DD234172A3 - Verfahren zur herstellung von ergotamin - Google Patents
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Abstract
Es wird die Gewinnung des Alkaloids Ergotamin mit Hilfe des Stammes Claviceps purpurea (Fr.) Tul. IBP 74, IMET PA 135, seiner Mutanten oder Varianten beschrieben. Dieser neue Stamm bildet ein Gesamalkoloidgemisch von 900-1 500 mg pro ml Kulturloesung, von dem mindestens 50% der Alkaloide mit organischen Loesungsmitteln ausschuettelbar sind. Neben dem Ergotamin bzw. seinem Isomeren Ergotaminin (zusammen mehr als 75-80% des ausschuettelbaren Alkaloidanteils) werden Chanoclavin (10-15%), Ergometrin (5-6%), Ergosin (Spuren - max. 4%), Ergokryptin (5%) und gegebenenfalls andere Clavine in Spuren gebildet. In dem Naehrmedium befindet sich auch Lysergsaeure. Der Stamm wird in aerober Fermentation in einem fluessigen Naehrmedium, welches eine assimilierbare Kohlenstoffquelle, eine assimilierbare Stickstoffquelle und Mineralsalze enthaelt, in emerser und/oder submerser Kultur bei einer Temperatur von 20-30C und einem p H-Wert von 4,0-6,2 waehrend eines Zeitraumes von 7-35 Tagen kultiviert. Mehr als 95% der gebildeten Alkaloide werden in das Naehrmedium abgegeben, aus dem man die Alkaloide isoliert.
Description
Von den über 50 bisher bekannten natürlichen Mutterkornalkaloiden besitzen die Vertreter der Peptidgruppe eine große Bedeutung in der Medizin. Die bekanntesten Vertreter sind Ergotamin, Ergocornin, Ergokryptin und Ergocristin. Das Ergotamin bewirkt vor allem einen Anstieg des Blutdruckes, eine Verstärkung und Beschleunigung der Uteruskontraktion und eine Hemmung der adrenergischen Nervenfasern. Es wird in der Gynäkologie und inneren Medizin angewandt. Daneben besteht die Möglichkeit der partialsynthetischen Abwandlung, insbesondere zur Erschließung neuer Indikationen.
Den Stand der Technik zur saprophytischen Ergotamingewinnung bestimmen heute drei Verfahren.
Der Stamm Claviceps purpurea (Fr.) TuI. ATCC 15383 bildet 900-1450£ig Ergotamin pro ml Kultursuspension. Die Alkaloide (Ergotamin/Ergotaminin) sind bei diesem wie auch bei den anderen zu diskutierenden Verfahren sowohl in der Kulturlösung als auch im Mycel verteilt (BRD-AS 1210128).
In einem anderen Verfahren wird mit Hilfe des Stammes Claviceps purpurea Fl 32/17 ein Alkaloidgemisch aus Ergotamin und Ergokryptin bzw. deren Isomeren Ergotaminin und Ergokryptinin in Mengen von 1 200-3800/xg Alkaloid pro ml Kultursuspension gebildet, wobei der Anteil der beiden Alkaloide Ergotamin und Ergokryptin etwa gleich hoch angegeben wird (BRD-OS 1792038).
Der Stamm Claviceps purpurea OKI 56/70 bildet in saprophytischer Kultur zwischen 1 300 und 1 850^,g Alkaloide pro ml Kultursuspension, von denen etwa 80% Ergotamin/Ergotaminin sind (Ungar. Pat. 161 654).
Alle Verfahren habenden Nachteil, daß zur Isolierung der Alkaloide die gesamte Kultursuspension aufgearbeitet werden muß. In der Notwendigkeit der Extraktion der Alkaloide sowohl aus dem Nährmedium als auch aus dem Mycel besteht ein technischer Nachteil dieser Verfahren. Ein weiterer Nachteil des zweiten der genannten Verfahren ist das Vorhandensein von zwei verwandten Peptidalkaloiden, dem Ergotamin und dem Ergokryptin, in gleichen Mengen, so daß aufwendige Trennverfahren eingeschaltet werden müssen.
