DD285369A5

DD285369A5 - Verfahren zur immobilisierung von mikroorganismen bzw. coimmobilisierung von mikroorganismen und enzymen

Info

Publication number: DD285369A5
Application number: DD33008489A
Authority: DD
Inventors: Horst Dautzenberg; Michael Foerster; Torsten Hoffmann; Alfred Schellenberger; Klaus-Peter Doepfer; Johanna Mansfeld; Gabriele Holzapfel; Brigitte Tiersch; Wolfgang Wagenknecht; Brigitte Lukanoff; Helmut Kluge; Joachim Roembach
Original assignee: Univ Halle Wittenberg
Priority date: 1989-06-29
Filing date: 1989-06-29
Publication date: 1990-12-12

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Immobilisierung von Mikroorganismen bzw. Coimmobilisierung von Mikroorganismen und Enzymen, das sehr stabile Biokatalysatoren liefert, die auch in Langzeitverfahren und stoffwandelnden Prozessen in der Biotechnologie, chemischen, pharmazeutischen und Lebensmittelindustrie sowie in der Medizin eingesetzt werden koennen. Die Mikroorganismen werden zunaechst durch Einschlusz in Netzwerke aus Polyelektrolytkomplexen vorimmobilisiert. Im Falle der Coimmobilisierung von Mikroorganismen und Enzymen werden die Enzyme an ein Traegermaterial gebunden und die Mikroorganismen und traegergebundenen Enzyme zur Vorimmobilisierung in Netzwerke aus Polyelektrolytkomplexen eingeschlossen. Nach Separation und Sedimentation der vorimmobilisierten Mikroorganismen bzw. Mikroorganismen und traegergebundenen Enzyme im Falle der Coimmobilisierung von Mikroorganismen und Enzymen werden diese in Mikrokapseln eingeschlossen und nach UEberfuehrung in ein fuer die Zuechtung der immobilisierten bzw. coimmobilisierten Biokatalysatoren geeignetes Milieu der gewuenschten Verwendung zugefuehrt.{Immobilisierung von Mikroorganismen; Coimmobilisierung von Mikroorganismen und Enzymen; Vorimmobilisierung; Einkapselung; Polyelektrolytkomplexe; Stoffwandlung}

Description

Anwendungsgebiete der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahmn zur Immobilisierung von Mikroorganismen bzw. Coimmobilisierung von Mikroorganismen und Enzymen zur Herstellung von Biokatalysatoren, die zur Durchführung stoffwandelnder Prozesse in der Biotechnologie, in der pharmazeutischen, chemischen und Lebensmittelindustrie sowie für den Einsatz in der Medizin geeignet sind. Sie finden z. B. Verwendung für die Biosynthese von Medikamenten, hochwertigen Chemikalien, Enzymen usw.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Zur Durchführung biochemischer Reaktionen in der Biotechnologie, pharmazeutischen, chemischen und Lebensmittelindustrie werden verstärkt Mikroorganismen eingesetzt. In zunehmendem Maße werden die Mikroorganismen in immobilisierter Form verwendet, um den Einsatz derselben ökonomisch und effektiv zu gestalten. Mit Hilfe der Immobilisierung wird eine Erhöhung der mikrobiellen Produktivität im Verhältnis zum Reaktorvolumen, eine leichtere Abtrennbarkeit des Biokatalysators vom Produkt und damit eine wesentliche Senkung des Aufwandes zur Isolierung der gewünschten Produkte ermöglicht. Zur Immobilisierung von Mikroorganismen ist eine Reihe von Methoden beschrieben worden, wie z.B. der Einschluß in Netzwerke und in Schaumstoffe, die Fixierung an porösen Trägermaterialien und die Verkapselung. Daneben sind einige Methoden und Materialien in Kombination getestet worden.

