DD281735A7 - Verfahren zur enzymatischen synthese von l(-)-carnitin - Google Patents
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Die Erfindung betrifft die enzymatische Synthese von * Das Ziel der Erfindung besteht darin, ein Verfahren anzugeben, das in oekonomisch vorteilhafter Weise die Herstellung von * auf biochemischen Weg erlaubt, wobei Nachteile anderer Methoden ueberwunden werden. Die Aufgabe wird darin gesehen, mit dem aufgezeigten neuen Verfahren die Synthese von * aus Crotonobetain ohne Nebenproduktbildung in guter Ausbeute zu ermoeglichen, wobei die Reaktionsbedingungen unkompliziert sein sollen. Erfindungsgemaesz wird die Aufgabe dadurch geloest, dasz das Enzym Carnitinhydrolyase aus Staemmen der Familie der Enterobacteriaceae isoliert und an einen Traeger immobilisiert wird. Dieses Enzym katalysiert die Synthese von * aus Crotonobetain, wobei die Umsetzung zu g-Butyrobetain unterbunden ist.{* Crotonobetain; g-Butyrobetain; Escherichia coli; Enterobacteriaceae; Enzymisolierung; Carnitinhydrolyase; Enzymimmobilisierung; Saeulenchromatographie; Carnitinmetabolismus}
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung des optisch-aktiven L(-)- bzw. R(-)-Carnitins aus einer optisch inaktiven Vorstufe.
!.(-!-Carnitin (L(-)-3-Hydroxy-4-trimethylaminobutyrat) ist eine im Tierreich ubiquitär verbreitete und auch bei höheren Pflanzen sowie zahlreichen Mikroorganismen nachgewiesene Verbindung. Es ist einerseits essentieller Bestandteil des mitochondrialem Fettsäureabbaus, andererseits ein Speicher von Acetylgruppen im Organismus. Da die innere Mitochondrienmembran für aktivierte fettsäuren impermeabel ist, werden diese in Form von Carnitinestern unter Beteiligung verschiedener Enzyme aus dem Zytosol in die Mitochondrienmatrix transportiert. Dort finden die Prozesse der ß-Oxidation der Fettsäuren unter Energiegewinnung statt.
Bei einem Mangel an L(-)-Carnitin infolge von Störungen in der Biosynthese, bei der Resorption bzw. Exkretion oder mikrobieller Fehlbesiediung des Darmes wird die mitochondriale ß-Oxidation gehemmt und Carnitinmangelsyndrome in Form von Muskeldystrophien, Lipidspeichermyopathien usw. entstehen (Übersicht: „Carnitine biosynthesis, metabolism, and functions" Hrsg. R.A.Fraenkel und J. D. McGarry, Academic Press 1980; Pathology 17 [1985] 116-169). Betroffene Patienten werden durch Applikation von L(-)-Carnitin behandelt. Dies gilt auch für Patienten mit chronischer Niereninsuffizienz. Bei einem Molekulargewicht von 161,2 wird endogenes L(-)-Carnitin den Patienten mit dem Dialysat ausgewaschen und so ein sekundärer Carnitinmangel induziert. Orale Substitution oder L(-)-Carnitinzugabe zur Spüllösung verhindern die Carnitindepletion bei diesen Patienten. In jüngster Zeit werden auch der therapeutische Einsatz von L(-)-Carnitin bei der Behandlung von Herzinfarkt, Hyperlipämie und Ketosis (Ann. Rev. Nutr. 6 [1986] 41-66) diskutiert.
