DD284029A5 - Peptide mit t-zellenunterstuetzungsaktivitaet - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung von Peptiden der Formel{Peptide-Herstellung; Stimulierung Immunsystem, menschlich}
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung allgemein synthetischer Peptide# die in der Lage sind, die T-Zellen-Helferaktivität zu stimulieren.
Dies ist eine CIP-Anmeldung der anhängigen US-Patentanmeldung SN 07/196138, die am 10. Mai 1988 eingereicht worden ist.
Die immunmodulierenden Proteine Thymopoietin und Thysplenin (früher als "Splenin" bezeichnet) sind aus der inneren Brustdrüse und der Milz vom Rind bzw. vom Menschen isoliert worden. Darüber hinaus sind kleine Peptide chemisch synthetisiert worden, die in ihrer biologischen Aktivität dem Thymopoietin
ähneln und weiter modifiziert wurden, um zusätzliche Eigenschaften wie Resistenz gegen enzymatisch^ Wirkung zu erhalten; siehe z.B. US-Patent 4 505 853.
Es wurden eine Vielzahl von Patente und Artikel publiziert, die derartige Proteine und synthetisierte Peptide betreffe.iie Die US-PS 4 190 646 betrifft das Pentapeptid Thymopentin, das die aktive Stelle von Thyraopoietin darstellt und die Sequenz Arg-Lys-Asp-Val-Tyr aufweist, sowie Peptidzusammensetzungen, in denen verschiedenartige Gruppen an den Amino- und/oder Oarboxyenden dieses Pentapeptids substituiert sind. Sowohl Thymopoietin als auch Thymopentin rufen biologische Veränderungen in zwei Human-T-Zellinien - CEM und MOLT-4 - hervor, wodurch sie eine Punktion bei der Stimulierung biologischer Aktivitäten von T-Zellen ausüben. Es wurden keine Analoga von Thymopentin kürzer als Pentapaptide (5 Aminosäuren in der Sequenz) gefunden, die aktiv bei CEM-Zellen sind.
Die ebenfalls anhängige US-Patentanmeldung Nr. 53 186 dieses Patentanmelders beschreibt ein immunmodulierendes Protein mit 48 Aminosäuren, Splenin (das hier nachfolgend als "Thysplenin" bezeichnet wird), das aus menschlicher Milz isoliert worden ist. Rinder-Thysplenin stimuliert die T-Zellen-Helferaktivität in vivo bei der Maus. Es ist daher zu erwarten, daß Human-Thysplenin beim Menschen eine analoge biologische Aktivität zeigt. Human-Thysplenin wurde in der oben genannten Anmeldung dahingehend beschrieben, daß es die Förderung von intrazellulärem cGMP bei der Human-T-Zelllnie MOLT-4 induziert. Die aktive Stelle von Rinder-Thysplenin, als SP-5 bezeichnet, umfaßt die Aminosäurerest« 32 - 36 davon und weist die Sequenz Arg-Lys-Glu-Val-Tyr auf. In der Anmeldung SN 56 186 wurde die aktive Stelle der Human-Sequenz als Arg-Lys-Ala-Val-Tyr erkannte
Anders als Thymopoietin ruft Thysplenin keine Veränderungen der biologischen Aktivität von CEM-Zellen hervor. Somit ist
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Thysplenin in die Stimulierung der T-Zellen-Helferaktivität und nicht in die T-Zellen-Suppressoraktivitä't miteinbezogen. Siehe auch beispielsweise Goldstein, G0 Nature (London) 247: 11-34(1974)} Basch, R.S. und Doldstein, G., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Xl* 1474-1478; Scheid, M.P. et al.,J.Exp.Med., 1£[Ί 1727-1743 (1978)} Schnei,M.P. et al., Science, IjK)I 1211-1213 (1975) j Ranges, G.E. et alc, J,Exp.Med., ,1^6: 1057-1064(1982); T·· Audhya et al., Biooheme 2£i 6195-6200 (1981)} Venkataaubramanian,K. et al0, Proo.Nat.Acad.Sei. USA, 8Jh 3171-3174 (1986)} Malaiae, M../. et al., in "Immunregulatorisches UGLA-Symposion über molekulare und zelluläre Biologie", Hrsgo Goldstein,G. et al., (Lies, New York) (1986); Sunshine, G.H., et al., J.Immunol., 1.20: 1594-1599 (1978) und E. Rentz et al., Arch. Geschwulstforsch. 54(2)ι 113-118 (1948). Siehe auch US-Patente 4 190 646} 4 261 886 j 4 361 673? 4 420 424} und 4 629 7231' Es wird Bezug genommen auf die oben aufgeführten Patente, Patentanmeldungen und Artikel für eine Diskussion von anderem Hintergrundmaterial und die in die vorliegende Erfindung miteinbezogenen biologischen Prozesse.
Das US-Patent 4 428 938 (Kisfaludy et al0), das am 3.1o Januar 1984 veröffentlicht worden ist, beschreibt bestimmte, die Immunregulierung bewirkende Peptide. Zu diesen Peptiden gehören die folgenden Tetrapeptide
Arg-Lys-Asp-Val
Arg-Lys-Asn-Val
Arg-Lys-Ala-Val
Arg-Lys-Asp-:" .' AIa
Arg-Lys-Asp-Ile
Arg-Lys-Glu-Val
Glp-Arg-Lys-Asp
2 θ 4 ο 2 9
Dieses US-Patent 4 428 938 schließt generell die Salze« Amide, niederen Alkylester und geschützten Derivate dieser Sequenzen mit ein sowie Methoden für den Einsatz dieser Sequenzen bei der Behandlung immunologjscher Krankheiten infolge von Thymusdefekten. Ir diesem Patent wurden die Peptide auf Aktivität in einer in vitro E-Rosette-Assay getestet.
Dieselben Forscher berichteten über solche Tetrapeptide in Kisfaludy et al., Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. B.D. 364, S. 933-940 (1983). Darin wurde berichtet, daß die Sequenz Arg-Lys-Glu-Val ein hochaktives Analoges gemäß einem in vitro E-Rosette-Teet war und daß die Sequenzen Arg-Ala-Asp-Val und Arg-Lys-Ala-Val eine drastische verringerte Aktivität besitzen.
Es bleibt die Notwendigkeit zur Bereitstellung von Peptiden, die bei der Stimulierung des menschlichen Immunsystems für verschiedene T-Zellen-Mangelerscheinungen nützlich sind.
Durch das erfindungsgemäße Verfahren werden neue Peptide, die zur Stimulierung des menschlichen Immunsystems verwendet werden, zur Verfügung gestellt.
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Verfahren zur Herstellung neuer Peptide, die die Fähigkeit besitzen, die cGMP-Aktivität in der Human-T-Zellinie MOLT-4 zu steigern, bereitzustellen.
Die vorliegende Erfindung beschreibt demzufolge die Herstellung einer Reihe von Thysplenin-Peptidanaloga, die in der Lage sind, biologische Aktivität in der MOLT-4 T-Zellinie zu induzieren» Anders als die Thymopentinanaloga, die bereits vorher diskutiert worden sind, sind Peptide, mit einer Länge von weniger als fünf Aminosäuren und auf Thysplenin bezogen, aktiv beim Hervorrufen einer T-Zellen-Helferaktivität in MOLT-4-Zellen, so wie die hier beschriebenen Pentapeptidanaloga von Thysplenin.
Nach einem Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die Herstellung neuer Tetrapeptide der folgenden Formel
R - Arg - X - Y - Z - R1 (I)
oder ein pharmazeutisch annehmbares Säure - oder Basenadditions· salz davon, worin
alkanoyl darstellt; X ist Pro, Dehydro-Pro, Hydroxy-Pro, D-Lys, alpha-Methyl-
alanin (Aib) oder Lys; Y ist eine D- oder L-Aminosäure, ausgewählt unter Ala, Asp,
GIu, Gin, A8n, beta-Asp, VaI, Leu oder He; Z ist Gly oder eine D- oder L-Aminosäure, ausgewählt unter
1 2 3 2 3
ein geradkettiges oder verzweigtes Alkyl oder Alkanyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls substituiert mit einer Arylgruppe oder Aryl, gegebenenfalls substituiert mit entweder einem Halogen oder einem geradkettigen
oder verzweigten Alkyl- oder Alkenylrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, oder R und R bilden zusammen eine cyclische Methylengruppe mit 3 bis 7 Kohlenstoffatomen, mit der Maßgabe, daß wenn X Lys ist und Z VaI, Y nicht Asp, Asn, AIa, Asu oder GIu ist; und wenn X Lys ist, dann Y nicht Asp ist; und wenn X Ala ist und Z VaI, dann Y nicht Asp ist.