Beim Einschluß in Netzwerke aus Gelen ist neben einer relativ geringen mechanischen Festigkeit häufig ein Auswaschen der Zellen aus den Gelen zu beobachten (Stöcklein, Eisgruber, Schmidt, Biotechnol. Lett. 5[1O], 703 [1983]). Um die Gefahr des Auswachsens von Zellen in das Medium herabzusetzen und daraus resultierende Störungen des Prozesses zu vermeiden, wird in DE OS 3432932 ein Verfahren beschrieben, das das Auswachsen von Zellen auch bei Langzeitversuchen sicher verhindern soll. Diese Aufgabe wird dadurch gelöst, daß die Oberfläche des Biokatalysators durch eine zellenfreie Schutzschicht aus einem vernetzten, keine Durchlässigkeit für die Zellen aufweisenden den zollenhaitigen Kern umschließenden Gel gebildet wird. Dieses Verfahren liefert Gelkörpor, die im allgemeinen eine begrenzte mechanische Haltbarkeit aufweisen. Für den beschriebenen Verwendungszweck, die Sektherstellung, ist jedoch die mechanische Festigkeit von untergeordneter Bedeutung, da der Biokatalysator nicht stark beansprucht wird, in anderen stoffwandelnden Prozessen spielt die mechanische Festigkeit eine bedeutende Rolle.

In dieser Patentschrift wird zudem festgestellt, daß sich das Verfahren der Mikrokapselung für die Immobilisierung von Zellen nicht eignet aufgrund der Toxizität der zu verwendenden Lösungsmittel und der daraus resultierenden geringen Katalysatoraktivität, und daß auch bei dieser Methode das Auswachsen von Zellen nicht sicher verhindert werden kann. Von Mosbach (Phil. Trans. R. Soc. Lond. B300,355 [1983]) wird ebenfalls festgestellt, daß bei der Einkapselung von Mikroorganismen im Vergleich zum Einschluß in Netzwerken die Anzahl Zellen, die ins Medium wachsen können, weiter reduziert ist, dsß aber dennoch die in die Membran inkorporierten Zellen Biomasse nach außen abgeben können. In DE-OS 3012233 wird ein Verfahren zur Immobilisierung von chemisch oder biologisch aktiven Stoffen, lebendem Gewebe und Einzelzellen beschrieben, bei dem zunächst die Materialien in einem Gel eingeschlossen und anschließend die sauren Gruppen an der Oberfläche der Gelmatrix mit einem aminogruppenhaltigtin Polymer umgesetzt werden, so daß sich eine Membran ausbildet. Als nachteilig sind die geringe Widerstandsfähigkeit der so gebildeten Membran gegenüber proteolytischem Angriff anzusehen, die eine begrenzte Lebensdauer der Kapseln bedingt, und die Anwesenheit einer großen Anzahl freier Aminogruppen an der Oberfläche, die neben der Verklumpungsgefahr der Kapseln bei Einsatz anionischer Substrate zu einer Akkumulation derselben an der Oberfläche führt.

In den letzten Jahren wurden in zunehmendem Maße Mikroorganismen verschiedener Species und/oder Enzyme zusammen immobilisiert (Coimmobilisierung), nachdem anfangs jeweils nur ein bestimmter Mikroorganismus bzw. ein bestimmtes Enzym an oder in einer Matrix immobilisiert worden war, von denen einige in einer weiterentwickelten Form zusammen in einem Reaktor eingesetzt wurden. Die Coimmobilisierung von Mikroorganismen und Enzymen ermöglicht es, den Einsatzbereich immobilisierter Mikroorganismen zu verbreitern, indem andere, normalerweise nicht durch den betrachteten Mikroorganismus verwertete Substrate mit Hilfe der coimmobilisierten Enzyme in eine Form überführt werden, die vom betreffenden Mikroorganismus umgesetzt werden kann. Bei Auswahl einer geeigneten Sequenz von Enzymen können auf diese Weise mehrstufige Reaktionen katalysiert werden.

Nach einem Wfahren von B. Hägerdal und K. Mosbach (US 4,524,137) zur Coimmobilisierung von Mikroorganismen und Enzymen wird das Enzym kovalent an das Trägermaterial gebunden, das zum Einschluß der Mikroorganismen dient. Als nachteilig sind bei dieser Methode die relativ geringe mechanische Festigkeit der Gelperlen und das Problem 'ies Auswachsens von Zellen aus den Gelen beim Einsatz in Langzeitversuchen anzusehen.

