DE918162C - Verfahren zur Gewinnung von antibiotischen Wirkstoffen - Google Patents

Description

• Verfahren zur Gewinnung von antibiotischen Wirkstoffen Die Erfindung betrifft die Gewinnung neuer antibiotischer Wirkstoffe aus Streptomyces collinus n. sp. Dieser Stamm ist im »Archiv f. Mikrobiol. a, Bd. 17, S. 28o bis 282, beschrieben. Die neuen Antibiotica sind wegen ihrer bakteriostatischen Wirksamkeit wertvoll.
• Es wurde gefunden, daß man durch Züchtung von Streptomyces collinus in geeigneten Nährmedien und durch Extraktion der antibiotisch wirksamen Stoffe, vorzugsweise aus dem abgetrennten Mycel, zwei Wirkstoffe erhält, die sich durch Adsorptionsmethoden isolieren lassen. Es handelt sich um das Rubromycin und einen zweiten antibiotischen Wirkstoff, welcher Collinomycin genannt wurde.
• Das Rubromycin hat folgende Eigenschaften: Es kristallisiert aus Methanol oder Essigester in dünnen balkenförmigen Kristallen, die unter dem Mikroskop blaßviolett, makroskopisch dagegen rot aussehen und sich ab 2z5° (Berl-Block) zersetzen. Rubromycin ist mäßig löslich in Aceton und Chloroform, wenig löslich in Äther und niedermolekularen Alkoholen und praktisch unlöslich in Wasser, Petroläther sowie in Natriumhydrogencarbonatlösung. Von wäßrigem Alkali und konzentrierter Schwefelsäure wird es mit rötlichvioletter Farbe aufgenommen (Absorptionsmaxima: in 2 n-Natronlauge 584 mm, in konzentrierter Schwefelsäure 518 bis 52o my.) Beim Schütteln seiner roten Methylenchloridlösung mit wäßrigem Natriumhydrogencarbonat fällt an der Phasengrenzfläche ein rotvioletter Niederschlag des Natriumsalzes des Antibioticums aus. Die rote Lösung des Antibioticums in wasserhaltigem Dioxan wird durch Natriumhyposulfit (nicht durch Natriumbisulfit) entfärbt und beim Stehen an der Luft wieder rot. In Pyridin-Methanol gibt Rubromycin mit Titantrichlorid eine blaugrüne Lösung, die nach kurzer Zeit rotviolett wird. Die rote Lösung in Acetanhydrid färbt sich auf Zusatz von Pyroboracetat blauviolett und zeigt nach kurzem Kochen zwei Absorptionsmaxima bei 581 und 515 mu-Rubromycin enthält keinen Stickstoff und unterscheidet sich dadurch charakteristisch von Rhodomycin (B. 84, 700). Ein im Hochvakuum bei 154' getrocknetes Präparat gab folgende Analysenzahlen: C 6o,ßo, H 4,26, 0 3391 (summe 98,47).
• Mit Acetanhydrid-Pyridin erhält man aus kubromycin ein aus Benzol-Petroläther in gelben Nädelchen kristallisierendes Acetat vom Schmp. 193 bis 195° (unkorr.) (Gef. C 59,45. H 4,21, CH,C0 17,4). Das Acetat läßt sich aus seiner gelben Benzollösung mit N atriumhydrogencarbonat oderNatriumcarbonat nicht ausschütteln.
• Beim Kochen einer Lösung von Rubromycin in Methylenchlorid mit verdünnter Salzsäure entsteht in fast quantitativer Ausbeute eine rote Verbindung, die aus Aceton in roten, balkenförmigen Kristallen vom Sehmp. 265 bis 268° (unkorr.) kristallisiert. Sie hemmt das Wachstum von Staph. aureus noch in einer Verdünnung von über 1: 15 ooo ooo, d. h. also in der gleichen Größenordnung wie Rubromycin. Die Verbindung unterscheidet sich von Rubromycin dadurch, daß ihre Ätherlösung Absorptionsmaxima bei 547 und 532 n111, zeigt, ferner durch ihr Verhalten bei der Adsorption und Verteilung. Wird eine Mischung von Rubromycin und seinem Umwandlungsprodukt aus Chloroform an Calciumsulfat adsorbiert, so bilden sich beim Entwickeln des Chromatogramms zwei deutlich voneinander getrennte Zonen, von denen die obere das Rubromycin enthält. Bei der Verteilung im System Dioxan -- Wasser - Benzin (Volumenverhältnis 12: 2 : 3) geht Rubromycin überwiegend in die hydrophile Phase, das Umwandlungsprodukt dagegen verteilt sich gleichmäßig auf beide Phasen. Auch papierchromatographisch lassen sich das Antibioticum und das Umwandlungsprodukt trennen. Rubromycin kristallisiert aus Chloroform-Methanol in orangefarbenen Prismen vom Schmp. 28o bis 282° (unkorr.) und läßt sich im Hochvakuum nicht unzersetzt destillieren.