Nach einem anderen Aspekt der Erfindung betrifft diese die Herstellung neuer Pentapeptide, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie die Fähigkeit besitzen, die cGMP-Aktivität in der Human-T-Zellinie MOLT-4 zu steigern und die die folgende Formel aufweisen
oder ein pharmazeutisch annehmbares Säure- oder Basenadditionssalz davon, worin
R2 Wasserstoff, Acetyl, Formyl, Niederalkanoyl oder des-Aminο darstellt;
Y* ist eine O- oder L-Aminosäure, ausgewählt unter VaI, He, Leu, Lys, Ala, Asp, Glu, Gin;
Z* ist eine D- oder L-Aminosäure, ausgewählt unter Tyr, VaI, Leu, His, Ala oder Trp; und
R3 ist OH oder NR4R5, worin R4 und R5 Wasserstoff sind oder ein geradkettiges oder veizweigtes Alkyl oder Alkenyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls substituiert mit einer Arylgruppe oder Aryl, gegebenenfalls substituiert mit entweder einem Halogen oder einem geradkettigen oder verzweigten Alkyl- oder Alkenylrest mit 1 bis 6 Kohlen-
- 6a -
284 ο 29
Stoffatomen, oder R und R bilden zusammen eine cyclische Methylengruppe mit 3 bis 7 Kohlenstoffatomen.
Diese Peptide und Zusammensetzungen, die diese Peptide enthalten, behalten überraschenderweise die biologische Aktivität von Human-Thysplenin bei. Eine große Anzahl dieser Peptide ist auch gekennzeichnet durch einen erhöhten Widerstand gegen den Angriff von Endo- und, Exopeptidasen und Trypsinähnlichen Enzymen im Verdauungstrakt und im Serum. Daher eröffnen diese Peptide signifikante Vorteile bei der Behandlung von Immundefekten. Insbesondere die erfindungsqemäßen Tetrapeptide oder Pentapeptide, in denen X oder X1 Pro oder Alb darstellen, besitzen eine überraschende Resistenz gegen den Abbau durch Enzyme, wie z. B. Serumpeptidasen.
Es werden therapeutische Zusammensetzungen, die diese Peptide enthalten, sowie Methoden zum Einsatz dieser Peptide bei der Behandlung einer Vielzahl von Zuständen oder Krankheiten, die eine Immunregulierung erforderlich machen, beschrieben.
Weitere Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung sind in der folgenden detaillierten Beschreibung offenbart, wozu auch die Beispiele der gegenwärtig bevorzugten Ausführungsformen gehören
Die Erfindung wird durch Zeichnungen erläutert.
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Fig. 1 Graphische Darstellung einer MOLT-4 oGMP-Aasay unter Plotten der Peptidkonzentration 6ug/ral) gegen oGMP-Spiegel (Picogramm/ml) und Vergleioh der Aktivität darin von rhymopentin (TP-5) und erfindungsgemäßen Peptiden gegen Kontrollmessungenj
Pig. 2 Graphisohe Darstellung einer MOLT-4 cGMP-Assay unter Plotten der Peptidkonzentration ^ug/ml) gegen ofiMP-Spiegel (Pioopraram/ml) und Vergleich der Aktivität darin von Thymopentin (TP-5) und einem Peptid Ac-Arg-Pro-Val-Ala-NHg dieser Erfindung.
In detaillierter AuafUhrung betrifft die Erfindung eine Reihe von Tetrapeptiden der Formel
R - Arg - X - Y - Z - R1 (I)
oder ein pharmazeutisch annehmbares üäure- oder Basenadditionssalz davon, worin R, X, Y, Z und R die oben definierte Bedeutung haben und mit der Maßgabe, daß wenn X Lys ist und Z VaI, dann Y nloht Asp, Asnv AIa, Asu oder GIu ist; und wenn X Lys ist, dann Y nicht Asp'ist; und wenn X AIa ist,und Z VaI, dann Y nicht Asp ist. Die Erfindung betrifft auch eine Reiho von Pentapeptiden, die gekennzeichnet sind durch die Fähigkeit, Aktivität in MOLT-4-Zellen hervorzurufen und die allgemeine FormU
R2 - Arg - X» - AIa - Y1 - Z' -R3 (II)
aufweisen, oder dessen pharmazeutisch annehmbares Säure- oder Basenadditionsaalz, woj gebene Bedeutung haben«
2 3
Basenadditionsaalz, worin R , Xf, Ys, Z1 und R die oben ange-
Unter dem hier verwendeten Begriff "I^ederalkyl" werden verzweigte und geradkettige·gesättigte Kohlenwasserstoffraste verstanden, die 1 bis 6 Kohlenstoffatome aufweisen, wie Methyl,
Ethyl, Propyl, Isopropyl, Pentyl, Hexyl und ähnliche, während unter dem Begriff "Niederalkanoyl"
Il
Niederalkyl -C-verstanden wird.
Im Rahmen dieser Offenbarung cind die Aminosäurekomponenten der Peptide und bestimmte, bei ihrer Herstellung eingesetzte Materialien, durch gebräuchliche Abkürzungen bezeichnet» Die meisten dieser dreibuchstabigen Abkürzungen für Aminosäuren sind bekannt. Verschiedene weniger bekannte Abkürzungen sind Asu für Amino-Suecinimidyl und GIp für Pyroglutamyl (auch p-Glu). Wenn nichts anderes angegeben ist, liegen alle Aminosäuren in der L-isomeren Konfiguration vor« Wo die D-isomere Konfiguration gewünscht ist, wird es in dieser Weise angegeben.
Bestimmte bevorzugte Tetrapeptide der vorliegenden Erfindung sind solche der obigen Formel I, worin X Pro oder Aib iste Noch bevorzugtere Peptide sind solche der Formel I, worin X»Pro, Y=VaI und Z « Ala ist, oder worin X Pro, Y AIa und Z VaI ist. Einige der bevorzugten : · Tetrapeptide sind die folgenden Peptide
Acetyl-Arg-Pro-VaI-AIa-NH2 Arg-Pro-Asp-Val Arg-Pro-Asp-ValJSH2 Formyl-Arg-Pro-Asp-Val Acetyl-Arg-Pro-Asp-Val Acetyl-Arg-Pro-Asp-Val-NH2 Acetyl-Arg-Pro-Ala-Val-NH2 Acetyl-Arg-Pro-D-beta-Asp-Val-NH2 Acetyl-Arg-Pro-Glu-Val-NH2 Acetyl-Arg-Pro-Glu-Val Acetyl-Arg-Aib-Ala-Val-NH2 Acetyl-Arg-Aib-Glu-Val-NH2 Acetyl-Arg-Pro-beta-A8p-Gly-NH2
Bestimmte bevorzugte Pentapeptide der vorliegenden Erfindung sind solche der Formel II, worin X1 Pro oder Aib ist. Nooh bevorzugtere Peptide sind solche der Formel II, worin X1 Pro, Y' VaI und Z' Tyr ist. Noch weiter bevorzugte Pentapeptide sind die folgenden Peptide
Arg- Pro-Ala-Val-Tyr Arg-Pro-Ala-Val-Tyr·-NH2 Acetyl-Arg-Lys-Ala-Val-Tyr-NH2
Zu Säuren, die in der Lage sind, mit diesen Peptiden Salze zu bilden, gehören (sind aber nicht darauf beschränkt) anorganische Säuren wie Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Perchlorsäure, Salpetersäure, Thiocyansäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure und ähnliche. Zur Bildung der erfindungsgeraäßen Salze können auch organische Säuren eingesetzt werden, zum Beispiel Ameisensäure Essigsäure, Propionsäure, Glycolsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure, Oxalsäure, Malonsäure, Succinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Anthranilsäure, Zimtsäure, Naphthalensulfonsäure, SuIfanilsäure und ähnliche.
