergokryptin sowie dessen Strukturisomeres alpha-Ergokryptinin repräsentieren hierbei mindestens 80% des Cyclolalkaloidanteiles. Als weiteres Alkaloid der Cyclolgruppe wird nur Ergosin/Ergosinin gebildet.
Die Nährmedien enthalten eine oder mehrere assimilierbare C-Quellen, wie beispielsweise Saccharose, Glucose, Mannit, Sorbit, Glycerin, Zitronensäure, eine oder mehrere assimilierbare N-Quellen, wib beispielsweise Ammoniak, Asparagin, Pepton, Coseinhydrolysat, Harnstoff oder ein Ammoniumsalz, sowie Mineralsalze. Die Fermentation kann beispielsweise in Schüttelkolben oder in Fermentoren durchgeführt werden. Diese erfolgt ein- bis vierstufig, wobei es vorteilhaft ist, wenn die Vorkultur 5-8 Tage als und das Impfverhältnis Vorkultur:Hauptkultur 1:5 bis 1:20 ist. Die Hauptkultur zur Alkaloidproduktion dauert 7-14 Tage. Der pH-Wert kann zwischen 4,0 und 6,4, die Temperatur zwischen 20 und 300C liegen. Optimal ist eine Fermentation bei 22-25T und pH b,2-5,9.
Durch Zufütterung dercyclolteilspezifischen Aminosäuren Valin bzw. Alanin kann .nan das Verhältnis der beiden Cyclolalkaloide alpha-Ergokryptin und Ergosin zueinander zugunsten des jeweils bevorzugt benötigten Cyclolalkaloids steuern. So kann man beispielsweise durch Fütterung von L-Valin die Bildung von Ergosin zugunsten des alpha-Ergokryptins hahezu vollständig unterdrücken. Die Steuerung zugunsten des Ergosins erfolgt durch Fütterung von L-Alanin. Im allgemeinen verwendet man zur Steuerung nicht mehr als 6g der Aminosäure/l Kultursuspension.
Isolation und Reinigung des alpha-Ergokryptin/alpha-Ergokryptinins sowie des Ergosin/Ergosinins erfolgen auf den an sich bekannten Wegen, wobei mindestens 90% der Alkaloide aus dem Kulturfiltrat isolierbar sind.
Dadurch, daß aus der Gruppe der Ergotoxine nur ein Alkaloid, das alpha-Ergokryptin, im Cyclolalkaloidgemisch enthalten ist, sind keine komplizierten Trennungen notwendig. Das alpha-Ergokryptin und das Ergosin bzw. deren Isomeren sind auf bekannten Wegen, z. B. durch Chromatographie, voneinander trennbar.
Die bei der Aufarbeitung anfallenden isomeren Alkaloide alpha-Ergokryptin und alpiia-Ergokryptinin bzw. Ergosin und Ergosinin können auf übliche einfache Weise ineinander überführt werden.
Die Stammhutung ist über Schrägagarkulturen, durch Tiefkühllagerung unter Verwendung an sich bekannter Schutzkolloide oder durch lyophilisierte Konserven auf übliche Weise möglich.
Das neue Verfahren zeichnet sich dadurch aus, daß in einer Fermentationszeit von 7-14 Tagen ein Alkaloidgemisch gebildet wird, das an Cyclo'alkaloiden nur alpha-Ergokryptin und Ergosin (sowie deren Isomeren alpha-Ergokryptinin und Ergosinin) in einem Mengenverhältnis von durchschnittlich 80:20 enthält, wobei mindestens 90% der Alkaloide in das Kulturfiltrat ausgeschieden werden. Ein weiterer Vorteil besteht darin, daß dieses Mengenverhältnis der gebildeten Cyclolalkaloide durch Zufütterung der cyclolteilspezifischen Aminosäuren L-Valin oder L-Alanin steuerbar ist. Der Stamm ist, wie auch seine Varianten und Mutanten, gekennzeichnet durch Stabilität, ein homokaryotisches Mycel und gute Fermontationseigenschaften.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung erläutern. Die verwendeten Nährmedien sind Tabelle 1 zu entnehmen.