Es ist das Ziel der Erfindung, nach einem günstigen Verfahren das Alkaloid Ergotamin herzustellen und damit verstärkt der Verwendung in der Medizin zuzuführen.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung von Ergotamin zu entwickeln, bei dem die Isolierung des Alkaloids nur aus dem Nährmedium erfolgt und das die aufwendige Abtrennung verwandter Peptidalkaloide nicht erfordert. Hierzu sind Stämme zu isolieren, die
1. in der Lage sind, saprophytisch Ergotamin zu bilden, das nahezu frei ist von Nebenalkaloiden der Peptidgruppe,
2. die gebildeten Alkaloide zu mehr als 95% in das umgebende Nährmedium ausscheiden und
3. sich durch Stabilität, gute Alkaloidproduktion und günstige Fermentationseigenschaften auszeichnen. Erfindungsgemäß werden zur Herstellung von Ergotamin der Stamm Claviceps purpurea (Fr.) TuI. IBP 74, seine Mutanten oder Varianten verwendet.
Der neue Stamm Claviceps purpurea (Fr.) TuI. IBP 74 ist beim Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie der Akademie der Wissenschaften der DDR in Jena unter der Bezeichnung IMETPA 135 hinterlegt. Er bildet ein Gesamtalkaloidgemisch (ca. 900-1 500/i.g/ml Kulturlösung), von dem mindestens 50% der Alkaloide in organische Lösungsmittel ausschüttelbar sind und davon wiederum mehr als 75-80% durch das Isomerenpaar Ergotamin/Ergotaminin repräsentiert werden. Als Begleitalkaloidesind im Gemisch enthalten:
Chanoclavin 10-15 % des ausschüttelbaren Anteils,
Ergometrin 5-6% des ausschüttelbaren Anteils,
Ergosin Spur-4% des ausschüttelbaren Anteils,
Ergokryptin 5 % des ausschüttelbaren Anteils,
andere Clavine teilweise in Spuren.
In den Nährmedien verbleibt nach dem Ausschüttel.i u.a. auch Lysergsäure. Die Alkaloide lassen sich auf bekannten Wegen aus dem Nährmedium isolieren. Eine Umwandlung der isomeren Alkaloide ineinander ist möglich.
Der neue Stamm zeichnet sich dadurch aus, daß er mehr als 95% der gebildeten Alkaloide in die umgebenden Nährmedien abgibt und daß die Begleitalkaloide relativ leicht abtrennbar sind.
Die Kultivation zur Charakterisierung von Claviceps purpurea (Fr.) TuI. IBP 74, IMET PA 135, erfolgte auf bzw. in den in Tabelle 1 zusammengestellten Medien. Der neue Stamm besitzt die folgenden makroskopischen und mikroskopischen Eigenschaften:
Alter der Kulturen: 3 Wochen
Agar NL126: Flacher, hellbrauner Rasen, feinwollig, braun, gefaltet.
Einzelkolonien: 0 0,8-1,3cm, scharf aufgesetzt, hellbraun, feinwollig.
Schwache Fluoreszenz im UV-Licht
Agar NL 829: Rasen erhaben, stark gefaltet, Oberseite graubraun, scharf aufgesetzter Rand.
Einzelkolonien: 0 0,8-1,3cm, Höhe bis 1 cm. Napfkuchenförmig, scharf aufgesetzt. Oberseite graubraun, Unterseite: junge Kolonien gelbbraun, alte Kolonien mittelbraun. Fluoreszenz im UV-Licht.
Vorkultur NL 849: 3 Tage alt— relativ kurze, stark verzweigte Hyphen. Die Hyphen sind mehr oder weniger deutlich septiert, stark gekörnelt, mit leicht knotenstockartigen Verdickungen, vereinzelt Arthrosporen. Länge der Hyphen 50-200μ,ιτι, blasige
Verdickungen ΙΟμ,Γη
Hauptkultur NL 833: 7 Tage alt— Mycel mit langen verzweigten Hyphen. Hyphenwand normal, nicht besonders auffällig, septiert. Hyphen „körnig", Plasma zentral oder wandständig. Blasige Anschwellungen, meist am Hyphenende. Vereinzelt Sporen
(Chlamydo- oder Arthrosporen), Hyphen-0 5-7μ,Γη, 0 der blasigen Anschwellungen: 8-10/xm. 14 Tage alt— Mycel mit langen verzweigten Hyphen, stark septiert. Plasma zentral oder wandständig. Hyphen-0 5-7μ.ιτι.