Ein therapeutischer Einsatz von racemischen D.L-Carnitin, das bei der chemischen Totalsynthese entsteht, ist aus heutiger Sicht nicht vertretbar. Im Unterschied zu dem physiologischen L(-)-Carnitin hat D(+)· Carnitin keinen Effekt auf die Fettsäureoxidation. Die für die Funktion des L(-)-Carnitins notwendigen Transportieren.. Carnitmacetyltransferase (EC 2.3.1.7) und Carnitinpalmitoyltransferas?. (EC 2.3.1.21) sowie die Carnitin-Acylcarnilin-Translokase sind spezifisch für L(-)-Carnitin und Acyl-M-I-Carnitin und werden durch das D-Isomere gehemmt (J. Biol. Chem. 240 [1965] 2188-2192; Proc. Nat. Acad. Sei. USA 72 [1975] 883-887). D(+)-Carnitin führt zuder> durch Austausch an der Plasmamembran zu einer funktionell relevanten L(-)-Carnitinverarmung der Skelett- und Herzmuskulatur (Life Sciences 28 [1981] 2931-2933). Dieser D(+)-Carnitin-induzierte sekundäre L(-)-Camitinmangel antagonisieit die eigentlichen Therapieziele einer Carnitinsubstitution. D(-f !-Carnitin ist auch ausschließlich für das Auftreten von Myasthenie gravis-artigen Symptomen bf i mit D,L-Carnitin substituierten anurischen Patienten unter intermittierender Dialysebehandlung verantwortlich 'Lancet I [1979] 1041-1042).
D(+)-Carnitin ist somit nicht nur wirkungslos, sondern zeiltoxisch, speziell in der Sr.elettmuskulatur und im Myokard. Klinisch sollten deshalb nur D(+)-Camitin-freie L(-)-Carnitinpräparate verwendet werden. L(-)-Carnitin hat weiterhin stimulierende Einflüsse auf das Wachstum verschiedener Mikroorganismen. Für mehrere Hefest' mme der Gattungen Zygosacharomyces, Candida, Pichia, Saccharomyces, Rhodotorula, Torulopsis, Trichosporon und Saccharomycopsis wurde der wachstumsstimulierende Effekt des Carnitins bei der Kultivierung dieser Stämme auf Kohlenwasserstoffen, aber auch anderen
C-Quellen (JP 73128,724) nachgewiesen. Ähnliche Effekte werden für verschiedene Acinetobacter- und Pseudomonas-Species sowie Enterobacteriaceae (DD-PS 204105), aber auch einige obligat und fakultativ methylotrophe Bakterien (DD-PS 211039) beschrieben.
In den ersten 60 Jahren nach der Entdeckung des Carnitine wurde dieses in aufwendigen Isolierungs- und Reinigungsarbeiten aus Muskelgewebe gewonnen. Eine günstigere Möglichkeit, größere Mengen an L-Carnitin zu gewinnen, ist die Racematspaltung von chemisch synthetisiertem D,i.-Carnitin. Mittels zahlreicher Kristallisationsschritte unter Einsatz optischaktiver Trennsäuren ist en möglich, sowohl verschiedene D.L-Carnitinderivate, wie D,L-Carnitinnitril und D,L-Carnitinamid, als auch D,L-Carnitin in freier Betainform in die reinen Enantiomere zu trennen. Als Trennsäure finden insbesondere die optischen Isomere der Weinsäure, der Camphersäure und der Camphersulfonsäure Anwendung (z. B. DD-PS 2317; DD-PS 93347; DE-OS 2927672).
Möglich sind auch Racematspaltungen auf enzymatischer Basis. Ein Verfahren besteht in der chemischen Acetylierung von D,L-Carnitin und anschließender Spaltung des Acetyl-D-carnitins mittels immobilisierter Acetylcholinesterase aus Zitteraal (Biotechnol. Bioeng. 26 [1984] 911-915). Auch die Racemataufspaltung mit Hiife der L(-)-spezifischen Carnitinacetyltransferase (EC 2.3.1.7) ist möglich (FEBS Lett. 54 [1975] 21-25, J. Org. Chem. 51 [1986] 2842-2844). Zur Herstellung von Acetyl-L-carnitin werden allerdings mindestens stöchiometrische Mengen an Acetyl-Coenzym A benötigt.
Der Einsatz von Acetyl-Coenzym A und gereinigter Acetylcholinesterase macht diese Verfahren zu teuer, um industrielle Bedeutung zu erlangen.
