DD281919A7 - Verfahren zur herstellung eines enzyms - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft die Herstellung von Carnitinhydrolyase. Das Ziel der Erfindung besteht darin, ein von Seim et al. postuliertes Enzym aufzufinden, zu isolieren und zu charakterisieren. Die Aufgabe wird darin gesehen, durch Einsatz einer mikrobiellen Enzymquelle in Zusammenwirken mit einer effektiven Reinigungstechnologie das gewuenschte Enzym mit hoher spezifischer Aktivitaet und frei von stoerenden Fremdaktivitaeten zur Verfuegung zu stellen. Erfindungsgemaesz wird die Aufgabe dadurch geloest, dasz das als Carnitinhydrolyase bezeichnete Enzym aus Staemmen der Familie der Enterobacteriaceae nach anaerober Kultivierung in Gegenwart von Carnitin sowie Zellaufschlusz aus der Rohenzymloesung in hoher Reinheit hergestellt wird.{Carnitin; Crotonobetain; g-Butyrobetain; Escherichia coli, Enterobacteriaceae, Enzymherstellung; Carnitinhydrolyse; Crotonobetainreduktase; Zellaufschlusz; Saeulenchromatographie}
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Enzyms, das im folgenden als Carnitinhydrolyase bezeichnet wird. Dieses Enzym kann zur Synthese von L(-)-Carnitin aus dem optisch inaktiven Crotonobetain eingesetzt werden.
Verschiedene Mikroorganismen aus der Familie der Enterobacteriaceae sind unter anaeroben Bedingungen in der Lage, Carnitin zu γ-Butyrobetain umzusetzen, wobei Crotonobetain als Intermediat auftritt (Z. allg. Mikrobiol. 20 [1980] 591-594). Dabei werden die genannten Betaine weder als C- noch als N-Quelle genutzt. Für die beschriebene Metabolisierung von Carnitin wird die Existenz zweier Enzyme postuliert (Actabiol. med. germ. 41 [1982] 1009-1018). Danach ist die erste Teilreaktion, die Dehydratisierung von L(-)-Carnitin zu Crotonobetain, vermutlich an die Existenz einer Lyase gebunden. Für die Reduktion von Crotonobetain zu γ-Butyrobetain wird eine Reduktase verantwortlich gemacht. Die Carnitinmetabolisierung durch Enterobacteriaceae ist bisher nur mit ganzen Zellen untersucht worden (FEMS Microbiol. Lett. 13 [1982] 201-205, Arch. Microbiol. 132 [1982] 91-95, J. Basic Microbiol. 27 [1987] 131-137). Arbeiten zur Reinigung und Charakterisierung der postulierten Lyase liegen bisher nicht vor.
Die Erfindung hat das Ziel, das von Seim et al. postulierte Enzym aufzufinden, zu isolieren und zu charakterisieren.
Die Erfindung hat die Aufgabe, durch Einsatz einer mikrobiellen Enzymquelle in Zusammenwirken mit einer effektiven Reinigungstechnologie das gewünschte Enzym mit hoher spezifischer Aktivität und frei von störenden Fremdaktivitäten zur Verfügung zu stellen. Dabei soll nach einem einfachen Aufschlußverfahren eine Aktivität des Enzyms im Proteinrohextrakt von mindestens 0,05 U/mg erzielt werden und eine Anreicherung mit Hilfe von in der Proteinreinigung üblichen Methoden auf Werte bis zu 5U/mg möglich sein.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß das im folgenden als Carnitinhydrolyase bezeichnete Enzym aus Enterobacteriaceae wie
Escherichia, zum Beispiel E. coli 044 K74
E. coli 055 K 59
Е.СОІІ0111К58
E. coli 0114 K90 Proteus,zum Beispiel P. vulgaris
P. mirabilis
Citrobacter, zum Beispiel C. freundii
Salmonella,zum Beispiel S. typhimurium LT2
S. anatum
S. Cottbus
hergestellt wird. Überraschenderweise sind diese Stämme in der Lage, Carnitinhydrolyase bei Einhaltung bestimmter Kultivierungsbedingungen in annehmbaren Ausbeuten zu produzieren.