Knotenstockartige Verdickungen 8-12/xm. Vereinzelt Arthrosporen.
Das Mycel enthält Lipidtröpfchen, deren Anteil in alkaloidproduzierenden Kulturen besonders hoch ist. Die Kultivation erfolgte bei 24+10C. Die Schüttelkulturen wurden auf Rundschütteltischen bei 240 UpM inkubiert. Die aerobe Fermentation des Pilzes zur Produktion erfolgt zweckmäßigerweise in flüssigen Nährmedien in emerser und/oder submerser Kultur. Die Nährmedien enthalten eine assimilierbare C-Quelle, wie beispielsweise Saccharose, Glucose, Mannit, Sorbit, Glycerin, Zitronen- oder Bernsteinsäure, eine assimilierbare N-Quelle, wie beispielsweise Ammoniak, Asparagin, Pepton, Caseinhydrolysat oder ein Ammoniumsalz, sowie Mineralsalze. Die Fermentation kann beispielsweise in Fernbach-, Erlenmeyer- oder Schüttelkolben oder im Fermenter erfolgen.
Die Kultivation erfolgt zweckmäßigerweise ein-bis dreistufig. Es ist vorteilhaft, wenn die Vorkultur 4-14 Tage alt und das Impfverhältnis Vor-:Hauptkultur =1:5 bis 1:20 ist. Die Hauptkultur beträgt 7-20 Tage. Der pH-Wert kann zwischen 4,0 und 6,2, die Temperatur zwischen 20 und 300C liegen
Optimal ist eine Fermentation bei 22-25°C und pH 5,2-5,9.
Die Stammerhaltung kann über Röhrchen, Protoplastenkultivation oder durch Tiefkühllagerung unter Verwendung von Schutzkolloiden, wie z. B. 60%ige Saccharoselösung:Magermilch 2:1, auf übliche Weise erfolgen.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung erläutern. Die verwendeten Nährmedien sind Tabelle 1 zu entnehmen. Beispiel 1:
Ausgehend von Konserven des Stammes Claviceps purpurea (Fr.) TuI. IBP 74 wurden Vorkulturen von 100ml Medium NL 849 in 500-ml-Schüttelkolben beimpft. Die Kolben wurden 7 Tage bei 24 + 10C bei 240UpM bebrütet. 10% der erhaltenen Kulturen dienten dazu, 500-ml-Kolben mit je 100ml Medium NL 833 zu beimpfen. Nach 14tägiger Bebrütung unter den beschriebenen Bedingungen enthielten die Kulturen 1450^g/ml Kulturlösung Alkaloid der oben genannten Zusammensetzung.
Ausgehend von der im Beispiel 1 genannten Vorkultur in NL 849 wurden zwei Vorkulturen im gleichen Medium angesetzt. Das Impfverhältnis betrug auch diesmal 1:10. Nachdem durch 7tägige Kultur das Impfmaterial angezogen war, wurde es zur Beimpfung eines Fermenters mit 2,Ol NL 833 im Verhältnis 1:10 mit diesen zweiten Vorkulturen beimpft.
Temperatur: 240C
Rührgeschwindigkeit: 280—450 UpM, variiert nach Zuwachsrate
Luftstrom: 0,2-0,65 l/min, je nach Dichte des gewachsenen Mycels.
Nach 12 Tagen waren 900/ng Gesamtalkaloid/ml Kulturlösung gebildet.