In der Patentschrift WO 8504,900 wird ein Mikroorganismus beschrieben, der das Verhalten von Acinetobacter calcoeceticus zeigt und der bei der Kultivierung auf D,L-Carnitin nur das D-Carnitin metabolisiert. Das gebildete L-Carnitin kann rr it einer Ausbeute von 38% aus der Kulturflüssigkeit isoliert werden.
Allen chemischen Synthesen mit anschließender Racematspaltung haftet der weitere Nachteilen, daß von der synthetisierten Substanz selbst nur maximal 50% als !.(-!-Carnitin isoliert werden können. In den letzten Jahren wurde dieser Nachteil durch stereospezifische Synthesen aus achiralen Vorstufen umgangen: In der US-PS 4,221,869 wird die Rückreaktion der Carnitindehydrogenase (EC 1.1.1.108) genutzt, um Dehydrocarnitin zu L(-)-Carnitin zu hydrieren. Das Enzym wurde aus Bakterien der Pseudomonas fluorescens-Gruppe gewonnen. Für die Reaktion sind jedoch weitere Biochemikalien und Hilfsenzyme zur Regenerierung des NADH notwendig, z. B. Glukosedehydrogenase oder Alkoholdehydrogenase. Erschwerend kommt hinzu, daß das Dehydrocarnitin sehr instabil ist und spontan in Acetonyltrimethylammonium und CO2 zerfällt. In der DE-OS 3123975 wird ein enzymatisches Verfahren zur Herstellung von L(-)-Carnitin aus γ-Butyrobetain beschrieben, wobei die γ-Butyrobetainhydroxylase (EC 1.14.11.1) aus dem Schimmelpilz Neurospora crassa eingesetzt wird. Bei dieser Dioxygenasereaktion muß dem Ansatz noch a-Ketoglutarat, ein Reduktionsmittel, wie z. B. Ascorbinsäure und Katalase zugesetzt werden. Die y-Butyrobetainhydroxyiase wird nach Kultivierung des Pilzes, Isolierung und Reinigung der Sporen aus diesen durch Behandlung mit Detergenzien, mechanische Vorrichtungen oder Ultraschall-Desintegratoren gewonnen. Weitere Verfahren beruhen auf dem Einsatz von Crotonobetain als achirale Ausgangsverbindung.
In den EP 121,444 und EP 122,794 sind eine Vielzahl von Miki ^Organismen beschrieben, die in unterschiedlicher Ausbeute während der Kultivierung oder als ruhende Zellen unter aerooen Bedingungen Crotonobetain in L(-)-Carnitin umwandeln. L(-)-Carnitin kann in einer maximalen Ausbeute von 39% gewonnen werden.
Die in den DD-PS 221905; JP 6167,494, JP 61,234,794 wnd JP 61,234,788 beschriebenen Verfahren beruhen auf dem Einsatz verschiedener Stämme der Enterobacteriaceae, die unter anaeroben Bedingungen L(-)-Carnitin in γ-Butyrobetain mit Crotonobetain als Intermediat umsetzen. Die erste Teilreaktion, die zur Bildung von Crotonobetain führt, ist reversibel und kann für die Synthese von L(—!-Carnitin genutzt werden. In der erstgenannten Patentschrift wurde insbesondere auf die Eignung von E. coli 044 K74 für die anaerobe L-(-)-Carnitinsynthese hingewiesen und Verfahrensbedingungen ausgearbeitet. In J. Basic Microbiol., Vol. 27, {1987), S. 131 beziehen sich Jung et al. auf die Möglichkeit der stereospezifischen Synthese von L(-)-Carnitin aus Crotonobetain auf der Grundlage eines bis dahin hypothetischen Enzyms. Nachteilig für diese Verfahren ist, daß die Ausbeuten relativ niedrig sind, da ein Teil des Crotonobetains in Richtung γ-Butyrobetain sowohl bei wachsenden als auch bei ruhenden Zellen abVI'eßt. Zur Verminderung dieser Reaktion müssen zusätzlich entsprechende Elektronenakzeptoren, wie z. B. Nitrat oder Fumarat dem Reaktionsmedium zugesetzt werden. In den EP 158,194; EP 195,944 und JP 61,199,793 sind Verfahren beschrieben, die auf der Produktion von L(-)-Carnitin aus Crotonobetain oder γ-Butyrobetain mittels Kultivierung selektionierter Mikroorganismen auf einer zusätzlichen C-Quelle, wie z. B. L-Glutamat oder Glycinbetain in Anwesenheit von Crotonobetain oder γ-Bu ty robet.iin, beruhen
Von Nachteil istdaiiei der erhebliche Aufwand zur Aufarbeitung der verdünnten L(-)-Carnitin-haltigen Kulturflüssigkeit.