In EP 0041610 wird von C. H. Boehringer Sohn, Ingelheim die Bindung des Enzyms an Hefezellen vorgeschlagen. Diese Methode ist jedoch nicht bei allen Mikroorganismen-Species anwendbar, da die meisten Mikroorganismen durch die Immobilisierungsprozedur des Enzyms inaktiviert werden. Darübor hinaus wird die Größe der Zellen nicht wesentlich verändert, so daß dio Rückhaltung des Coimmobilisats in kontinuierlichen Farmentationsprozessen sehr schwierig ist. Von W. Hartmeier und A. Heinrichs wird in DE 3534983 ein Verfahren zur Coimmobilisierung von Mikroorganismen und Enzymen beschrieben, bei dem die Mikroorganismen und Enzyme zugleich in einer polymeren Matrix eingeschlossen werden, die in situ mit einer entgegengesetzt geladenen, semipermeable η Membran überzogen wird. Bei diesem Verfahren wird die Anzahl Zellen, die bei Langzeitfermentationen ins Medium auswichsen können, gegenüber dem alleinigen Einschluß in ein Gelnetzwerk reduziert. Es kann aber dennoch nicht verhindert warden, daß beim Eintropfen der Mikroorganismen/Enzym/ Alginatlösung in die Calciumchlorid/Methacrylat/Acrylat-Copolymer-Lösung Mikroorganismen in die Membran inkorporijrt werden, die Ursache für das Auswachsen von Mikroorganismen ins Außenmedium sein können. Bei den an dieser Stelle dargestellten Methoden zur Immobilisierung von Mikroorganismen bzw. Mikroorganismen und Enzymen ist festzustellen, daß sie im FaSIe des Geleinschlusses von vornherein eine geringe mechanische Festigkeit besitzen und daß bei den bekannten Verfahren zur Einkapselung von Mikroorganismen bzw. Mikroorganismen und Enzymen dieselben in die Kapselmembran inkorporiert werden und durch Wachstums- und Zellteilungsvorgänge der vitalen Objekte eine beträchtliche Verminderung der Kapselfestigkeit verursacht wird.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung sind stabile enkapsulierte Biokatalysatoren, deren Stabilität auch im Falle der Einkapselung proliferierender Systeme nicht durch Wachstums- und Zellteüungsvorgänge derselben herabgesetzt wird und die in biotechnologischen Verfahren eingesetzt werden können.

Darlegung des Wesens der Erfindung Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung immobilisierter oder coimmobilisierter Biokatalysatoren

mit hoher Operationsstabilität auf dem Wege der Enkapsulierung von Mikroorganismen oder Mikroorganismen und Enzymen zufinden, das den Einbau der zu immobilisierenden Biokatalysatoren -n die Kapselwand verhindert und Kapseln mit hoher

Membranfostigkeit erzeugt. Erfindungsgemäß wird das dadurch gelöst, daß das Enzym/die Enzyme im Falle der Coimmobilisierung von Mikroorganismen

und Enzymen an ein Trägermaterial gebunden werden, die zu immobilisierenden Mikroorganismen, beispielsweise Hefen und

Bakterien, bzw. Mikroorganismen und trägergebundenen Enzyme zur Vorimmobilisierung in ein Netzwerk, gebildet aus Polyelektrolytkomplexen, eingebettet werden, anschließend die sedimentierten und separierten Gelpartikel (Vorimmobilisate)

in einer wäßrigen Lösung aus Cellulosesulfat suspendiert werden, die Suspension in eine wäßrige