Eine unvollständige Liste von Basen, die in der Lage sind, Salze mit solchen Peptiden zu bilden, die saure Gruppierungen aufweisen, stellt die folgende dar t anorganische Basen wie Natriumhydroxid, Ammoniumhydroxid, Kaliumhydroxid und ähnliche; sowie organische Basen wie Mono-, Di- und Trialkyl- und -arylamine (z.B. Triethylamin, Diisopropylamin, Methylamin, Dimethylamin) und gegebenenfalls substituierte Ethanolamine (z.B. Ethanolamin, Diethanolamin), wobei diese nicht darauf beschränkt sind.
Die erfindungsgemäßen Peptide können im allgemeinen nach bekannten Verfahren hergestellt werden. Üblicherweise erfolgt die synthetische Herstellung der erfindungsgemäßen Peptide nach den Methoden der synthetischen Festphasensynthese, die von Merrifield in J.A.CS. 8^:2149-2154 (1963) beschrieben wordenist.
Diese Teohnik wird gut beherrsoht und ist^elne Ubliohe Methode für die Peptidherstellung. Die Methode der Festphasensynthese besteht in einer schrittweisen Ankopplung gesohützter Aminosäuren an eine wachsende Peptidkette, die über kovalente Bindungen an ein festes Harzteilohen gebunden ist. Bei dieser Methode werden Reagenzien und Nebenprodukte durch Filtrieren entfernt, wodurch die Notwendigkeit der Reinigung von Zwischenprodukten entfällt. Das allgemeine Konzept dieser Methode hängt von dem Angriff der ersten Aminosäure der Kette auf ein festes Polymeres durch eine kovalente Bindung ab. Nachfolgend werden gesohützr te Aminosäuren hinzugefügt, eine in einem Zeitabschnitt oder in Blöcken, in einem Stufenverfahren, bis die gewünschte Sequenz vervollständigt ist. Schließlich wird das geschützte Peptid vom Festharzträger abgetrennt, und die Schutzgruppen werden abgespalten.
Die Aminosäuren können an ein beliebiges Polymeres angekoppelt sein. Das Harz muß eine funktioneile Gruppe aufweisen, an die die erste geschützte Aminosäure über eine kovalente Bindung angefügt v/erden kann. Für diesen Zweck sind verschiedene Polymere geeignet, beispielsweise Zellulose, Polyvinylalkohol, Polymethyl« methacrylat und Polystyren. Entsprechend geeignete Schutzgruppen die bei derartigen Synthesen einsetzbar sind, sind t-Butyloxyoarbonyl (BOO), Benzyl (BZL), t-Amyloxycarbonyl (AOC), Tosyl (Tos),o-Bromphenylmethoxycarbonyl (BrZ), 2,6-Dichlorbenzyl (Gl2BZL) und Phenylmethoxycarbonyl (Z oder GBZ).
Zusätzliche Schutzgruppen sind in dem obigen Text genannt sowie in JiF0W. McOmie "Schutzgruppen in der organischen Chemie", Plenum Press, New York, 1973. Auf beide Werke wird hier Bezug genommen.
Die generelle Verfahrensweise bei der Herstellung der erfindungsgemaßen Peptide besteht darin, zuerst die geschützte C-terminale Aminosäure an das Harz anzubinden. Nach der Ankopplung
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wird das Harz filtriert, gewaschen und die Schutzgruppe an der C-terrainalen Aminosäure entfernt. Bs iat wünschenswert, daß diese Schutzgruppe t-Butyloxycarbonyl ist. Die Entfernung dieser Schutzgruppe muß natürlich so erfolgen, daß dabei die Bindung zwischen der Aminosäure und dem Harz nicht aufgebrochen wird. An das erhaltene Harzpeptid wird dann die O-terminal gesohützte Aminosäure angekoppelt. Diese Kopplung erfolgt durch die Bildung einer Araidbindung zwischen der »freien Carboxygruppe der zweiten Aminosäure und der Arainogruppe der ersten, an das Harz gebundenen Aminosäure. Dieses Sequenzergebnis wird mit den nachfolgenden Aminosäuren wiederholt, bis alle Aminosäuren an das Harz angefügt worden sind. Schließlich wird das geschützte Peptid vom Harz abgetrennt und die Schutzgruppen abgespalten, wobei man das gewünschte Peptid erhält. Die Technik des Abapaltens, die zur Abtrennung des Peptide vom Harz und zur Entfernung der Sohutzgruppen eingesetzt wird, hängt von der Auswahl des Harzes und der Schutzgruppen ab und ist dem Fachmann auf dem Gebiet der Paptidsynthesen geläufig.
Alternative Methoden zur Herstellung von Peptiden sind in "Peptldsynthesen" von Bodansky et al., 2.Auflage, John Wiley and Sons, 1976, beschrieben. Beispielsweise können die erfindungsgemäßen Peptide auch unter Verwendung von Standardverfahren der Lösungspeptidsynthese hergestellt werden, wobei entweder eine stufenweise oder eine Blockkopplung der Aminosäuren oder PeptidfragJnente unter Verwendung chemischer oder enzymatisoher Methoden der Amidbindungsbildung erfolgt. Diese Lösungssyntheseverfahren sind aus dem Stand der Technik bekannt.
Die erfindungsgemäßen Peptide können auch durch andere, den Fachleuten bekannte Methoden hergestellt werden, beispielsweise durch Methoden des genetic engineering, siehe z.B. Tr Maniatis et al in "Molekulares Klonieren - ein Laboratoriumshandbuch", Gold Spring Harbor Laboratory, Gold Spring Harbor, New York, 1982,
Es wurde gefunden, daß die erfindungsgemäßen Peptide eine biologische Aktivität aufweisen, ähnlioh wie Human-Thysplenin, und wie dafür in der oben angeführten US-Patentanmeldung und den Artikeln beschrieben. Diese biologische Aktivität wird in erster Linie durch eine Assay augenscheinlich, bei der die Induktion der cyclischen GMP-Produktion in der Human-T-Zelline ΜΟΙιΐ-4 vergleichend gemessen wird mit Human-Thysplenin und Human-Thymopentin. Die Induktion der c-GMP~Produktion durch ein erfindungsgemäßes Peptid in dieser Assay zeigt die Fähigkeit dieses Peptids, an die Humun-Thysplenin-Reseptorstelle an der Zelle anzukopplen und Human-Thysplenin-ähnllche Aktivität hervorzurufen.
Viele der in Rede stehenden Tetrapeptide und Pentapeptide zeigen einen weiteren signifikanten Vorteil gegenüber Human-Thysplenin. Viele der erfindungsgemäßen Peptide sind gekennzeichnet durch Widerstandsfähigkeit gegen enzymatischen Abbau durch Verdauungs- oder Serumenzyme0 Sie zeigen daher eine verlängerte Halbwertszeit in vivo, wenn sie einem biologischen Objekt durch Injektion verabreicht werden. Ein anderer Vorteil vieler dieser Peptide ist die Möglichkeit, sie oral zu verabreichen. Human-Thysplenin selbst hat ein zu großes-Molekül, um effektiv oral verabreicht zu werden und würde im Magen-Darm-Trakt abgebaut werden.
Vor dem Test der Peptide der vorliegenden Erfindung war nicht zu erwarten, daß Tetra- oder Penta**peptidanaloga von Human-Thysplenin hergestellt werden können und sie die gleiche biologische Spezifik aufweisen, da Arg-Lys-Ala-Val-Tyr, welches das Humsji-Analoge des Rinderpentapeptids SP-5 (Arg-Lys-Glu-Val-Tyr) darstellt, bei MOLT-4 Zellen inaktiv ist. Die Entdeckung von Pentapeptid- und Tetrapeptidanaloga von Human-Thysplenin, die die gleiche biologische Aktivität wie das intakte Human-Thyspleninmolekül zeigten, war daher überraschende
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Wefeen der imrauninodulatorisohen Charakteristik^ der den Erfindungsgegenstand bildenden Peptide sind dise therapeutisch nützlich bei der Behandlung von Menschen und möglicherweise auch von Tieren, da aie die Fähigkeit aufweisen, die Differenzierung und Reifung von T-Zellen zu induzieren, die in die Immunreaktion des Körpers miteinbezogen sind« Im Ergebnis sind die erfindungsgemäi3en Peptide in mehrfacher therapeutischer Hinsicht verwendbar.