Zf der Erfindung
Das Ziel der Erfindung ist die Darstellung eines Verfahrens, das in ökonomisch vorteilhafter Weise die Herstellung von L(-)-Carnitin auf biochemischen Weg erlaubt, wobei Nachteile anderer Methoden überwunden werden.
Darlegung des Wesens der Erfindung
Die Erfindung hat die Aufgabe, ein neues Verfahren aufzuzeigen, welches die Synthese von L(-)-Carnitin aus Crotonobetain ohne Nebenproduktbildung in guter Ausbeute ermöglicht, wobei die Reaktionsbedingungen unkompliziert sein sollen. Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß das Verfahren der mikrobiellen Synthese von L(-)-Carnitin in Teilschritte aufgelöst wird. Das für den ersten Teilschritt verantwortliche Enzym Carnitinhydrolyase wird angereichert und von
der Reduktase, die die 2.Teilreaktion katalysiert, getrennt. So wird erreicht, daß aus Crotonobetain ausschließlich (.(-!-Carnitin entsteht, weil eine Umsetzung zu γ-Butyrobetain unterbunden wird.
Die zur erfindungsgemäßen Durchführung des Verfahrens geeigneten Stämme gehören zur Familie der Enterobacteriaceae, insbesondere sind geeignet Pioteus, Citrobacter, Escherichia, Salmonella ο.dgl. Bevorzugt werden verwendet:
Einer der am besten geeigneten Bakterienstämme ist Escherichia coli 044 K74, der unter entsprechend gewählten Kultivierungsbedingungen hohe Ausbeuten an Carnitinhydrolyase gewährleistet.
E. coli 044 K74 wird in einem Komplexmedium oder Minimalmedium unter Zusatz von D.L-Carnitin oder Crotonobetain oder eines ihrer Salze unter anaeroben Bedingungen 6-24 Stunden, vorzugsweise 8-16 Stunden zur Induktion der Carnitinhydrolyase kultiviert. Die gewonnenen Zellen werden durch mechanische oder Ultraschallbehandlung aufgeschlossen. Dem zellfreien Extrakt wird Ammoniumsulfat bis zu einer Sättigungskonzentration von 25-40% zugesetzt. Die mittels Zentrifugation geklärte Proteinlösung wird an Phenylsepharose 4B hydrophob gebunden. Diese Form der immobilisierten Carnitinhydrolyase kann bereits in diskontinuierlicher oder kontinuierlicher Weise zur Synthese von L(-)-Carnitin genutzt werden, wenn sie mit einer Crotonobetain-haltigen Lösung, der lösliche proteinfreie Zellbestandteile von E. coli 044 K74 zugesetzt wurden, in Kontakt, gebracht wird. Nach einer bestimmten Inkubationszeit (5-30min) bzw. einer Durchflußrate von 1-100 ml/h wird L(-)-Carnion aus Crotonobetain gebildet (Tabellen I, II, III). Das nicht umgesetzte Crotonobetain kann nach Abtrennung des L(-)-Carnitins erneut zur Reaktion gebracht werden; ebenso ist der für die Aktivität der Carnitinhydrolyase notwendige lösliche Faktor wiederverwendbar. Zur Erhöhung des Verhältnisses von gebundener Carnitinhydrolyase pro ml Phenylsepharose (Tabelle IV) sowie zur Erhöhung der Stabilität des Enzyms wird die partiell angereicherte Carnitinhydrolyase über weitere Reinigungsstufen (Chromatographie an Phenylsepharose, Hydroxy !apatit und DEAE-Sepharose) angereichert. Das angereicherte Produkt wird mit