Polydimethyldiallylammoniumchlorid-Lösung eingetropft wird, und die immobilisierten bzw. coimmobilisierten Biokatalysatoren nach Abschluß des Einkapselungsprozesses in bekannter Weise abgetrennt und in ein für die Züchtung der Mikroorganismen geeignetes Milieu eingebracht werden. Im Falle der Coimmobilisierung von Mikroorganismen und Enzymen erfolgt die Bindung des Enzyms/der Enzyme entweder

adsorptiv oder kovalent an einem Trägermaterial, das vorzugsweise ein unlösliches Material darstellt, in einer wäßrigen Lösungbei pH-Werten zwischen 3,5 und 8, bei Temperaturen von 277 K bis zur Stabilitätgrenze der Enzyme und bei einer Reaktionsdauorvon 30min bis 24 Stunden. Als Kupplungsreagens wird vorzugsweise Glutardialdehyd mit einer Konzentration zwischen 0,1 bis10%, vorzugsweise jedoch 2,5%. Als unlöslichesTrägermaterial werden vorzugsweise aminogruppenhaltigePolystyrenderivatemit einem Partikeldurchmesser von 5 bis 200pm veiwendet.

Zur Vorimmobilisierung werden die Mikroorganismen bzw. Mikroorganismen und trägergebundenen Enzyme in ein Netzwerk

aus Polyelektrolytkomplexen, das vorzugsweise durch Eintropfen einer Polydimethyldiallylammoniumchlorid-Lösung in eine

Suspension, bestehend aus Mikroorganismen bzw. Mikroorganismen und trägergebundenen Enzymen sowie Cellulosesulfat- Lösung, bis zum isoionischen Punkt hergestellt wird, eingeschlossen. Die Konzentration der Cellulosesulfat-Lösung liegt zwischen 0,5 und 10g/l, die Konzentration der Polydimethyldiallylammoniumchlorid-Lösung ebenfalls zwischen 0,5 und 10g/l für die Herstellung der Vorimmo'iilisate. Die Temperatur während des Vorimmobilisierungsprozesses wird zwischen 273 K und der Stabilitätsgrenze der zu

immobilisierenden Biokatalysatoren gewählt.

Die Cellulosesulfatkonzentration für die Einkapselung der Vorimmobilisate liegt zwischen 5 und 100g/l, die Konzentration dar Polydimethyldiallylammoniumchlorid-Lösung gleichfalls zwischen 5 und 100g/l. Die Temperatur bei der sich anschließenden Einkapselung der sedimentierten und separierten Vorimmobilisate wird ebenfalls

zwischen 273 K und der Stabilitätsgrenze der zu immobilisierenden Biokatalysatoren gewählt.

Die Verweilzeit der immobilisierten Mikroorganismen oder Mikroorganismen und Enzyme liegt zwischen 30 Sekunden und

12 Stunden. Nach Abtrennung der erfindungsgemäß hergestellen immobilisierten bzw. coimmobilisierten Biokatalysatoren vonder Polydimethyldiallylammoniumchlorid-Lösung werden diese in ein für die Züchtung der immobilisierton Biokatalysatorengeeignetes Milieu überführt und anschließend der gewünschten Verwendung zugeführt. Somit liefert das erfindungsgemäße

Verfahren immobilisierte Biokatalysatoren, die sich durch eine hohe Vitalität, Aktivität und Operationsstabilität auszeichnen, die

auch im Falle der Einkapselung vitaler, proliferiondor Systeme bei Langzeitversuchen nicht durch Wachstums- und

Zellteüungsvorgänge derselben oder Auswaschen vermindert wird. Die Bindung des Enzyms/der Enzyme schützt dieses vor Abbauprozessen und Inaktivierung. Die Vorimmobilisierung gewährleistet, daß keine Mikroorganismen oder trägergebundenen Enzyme in die Kapselwand inkorporiert werden und die Oberfläche des immobilisierten Biokatalysators froi von Mikroorganismen und trägergebundenen Enzymen ist. Somit ist das Risiko des Auswachsens von Mikroorganismen in das Kulturmedium, das beim Einschluß von Mikroorganismen in Gelnetzwerke nicht verhindert werden kann und zu Störungen des Prozesses führt, ausgeschlossen. Von Vorteil ist weiterhin eine erhöhte mechanische Stabilität der Biokatalysatoren gegenüber

der von Gelnetzwerken.

