DD283738A7

DD283738A7 - Verfahren zur kultivierung von mikroorganismen

Info

Publication number: DD283738A7
Application number: DD32329988A
Authority: DD
Inventors: Karin-Dagmar Wendlandt; Angelika Wandt; Edda Bruehl; Klaus Karbaum; Karl-Heinz Schurig; Dietrich Wagler
Original assignee: Akademie Der Wissenschaften Der Ddr,Dd
Priority date: 1988-12-16
Filing date: 1988-12-16
Publication date: 1990-10-24

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Kultivierung von Mikroorganismen auf Methan/Erdgas als einziger Kohlenstoffquelle. Erfindungsgemaesz werden der neue methanotrophe Bakterienstamm IMET 11334 und der methanotrophe Bakterienstamm ZIMET B 502 gemeinsam als definierte Mischkultur kontinuierlich auf einem Methan-Luft-Gemisch unter Normal- oder erhoehtem Druck in einer streng bilanzierten Naehrloesung unter unsterilen Bedingungen kultiviert. Dasz nach diesen Verfahren gewonnene Endprodukt enthaelt bis zu 75% Rohprotein und alle lebenswichtigen Aminosaeuren.{Kultivierung; Eiweiszgewinnung; Bakterien; Rohprotein; Mikroorganismen; Prozeszfuehrung; methanotroph; Aminosaeuren; Methan; Mischkultur; unsteril}

Description

Charakteristik der bekannten technischen Losungen

Es sind Verfahren zur Kultivierung von Mikroorganismen, Insbesondere Bakterien, auf der Grundlage gasförmiger Kohlenwasserstoffe, z. B. Methan, bekannt. So wird In der US-PS 4042458 ein Verfahren beschrieben, In weichem ein Stamm Methylococcus auf Methan In einer Mischkultur mit heterotrophen und methylotrophen Mikroorganismen, die Stoffwechselprodukte assimilieren, mit einer Produktivität von 0,9g/l · h gezüchtet wird. Die gewonnene Biomasse enthält 69% Rohprotein. In den DE-OS 2307692 und DE-OS 2241258 wird ebenfalls Verfahren mit einem Stemm Methylococcus beschrieben. Der Nachteil dieser Verfahren liegt in der zu geringen Produktivität, zu niedrigem Rohproteingehalt und der Empfindlichkeit gegenüber hohen Ammoniumionenkonzentrationen. Ebenfalls bekannt ist die Züchtung einer symbiotischen Bakterienkultur (SU-US 460745), bei einer Durchflußrate bis 0,16h"¹ sowie einer Temperatur von 33⁰C und einem pH-Wert von 6,7 auf Erdgas. Ein thermotoleranter Stamm der Gattung Methylococcus capsulatus, der bei einem Temperaturoptimum von 38-39⁰C und einer Durchflußrate von D = 0,12 h"¹ wächst, wird in dem SU-US 467620 beschrieben. Die mit dieser Kultur erreichte Produktivität beträgt 1,2g/kg · h. Diesen genannten Verfahren und den in den Patentschriften (GB-PS 1421135; GB-PS 1397735; DD-PS113928; DD-PS 124194) beschriebenen sind folgende Nachteile gemeinsam:

- relativ geringe Wachstumsgeschwindigkeiten

- niedrige Produktivitäten

- niedrige Toleranzgrerizen bezüglich der Ammoniumstickstoffkonzentration.

In der DD-PS 157866 wird ein Verfahren vorgestellt, das sich durch hohe Produktivitäten bei großen Durchflußraten auszeichnet. Der Nachteil dipres Verfahrens beruht auf der für Bakterien dieser Gattung bekannten hohen Empfindlichkeit gegenüber Ammoniumstict'StoiTKcnzentrationen. Die im Patent DD-PS148465 beschriebenen Mikroorganismen tolerieren Ammoniumstickstoffkonzentrationen bis 400mg/l ohne Produktivitätsverlust, jedoch genügen die erreichten Durchflußraten nicht den Anforderungen an eine Produktionskulturzur Erreichung hoher Produktivitäten.

Hol der Erfindung

Die Erfindung verfolgt das Ziel, ein Verfahren zu entwickeln, das eine stabile Prozeßführung unter unsterilen Bedingungen mit hohen Durchflußraten bei gleichzeitiger Gewährleistung eines eiweißreichen Endproduktes gewährleistet.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Produktionskultur zu selektieren und einzusetzen, die im unsterilen Prozeß mit hohen Biomassekonzentrationen wächst und gegenüber den bisher bekannten methylotrophen Mikroorganismen eine große Wachstumsgeschwindigkeit sowie einen ausreichenden Selektionsvorteil und hohe Konkurrenzfähigkeit aufweist.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß der neue methanotrophe Bakterienstamm IMET11334 gemeinsam mit dem methanotrophen Bakterienstamm ZIMET B 502 als definierte Mischkultur kontinuierlich auf einem Methan-Luft-Gemisch unter Normal- oder erhöhtem Druck in einer streng bilanzierten Nährlösung unter unsterilen Bedingungen kultiviert wird.