Ammoniumsulfat bis zu einer Sättigung von 25-40 % versetzt und an Phenylsepharose 4 B immobilisiert. Dieses immobilisierte Enzym wird in eine Säule gefüllt und für die kontinuierliche Synthese von L(-)Carnitin aus Crotonobetain eingesetzt. Die L(-)-Carnitinbildung aus Crotonobetain mittels immobilisierter Carnitinhydrolyase ist ein temperatur- und pH-abhängiger Prozeß. Gute Umsätze werden bei Temperaturen von 25-4O0C, vorzugsweise 370C, sowie bei pH-Werten von 6,0-9,0, vorzugsweise 7,5 erreicht. Crotonobetain, die Ausgangsverbindung dieses Verfahrens, bzw. eines seiner Salze wird nach einem der bekannten Verfahren hergestellt:
1. Abspaltung von Wasser aus D,L-Carnitin und D-Carnitin mittels Schwefelsäure oder Essigsäureanhydrid oder Eliminierung der Säure aus den O-Acyl-D,L- bzw. -D-Carnitinen,
2. Permethylierung von 4-Aminocrotonsäure mittels Methylhalogeniden,
3. Anlagerung von Trimethylamin an 4-Halogencrotonsäure.
lonenaustauschchromatographie erfolgen, wie es in „Recent research on carnitine" (Ed. G.Wolf) S. 11-21 (1065) bzw. in der
mittelkettiger Fettsäuren. O-Acylcarnitine lassen sich durch Extraktion der wäßrigen Phase mit n-Butanol oder Isobutanol vom
anschließender Behandlung mit Kationenaustauschern möglich.
(Methoden der enzymatischen Analyse, Akademie-Verlag, Berlin 1970,1714).
1. D(+)-Carnitin-freie L(-)-Carnitinpräparate können gewonnen werden.
2. Die Synthese von L(-)-Carnitin aus Crotonobetain erfolgt ohne Nebenproduktbildung.
3. Die Synthese von L(-)-Carnitin mit Hilfe der Carnitinhydrolyase benötigt keine zusätzlichen Biochemikalien oder weitere Hilfsenzyme.
4. Der Aufwand für Ausgangssubstanzen, Medien und Energie ist minimal.
Die Kultivierung von Escherichia coli 044 K74 erfolgt submers in einem 5-l-Gefäß, welches bis zum Rand mit einem Carnitinhaltigen Komplexmedium (20g pankreatisches Pepton, 5g NaCI und 3g D,L-Carnitin · HCI pro I aqua dest.) gefüllt ist. Es wird mittels NaOH ein pH von 7,5 eingestellt. Beimpft wird mit 250 ml einer aeroben Vorkultur (E = 1,8 bei λ = 600 nm, d = 1 cm) unter Verwendung des genannten Komplexmediums ohne Carnitinzusatz. Das Kulturgefäß wird luftdicht verschlossen und 8h bei 370C inkubiert. Die Bakterien werden danach durch Zentrifugation für 15min bei 6000 χ g und 4°C geerntet und zweimal mit Phosphatpuffer (0,067 M, pH 7,5) gewaschen. Die Zellen werden mit Alcoa (10 min reiben bei 40C) aufgeschlossen. Das Protein wird mittels 40ml Phosphatpuffer (0,05M, pH 7,5) extrahiert und durch Zentrifugation für 30min bei 15000 x g und 4°C zentrifugiert. Für die Immobilisierung der Carnitinhydrolyase werden 15 ml gut abgesetzte Phenylsepharose verwendet, die vorher mit 200 ml einer 30%igen (NH4)2SO4-Lösung in Phosphatpuffer (0,05 M, pH 7,5) gewaschen worden war. Der Proteinextrakt
wird mit der Phenylsepharose gemischt und 15min vorsichtig gerührt. Nicht gebundenes Material wird über eine Glasfritte G 3 von der Phenylsepharose getrennt.