Im Falle der Coimmobilisierung von Invertase und Yarrowia lipolytica-Zellen wird es möglich. Saccharose als Substrat

einzusetzen, die normalerweise nicht von diesen Zellen verwertet werden kann, jedoch ein w sentlich preiswerteres Substrat alsdas eigentliche Substrat Glucose darstellt.

Das erfindungsgemäße Verfahren soll anhand nachfolgender Beispiele erläutert werden. Ausführungsbeispiele Beispiel 1

1,2ml einer 2,4%igen Cellulosesulfat-Lösung (Cellulosesulfat mit einem DS von 0,43) werden in 10ml einer Zellsuspension der

Hefe Yarrowia lipolytica mit einem Gehalt von 1 mg HTM/ml gleichmäßig verteilt. In diese Suspension werden langsam unter leichtem Rühren 3ml einer 0,25%igen Lösung von Polydimethyldiallyiammoniumchlorid mit einer Molmasse von 40000 eingetropft. Die Suspension wird 1,5min stark gerührt und

anschließend mit 13ml ste/ilem Wasser verdünnt. Dann läßt man die entstehenden Polysalze, in deren Geflecht die

Mikroorganismen fixiert sind, sedimentieren und verwendet das Sediment, wie in Beispiel 2 beschrieben. Beispiel 2

0,5ml des Sediments der vorimmobilisierten Hefe Yarrowia lipolytica gemäß Beispiel 1 werden in 5ml, 2,2%iger

Cellulosesulfallösung (Cellulosesulfat mit einem DS von 0,43) suspendiert und möglichst homogen verteilt. Dann wird diene Suspension in 50ml einer Lösung von 1,2%igem Polydimethyldiallylammoniumchlorid mit einer Molmasse von

40000 unter Ie ichtem Rühren getropft und mindestens 5 min langsam gerührt.

Nach Abtrennung des Fällbads von den gebildeton Mikrokapseln werden diese zweimal mit 50 ml sterilem destillierten Wasser

gewaschen.

Zur Kultivierung werden 20 g der so erhaltenen Kapseln in einem 500-ml-Fermenter eingesetzt. Nach einer Kultivierungsdauer

von 24h ist das Kulturmedium aufgezehrt und das Zellwachstum abgeschlossen. Die Zellmasse im Kapselinneren ist auf eine

Konzentration von 15mg HTM/ml Immobilisat angewachsen. Das Außenmedium ist nicht getrübt, d. h. frei von Hefezellen. Diese Kapseln were en in einem kontinuierlichen Fermontationsprozeß zur Produktion von Citronensäure eingesetzt. Das erfindunijsgemäße Verfahren wurde analog mit Bakterien der Species Pseudomonas aeruginosa ausgeführt. Beispiel 3

0,2g Polystyren Wofatit UF93 (Partikeldurchmeaserö bis 100pm) werden mit 3ml 2,5%igerGlutardialdehyd-Lösung in

SÖRENSEN-Phosphatpuffer pH 7,0 2 h bei Raumtemperatur gerührt. Das aktivierte Trägermaterial wird anschließend mit Wasser bis zur völligen Entfernung de=; überschüssigen Qlutardialdehyds gewaschen. Anschließend wird das aktivierte Polystyren mit 800 U Invertase in 3 ml SÖRENSEN-Phosphatpuffer pH 7,0 4 h bei Raumtemperatur gerührt und danach mit

25mM Natriumacetatpuffer pH 5,0/1 M NaCI und 25mM Natriumacetatpuffer pH 5,0 gewaschen, bis kein Protein mehr im

Waschwassor nachweisbar war. Der Invertas'3-Polystyren-Komplex wird, wie in Beispiel 5 und 6 beschrieben, verwendet. Beispiel 4

0,2g Polystyren Wofatit UF93 (Partikeldurchmesser 5 bis 100pm) werden mit 800 U Invertase in 3 ml SÖRENSEN-PhosphatpufferpH 7,0 4hbai Raumtemperatur gerührt und anschließend mit 25mM Natriumacetatpuffer pH5,0/1 M NaCI und25mM