Der neue Stamm IMET11334 wurde in der Stammsammlung des Zentralinstitutes für Mikrobiologie und experimentelle Therapie der AdW der DDR hinterlegt. Er wird durch nachfolgende Merkmale charakterisiert:

Zellmorphologie:

kurze dicke bis mittelgroße gerade Stäbchen mit einer Größe von 0,8 bis 0,9 x 1,2 bis 2,0Mm. Die Zellen treten überwiegend als Diploform auf, sind gramnegativ und unbeweglich. Bei der Kultivierung unter Normalbedingungen im Schüttelkolben wurden keine sudanophilen Granula in den Zellen eingelagert. Schleimbildung wurde nicht beobachtet.

Koloniemorphologie:

Auf Mineralagarplatten werden nach 2 Wochen rotbraune ir der Mitte dunkelbraune, flache, fain amorphe Kolonien mit einem glänzenden Rand gebildet, wenn eine anorganische Stickstoffqualle und Methan als C-Quelle angeboten werden. Der Durchmesser der Kolonien beträgt etwa 1 mm, die Farbintensität der Kolonien richtet sich nt>r.h der Wachstumsdauer. Nach 8 Tagen Bebrütungszeit sind die Kolonien gelborange bis hellbraun und nach 2 Wochen rotbraun.

Waltere Merkmale: Kein Wachstum auf peptonhaltigen Nährböden Temperaturbereich: 20 bis 42⁰C

pH-Bereich: 4,7 bis 6,9

Toleranzgrenze für Ammoniumstickstoff: 600 mg/1 Optimales Wachstum erfolgt bei 100-200 mg/1. Der Stamm ZIMET B 502 bildet in der Mischkultur den Basisstamm und wurde bereits In der DD-PS148465 ausführlich

beschrieben. Der Stamm IMET11334 ist serologisch vom Stamm ZIMET B 502 unterscheidbar. Der Stamm reagiert negativ mitdem Kaninchan-Antiserum des Stammes ZIMET B 502 sowohl bei der Objektträgeragglitunation als auch bei der

Immunofloureszenz. Die Ferment jrbiozö nose bestehend aus 70-95% des Stammes ZIMET B 602 und 5-30% des ^c.'.ammes IMET11334, hat den Vorteil gegenüber der bisherigen Kultivierung von nur einem methanotrophen Stamm (ZIMET B 502), daß

an dem Prozeß der Methankonvertierung zwei definierte methanotrophe Bakterienstämme mit unterschiedlichen

Stoffwechselwegen beteiligt sind, wobei eine maximale Wachstumsrate von M_max = 0,33 h~' erreicht wird. Die symbiotischen Beziehungen beider methanotropher Stämme ermöglicht diese hohe Wnchstumsgeschwindigkeit. Des weiteren ist das Vorhandensein zweier methanotropher Stämme mit unterschiedlichem Stoffwechselweg für den Fall von Nutzen, daß ein

eventueller Befall virulenter Phagen dia Massenzellkultivierung stört, da immer nur ein Stamm davon betroffen wäre.

Werden die Stdmme ZIMET B 502 und IMET11334 als definierte Mischkultur fermentiert, so ist eine Steigerung der Produktivität

um 25% gegenüber der Fermentation mit dem Stamm ZIMET B 502 zu verzeichnen. Unter unsterilen Prozeßbedingungen sinddie Organismen ZIMET B 502 und IMET11334 im Temperaturbereich von 28 bis 42⁰C, bevorzugt bei 38 bis 4O⁰C, bei einempH-Wert im Bereich von 4,7 bis 6,8, bevorzugt bei 5,4 bis 6,2 und einem Druck von 0,1 bis 1,0 MPa kontinuierlich bei Verweilzeitenbis minimal 3,5h kultivierbar.

