DD283156A5

DD283156A5 - Verfahren zur herstellung des mykotoxins tenuazonsaeure

Info

Publication number: DD283156A5
Application number: DD32846389A
Authority: DD
Inventors: Marina Mueller
Original assignee: Adl Inst Futterproduktion
Priority date: 1989-05-10
Filing date: 1989-05-10
Publication date: 1990-10-03

Abstract

Die Erfindung betrifft ein mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung des Mykotoxins Tenuazonsaeure mit Hilfe eines geeigneten Alternaria alternata-Stammes. Tenuazonsaeure wird als Standardsubstanz fuer analytische und toxikologische Untersuchungen in Einrichtungen der Human- und Veterinaermedizin, der Landwirtschaft und der Nahrungsgueterindustrie genutzt. Es ist das Ziel des Verfahrens, Tenuazonsaeure in hohen Ausbeuten durch die Kultivierung von Alternaria alternata IFP/A 374 und in hoher Reinheit zu isolieren. Es werden die Kultivierung des Alternaria-Stammes auf halbsynthetischem Fluessigmedium sowie eine effektive chromatografische Reinigung des Mykotoxins beschrieben.{Mykotoxin; Tenuazonsaeure; mikrobiologisches Verfahren; Alternaria alternata IFP/A 374; Kultivierung; Fluessigmedium; chromatografische Reinigung; Ausbeute; Reinheit; Standardsubstanz; Analytik; Toxikologie}

Description

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Für das die Erfindung betreffende mikrobiologische Verfahren unter Verwendung des hinterlegten Alternaria-Stammes konnten keine technischen Lösungen ermittelt werden. In der Fachliteratur (SCHADE, J. E., und KING, A. D.: J. Food Prot. 47 [1984], 978-995) werden der Nachweis von Tenuazonsäure mit den üblichen chemischen Extraktions- und Reinigungsverfahren beschrieben sowie eine Isolierung von Tenuazonsäure mittels nicht näher charakterisierter Alternaria-Stämme und ohne Angaben über Ausbeute und Reinheit des isolierten Mykotoxins.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung hat das Ziel, ein mikrobiologisches Verfahren für die Hersteilung des Mykotoxins Tenuazonsäure mittels Altei naria alternate IFP/A374 in hoher Ausbeute und Reinheit zu schaffen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, mit Hilfe eines hochproduktiven Alternaria alternata-Stammes das Mykotoxin Tenuazonsäure herzustellen.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß der Pilzstamm Alternaria alternate IFP/A374 zur Herstellung des Mykotoxins in einer Hefeextrakt/Saccharose-Bouillon bei 25°C für 28 Tage kultiviert wird.

Tenuazonsäure wird zu 70-80% ins Kulturmedium abgegeben, deshalb erfolgt die Extraktion sowohl des Flüssigmediums als auch des getrockneten Pilzmyzels mit einem organischen Lösungsmittel wie Methanol oder Chloroform. Die vereinigten Rohextrakte werden säulenchromatografisch an Kieselgel gereinigt.

Tenuazonsäure ist ein voiskoses Öl, das als Kupferkomplex auskristallisiert wird (Schmelzpunkt: 170°C-175°C). Die notwendige heinheit als Standardsubstanz von S 99% wird am Hochdruckflüssigkeitschromatografen überprüft. Die Ausbeute an Tenuazonsäure mit einer Reinheit von ä99% beträgt etwa 15-30mg/100ml Kulturansatz.

Die nach dem beschrieber en Verfahren gewonnene Tenuazonsäure der Formel

ist durch folgende physikalisch-chemisch Daten charakterisiert:

a) Molekulargewicht: 197

b) Aussehen: gelbbraunes viskoses Öl

c) Löslichkeit: gut löslich in Aceton, Benzene, Chloroform, Ethanol

MeOH, acidisch (löge)

d) UV-VIS-Spektrum: Ämax 218nm(3,70)

277,5nm(4,10) MeOH, neutral, basicXmax 240nm,280nm

θ) dünnschichtchromatografische Daten Adsorbent: Kieselgel

Detektion - nach Besprühen mit 1 %iger ethanolischei FeClj-Lösung zeigt sich intensive organgerote Färbung

- Fluoreszenzlöschung unter kurzwelligem UV-Licht Lösungsmittel: Benzene/Methanol/Eisessig90 + 5+5

RrWert: 0,48-0,51

Der zur Produktion von Tenuazonsäure verwendete Alternaria alternata-Stamm IFP/A374 wurde im Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie Jena (ZIMET) unter der Bezeichnung IMET43905 hinterlegt.