Die erflndungagemäßen Peptide werden als nützlich ". angesehen bei der Stützung des Gesamt-Immungeaohehens im Körper, da sie die therapeutische Stimulierung der zellulären Immunität erhöhen oderbel ihr mitwirken« Sie sind dadurch zur Behandlung von Krankheiten des Bereiches der chronischen Infektionen wie fungale oder Myooplaamainfektionen einzusetzen, sowie bei Tubefckulose, Lepra, akuten und chronischen Infektionen und ähnlichem.
Die dem Erfindungsgegenstand zugehörenden Peptide der pharmazeutischen Zusammensetzungen, die diese Peptide enthalten, oder deren saure oder basische Salze sind allgemein gesehen auf einem Gebiet nützlich, bei dem die zelluläre Immunität ein Problem ist und insbesondere dort, wo Immundefekte auftreten. Y/enn daher ein Überschuß in der Antikörperproduktion wegen nicht ausgeglichener T-Zellen zu verzeichnen ist, können die erfindungagemäßen Peptide durch Stimulierung der T-Zellenfunktion diese Bedingung korrigieren. Es iat daher zu erwarten, daß sie therapeutiscehn Wert aufweisen bei gewissen Autoimmunkrankheiten, bei denen schadhafte Antikörper produziert werden wie z.B bei syatemischem Lupus erythematodea, rheuraatoider Arthritis oder ähnlichem.
In ihrer breitesten Anwendung sind die erfindungsgemäßen Peptide oder diese enthaltende pharmazeutische Verbindungen nützlich für die Regulierung dea Immunay^ema eines Objektes, Mensch oder
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Tier, das eine solche Regulierung benötigt.
Unter dem hier benutzten Begriff "regulieren" wird verstanden, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen das Imraunsystem veranlassen, von einem anormalen, kranlchften Zustand zu einem normalen, im Gleichgewicht befindlichen Zustand zurückzukehren. Während diese Regulierung große Anwendung bei der Korrektur immunologischer Defekte (z0B0 DiGeorgi-Syndrom) finden kann, ist sie auch anwendbar, um Bedingungen überschüssiger immunologischer Aktivität (zoB. Autoimmunkrankheiten) zu korrigieren.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher auch Methoden zur Regulierung des Immunsystems eines Menschen oder Tieres, der/das eine solche Regulierung benötigt, durch Verabreichung wenigstens eines der Peptide in einer das Imniunsystem regulierenden wirksamen Menge an den Menschen oder das Tier, sowie Pharraa·- zusammensetzungen zur Anwendung dieser Methoden.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Behandlung von Zuständen, die sich aus relativen oder abjoluten Defekten des Immunsystems eines Objektes ergeben, insbesondere als T-Zellen-Helferfunktion, gekennzeichnet durch Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge wenigstens eines der erfindungsgemäßen Peptide an dieses Objekt.
Der hier benutzte Begriff "therapeutisch wirksam" bedeutet eine Menge, die wirksam ist, die oben genannten Zustände zu behandlen. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Hervorrufen der Differenzierung und Reifung von T-Zellen, gekennzeichnet durch Verabreichen einer für die Induktion wirksamen Menge von wenigstens einem der erfindungsgemäßen Peptide, und zwar an ein Objekt.
Die Erfindung betrifft weiterhin pharmazeutische Zusammensetzungen, um diese Verfahren anzuwenden. Zur Herstellung der
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erfindungsgemäßen Zusammensetzungen wird ein erfindungsgemäßes Peptid als aktiver Bestandteil in ein inniges Gemisch mit einem pharmazeutischen Trägerstoff nach übliohen pharmazeutischen Verarbeitungstechniken gebracht. Dieser Träger kann eine Vielzahl von Formen aufweisen, abhängig von der für die Verabreichung gewünschten Form, z.B. oral, sublingual, rektal, nasal oder parenteral.
Bei der Herstellung der Zusammensetzungen in der bevorzugten oralen Dosierungsform können beliebige übliche pharmazeutische Medien eingesetzt werden. Für oral flüssige Zubereitungen (z.B. Suspensionen, Elixiere und" Lösungen) können Medien eingesetzt werden, die beispielsweise Wasser, Öle, Alkohole, Geschmacksstoff , Konservierungstoffe, Färbemittel und ä.'anliches enthalten. Träger wie Stärke, Zucker, Verdünnungsmittel, Granulierungsmittel, Gleitmittel, Bindemittel, Verteilungsraittel und ähnliche können be.i der Herstellung oraler Feststoffe (b.B. Pulver, Kapseln und Tabletten) verwendet werden. Auch Formen mit gesteuerter Freisetzung können verwendet werden. Wegen der besonders leichten Verabreichung stellen Tabletten und Kapseln die vorteilhafteste orale Dosierungsform dar, bei der feste pharmazeutische Trägerstoffe in naheliegender Weise eingesetzt werden können. Gewünschtenfalls können Tabletten nach Standardverfahren zuckerüberzogen oder für den Darm überzogen sein.
Für parenterale Produkte enthält der Träger üblicherweise steriles Wasser, obgleich auoh andere Bestandteile, z.B. die Löslichkeit verbessernde oder konservierende, mit eingearbeitet werden können. InJizierbare Suspensionen können ebenfalls hergestellt werden, wobei entsprechende flüssige Träger, Suspendierungsmittel und ähnliche Stoffe eingesetzt werden können.
Ein erfindungsgemäßes Tetrapeptid oder Pentapeptid ist im allgemeinen aktiv·, wenn es in Mengen von über etwa 1 /Ug/kg Körpermasse verabreicht wird, vorzugsweise von etwa 0,001 bis etwa 10 mg/kg Körpermasse. Im allgemeinen ist bei der Behandlung
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der genannten Krankheiten oder Zustände, wo ein Immundefekt zu behandeln ist, der gleiche Dosierungsbereich anzuwenden. Größere Mengen (z. B. über IO - 100 mg/kg Körpermasse) sind für die Unterdrückung einer übermäßigen Immunaktivität nützlich.
Die folgenden Beispiele dienen der Erläuterung dor Erfindung, ohne daß die Erfindung darauf speziell beschränkt werden soll. In den Beispielen und in der Beschreibung sind, wenn nichts anderes ausgeführt werden sollte, Teile stets Masseteile. In den Beispielen werden die folgenden Abkürzungen verwendet:
TFA für Trifluoressigsäure; HOAc für Essigsäure; CH2Cl2 für Methylenchlorid; CH3CN für Acetonitril; DMF für Dimethylformamid; NH4OAc für Ammoniumacetat; MH4OH für Ammoniumhydroxid; n-PrOH für n-Propanol; n-BuOH für n-Butanol; pyr für Pyridin; DCC für Dicyclohexylcarbodiimid; HOBt für 1-Hydroxybenzotriazol; DMAP für Dimethylamlnopyridln; HF für Fluorwasserstoff; TCA für Trichloresslgsäure; BHA für Benzhydrylamin; und MeCH für Methanol.
Das oben genannte Tetrapeptid wurde nach der Festphasensynthese über stufenweise Ankopplung synthetisiert. All. Aminosäuren wurden an ihrer alpha-Aminogruppe mit einer t-Butyloxycarbonylgruppe (BOC) geschützt. Tosyl (TOS) wurde verwendet, um die Seitenkette von Arg zu schützen. Die geschützten Aminosäuren wurden eingesetzt mit 2,5 Äquivalenten im Überschuß im Ver-
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gleich zu jedem Äquivalent der Substitution des Harzes. Alle Kupplungen erfogten durch DCC/HOBt und bei gleichen Äquivalenten an geschützten Aminosäuren. Alle Aminosäuren wurden in CH2Cl2 gelöst , mit Ausnahme von Arg, das in OMF gelöst wurde.