Natriumaceiatpuffer pH 5,0 gewaschen, bis kein Protein mehr im Waschwasser nachweisbar war. Der Invertase-Polystyren-Komplex wird, wie in Beispiel 5 und 6 beschrieben, verwendet. Beispiel 5

15ml einer (i,25%igen Cellulosesulfat-Lösung (Cellulosesulfat mit einem DS von 0,43) werden mit 7ml einer Zellsuspension der Hefe Yarrowia lipolytica mit einem Gehalt von 1 mg HTM/ml und 3 ml Invertase-Polystyren-Komplex vermischt. Zu dieser Suspension wird langsam unter leichtem Rühren eine 0,25%ige Lösung von Polydimethyldiallylammoniumchlorid mit einer Molmasse von 40000 eingetropft, bis der isoionische Punkt erreicht ist, der durch Ausflockung der Cofällung sichtbar wird. Die entstandeni) Suspension wird 1,5min stark gerührt und anschließend mit 13ml sterilem Wasser verdünnt. Dann läßt man die entstehenden Polysalze, in deren Geflecht die Mikroorganismen und der Invertase-Polystyren-Komplex fixiert sind, sedimentiei en und verwendet das Sediment, wie in Beispiel 6 beschrieben.

Beispiel 6

0,5ml des Sediments der zusammen mit Invertase-Polystyren-Komplex vorimmobilisierten Hefe Yarrowia lipolytica gemäß

Beispiel 5 v/erden in 5 ml 2,2%iger Cellulosesulfatlösung (Cellulosesulfat mit einem DS von 0,43) suspendiert und möglichst

homogen verteilt.

Dann wird diese Suspension in 50ml einer Lösung von 1,2%igem Polydimethyldiellylammoniumchlorid mit einer Molmasse von

40000 untc r leichtem Rühren getropft und mindestens 5min langsam gerührt.

Nach Abtr« nnung des Fällbads von den gebildeten Mikrokapseln werden diese zweimal mit 50ml sterilem destillierten Wasser

gewaschen.

Zur Kultivierung werden 20g der so erhaltenen Kapseln in einem 500-ml-Fermenter eingesetzt. Nach einer Kultivierungsdauer

von 24h ist das Kulturmedium aufgezehrt und das Zellwachstum abgeschlossen. Dio Zellmasse im Kapselinneren ist auf eine

Konzentration von 15mg HTM/ml Immobilisat angewachsen. Das Außenmedium ist nicht getrübt, d. h. frei von Hefezellen. Diese Kapseln werden in einem kontinuierlichen Fermentationsprozeß zur Produktion von Citronensäure eingesetzt Beispiel 7

50ml einer 2,2%iqen Cellulosesulfatlösung (Cellulosesulfat mit einem DS von 0,43) werden 10min bei 121"C autoklaviert. Dann werden 0,5ml des Sediments gemäß Beispiel 1 bzw. 6 in 5ml des autoklavieren Cellulosesulfats suspendiert und homogen verteilt. Diese Suspension wird in 50ml einer Lösung von 0,25% Polydimethyldiallylammoniumchlorid mit einer Molmasse von 40000 unter leichtem Rühren getropft und mindestens 40 min gerührt. Danach wird das Fällbad 1:1 mit Wasser verdünnt. Die Kapseln werden weitere 80min unter leichtem Rühren im Fällbad bewegt. Nach Abtrennung des Fällbades werden die Kapseln ohne weitere Behandlung sofort dem Kultivierungsprozeß zugeführt, wie es in Beispiel 2 und 6 beschrieben wurde.