Ausführung ibolspiele
Ausgehend von einer Gefrierkonserve des Stammes Claviceps purpurea (Fr.) TuI. IBP84, ZIMET 43768, werden Vorkulturen in oOOrnl-Stehrundkolben mit 100ml NL849 beimpft. Nach 7 Tagen Inkubation auf einem Rundschwingtisch (240Upm) dienen sie zum Beimpfen von Hauptkulturen mit 100ml NL833 in 500ml-Stehrundkolben (Impfverhältnis 1:10).
Nach 10tägiger Inkubation unter den gleichen Bedingungen enthalten die Kulturen 1044 pg Gesamtalkaloidgemisch/ml Suspension, von denen 305pg Cyclolalkaloide sind. Die Cyclolfraktion enthält alpha-Ergokryptin als Hauptalkaloid neben Ergosin.
Vorkulturen vom Beispiel 1 werden im Verhältnis 1:10 in jeweils 100 ml NL833 H überimpft. Nach 12 Tagen Inkubation (s. Beispiel 1) enthalten diese Kulturen 773pg Gesamtalkaloidgemisch/ml, von denen 213pg/ml Cyclolalkaloide sind mit 85% alpha-Ergokryptin als Hauptalkaloid und 15% Ergosin.
5 Vorkulturen von Beispiel 1 dienen als Impfmaterial für 5I Medium NL833 in einem Laborfermentor. Nach 12tägiger Fermentation bei 230C und bei einer Durchmischungsrate von 300-500Upm sowie einer Belüftungsrate von 1,4-7 vvm enthält die Suspension
812pg Gesamtalkaloide/ml bzw.
225pg Cyclolalkaloide mit 90% alpha-Ergokryptin und 10% Ergosin.
Ein nach den Angaben des Beispiels 3 kultivierter Fermentor mit 5I NL833H enthält nach 10 Tagen Fermentation in der Suspension 708 pg Gesamtalkaloide/ml bzw., 210pg Cyclolalkaloide mit 84% alpha-Ergokryptin und 16% Ergosin.
Vorkulturen vom Beispiel 1 werden im Verhältnis 1:10 in jeweils 100ml NL833in 500ml-Stehrundkolben übertragen. Parallel zu unbehandelten Kontrollkolben werden einzelne Kolben mit 2,3,4 und 6g L-Valin/I Medium bzw. mit 3g L-Alanin/I Medium gefüttert. Nach 12 Tagen Inkubation (s. Beispiel 1) können folgende Werte ermittelt werden:
| Gesamt- | Cyclol | % alpha-Ergo | % Er | |
| alkaloide | alkaloide | kryptin | gosin | |
| (pg/ml) | (pg/ml) | im Cyclolalkaloidgemisch | ||
| Kontrolle | 1067 | 380 | 80 | 20 |
| Zusatz von 2 g/l L-VaMn | 1012 | 384 | 92 | 8 |
| Zusatz von 3 g/l L-Valin | 979 | 3ü4 | 94,5 | 5,5 |
| Zusatz von 5 g/l L-Valin | 862 | 227 | 100 | 0 |
| Zusatz von 3 g/l L-Alanin | 1034 | 272 | 73,3 | 26,7 |
Z'jr Identifizierung der Cyclolalkaloide alpha-Ergokryptin und Ergosin wird die Kultursuspension mit Ammoniaklö sung alkalisiert und die Mischung mehrmals mit Chloroform homogenisiert. Die organischen Phasen werden gesammelt, getrocknet und im Vakuum zur Trockne eingeengt.
Nach dem Aufnehmen eines aliquoten Teiles des Rückstandes mit 0,5%iger Weinsäure wird die Mischung über eine kurze (0,5cm χ 2cm) MNCollulose-Säule filtriert und das Filtrat unter folgenden Bedingungen einer HPLC-Untersuchung unterworfen.
Bedingungen: Säule vom Typ Si 100 Polyol RPS (Serva, 4,6mm = mm);
Fließmittel: Methanol:Wasser:Triethylamin - 60:40:1; Detektion bei 312nm.
Durch Zumischen von reinem alpha-Ergokryptin bzw. Ergosin werden die Peaks identifiziert. Durch Berechnung der Peakflächen ist eine quantitative Bestimmung der Einzelkomponenten möglich. Zur Eichung dienen Reinstalkaloide.
Ein weiterer Teil des zur Trockne eingeengten Extraktes wird einer DC-Kontrolle nach Rochelmeyer unterworfen.