Die Phenylsepharose wird danach mit 60ml einer 30%igen (NH4)2SO4-Lösung in Phosphatpuffer (0,05M, pH 7,5) versetzt. Das Filtrat wird mit dem Waschpuffer vereinigt und durch Amiconfiltration (Membran YM 5) von Protein befreit. Die auf diese Weise hergestellte Lösung wird im folgenden als Lösung F bezeichnet. Auf diese Weise werden 5 U Carnitinhydrolyase pro ml Phenylsepharose immobilisiert. Für die Synthese von L(-)-Carnitin aus Crotonobetain wird das immobilisierte Enzym mit einer Lösung von 5mmol/l Crotonobetain in F in Kontakt gebracht. Die Inkubation erfolgt unter Rühren bei 37°C. Nach verschiedenen Inkubationszeiten wird das synthetisierte L(—!-Carnitin mit einer Glasfritte G 3 vom Gel getrennt. Die Bildung von L(—!-Carnitin in Abhängigkeit von der Zeit ist in Tabelle I dargestellt.
Die Synthese von L(-)-Carnitin mittels gemäß Beispiel 1 an Phenylsepharoso immobilisierter Carnitinhydrolyase wird bei verschiedenen Crotonobetainkonzentrationen durchgeführt. Hierfür wird das immobilisierte Enzym mit der jeweiligen Crotonobetainlösung in Lösung F für30min bei 370C unter Rühren inkubiert. Nach erfolgter Inkubation wird die L(-)-Carnitinhaltige Lösung mittels einer Glasfritte G3 vonGel getrennt (Tabelle II).
Gemäß Beispiel 1 an Phenylsepharose immobilisierte Carnitinhydrolyase wird in eine Säule (1 cm x 6cm) gefüllt. Mittels einer Peristaltikpumpe wird kontinuierlich Crotonobetain gelöst in Lösung F aus einem Vorratsgefäß über die Säule gepumpt. Säule wie auch Vorratsgefäß werden auf 370C temperiert. Die Synthese von L(-)-Carnitin aus Crotonobetain in Abhängigkeit von der Fließgeschwindigkeit und der Crotonobetainkonzentration ist in Tabelle III dargestellt.
Es werden Bakterien einer 10-l-Kultur gemäß Beispiel 1 kultiviert, geerntet und mittels Alcoa aufgeschlossen. Die Extraktion des Proteins erfolgt mit 100ml Phosphatpuffer (0,05M, pH 7,5). Alcoa sowie nicht aufgeschlossene Zellen werden durch Zentrifugation für 30min bei 15000 χ g und 40C abgetrennt. Dem Überstand werden tropfenweise über einen Zeitraum von 30min unter Rühren 33,3ml einer 100%igen(NH4)jSO4-Lösung zugesetzt. Nach 15min Rühren wird für 30min bei 15000 xg und 4°C zentrifugiert. Der so erhaltene Überstand wird auf eine Phenylsepharosesäule (2 χ 15cm) aufgetragen. Die Säule ist vorher mit 200 ml einer 25%igen (NH4)2SO4-Lösung in Phosphatpuffer (0,05 M, pH 7,5) äquilibriert worden. Nach Auftragen der Proteinlösung wird die Säule mit 100ml des Äquilibrationspuffers gewaschen. Das Eluat wird bei 280nm an einem Spektrophotometer vermessen. Alle Fraktionen, die ein ΔΕ > 30 (bei d = 1 cm) aufweisen, werden vereinigt. Diese Lösung wird mittels Amiconfiltration (Membran YM 5) von Protein befreit. Die proteinfreie Lösung wird im folgenden als Lösung F' bezeichnet. Die Elution der Carnitinhydrolyase von der Phenylsepharosesäule erfolgt mit einer 15%igen Lösung von (NH4I2SO4 in Phosphatpuffer (0,05M, pH 7,5). Es werden 4-ml-Fraktionen gesammelt. Die Elutionsgeschwindigkeit beträgt 50 ml/h. Die vereinigten, aktiven Fraktionen werden gegen 51 Phosphatpuffer (0,01 M, pH 7,5) 12h dialysiert. Die dialysierte Proteinlösung wird auf eine Hydroxylapatitsäule (1,5cm x 7cm) aufgetragen, die