Zur Identifizierung der Alkaloide wurden 1-5 ml der Nährmedien alkalisiert und dreimal mit Chloroform extrahiert. Der Extrakt wird zurTrockne gebracht, in wenig Chloroform aufgenommen und durch präparative Schichtchromatographie an Kieselgel mit Fluoreszenzindikator getrennt. Als Lösungsmittelsystem wird Chloroform :Äthanol (9:1) verwendet. Die Alkaloidzonen werden von der Platte abgetrennt, mit einer Mischung von Wasser:Methanol:Eisessig (45:45:10) aufgenommen, im Verhältnis 2:4 mit van Urk's Reagenz versetzt, unter einer Quarzlampe 5 Minuten bestrahlt, zentrifugiert und die Extinktion im Photometer bestimmt. Die Alkaloidmengen können Eichkurven entnommen werden. Von Parallelproben der präparativen Schichtchromatographie können die dem Ergotamin bzw. Ergotaminin zuzuordnenden Zonen getrennt eluiert und der Identifizierung zugeführt werden. Besonders geeignet sind: Massenspektrometrie (m/e: 581 (M+), 314, 296, 286, 271, 267,244, 223,221,215,180,167,153,131,125), UV-, IR-, NMR-Spektroskopie, chromatographische Methoden sowie saure Hydrolyse und Nachweis der charakteristischen Aminosäuren Prolin und Phenylalanin. Bei alkalischer Hydrolyse ist Lysergsäure (aus Ergotamin) bzw. lsolysergsäure (aus Ergotaminin) nachweisbar.
Zusammenstellung der verwendeten Nährlösungen (Angaben in g/l).
N L 849
NL 720
N L
NL126
NL829
Saccharose Magermilch Bierwürze Ammoniumeitrat Asparagin Hefeextrakt Ca(NO3I2 KH2PO4
(NH4I2HPO4 MgSO4-7 H2O FeSO4-7H2O ZnSO4 -7 H2O
Aquadest. ad Agar-Agar pH vor dem Sterilisieren pH-Einstellung mit Autoklavieren
| 300,0 | 200,0 | 300,0 | — | 100,0 |
| 10OmI | — | — | — | — |
| — | — | — | 150ml | — |
| 10,0 | 15,0 | 20,0 | 1,0 | — |
| — | — | — | — | 10,0 |
| — | — | — | 5,0 | 0,5 |
| — | 1,0 | 1,0 | — | 1,0 |
| 0,25 | 0,25 | 0,25 | — | 0,25 |
| — | — | — | 5,0 | — |
| 0,3 | 0,3 | 0,3 | — | 0,25 |
| — | 0,010 | 0,010 | — | 0,020 |
| — | 0,0308 | 0,0308 | — | 0,02 |
| — | 0,1 | — | — | — |
| 000,0 | 1 000,0 | 1 000,0 | 1 000,0 | ' 1 000,0 |
| — | — | — | 30,0 | 30,0 |
| 5,4 | 5,8-6,0 | 5,4 | 6,0 | 5,4 |
| aOH | NaOH | NaOH | NaOH | NaOH |
Jeweils einheitlich 30 min bei 110 0C.
Claims (3)
1. Verfahren zur Herstellung von Ergotamin, dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm Claviceps purpurea (Fr.) TuI. IBP 74, IMET PA 135, seine Mutanten oder Varianten verwendet werden.
2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm Claviceps purpurea (Fr.) TuI. IBP 74, IMETPA 135, in aerober Fermentation in einem flüssigen Nährmedium, welches eine assimilierbare Kohlenstoffquelle, eine assimilierbare Stickstoffquelle und Mineralsalze enthält, in emerser und/oder submerser Kultur bei einer Temperatur von 20-30°C und einem pH-Wert von 4,0-6,2 während eines Zeitraumes von 7-35 Tagen kultiviert und das gebildete Ergotamin/Ergotaminin aus dem Nährmedium auf an sich bekannte Weise isoliert wird.
3. Verfahren nach den Punkten 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Fermentation bei 22-250C und pH 5,2-5,9 durchgeführt wird.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD21723579A DD234172A3 (de) | 1979-07-16 | 1979-07-16 | Verfahren zur herstellung von ergotamin |
| CS794080A CS258001B1 (en) | 1979-07-16 | 1980-11-20 | Method of ergotamine production |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD21723579A DD234172A3 (de) | 1979-07-16 | 1979-07-16 | Verfahren zur herstellung von ergotamin |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DD234172A3 true DD234172A3 (de) | 1986-03-26 |
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ID=5521316
Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
| DD21723579A DD234172A3 (de) | 1979-07-16 | 1979-07-16 | Verfahren zur herstellung von ergotamin |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| CS (1) | CS258001B1 (de) |
| DD (1) | DD234172A3 (de) |
-
1979
- 1979-07-16 DD DD21723579A patent/DD234172A3/de unknown
-
1980
- 1980-11-20 CS CS794080A patent/CS258001B1/cs unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CS258001B1 (en) | 1988-07-15 |
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