Ausfuhrungsbeispiel Die Erfindung soll nachstehend an einem Ausführungsbeispiel näher erläutert werden. Je 100ml einer 2%igen Yeastextraktlösung mit Zusatz von 4% Saccharose werden in 500-ml-Standkolben bei 121⁰C sterilisiert. Jeder Kolben wird mit einer Sporensuspension einer 7 Tage alten Einsporkultur von Aiternaria alternate IFP/A374, die auf Kartoffel-Dextrose-Agar angezogen wurde, beimpft. Die Kolben werden als Standkultur 28 Tage bei 25⁰C inkubiert. Anschließend wird das Pilzmyzel durch Filtrieren vom Flüssigmedium getrennt und bei 50°C getrocknet. Das Kulturmedium wird mit 2 NH₃PO₄ auf einen pH-Wert von 2 eingestellt und anschließend mit dem 1 'Machen Volumen Chloroform extrahiert. Die organische Phase wird dann mit dem gleichen Volumen einer 5%igen wäßrigen NaHCO₃-Lösung

versetzt und extrahiert. Die wäßrige Phase wird nochmals auf pH 2 eingestellt und anschließend mit Hexan extrahiert. Dieseorganische Phase wird über Na]SO₄ getrocknet und bis zur Trockne eingeengt.

Das getrocknete und gemahlene Pilzmyzel wird mit Chloroform/Methanol/Ameisensäura(94 + 3 + 3)4 Stunden extrahiert und

anschließend filtriert. Das Filtrat wird mit derrvgleichen Volumen 5%iger NaHCOaLösung extrahiert. Die wäßrige Phase wird aufpH2 eingestellt und mit Hexan extrahiert. Die gewonnene organische Phase wird mit dem Rohextrakt der Extraktion des

Kulturmediums vereinigt. Für die anschließende säulenchromatografische Reinigung wird das verwendete Kieselgel 60 (0,063-O,2mm) mit Oxalsäure

präpariert (5g Oxalsäure/95g Kiesolgtl). 200-800mg Tenuazonsäure-Rohextrakt werden an 20g aktiviertem Kieselgel in einer300mm χ 23 mm Säule gereinigt. Zuerst wird die Säule mit 75ml Toluol gewaschen, anschließend wird als Elutionsmittel ein

Stufengradient von Methylenchlorid/Aceton von 100 + 0 nach 90 + lOmitje 100ml eingesetzt. Eswerden Fraktionen zuje15ml

gesammelt und dünnschichtchromatografisch auf Tenuazonsäure untersucht. Alle Tenuazonsäure enthaltenen Fraktionenwerden vereinigt und zur Trockne eingeengt. Zur stabilen Lagerung wirdTenuazonsäure als Kupferkomplexsalz auskristallisiert.

Dazu wird Tenuazonsäure in Methanol aufgenommen (etwa 100 mg/ml MeOH) und mit einer 2%igen wäßrigen Kupfer(ll)-acetat- Lösung (0,5mol equivalent) versetzt. Es wird zweimal aus Methanol/Wasser (1 + 1) umkristallisiert. Kupfertenuazonat liegt dann

in Form hellgrüner kurzer Nadeln (Schmelzpunkt: 172⁰C) vor. Der Reinheitsgrad wird hochdruckflüssigkeitschromatografischbei einer Wellenlänge von 280 nm ermittelt.

Claims

Verfahren zur Herstellung des Mykoloxins Tenuazonsäure, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus Alternaria alternate IFP/A374 in flüssigem Nährmedium, bestehend aus Hefeextrakt und Saccharose, als Standkultur bei 25⁰C während eines Zeitraumes von 28 Tagen kultiviert wird und das dabei gebildete Mykotoxin Tenuazonsäure sowohl aus dem Myzel als auch aus dem Kulturfiltrat extrahiert, nachfolgend mit den üblichen Methoden konzentriert, säulenchormatografisch gereinigt und in sein stabiles Kupfersalz überführt wird.

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung ds Mykotoxins Tenuazonsäure, das als Standardsubstanz für analytische Untersuchungen mykotoxitiverdächtiger Nahrungs- und Futtermittel und für toxikologische Untersuchungen benötigt wird.