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| 1. | CH2Cl2 | TPA - CH2Cl2 | 2 | X | 3 | Min | Min | Min |
| 2. | 1 | X | 3 | Min | Min | Min | ||
| 3. | 50 % TPA-CH9CIp | Isopropanol - CH2Cl2 | 1 | X | 30 Min | Min | Min | |
| 4. | 50 Prozent | 1 | X | 3 | 10 Min | 10 Min | ||
| 5. | 0V1I2 | Diisopropyle thylamin | 2 | X | 3 | 3 | Min | |
| 6. | 40 Prozent | 2 | X | 3 | 3 | Min | ||
| 7. | CH2Cl2 | 2 | X | 3 | Min | |||
| 8, | 10 Prozent | 1 | X | 1i | Min | |||
| 9. | CH2Cl2 | 1 | X | 3 | ||||
| 10 | Aminosäure | 1 | X | 3 | ||||
| 11 | ο HOBt | Isopropanol - CH2Cl2 | 1 | X | 3 | |||
| 12 | • DCC | 2 | X | 3 | ||||
| 13 | . CH2Cl2 | 2 | X | |||||
| 14 | ο 40 Prozent | 1 | X | |||||
| 15 | . DMP | 2 | X | |||||
| a) | . CH2Cl2 | |||||||
| Synthese |
Daa geschützte Peptid wurde unter Verwendung eines Beokmann-Peptidsyhthetisators Modell 990, synthetisiert. Das erhaltene Tetrapeptidharz lag bei 0,67 meg/g,und die Synthese begann mit 5|0 g (3»35 mmol) Harz. Das erhaltene Totrapeptid wurde dann acetyliert durch Behandlung des Harzes mit t
| 1. | CH2Cl2 | TPA - CH2Cl2 | 2 | X | VjJ | Min | Min |
| 2. | 50 Prozent | TPA - CH2Cl2 | 1 | X | 3 | Min | 20 Min |
| 3. | 50 Prozent | 1 | X | 3 | Min | ||
| 4. | CHoCl2 | Isopropanol - CH2Cl2 | 1 | X | 3 | Min | |
| 5. | 40 Prozent | 2 | X | 3 | Min | ||
| 6. | CH2Cl2 | Diisopropylethylamin | 2 | X | 3 | Min | |
| 7o | 10 Prozent | 2 | X | 10 Min | |||
| 8* | CH2Cl2 | Essigsäureanhydrid - | 1 | X | VaJ | ||
| 9. | 50 Prozent | einer katalytischen | 1 | X | Yc | ||
| CH2Cl2 mit. | Menge an DMAP | ||||||
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10. CH2Ol2 2 χ 3 Min
11. 40 Prozent Iaopropanox - CH0Cl2 2x3 Min
12. DMP " 1x3 Min.
13. CH2Cl2 2x3 Min
Das Peptidharz wurde unter vermindertem Druck nach Waschen mit Ethanol (2 χ 50 ml) getrocknet.
b) HP-Spaltung
Das rohe Tetrapeptid wurde durch Spaltung des Harz-Peptids mit HP (25 ml) und Anisol (25 ml) über visr Stunden bei 0 0C erhalten. D?.e HP wurde unter vermindertem Druck entfernt. Zum Gemisch wurden 150 ml Diethylether hinzugesetzt. Die Lösung wurde gerührt und in einen gesinterten Glastriohter gegeben und mit weiterem Diethylether gewaschen (3 x 100 ml). Das Pepcid wurde aus dem Harz mit 10 %iger HOAc (3 x 100 ml) extrahiert und die wäßrige Lösung lyophilisiert, wobei man 1,20 g erhielt.
o). Reinigung
Das Produkt wurde durch präparative Hochleistungs-i'lüssigohroraatografie. (HPLC) unter den folgenden Bedingungen gereinigt: Whatman-Sa'ule Partisil M 20 10/50 0DS3; 200 mg Probe unter Ver-
JE»·
wendung eines isokrftisohen 15 %igen ΟΗ^ΟΝ/Ο,οΐ Μ NH.OAc-Systems (pH 5 mit HOAc eingestellt); Durohflußgeschwindigkeit 15 ml/min; 220 mn Nachweiswellenlänge. Alle reinen Fraktionen wurden gesammelt. Das organische Lösungsmittel wurde eingedampft und die wäßrige Lösung lyophilisiert, wobei man 258 mg eines weissen Peststoffes erhielt.
Aminosäureanalyse : iro 1,00; AIa 1,00; VaI 1,00} Arg 1,01; 83 Prozent Peptide0
Dünnschichtchromatografie (Silica 60/Analtech) Rf(I) = 0,50 (Butanol:Essigsäuro:Wasser/ 3:1:1) a 0,59 (Butanol:IyridinjEssigsäure:Wasser/ 4:1:1:2)
) - 0,29 (Butanol:Essigsäure:WasserjEthylacetat / 1:1:1:1)
Synthese eines Tetrapeptide» Aoetyl-Arg-Pro-Val-Ala-NHr,
a) Synthese
Das Peptid wurde auf dem Peptidsynthetiaator von Applied Biosystems, Modell *30A, hergestellt. Es 'viurde das Std 1-Zyklus-Verfahren (Herstellervaroion 1*40) eingesetzt, bei dem jede Aminosäure einmal angekoppölt wurde mit Ausnahme von BOC-Tos-Arg, das doppelt angekoppelt wurde. Bei der Synthese wurden die /olgenden, vorher gepackten Asugangsmaterialien eingesetzt:
| Reaktionsmittel | Herkunft | mMol | Menge |
| p-Methyl-BHA-Harz | ABI | 0,50 | 760 mg |
| BOO-Tos-Arg | ABI | 2,0 | 857 mg |
| BOO-Pro | ABI | 2,0 | 430 mg |
| BOC-VaI | ABI | 2,0 | 434 mg |
| BOO-AIa | ABI | 2,0 | 378 mg |
Nachdem die BOG-Gruppe von Arginin entfernt und das Peptidharz neutralisiert und gewaschen worden war, wurdee die Verbindung unter Verwendung von 10 ^i^em Essigsäureanhydrid in CH0Ol5 (15 v*l) in Anwesenheit von 4-Dimethylaminopy.»?idin (20 mg) acetyliert. Nach 60 Minuten wurde das Peptid mittels Ninhydrintest überprüft, um die vollständige Acetylierung zu sichern» Das Peptidharz wurde mit CHpCIp gewaschen und vakuumgetrocknet (Raumtemperatur), wobei man 1,0 g des Materials erhielt.
b) HF-Spaltung
Das Peptid wurde unter Verwendung von 10 ml HP in Gegenwart von 1,5 ml Anisol vom Harz abgespaltene Gas Gemisch wurde bei O0C 1,5 Stunden gerührt, und danach wurde die HP unter vermindertem Druck entfernt. Dps Gemisch wurde mit EtpO (3 x 50 ml) gewaschen und luftgetrocknet. Das Peptid/Harz-Genlsch wurde mit 25 %iger wäßriger HOAc (3 x 50 ml ) extrahiert.
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c) Reinigung
Das wäßrige Piltrat wurde lyophllisiert, wobei man 240 rag Rohmaterial erhielt. Dieses Material wurde durch ein Ionenaustauschharz Amberlit IRA b8 - Acetatform) in Wasser geführt. Peptid enthaltende Fraktionen wurden gesammelt und lyophilislert (220 mg).
Das Peptid wurde auf einer Whatman-Partisil 20IvI 10 ODS-3-Säule (22mm χ 50 cm) gereinigt unter Verwendung von 15 % Acetonitril (0,1 % Trifluoressigaäure) und wäßriger 0,1 %iger Trlfluoressigsäure als Eluierungamittel (10,0 ml/Min). Die Bluierung wurde über HPLO verfolgt und die entsprechenden Fraktionen wurden vereinigt und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde in HgO ' gelöst und zweimal lyophilisiert, wobei man 167 mg des Produktes mit einer Geaamtausbeute von 50 % erhielt.