Die Stammhaltung geschieht bevorzugt auf Nährbouillon-Il-Agar (20g/l). Die Agarröhrchen werden 8h bei 37°C inkubiert und bei 40C gelagert. Die Kultivierung der Stämme erfolgt submers in Komplex- oder Minimalmedium unter Zusatz von Glycerol (1-50mmol/l), vorzugsweise 20mmol/l), Fumarsäure (1-50mmol/l, vorzugsweise 20mmol/l) und D,L-Camitin (1-100mmo)/l, vorzugsweise 20mmol/l) oder Crotonobetain (1-IOOmmol/l, vorzugsweise 10mmol/l) oder eines ihrer Salze, wobei die Carnitinhydrolyase in ausreichendem Maße induziert wird. Nach einer Inkubationszeit von 6-24 h (vorzugsweise 8-15 h) unter anaeroben Bedingungen bei einer Temperatur von 20-450C {vorzugsweise 37"C) werden die Zellen durch Zentrifugation geemtet. Nach Waschen mit Phosphatpuffer werden die Zellen durch Reiben in Gegenwart von Alcoa aufgeschlossen. Der Proteinrohextrakt wird in Phosphatpuffer aufgenommen und durch Zentrifugation von Alcoa und noch vorhandenen ganzen Zellen getrennt. Danach wird dem Proteinrohextrakt Ammoniumsulfat bis zu einer Sättigungskonzentration von 25% zugesetzt. Nach Zentrifugation wird das Enzym aus dem Überstand mittels Chromatographie an Phenylsepharose, Hydroxylapatit, DEAE-Sepharose oder DEAE-Zellulose sowie Gelfiltration über Sephadex G 100 isoliert. Das gewonnene Enzym ist inaktiv. Für seine Reaktivierung ist ein Effektor (F) notwendig, der während der Präparation der Carnitinhydrolyase gewonnen wird. Er wird auf der Stufe der Chromatographie an Phenylsepharose vom Enzym getrennt und mittels Ultrafiltration (Amiconultrafiltrationszelle, Membran YM 5) von Protein befreit. Die Zugabe von F zum isolierten Enzym führt sofort zur Aktivierung der Carnitinhydrolyase. Unter den genannten Bedingungen wird eine Anreicherung des Enzyms bis auf eine spezifische Aktivität von etwa 5 U/mg erreicht. Das erfindungsgemäß hergestellte Enzym ist bei 4°C mehrere Monate lagerfähig. Die Erfindung soll nachsthend an einem Ausführungsbeispiel näher erläutert werden.
Ausführungsbeispiel 1
Die Kultivierung von Escherichia coli 044 K74 erfolgt submers in einem 10-l-Gefäß, welches bis zum Rand mit einem Carnitinhaltigen Medium (Pankreatisches Pepton 20g/l, NaCI 5g/l, Glycerol 10ml/l, Fumarsäure 2g/l, D,L-Carnitin · HCI 3g/l) gefüllt ist. Es wird mit NaOH ein pH von 7,5 eingestellt. Beimpft wird mit 500ml einer aeroben Vorkultur in Komplexmedium (Pankreatisches Pepton 20g/l, NaCI 5g/l) aus der exponentiellen Wachstumsphase. Die Animpfdichte liegt bei ЛЕёоотлт ~ 0,08. Das Kulturgefäß wird luftdicht verschlossen und für 8 h bei 37°C stehen gelassen. Zur Isolierung des Enzyms werden die Bakterien nach beendeter Inkubation durch Zentrifugation für 15min bei 6000 x g und 4°C geerntet und zweimal mit 0,067 M Phosphatpuffer pH 7,5 gewaschen. Die Zellen werden mit Alcoa (10min Reiben bei4°C) aufgeschlossen. Das Protein wird mit 0.05M Phosphatpuffer (pH 7,5) extrahiert und durch Zentrifugation für 30min bei 15000 χ g und 4°C von Alcoa und nicht aufgeschlossenen Zellen getrennt. Dem so gewonnenen Proteinrohextrakt wird Ammoniumsulfat bis zu einer Sättigungskonzentration von 25% zugesetzt. Nach 30min Rühren bei 4°C wird der Proteinrohextrakt bei 15000 χ gfür 30min zentrifugiert. Der gewonnene Überstand wird auf eine Phenylsepharosesäule (2x15cm) aufgetragen, die mit einer 25%igen Ammoniumsulfatlösung in 0,05M Phosphatpuffer (pH 7,5) äquilibriert ist. Danach wird die Säule mit 150 ml der25%igen Ammoniumsulfatlösung gewaschen. Alle hierbei gewonnenen Fraktionen, die ein ДЕгвсГпт > 30 aufweisen, werden vereinigt und die Lösung mittels Ultrafiltration (Amiconultrafiltrationszelle, Membran YM 5) von Protein befreit. Die gewonnene Lösung wird im folgenden als Lösung F bezeichnet. Die Carnitinhydrolyase wird mit einer 15%igen Ammoniumsulfatlösung von der Phenylsepharosesäule eluiert. Die Elutionsgeschwindigkeit beträgt 50 ml/h. Es werden 3,5 ml Fraktionen gesammelt. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und 12 h gegen 510,01 M Phosphatpuffer (pH 7,5) dialysiert. Die dialysierte Proteinlösung wird auf eine mit 0,01 M Phosphatpuffer (pH 7,5) äquilibrierte Hydroxylapatitsäule (1,5 x 10cm) aufgetragen. Nach Waschen der Säule mit Phosphatpuffer wird das Enzym mit 0,03 M Phosphatpuffer, pH 7,5, von der Säule eluiert und die aktiven Fraktionen vereinigt. Die Elutionsgeschwindigkeit beträgt 20ml/h. Es werden 3ml Fraktionen gesammelt. Die gewonnene Enzymlösung wird auf eine Säule (0,9cm χ 10cm) aufgetragen, die mit DEAE-Sepharose CL 6ß gefüllt ist. Diese Säule ist mit 0,03 M Phosphatpuffer, pH 7,5, äquilibriert und wird nach dem Auftragen der Proteinlösung auch mit 50ml dieses Puffers gewaschen. Die Elution des Enzyms erfolgt mittels eines 200-ml-Gradienten von 0,03M-0,30M Phosphatpuffer pH 7,5. Die Elutionsgeschwindigkeit beträgt 20m!/h. Es werden 2,5-ml-Fraktionen gesammelt. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und mittels Ultrafiltration (Amiconultrafiltrationszelle, Membran YM 5) auf 2 ml eingeengt. Die konzentrierte Proteinlösung wird auf eine Sephadex G 100 Säule (1,5cm x 45cm) aufgetragen, die mit 0,05M Phosphatpuffer pH 7,5 äquilibriert ist. Die Elution des Enzyms erfolgt mit 0,05M Phosphatpuffer pH 7,5. Die Elutionsgeschwindigkeit beträgt 12ml/h. Es werden 2-ml-Fraktionen gesammelt. Die vereinigten aktiven Fraktionen werden mittels Ultrafiltration (Amiconultrafiltrationszelle, Membran YM 5) auf 5ml eingeengt. Zur Aktivierung des präparierten Enzyms wird dem jeweiligen Reaktionsansatz 50% (v/v) Lösung Fzugesetzt. Die so gewonnene Carnitinhydrolyase ist bis zu einer spezifischen Aktivität von 4,95U/mg angereichert. Die Präparationsschritte sind in Tabell 1 zusammengefaßt.
Reinigung der Carnitinhydrolyase aus Escherichia coli 044 K74
| Reinigungs | Gesamt | spez. Ak | Gesamtak | Ausbeute | Anrei |
| stufe | protein | tivität | tivität | (%) | cherung |
| (mg) | (U/mg) | (U) | 100 | ||
| Rohextrakt | 4140 | 0,050 | 207 | 90 | — |
| Überstand | 3957 | 0,047 | 186 | 1 | |
| nach Sätti | |||||
| gung mit 25% | |||||
| (NH4J2SO4 | 49 | ||||
| Phenyl- | 1010 | 0,100 | 101 | 2 | |
| sepharose | 35 | ||||
| Hydroxyl- | 162 | 0,450 | 73 | 9 | |
| apatit | 29 | ||||
| DEAE-Sepha- | 46 | 1,250 | 58 | 25 | |
| rose | 25 | ||||
| Gelfiltration | 11 | 4,75 | 52 | 95 | |
Ausführungsbeispiel 2 Man verfährt wie in Beispiel 1 beschrieben, kultiviert jedoch den Stamm Proteus vulgaris. Nach Isolierung und Anreicherung des Enzyms erhält man Carnitinhydrolyase mit einer spezifischen Aktivität von 5,2 U/mg.
Man verfährt wie in Beispiel 1 beschrieben, kultiviert jedoch den Stamm Citrobacter freundii. Nach Isolierung und Anreicherung des Enzyms erhält man Carnitinhydrolyase mit einer spezifischen Aktivität von 4,3 U/mg.
Claims (5)
1. Verfahren zur Herstellung eines Enzyms, das im folgenden als Carnitinhydrolyase bezeichnet wird, und seiner Aktivierung, dadurch gekennzeichnet, daß Stämme aus der Familie der Enterobacteriaceae als mikrobielle Enzymquelle auf einem kompletten Nährmedium, das D,L-Camitin und/oder Crotonobetain enthält, unter anaeroben Bedingungen in an sich bekannter Weise kultiviert wird, das gebildete Enzym mittels Chromatographie an z. B. Phenylsepharose isoliert wird, aus der nahezu carnitinhydrolyasefreien Lösung durch z. B. Ultrafiltration der enzymaktivierende Effektor F gewonnen wird, das gebundene Enzym durch Einsatz von Hydroxylapatit, DEAE-Sepharose bzw. DEAE-Zellulose sowie Gelfiltration angereichert wird und das an ein Trägermaterial gebundene Enzym durch Zugabe des bei seiner Herstellung anfallenden oder gesondert gewonnenen Effektors F aktiviert wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Stamm Escherichia coli, insbesondere E. coli 044 K74, E. coli 055 K59, E. coli 0111 K58, E. coli 0114 K90 eingesetzt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Stamm Citrobacter, bevorzugt Citrobacterfreundii, eingesetzt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Stamm Salmonella, insbesondere Salmonelle typhimurium, Salmonella anatum oder Salmonella Cottbus eingesetzt wird.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Stamm Proteus eingesetzt wird, bevorzugt Proteus vulgaris oder Proteus mirabilis.
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| DD30824287A DD281919A7 (de) | 1987-10-26 | 1987-10-26 | Verfahren zur herstellung eines enzyms |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DD (1) | DD281919A7 (de) |
-
1987
- 1987-10-26 DD DD30824287A patent/DD281919A7/de not_active IP Right Cessation
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