Trägermaterial: Kieselgel PF254 „Merck" Schichtdicke 0,7mm Laufmittel: CHCI3JC2H5OH = 9:1 Nachweis auf der Platts: UV-Löschung Die entsprechenden Zonen werden von der Platte abgekratzt und mit van Urk-Reagenz angefärbt. Nach UV-Bestrahlung und Abzentrifugation des Kieselgels wird in einem Fotometer bei 570nm die Extinktion bestimmt und durch Vergleich mit ainer Eichkurve der Alkaloidgehalt ermittelt.
Zusammensetzung der verwendeten Nährlösungen (Angaben in g/l)
| N L 849 | NL 833 | NL 868 | NL 833 H | |
| Saccharose | 300,0 | 300,0 | 100,0 | 300,0 |
| Magermilch" | 100ml | - | 100 ml | - |
| Ammoniumeitrat | ΊΟ,Ο | 20,0 | 10,0 | - |
| Harnstoff | - | - | - | 5,0 |
| Ca(NO3I2 | - | 1.0 | - | 1.0 |
| KH2PO4 | 0,25 | 0,25 | 0,25 | 0,25 |
| MgSO4-7 H2O | 0,3 | 0,3 | 0,3 | 0,3 |
| FeSO4-7 H2O | - | 0,010 | - | 0,010 |
| ZnSO4-7 H2O | - | 0,0308 | - | 0,0308 |
| Agar | - | - | 30,0 | - |
| Aquadest. ad | 1 000,0 | 1 COO1O | 1 000,0 | 1 000,0 |
| pH vor dem | ||||
| Sterilisieren | 5,4 | 5,4 | 5,5 | 5,4 |
| pH-Einstellung mit | NaOH | NaOH | NaOH | NaOH |
| Sterilisation jeweils einheitlich 30min bei 1101C |
1 Die Milch muß getrennt sterilisiert werden.
Claims (6)
- Patentanspruch:1. Verfahren zur Herstellung von alpha-Ergokryptin und Ergosin, dadurch gekennzeichnet, daß man den Stamm Claviceps purpures (Fr.) TuI. IBP 84, ZIMET 43768, oder eine seiner Mutanten oder Varianten verwendet.
- 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den Stamm Claviceps purpurea (Fr.) TuI. IBP 84, ZIMET43768, in aerober, submerser Kultur in einem Nährmedium, das mindestens eine assimilierbare Kohlenstoffquelle, eine assimilierbare Stickstoffquelle und Mineralsalze enthält, bei einer Temperatur von 20-3O0C und einem pH-Wert zwischen 4,0 und 6,4 während eines Hauptkultur-Zeitraumes von 7-14 Tagen fermentiert und die gebildeten Cyclolalkaloide alpha-Ergokryptin/ alpha-Ergokryptinin und Ergosin/Ergosinin auf an sich bekannte Weise aus der Kultursuspension isoliert.
- 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Fermentation bei 22-25°C und bei pH5,2-5,9 durchführt.
- 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man das Verhältnis der hergestellten Cyclolalkaloide durch Zufütterung von cyclolteilspezifischen Aminosäuren in Mengen bis zu 6g/l Kultursuspension steuert.
- 5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man das Verhältnis der hergestellten Cyclolalkaloide alpha-Ergokryptin und Ergosin durch Zufütterung von L-Valin zugunsten des alpha-Ergokryptins steuert.
- 6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man das Verhältnis der hergestellten Cyclolalkaloide alpha-Ergokryptin und Ergosin durch Zufütterung von L-Alanin zugunsten des Ergosins steuert.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD28951886A DD280977A1 (de) | 1986-04-23 | 1986-04-23 | Verfahren zur herstellung von alpha-ergokryptin und ergosin |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD28951886A DD280977A1 (de) | 1986-04-23 | 1986-04-23 | Verfahren zur herstellung von alpha-ergokryptin und ergosin |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DD280977A1 true DD280977A1 (de) | 1990-07-25 |
Family
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DD28951886A DD280977A1 (de) | 1986-04-23 | 1986-04-23 | Verfahren zur herstellung von alpha-ergokryptin und ergosin |
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| Country | Link |
|---|---|
| DD (1) | DD280977A1 (de) |
-
1986
- 1986-04-23 DD DD28951886A patent/DD280977A1/de not_active IP Right Cessation
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