Aminosäureanalyse : Arg 1,04} Pro 1,02; VaI 1,00} AIa 1,01} 72 Prozent Peptide.
Dünnschichtchromatografie(Silioagel GF 250 ,um Platten) Rf(I) = 0,37 (n-Bu0H:H0Ac:H20/3;1j1) = 0,15 (CH013:Me0H:HOAc/6O:35t5) = 0,48 (n-Bu0HiH0AciH20jEt0Ac/1:1:1:1) .
Synthese eines Tetrapeptids: Aoetyl-Arg^Pro-Aap-VaI-NHg
a) Synthese
Die Titelverbindung wurde über eine Standard-Festphasensynthese unter Verwendung eines Beckmann-Synthetisators, Modell 990, synthetisiert. Die Synthese wurde mit 5,0 g BHA-Harz (O1,67 meg/ g) begonnen« Nachdem das Ankoppeln von BOO-Arg(Tos) beendet war, wurde die tert-Butyloxyoarbonyl-Schutzgruppe mit 50 %igem TFA
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in OH9Gl9 entfernt und das Harz-Peptid mit 50 prozentigom Essigsäureanhydrid in CH2Ol2 in Anwesenheit einer katalytiachen Menge DMAP aoetylierto Das Peptid-Harz wurde mit Ethanol (2 χ 50 ml) gewaschen und unter vermindertem Druok vor der HF-Spaltung über Naoht getrocknet. Das trockene Peptid-Harz wog 6,5 g .
b) Spaltung (Hf)
Das rohe Tetrapeptid wurde durch Spalten von 6,5 g des Harz-Peptids mit 25 ml HF und 25 ml Anisol bei 0 0G über 4 Stunden erhaltene Die HF wurde unter vermindertem Druok abgedampft und 150 ml Diethylether zum Reaktionsgemisch hinzugegeben. Das rohe Peptid und das Harz wurden in einen gesinterten Glastriohter gegeben und mit Diethylether (3 x 100 ml) gewaschen. Das Peptid wurde mit 10 % HOAc (3 x 100 ml) extrahiert und die wäßrige Lösung lyophilisiert, wobei man 900 mg eines weißen Feststoffes erhielt.
c) Reinigung
Das Rohprodukt (98 prozentige Reinheit gemäß HPLG) wurde auf einer Sephadex LH-20-Säu.Te (100 g; 2,5 cm χ 89 cm) entsalzen unter Verwendung von 10 prozentiger HOAc als Eluierungsmittel. Nach der Lyophilisierung lag das Produkt als ein weißer, flokkiger Feststoff vor, wobei dieser weiße Feststoff 800 mg ausmachte.
Aminosäureanalyse j Arg 0,99} VaI 1,00; Pro 1,05; Asp 1,01
Dünnschichtchromatografie (Sllioa 60/Merck, 250 F) Rf(D = 0,51 U-BuOHiHOAcJH2O/ 3:1 :1 ) Rf(II) =0,60 (n-Bu0H:H0AcJH2O:StOAc/ 1:1:1:1) Rf(III) = 0,59 (n-BuOH:Pyridin:HOAc:H2O/ 4:1:1:2)
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a) N-t-Butyloxyoarbonyl-fi-benzyl-Aspartyl-Valin-benzyleater
In 80 ml 0H0Ol0 wurden 3»23 g N-t-Butyloxycarbonyl-ß-benzyl-Asp und 3,97 g Val-benzyleater-ftosylat gelöst. Dann wurden 1,74 ml Diisopropylethylamin hinzugegeben und die Lösung auf 5 0O gebrachte Zu dem Gemisch wurden 2,06 g DOG gegebene Das Gemisch wurde bei 5 ° für 30 Minuten gerührt und im Anschluß daran zwei weitere Stunden bei Umgebungstemperatur. Der Niederschlag wurde abfiltriert und das Filtrat mit Wasser, 10 % iger Citronensaurelöaung und gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung extrahiert. Wach Entfernung des Löaun amittels erhielt man ein Öl, das durch Chromatografie über Silicagel 60 mit 97:3 CH2Ol2-MeOH gereinigt wurde. Das Produkt, ein Öl, wog 3,46 go
b) N-t-Butyloxyoarbonyl-Prolyl-ß-benzyl-Aapartyl-Valinbenzyleater
Nach Entschützen von 3,41 g des obigen Produktes mit 60 ml 2:1 CH2Cl2-TFA über 30 Minuten erhielt man das Trifluoracetat salz als ein Öle Daa freie Amin erhielt man durch Neutralisieren mit gesättigter Natrium! .carbonatlösung und Extraktion in OH Cl2. Der Extrakt v/urde durch Eindampfen im Volumen reduziert und anschließe«! zu 1,05 g N-t-Butyloxycarbonyl-Pro hinzugegeben. Eine Lösung von 0,73 g HOBt in 2 ml DMF wurde hinzugesetzt, gefolgt von 0,99 g DCO. Daa Gemisch wurde 21/2 Stunden gerührt und im Anschluß daran abfiltriert. Das Filtrat wurde extrahiert mit Wasser, 10 prozentiger Citronensäurelöaung und zweimal mit gesättigter Natriumhydrogenkarbonatlöaug^, Nach dem Trocknen wurde das Lösungsmittel entfernt, wobei man ein Öl erhielt. Das Produkt wurde durch Sehnellchromatografie über Silicagel 60 mit 9:1 CH2Cl2-CHoCN gereinigt. Die Fraktion, die die Hauptkomponente enthielt, erbrachte 2,31 g eines farblosen
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Öles, IR-Spektrum» 1740 onf1, 1695 cm"1 und 1675 cm"1,
c) N-alpha-Formyl-N -nitro-Arffinyl-Prolyl-ft-benzyl-ABpartyl-Valin-benzylester
Zu 2,23 g des oben genannten Produktes wurden 60 ml 1«2 TFA-OH2Ol2 gegeben. Die Lösung wurde 30 Minuten gerührt und ansohließend das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt, wobei ein wachsartiger Peststoff anfiel, der mit Petrolether gewaschen wurde. In 15 ml DMF wurden 0,72 g N-alpha-Formyl-N nitro-Arginin und 0,33 ml N-Methylmorpholin gelöst. Die Lösung wurde auf -20 0O abgeschreckt und tropfenweise 0,40 g Isobutylchlorfflformiat hinzugegeben. Das Gemisch wurde bei -20 0C bis -10 0C für 20 Minuten gerührt und im Anschluß daran wurde eine abgekühlte Lösung des Prolyl-ß~benzyl-aspartyl-valin-benzylester-trifluoracetats in 20 ml DMF und 0,33 ml N-Methylmorpholin hinzugesetzt. Das Gemisch wurde bei -15 0O für 20 Minuten gerührt, anschließend das Kühlbad entfernt und das Rühren bei Umgebungstemperatur für zwei Stunden fortgesetzt. Der meiste Teil Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde in 50 ml OH2Ol2 gelöst und mit Wasser, 10 prozentiger Zitronensäurelösung und gesättigter Natriumhydrogenoarbonatlösung extrahiert» Die organische Schicht wurde getrocknet und das Lössungsmittel eingedampft, wobei man 2,08 g erhielt.
Dünnschichtchromatografie (Silicagel GF) ι Rf(I) = 0,56 (CH2GL2:Me0H/9:1)
Rf(II) = 0,72 (0Hßi3:Me0H:H0Ac/8j1»1)
d) N-alpha-Formyl-Argi nyl-Prolyl-Aspartyl-Valin
Das Entschützen wurde durch Wasserstoffübertragung mit 30 ml 5 prozentigem Ameisensäure-Amraoniumformiat über Palladiumschwarz vervollständigt. Das Reaktionsgemisch wurde in einem Kurzhals-Rundkolben 18 Stunden lang gerührt. Nach dem Abfiltrieren des Gemisches durch Oelit wurde das Lösungsmittel unter
vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde in Wasser gelöst und lyophilisiert. Das Produkt wurde über eine 1,6 χ 60 cm DEAE-Sephadex-Säule gereinigt. Die Eluierung wurde begonnen mit 0,02 M Ammoniumhydrogencarbonat von pH 8,5 unter Sammeln von 150 Tropfen-Fraktionen. Nachdem 52 Fraktionen gesammelt worden waren, wurde mit einem Gradienten von 0,02 bis 0,20 M Ammoniumhydrogenoarbonat übar 2 L begonnen. Der größte Peak im eluierten Chromatogramm erreichte mit der Fraktion 88 seinen Höhepunkt< Die Fraktionen 75 bis 100 wurden vereinigt und lyophilisiert, wobei ein flookiger, amorpher Feststoff anfiel. HPLCj rt = 9,4 Min. mit 10 %LIeOH - 0,01 N NH.OAc pH 5 bei 1,5 ml/min auf Bondapak-C-Q.