vorher mit 100ml Phosphatpuffer (0,01 M, pH 7,5) äquilibriert wird. Nach waschen mit 500ml Phosphatpuffer (0,01 M, pH 7,5) wird die Carnitinhydrolyase mittels Phosphatpuffer (0,03M, pH 7,5) eluiert. Es werden 3-ml-Fraktionen gesammelt. Die Elutionsgeschwindigkeit beträgt 20ml/h. Die vereinigten aktiven Fraktionen werden danach auf eine DEAE-Sepharosesäule (0,9cm χ 10cm) aufgetragen. Die Säule wird mit 50ml Phosphatpuffer (0,03M, pH7,5) gewaschen. Die Elution der · Carnitinhydrolyase erfolgt mit einem linearen Phosphatgradienten (0,03-0,30ml/l Phosphatpuffer, pH 7,5). Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und mittels Amiconfiltration (Membran YM 5) auf 3ml eingeengt. Dieser Lösung werden 1,3 ml einer 10%igen Ammoniumsulfatlösung zugesetzt. Nach 30min Rühren wird die Lösung mit 1 ml Phenylsepharose gemischt und weitere 30min gerührt. Danach wird mit 10ml einer 30%igen Ammoniumsulfatlösung in Phosphatpuffer (0,05mol/l, pH 7,5) gewaschen. Die so präparierte Phenylsepharose enthält pro ml Gel 4OU immobilisierte Carnitinhydrolyase. Das an Phenylsepharose gebundene Enzym wird in eine Säule (0,8cm x 2,0cm) gefüllt. Über diese Säule wird mittels einer Peristaltikpumpe Crotonobetain, gelöst in Lösung F', mit einer Geschwindigkeit von 3,6ml/h geleitet. Die Arbeitstemperatur beträgt 37°C. Tabelle IV zeigt die Synthese von L(-)-Carnitin bei verschiedenen Crotonobetainkonzentrationen.
Es wird wie in Beispiel 1 unter Verwendung von Proteus vulgaris verfahren. Bei Inkubation des aus diesem Stamm isolierten und an Phenylsepharose immobilisierten Enzyms mit einer Lösung von 5mmol/l Crotonobetain in F werden nach 30min 3mmol/l LH-Carnitin gebildet.
Es wird wie im Beispiel 1 unter Verwendung von Citrobacter freundii verfahren. Bei Inkubation des aus diesem Stamm isolierten und an Phenylsepharose immobilisierten Enzyms mit einer Lösung von 5mmol/l Crotonobetain in F werden nach 30min 2,3mmol/l L(-)-Carnitin gebildet.
| Inkubationszeit | μΓηοΙ/ml | • Synthese von L(-)-Carnitin |
| min | L(-)-Carnitin (Mmol) .q2 | |
| 0,80 | Crotonobetain (Mmol) | |
| 1 | 1,45 | 16 |
| 3 | 2,25 | 29 |
| 5 | 2,70 | 43 |
| 10 | 3,25 | 54 |
| 20 | 3,35 | 65 |
| 30 | 67 | |
., . ., . L{-)-Carnitin(umol) Λη1
0,5 0,3 60
1,0 0,68 68
5,0 3,2 64
10,0 6,5 65
20,0 10,0 50
| Crotonobetain | Fließgeschwindigkeit | Synthese von M-) | •Carnitin |
| Mmol/ml | ml/h | μΓηοΙ/ml | L(-)-Carnitin (Mmol) , |
| 1 | 20 | 0,4 | Crotonobetain (Mmol) |
| 10 | 0,6 | 40 | |
| 5 | 0,65 | 60 | |
| 5 | 20 | 1,5 | 65 |
| 10 | 2,25 | 30 | |
| 5 | 2,9 | 45 | |
| 10 | 20 | 2,4 | 58 |
| 10 | 4,0 | 24 | |
| 5 | 5,0 | 40 | |
| 50 |
Mmol/ml ml/h
1 30
15 5
5 30
15 5
| Mmol/ml | !.(-!•Carnitin (Mmol) |
| 0,55 | Crotonobetain (Mmol) |
| 0,65 | 55 |
| 0,63 | 65 |
| 2,45 | 63 |
| 2,75 | 49 |
| 3,00 | 55 |
| 60 |
Claims (7)