• Collinomycin ist mäßig löslich in Chloroform, Aceton und Dioxan, schwer löslich in Äther und niedermolekularen Alkoholen, praktisch unlöslich in Petroläther, Wasser und Natriumhydrogencarbonatlösung. Beim Schütteln seiner gelben Ätherlösung mit 2 n-Natriumcarbonat fällt an der Phasengrenzfläche das 1latriumsalz desAntibioticums als violetterNiederschlag aus, während sich die wäßrige Phase nur schwach violett färbt. Von 2 n-Natronlauge wird die neue Verbindung mit rotvioletter (Absorptionsmaxima: 575, 535 mA, von konzentrierter Schwefelsäure mit karminroter Farbe (Absorptionsmaxima: 525, 48o mA) aufgenommen. Versetzt man Collinomycin in Pyridin-Methanol mit Titantrichlorid, so wird die Lösung zunächt olivgrün und bald danach rot. Die orangefarbene (im UV-Licht mit gleicher Farbe fluoreszierende) Lösung in Acetanhydrid wird auf Zugabe von Pyroboracetat karminrot und zeigt nach kurzem Kochen Absorptionsmaxima bei 6o8, 555 und 515 mY. Die gelbrote Dioxanlösung wird durch Natriumhyposulfit blaßgelb; bei Stehen an der Luft kehrt die ursprüngliche Farbe zurück. Collinomycin enthält ebenso wie Rubromycin keinen Stickstoff, zeigt zum Unterschied von diesem aber einen erheblichen Methoxylgehalt. Ein im Hochvakuum bei 15q.° getrocknetes Präparat gab folgende Analysenzahlen: C 59,41, H 4.o1, 0 34,83,C H30 16,2.
• Mit Acetanhydrid-Pyridin erhält man aus Collinomycin ein aus Benzol-Petroläther in gelben Nadeln vom Schmp. 228 bis 230° kristallisierendes Acetat (Gef. C 61,18, H 4,17, CH3C0 2z,4), das sich aus Benzol mit 2 n-Natriumcarbonat nicht ausschütteln läßt.
• Benzoylchlorid-Pyridin verwandelt das Antibioticum in ein aus Aceton-Äther in zitronengelben Nadeln kristallisierendes Benzoat vom Schmp. 226' (Gef. C 66,43, H 3,94, C,H"C0 38,8).
• Durch längeres Erhitzen in schwefelsäurehaltigem Aceton geht Collinomycin in eine aus Aceton in orangefarbenen Nadeln kristallisierende Verbindung vom Schmp. 273 bis 275° über, die sich vom Ausgangsmaterial dadurch unterscheidet, daß ihre Ätherlösung Absorptionsbanden bei 529 und 515 nu zeigt und beim Schütteln mit Natriumhydrogencarbonatlösung ein rotviolettes, in Wasser nahezu unlösliches Natriumsalz des Umwandlungsproduktes ausscheidet. Versetzt man die Methanollösung des Umwandlungsproduktes mit methanolischem Bleiacetat, so fällt ein dunkelbrauner Niederschlag aus, während Collinomycin bei dieser Reaktion nur einen Farbumschlag von rotgelb nach braunviolett zeigt.
• Die folgende Tabelle zeigt die Wirksamkeit von Rubromycin gegen verschiedene Mikroorganismen im Verdünnungstest (Hemmwerte nach 8o Stunden bei 37' in Hißscher Lösung): Bact. coli etwa ..... i : 1o ooo B. typhi . . . . . . . . . . . i : io ooo bis i : 2o ooo Staphylococcen ..... i : ioo ooo bis i : Zoo ooo Enterococcen ....... i : ioo ooo Streptococcen....... i:8oo ooo Co. diphth.......... i : 80o ooo B. subtilis . . . . . . . . . i : 80o ooo In serumfreier Nährlösung wurden folgende Werte gefunden St. aureus etwa . . . . . . . . . . . . . . . i : 2o ooo ooo B. subtilis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 : 25 000 000 Collinomycin hemmt Staph. aureus in einer Verdünnung von 1: 2 ooo ooo.