Dünnschiohtchromatogi'af ie, (Silioagel 60)j Rf(I) =0,16 (u-BuOHjHOAc:H2O/3;1i1) = 0,27 (n-BuOHjHOAciH2OiPyr/15»3i12j1O) = 0,42 (EtOAc:Pyr:HOAcjH2O/5i5j1:3)
Aminosäureanalyce ι Asp 0,99; Pro 0,97; VaI 1,05; Arg 1,00; 38 Prozent Peptide.
Das Peptid wurde mittels Festphasenmethode synthetisiert, beginnend mit BOC-(BZLCl2)-Tyr-HarzesteJ? (4,4 g, 0,40 meg/g). Das Harz wurde nacheinander mit drei Äquivalenten jeweils von BOC-VaI, BOC-AIa, BOC-Pro und CBZo-Arg gekoppelt. Die Kopplnuagsmittel waren DCC und HOBt in 4:1 CH2C12*DMF. Das Harz wurde mit 40 ml HF in 5 ml Anisol abgespalten, wobei dies über 45 Minuten bei 0 0C erfolgte. Der feste Rückstand wurde mit 10 HOAc extrahiert, filtriert und die wäßrige Lösung lyophilisiert, Wobei man 1,56 g des rohen Peptide erhielt.
Die Reinigung erfolgte über Sephadex SPC 25-Chromatografie (2,6 χ 90 cm Säule) unter Eluierung mit einem atufenweisem
Gradienten von NH4OACi 0,05 M, pH 5 (21), 0,15 M, pH5 (11), 0,15 M, pH 6,7 (2 Dj 100 ral/Sbd. Durchflußgeschwindigkeit, 12,5 ml Fraktionen, Bestimmung bei 280 mn. Die Isolierung der Fraktionen 198-207 ergab das Titelpeptid als einen farblosen Peststoff, 1,13 go
Dünnschichtchromatografie (Silicagel g, 250) Rf(I) =0,25 (n-Pr0H:NH40H/84i37) Rf(II) β 0,64 (Trifluorethanol:NH40H/78{22) Rf(III) = 0,58 (n-BuOH:HOAciH2OtPyr/15:3:12»1O)
Aminosäureanalyse t Arg 1,00; AIa 0,96} Pro 0,97} VaI 1,03; Tyr 1,01; 67 Prozent Peptid „
Biologische Aktivität
t
Gyclisches GMP-Aaaay
Mit dieser Assay wurde die Fähigkeit eines erfindungsgemäßen Peptids gemessen, an den Zellmembranrezeptor der intakten MOLT-4-Zelle anzukoppeln und die Produktion von cyclischem GMP selektiv zu stimulieren, wie dies durch Human-Thysplenin undHuraan-Thymopentin geschieht.
Die MOLT-4-Zellinie wurde vom American Type Culture Collection in Rockville, Md. erhalten» MOLT-4-Zellen wurden frisch angesetzt und wuchsen 3 Tage, wonach sie gemäß Beschreibung von T. Audhya et al., Arche Biochenu Biophys., 2^±: 167-177 (1984) geerntet wurden. Die Zellen wurden dreimal in PBS gewaschen und in RPMI I640 bei einer Konzentration von 1,0 χ 10 Zellen pro ml resuspendiert. Dann ließ man sie bei 37 0C für 30 Minuten ins Gleichgewicht kommen, bevor die Zugabe der Test-Tetrapeptide und -Pentapeptide (25 yUl) und der Kontrollpeptide erfolgte. Die Inkubation ließ man in einem geschüttelten Wasserbad für 4-5 Minuten vor sich gehen und beendete sie durch Zugabe von 1 ml eiskaltem TCA (10 Prozent)0
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Die Zellen in TGA wurden homogenisiert und einer Ultraschallbehandlung unterworfen, um das oyolisohe Nucleotid freizusetzen, Die Suspension wurde mit 3000 χ g über 20 Minuten bei 4 0O zentrifugierte Der erhaltene Niederschlag wurde in 0,1 N NaOH gelöst, um den Proteingehalt zu bestimmen TOA wurde aus der überstehenden Fraktion durch viermaliges Extrahieren mit 5ml wassergesättigtem Diethylether entfernto Nach der letzten Extraktion wurden die restliohen Stherspuren durch Erhitzen für 10 Minuten in einem 50 °0-Wasserbad entfernt. Nach der Lyophilisierung der Probe wurde sie in 50 mM Acetatpuffer (pH 6,2) für die Radioimmunoassay der cyclischen GMP auf die Ursprüngliche Konzentration gebracht.
Pig. 1 zeigt typische dosisabhängige Kurven, berechnet aus 1 bis 1000 /Ug/ml für die aktiven Peptide Acetyl-Arg-Pro-ß-D-Asp-Val-NH2, Arg-Pro-Ala-Val-Tyr und Acetyl-Arg-Pro-Ala-Väl-NHp, verglichen mit Thymopentin und den inaktiven Peptiden Aoetyl-Arg-Pro-Asp-Pro-NH2, AIa-Lys-Asp-Val und Lys-Lys-Asp-Val-NH2 in M0LT-4-Zelleno
Fig. 2 zeigt dosisabhängige Kurven, berechnet aus 1 bis 100 /Ug/ml für das aktive Peptid Acetyl-Arg-Pi'o-Val-Ala-NHg, verglichen mit dem Thymopentin-Standard in M0LT-4-Zelleno
Für jedes getestete Peptid wurde eine Schv/ellenaktivität bestimmt. Dfse ist definiert als niedrigste? Konzentration des Testpeptids, die einen intrazellulären Spiegel an cyclischer GMP hervorruft, der größer als zwoi Standardabweichungen über dem Kontrollwert ist. Die Kontrollwerte v/ieaen intrazelluläre cyclische GMP-Werte von weniger als 0,5 Picomole/ml (Mittel^ Standardabweiohung)· auf. Die Testergebnisse wurden als positiv angesehen, wenn der Spiegel von cyclischer GMP größer als das Zweifache (2 Standardabweichungen) war als für die parallele negative Kontrolle bestimmt worden war.
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Die Ergebnisse ddr cyclischen GMP-Aosays sind in Pig.1 und in der damit korrespondierenden Tabelle I sowie in Fig. 2 und in der damit korrespondierenden Tabelle II aufgeführt, in denen repräsentative erfindungsgem^ße Peptide verglichen wurden mit Thymopentin und Kontrollpeptiden. Diese Ergebnisse wurden mit Thymopentin (Arg-Lys-Asp-Val-Tyr) bei MOLT-4 vergliohen,da das Human-Pentapeptid Thysplenin "SP-5" (Arg-Lys-Ala-Val-Tyr) bei MOLT-4 inaktiv ist. Die Ergebnisse zeigen die biologische Aktivität der Peptide der Erfindung bei der Stimulierung der T-Zellen-Helferaktivität in MOLT-4-Zellen.