Die Begasung erfolgt mit Methan-Luft-Gemischen von 1:3 bis 1:6. Die Regelung des pH-Wertes wird bevorzugt mit einer Ammoniaklösung vorgenommen. Die Nährlösung wird mit Leitungswasser angesetzt und mit Phosphorsäure auf einen pH-Wert

von s 3 eingestellt. Dabei werden Konzentrationen der Bestandteile der Nährlösung so gewählt, daß das Nährsalzangebot stetsder aktuellen Biomassekonzentration entspricht bzw. nur unwesentlich davon abweicht. Das Endprodukt des Prozesses ist eine

Trockensubstanz, die bis zu 75% Rohprotein enthält und alle lebenswichtigen Aminosäuren aufweist. , An nachfolgenden Beispielen sei die Erfindung näher erläutert: Beispiel 1

In einem Rührfermentor werden 5kg vorgezüchtetes Impfmaterial des Kulturgemisches ZIMET B 602 (85% der Methanassimilierer)/IMET 11334 (15% der Methanassimilierer) mit einer Konzentration von 8 bis 10g/l eingesetzt. Das Nährmedium enthält pro Liter aqua dest.:

H₂PO₄ (80%ig)	0,028 ml
KH₂PO₄	35 mg
MgSO₄* 7 H₂O	25 mg
CuSU₄* 5H₂O	0,785 mg
MnSO₄* 4H₂O	1,825 mg
FeCI₂* 4 H₂O	1,2 mg
ZnCI₂	0,322 mg
CoSO₄* 7 H₂O	0,036 mg
NiSO₄* 7H₂O	0,109 mg
AI₂(SO₄J₃* 18H₂O	0,186 mg
Ca (NOj)₂* 4 H₂O	0,883 mg
Na₂McO₄* 2H₂O	0,041 mg
H₃BO₃	1,286 mg
CrCI₃* 6H₂O	0,077 mg

Die Temperatur wird auf 38⁰C, der pH-Wert auf 5,7 und die Verweilzeit auf 6h eingestellt. Das Medium wird mit 15 l/kg · h Methan und 60l/kg · h Luft begast. Die Regelung des pH-Wertes erfolgt mit einer 2%igen Ammoniaklösung; J'mit wird gleichzeitig die Stickstoffversorgung der Mikroorganismen gewährleistet. Die Nährlösung wird zunächst auf eine Bakterienkonientration von 15g/l bilanziert. Nachdem die Biomasse auf eine Konzentration von 15g/l angewachsen ist, wird die Verweilzeit auf 4h herabgesetzt. Die Ammoniumstickstoffkonzentration wird zwischen 60 und 300mg/l gehalten. Unter diesen Bedingungen werden im stabilen kontinuierlichen Prozeß Bakterienkonzentrationen von 12 g/l, entsprechend einer Produktivität von 3,0g/kg · h, erzielt. Der Anteil der methanotrophen Stämme in der Mischkultur beträgt 85% ZIMET B 502 und 15% IMET11334. Der Rohproteingehalt der Biomasse beträgt 75%.

Beispiel 2

Die Kultivierung der Bakterienmischkultur erfolgt wie im Beispiel 1 beschrieben, allerdings wird die Temperatur auf 32⁰C, die Verweilzelt auf 6h eingestellt. Bei diesen Bedingungen erhält man im stabilen kontinuierlichen Prozeß eine Biomassekonzentration von 14g/l. Dies entspricht einer Produktivität von 2,3g/kg · h. Das Verhältnis der methanotrophen Stämme der Mischkultur stellt sich dabei auf 70% ZIMET B 502:30% IMET11334 ein.

Beispiel 3

Die Anzucht der Impf kultur erfolgt wie im Beispiel 1 beschrieben, jedoch wird der pH-Wert auf 5,0 und die Verweilzeit auf 8 h eingestellt. Im stabilen kontinuierlichen Prozeß stellt sich unter diesen Bedingungen eine Biomassekonzentration von 16g/l ein. Damit wird eine Produktivität von 2,0g/l · h erreicht. Der Anteil der methanotrophen Stämme beträgt bei diesen Kultivierungsbedingungen 95% ZIMET B 502 und 5% IMET11334.

Claims

Verfahren zur Kultivierung von Mikroorganismen auf Methan/Erdgas als einziger Kohlenstoffquelle in Gegenwart einer wäßrigen Nährsalzlösung, eines freien Sauerstoff enthaltenden Gases und des methanotrophen Bakterienstammes ZIMET B 502, bei einer Temperatur von 28 bis 42⁰C, einem pH-Wert von 4,7 bis 6,8 und einem Druck von 0,1 bis 1,0MPa, dadurch gekennzeichnet, daß der neue methanotrophe Bakterienstamm IMET11334 gemeinsam mit dem methanotrophen Bakterienstamm ZIMET B 502 als Mischkultur kontinuierlich kultiviert wird, wobei der Anteil des Stammes IMET11334 innerhalb der Mischkultur 5 bis 30% beträgt.

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung gehört In das Gebiet der mikrobiologischen Eiweißgewinnung und kann eingesetzt werden in Anlagen, in denen gasförmige Kohlenwasserstoffe mit Hilfe von Bakterien mikrobiologisch umgesetzt werden.