Claims

1. Verfahren zur Immobilisierung von Mikroorganismen bzw. Coimmobilisierung von Mikroorganismen und Enzymen durch Vorimmobilisierung und Einkapselung, gekennzeichnet dadurch, daß die Mikroorganismen bzw. die Mikroorganismen und das Enzym/die Enzyme, die an ein Trägermaterial gebunden wurden, zur Vorimmobilisierung in ein Netzwerk at s Polyelektrolytkomplexen eingebettet werden, anschließend die sedimentierten und separierten Gelpartikel (Vorimmobilisate) in einer wäßrigen Lösung aus Cellulosesulfat suspendiert werden, die Suspension in eine wäßrige Polydimethyldiallylammoniumchlorid-Lösung eingetropft wird, und die immobilisierten Mikroorganismen bzw. die erhaltenen komplexen (coimmobilisierten) Biokatalysatoren in bekannter Weise abgetrennt werden und in ein für Züchtung der immobilisierten bzw. coimmobilisierten Biokatalysatoren geeignetes Milieu eingebracht werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß das Enzym/die Enzyme adsorptiv oder kovalent an einem Trägermaterial in einer wäßrigen Lösung bei pH-Werten zwischen 3,5 und 8, bei Temperaturen von 227 K bis zur Stabilitätsgrenze der Enzyme und bei einer Reaktionsdauer von 30min bis 24 Stunden gebunden werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß zur kovalenten Bindung der Enzyme an das Trägermaterial vorzugsweise Glutardialdehyd als Kupplungsreagens verwendet wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, gekennzeichnet dadurch, daß die Konzentration des Glutardialdehyds 0,1 bis 10%, vorzugsweise 2,5% beträgt.

5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, gekennzeichnet dadurch, daß vorzugsweise ein unlösliches Trägermaterial zur Bindung der Enzyme verwendet wird.

6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, gekennzeichnet dadurch, daß als unlösliches Trägermaterial vorzugsweise Aminomethylpolystyren verwendet wird.

7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, gekennzeichnet dadurch, daß der Partikeldurchmesser der Polystyrenkugeln von 5 bis 200Mm gewählt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Mikroorganismen bzw. die Mikroorganismen und trägergebundenen Enzyme zur Vorimmobilisierung in ein Netzwerk aus Polyelektrolytkomplexen, das vorzugsweise durch Eintropfen einer Poiydimethyldiallylammoniumchlorid-Lösung in eine Suspension der Mikroorganismen bzw. Mikroorganismen und trägergebundenen Enzyme und Mikroorganismen in einer Cellulosesulfat-Lösung hergestellt wird, eingeschlossen werden.

9. Verfahren nach Anspruch 1 und 8, gekennzeichnet dadurch, daß die Konzentration des Cellulosesulfats zur Herstellung der Vorimmobilisate 0,5 bis lOg/l beträgt.

10. Verfahren nach Anspruch 1,8 und 9, gekennzeichnet dadurch, daß die Konzentration der Polydimethyldiallylammoniumchlorid-Lösung zur Herstellung der Vorimmobilisate 0,5 bis 10g/l beträgt.

11. Verfahren nach Anspruch 1 und 8 bis 10, gekennzeichnet dadurch, daß die Temperatur während des Vorimmobilisierungsprozesses von 273 K bis zur Stabilitätsgrenze der zu immobilisierenden Mikroorganismen bzw. Mikroorganismen und trägergebundenen Enzyme reicht.

12. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß zur Einkapselung der Vorimmobilisate eine Konzentration des Cellulosesulfats von 5 bis 100g/l eingesetzt wird.

13. Verfahren nach Anspruch 1 und 12, gekennzeichnet dadurch, daß zur Einkapselung der Vorimmobilisate eine Konzentration des Polydimethylallylammoniumchlorids zwischen 5 und 100g/l verwendet wird.

14. Verfahren nach Anspruch 1,12 und 13, gekennzeichnet dadurch, daß die Temperatur bei der Einkapselung der Vorimmobilisate von 273K bis zur Stabilitätsgrenze der einzukapselndön Mikroorganismen bzw. Mikroorganismen und trägergebundenen Enzyme reicht.

15. Verfahren nach Anspruch 1 und 12 bis 14, gekennzeichnet dadurch, daß die Verweiizeit der immobilisierten bzw. coimmobilisierten Biokatalysatoren in der Polydimethyldiallylammoniumchiorid-Lösung von 30 Sekunden bis 12 Stunden gewählt wird.