• Zur Herstellung der Antibiotica kann man beispielsweise folgendermaßen vorgehen: Das Impfmaterial von Str. collinus wird auf Glycerin-Glykokoll-Schrägagar gezüchtet und nach 8 bis io Tagen auf Kulturkolben überimpft. Die Kulturlösung hat folgende Zusammenstellung: 2 % Glycerin, 0,25 O/o Glykokoll, o,i% NaC1, o,i%K2HP04, o,oi%FeS04, 010,0/0 Mg S 04, 0,50/, Hefekochsaft, Spuren von CaC03. Je 1,51 dieser Kulturlösung werden nach Beimpfung in Kolben 2o Minuten bei 2 Atü sterilisiert und 25 bis 27 Tage bei 27° bebrütet.
• Nach 8- bis iotägigem Bebrüten bedeckt ein dünner Mycelrasen die Oberfläche der Kulturlösung, und die Farbstoffbildung beginnt. Zur Erzielung größerer Mycelausbeuten werden die Kolben in diesem Alter einmal kräftig geschüttelt. Nach etwa 25 Tagen ist das Wachstum beendet, die Kulturlösung hat dann eine tief dunkelbraune bis braunrote Farbe, das Mycel ist an der Oberfläche grauweiß, an der Unterseite fast schwarz gefärbt und bildet eine starke Decke. D,ie Kulturlösung enthält nur geringe Mengen antibiotisch wirksamer Substanzen, so daß die Aufarbeitung wenig lohnend ist.
• Das Mycel enthält die Hauptmenge der antibiotisch wirksamen Substanz. Zur Aufarbeitung und Trennung wird das von der Kulturlösung abfiltrierte Mycel schwach abgepreßt, zur Sprengung der Zellwände ausgefroren und nach dem Auftauen durch Abpressen und Vakuumtrocknung bei 3o bis 35° von anhaftendem Wasser befreit. Dann wird fein vermahlen. Durch Extraktion mit Petroläther, Äther oder Schwefelkohlenstoff lassen sich lipoidähnliche Begleitstoffe entfernen. Zur Gewinnung des Rohantibioticums wird das Trockenmycel mit saurein Aceton (z 18o°/Qiges Aceton + 120 ccm 2 n-H2 S 04) in der Kälte weitgehend extrahiert. Als Extraktionsmittel eignen sich außer Aceton auch Chloroform, Methylenchlorid, Essigester, Tetrahydrofuran und Dioxan.
• Der saure Acetonextrakt wird zur weiteren Aufarbeitung (mit N a 0 H) auf pH 6,o gebracht, im Vakuum bei 35° auf ein Viertel seines ursprünglichen Volumens eingeengt und mit Wasser und Äther kräftig geschüttelt. In der hydrophilen Phase finden sich rote und braune unwirksame Begleitfarbstoffe, im Äther weitere Fettanteile neben Farbstoffen und geringen Mengen Antibiotica. Die Hauptmenge der antibiotisch wirksamen Substanz fällt an der Phasengrenzschicht aus. Dieser Niederschlag wird abzentrifugiert, mit Wasser gründlich gewaschen und getrocknet. Durch erschöpfende Extraktion mit Methylenchlorid (Aceton, Chloroform, Methanol sind ebenfalls geeignet) lassen sich daraus die Antibiotica gewinnen.
• Aus dem tiefroten Methylenchloridextrakt werden die Farbstoffe mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung weitgehend ausgeschüttelt, wobei sich an der Grenzschicht der beiden Phasen eine violette Fällung bildet, die vorwiegend aus Farbstoffsalz besteht. Die Methylenchloridphase wird vorsichtig neutralisiert, mit Wasser gewaschen und dann zur Trockne verdampft. Der tiefrote Rückstand läßt sich aus Chloroform an gefälltem, durch Erhitzen aktiviertem Gips durch chromatographische Adsorption auftrennen.
• Die fraktioniert aufgefangenen Chromatogrammeluate der beiden unteren Zonen liefern nach Einengung zur Trockne fast reines Rubromycin bzw. Collinomycin. Sie werden rein gewonnen durch Umkristallisieren, z. B. aus Chloroform, Methanol oder Essigester.

Claims (2)

1. PATENTANSPRÜCHE: z. Verfahren zur Gewinnung von antibiotischen Wirkstoffen, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces collinus in einem geeigneten Nährmedium züchtet und aus der entstandenen Kultur, vorzugsweise aus dem abgetrennten Mycel, durch Extraktion mit organischen Lösungsmitteln die antibiotischen Wirkstoffe gewinnt.
2. 2. Verfahren nach Anspruch r, dadurch gekennzeichnet, daß man nach Abtrennung der antibiotischen Wirkstoffe dieselben durch Adsorptionsmethoden voneinander trennt und so Rubromycin und Collinomycin isoliert.