1. Verfahren zur enzymatischen Synthese von L(-)-Camitin aus einer Crotonobetain-Lösung mit einer Konzentration von 1-IOmmol/l bei 25-4O0C und einem pH-Wert von 6-9 mit Hilfe katalysierender Bestandteile von Stämmen der Familie der Enterobacteriaceae, wie Proteus, Citrobacter, Escherichia o. dgl., insbesondere der Stämme E. coli 044 K74,055 K59,0111 K58 oder 0114 K90, dadurch gekennzeichnet, daß die Crotonobetain-Lösung über immobilisierte Carnitinhydrolyase geleitet wird, die mit einem bei der Kultivierung der Stämme anfallendem, nicht an üblicherweise in der hydrophoben Chromatographie verwendeten Trägermaterialien, wie Phenylsepharose, bindendem proteinfreien Extrakt, der Lösung F, aktiviert ist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Lösung F der Crotonobetain-Lösung zugesetzt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß eine Carnitinhydrolyase verwendet wird, die durch Kultivieren von E. coli auf einem carnitinhaltigen Komplexmedium erhalten worden und an Phenylsepharose immobilisiert ist.
4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein bei der Immobilisierung des Enzyms nicht gebundenes und von Protein durch Amiconfiltration befreites Material als Lösung F verwendet wird.
5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß Crotonobetain bei einer Konzentration von 5 mmol/l bei einer Temperatur von 370C, einer Fließgeschwindigkeit von 6 ml/h und einem pH-Wert von 7,5 in Anwesenheit des enzymaktivierenden Faktors F über eine Säule mit immobilisierter Carnitinhydrolyase geleitet wird.
6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren kontinuierlich durchgeführt wird.
7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß nicht umgesetztes Crotonobetain nach Abtrennung von L(-)-Carnitin in den Kreislauf zurückgeführt wird.
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD30824387A DD281735A7 (de) | 1987-10-26 | 1987-10-26 | Verfahren zur enzymatischen synthese von l(-)-carnitin |
| ES88830425T ES2051890T3 (es) | 1987-10-26 | 1988-10-19 | Procedimiento para aislar la enzima carnitinhidroliasa de cepas pertenecientes a la familia enterobacteriaceae y empleo de la enzima inmobilizada para producir l(-)-carnitina. |
| AT8888830425T ATE105021T1 (de) | 1987-10-26 | 1988-10-19 | Verfahren zur isolierung des enzyms karnitinhydrolyase von zur familie der enterobakteriaceae gehoerenden staemmen und verwendung des immobilisierten enzyms zur herstellung von l(- )karnitin. |
| EP88830425A EP0320460B1 (de) | 1987-10-26 | 1988-10-19 | Verfahren zur Isolierung des Enzyms Karnitin-Hydrolyase von zur Familie der Enterobakteriaceae gehörenden Stämmen und Verwendung des immobilisierten Enzyms zur Herstellung von L(-)Karnitin |
| US07/261,858 US4906568A (en) | 1987-10-26 | 1988-10-25 | Process for isolation of carnitinehydrolyase and an effector from enterobacteriaceae and use thereof to prepare carnitine |
| JP63270616A JPH01144996A (ja) | 1987-10-26 | 1988-10-26 | カルニチンヒドロリアーゼの分離方法およびｌ（−）−カルニチン合成への利用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD30824387A DD281735A7 (de) | 1987-10-26 | 1987-10-26 | Verfahren zur enzymatischen synthese von l(-)-carnitin |
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ID=5593296
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19749480A1 (de) * | 1997-11-08 | 1999-05-20 | Univ Leipzig | Verfahren zur Herstellung von L-Carnitin aus Crotonobetain |
-
1987
- 1987-10-26 DD DD30824387A patent/DD281735A7/de not_active IP Right Cessation
Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
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