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Tabelle I oGMP-Konzentration (Plcogramm/ml)
| Peptidkonzentration (,ug/ml) | 1 | 20,56 | 10 | 100 | 1000 |
| Arg-Lya-Aari-Val-Tyr | 6,4 | 0,33 | 18,3 | 20,8 | 21,9 |
| Arg-Pro-Asp-Val-NH2 | 0,1 | '0,44 | 17,1 | 19,3 | 24,8 |
| Acetyl-Arg-Pro-Asp-Val-NHg | 4,*55 | 0,71 | 8,99 | 19,62 | 24,09 |
| Acetyl-Arg-Pro-Glu-Val-NE^ | 4,7 | 0,09 | 9,41 | 16,76 | '25,00 |
| Acety1-Arg-Pro-AIa-VaI-NH2 | 7,1 | •3,71 | 14,6 | 19,1 | 24,5 |
| Acetyl«Arg-Aib-Glu-Val-NH2 | 3,7 | Acetyl-Arg-Lys-Ala-Val-Tyr-NHg 3,OO | 11,0. | 17,7 | 24,9 |
| Acetyl-Arg-Poi-Gln-Val-NHg | 18,75 | O-Peptidkontrolle lag zwiachen 0-0 | 29,68 | 34,98 | 40,23 |
| Acetyl-Arg-Pro-Glu-Val | 4,1 | 11,9 | 7,9 | 30,8 | |
| Ace ijy l-Arg-Aib-Ala-Val-NHg | 18,78 | 30,45 | 36,17 | 39,48 | |
| Acetyl-Arg-Pro-ß-D-Aep-Val-NHp 6,6 | 14,3 | 20,5 | 25,0 | ||
| Acetyl-Arg-Pro-ß-Asp-Gly-KH2 | 31,83 | 36,66 | 34,95 | ||
| Lya-Lys-Asp-Val-NH2 | 0,31 | 0,34 | 0,33 | ||
| Ly8-Arg-Aap-Val- | 0,43 | 0,44 | 0,39 | ||
| Arg-Gly-Aap-Ser | 0,50 | 0,68 | 0,58 | ||
| Arg-Pro-Ala-Val-Tyr | 16,41 | 27,90 | 37,14 | ||
| Arg-Pro-Ala-Val-Tyr-NH2 | 14,15 | 12,83 | 12,57 | ||
| 8,86 | 12,83 | 18,43 | |||
| ,3 pg/ml |
Tabelle II oGUP-Konzentration (Picogramm/inl)
Peptidkonzentration (/Ug/ml): 1 10 100 1000
Arg-Lya-Aap-Val-Tyr 3,55 13,56 18,70 24,,'35 Acetyl-Arg-Pro-Val-Ala-flH^ 7,77 17,39 24,47
Anmerkung: Der Hintergrund iat 0,19 Picomol cGMP/ml
Beiapi . 7 Enzymatiijohe Stabilität
Zur Erläuterung der Stabilität eines Peptide der vorliegenden Erfindung gegen den Abbau durch inteatinale und Serumenzyme wurde als"BeiBpielpeptid Acetyl-Arg-Pro-Asp-Val-NHp bei 37 in Ratteninteatinalsaft und HumanserTum bis zu 120 Minuten inkubiert. Zum Vergleich wurde, daa Tetrapeptid Arg-Lys-Aap-Val und Shymopentin in ähnlicher Weise behandelt«» Die HPLO zeigte an, daß Arg-Lya-Aap-Val nach 25 Sekunden vollständig abgebaut war», Thymopentin war nach etwa 20 Sekunden zu 50 % abgebaut» Das Peptid der vorliegenden Erfindung blieb sowohl im Serum als auch im Intestinalsaft für wenigstens 120 Sekunden im Wesentlichen unabgebaute
Die oben aufgeführten.Beispiele dienen ausschließlich zum Zwecke der Erläuterung und beschränken den Schutzurafang der Erfindung nicht, wie sie in den folgenden Ansprüchen gefaßt ist.
Claims (9)
1. Verfahren zur Herstellung von Peptiden der Formel
R - Arg -X-Y-Z-R1 ,
worin
R Hi niederes Alkyl, Acetyl« Formyl, niederes Alkanoyl ist;
X Pro, Dehydro-Pro, Hydroxy-Pro, D-Lys, Aib oder Lys ist;
Y eine O- oder L-Form einer Aminosäure, gewählt aus Ala, Asp, GIu, Gin, Asn, ß-Asp, VaI, Leu oder He ist;
Z Gly oder eine D- oder L-Form einer Aminosäure, gewählt aus VaI, AIa, Leu oder He ist;
R1 OH oder NR2R3 ist, worin R2 und R3 H oder geradkettige oder verzweigte Alkyl- oder Alkenylgruppen mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen sind, die substituiert sein können mit einer Arylgruppe oder einem Aryl, das mit einem Halogen oder einem geradkettigen oder verzweigten Alkyl oder
Alkenyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen substituiert ist,
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte Harz ein Polymer; oder copolymer ist, welches umfaßt Cellulose, Polyvinylalkohol, Polymethylmethacrylat, Polystyren und Polystyren-Divinylbenzen.
2 3
oder worin R und R zusammen eine cyclische Methylengruppe von 3 bis 7 Kohlenstoffatomen bilden, vorausgesetzt, daß, wenn X Lys ist und Z VaI ist, Y nicht Asp, Asn, Ala, Asu oder Glu ist, und wenn X Lys ist,
Y nicht Asp ist, gekennzeichnet durch:
(a) die Durchführung einer Festphasensynthese mit einem Peptidharz-Zwischenprodukt, das die Aminosäurereste der oben definierten Sequenz in Verbindung mit Schutzgruppen enthält, welche unabhängig gewählt werden aus Aminoschutzgruppen, Hydroxyschutzgruppen, Indolschutzgruppen, Imidazolschutzgruppen, sowie ein Harz, das ein Festphasenpolymer ist, an das Ariginin durch kovalente Bindung fest gebunden werden kann; oder
(b) die Durchführung einer Peptidsynthese in Lösung, die
28 4
29
die stufenweise oder Blockkupplung von Aminosäuren oder Peptidfragmenten, die in der obigen Formel enthalten sind, umfaßt, sowie die Verknüpfung der genannten Fragmente untereinander unter Ausbildung von Amidbindungen, wobei besagtas Verfahren zu dem Peptid der Formel führt.
3* Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die genannten Schutzgruppen umfassen tert-Butoxycarbonyl, Benzyl, tert-Pentyloxycarbonyl, Tosyl, o-Brom-benzyloxycarbonyl, 2,6-Dichlor-benzyl und Benzyloxycarbonyl.
4. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
in dem genannten Peptid X Pro ist, Y Asp, Ala, Glu, D-ß-Asp, VaI, Leu oder He ist und Z VaI oder Ala ist.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß R1 NRR3, R2 CH3 und R3 H ist.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß Acetyl-Arg-Pro-Val-Ala-NHCH3 hergestellt wird.
7. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte Peptid gewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus
Arg-Pro-Asp-Val
Arg-Pro-Asp-Val-NH2
Arg-Pro-Asp-Val-NH2
Formyl-Arg-Pro-Asp-Val
Acetyl-Arg-Pro-Asp-Val
Acetyl-Arg-Pro-Asp-Val-NHg
Acetyl-Arg-Pro-Ala-Val-NHg
Acetyl-Arg-Pro-D-ß-Aep-Val-NHg
Acetyl-Arg-Pro-Glu-Val-NHg
Acetyl-Arg-Pro-Glu-Val
Acetyl-Arg-Aib-Glu-Val-NHg
Acetyl-Arg-Aib-Ala-Val-NHg
Acetyl-Arg-Pro-ß-Asp-Gly-NHg·
8. Verwendung eines erfindungsgemäß hergestellten Peptide, oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes desselben, dadurch gekennzeichnet, daß es zur Herstellung eines phermazeutischen Präparats zur Regulierung des Immunsystems eines Subjekts eingesetzt wird.
9. Verwendung gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte Subjekt eine Infektion oder einen Mangel oder Oberschuß an T-Zellenfunktion hat.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US19613888A | 1988-05-19 | 1988-05-19 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DD284029A5 true DD284029A5 (de) | 1990-10-31 |
Family
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DD32870789A DD284029A5 (de) | 1988-05-19 | 1989-05-18 | Peptide mit t-zellenunterstuetzungsaktivitaet |
Country Status (3)
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|---|---|
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-
1989
- 1989-05-17 MX MX1607689A patent/MX16076A/es unknown
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- 1989-05-18 ZA ZA893713A patent/ZA893713B/xx unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| MX16076A (es) | 1993-12-01 |
| ZA893713B (en) | 1990-02-28 |
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