CH654328A5

CH654328A5 - Verfahren zur herstellung von durch lebende zellen erzeugten substanzen.

Info

Publication number: CH654328A5
Application number: CH1575/82A
Authority: CH
Inventors: Franklin Lim
Original assignee: Damon Biotech Inc
Priority date: 1981-03-13
Filing date: 1982-03-12
Publication date: 1986-02-14
Also published as: NO163060C; NO163060B; DE3209127A1; JPS6188893A; CA1172961A; GB2094833B; NO820794L; JPS6244919B2; FR2503183B1; SE8201554L; SE454780B; IT8220140A0; DK112282A; GB2094833A; DE3209127C2; IT1150682B; BE892479A; JPS6157288B2; FR2503183A1; JPS5816693A

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von durch lebende Zellen erzeugten Substanzen.

Fortschritte in der Zellenbiologie haben ergeben, dass die Zellen verschiedener höherer Organismen kleine Mengen von Substanzen erzeugen, die eine signifikante potentielle oder beweisbare Brauchbarkeit für die Behandlung oder Diagnose von Krankheiten haben. Beispiele derartiger Substanzen sind in der Literatur reichlich vorhanden, und dazu gehören verschiedene biologische Reaktionen modifizierende Mittel, wie Hormone, Interferone und Lymphokine sowie andere Substanzen, wie Antikörper, die bei diagnostischen Tests verwendet werden. Zellkulturen von mikrobiellem Ursprung wurden seit langem zur Herstellung grosser Mengen von Antibiotika verwendet.

Besonders bei Zellkulturen, die aus höheren Tieren stammen, besteht eine immerwährende Gefahr von bakteriellen oder anderen Verunreinigungen. In den meisten Fällen sind auch die durch die Zellkulturen erzeugten Mengen der interessierenden Substanz sehr gering und sammeln sich in dem Kulturmedium an, das ein kompliziertes Gemisch von Serumproteinen und anderen Substanzen enthält. Dies macht die Isolierung und Reinigung der interessierenden Substanz schwierig.

Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung von Substanzen, die durch lebende Zellen erzeugt werden, zur Verfügung. Die praktische Ausführung der Erfindung hat den doppelten Vorteil, dass sie ein schützendes Milieu für die Zellen der Kultur zur Verfügung stellt und ein Mittel zum Sammeln von interessierenden Substanzen in einem Medium, das weniger beigemischte Fremdkomponenten enthält, zur Verfügung stellt. Die Erfindung kann angewandt werden, um die interessierende Substanz von höhermolekularen Serumproteinen und dergleichen zu trennen, die normalerweise erforder5

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lieh sind, um die fortlaufende Lebensfähigkeit und den Stoffwechsel der erzeugenden Zellen zu unterhalten. Die Erfindung kann aber auch angewandt werden, um die interessierende Substanz in einem Medium zu sammeln, das verhältnismässig geringe Mengen von niedermolekularen Nährstoffen oder Zellstoffwechselprodukten enthält.

Das Verfahren umfasst die Einkapselung von Zellen innerhalb einer Membran, die für die Nährstoffe, Ionen und andere verhältnismässig niedermolekulare Materialien, die erforderlich sind, um den normalen Stoffwechsel und die fortlaufende Lebensfähigkeit der Zellen zu gewährleisten, permeabel ist. Die Membran kann für die durch die Zellen ausgeschiedene interessierende Substanz permeabel sein oder nicht, hat aber in jedem Falle eine Obergrenze der Permeabilität, die genügt, um den Durchgang von Molekülen mit einem Molekulargewicht eines bestimmten vorgegebenen Wertes, der im allgemeinen unterhalb etwa 2,0 x IO5 u liegt, zu ermöglichen. Die so erzeugten Kapseln werden in einem herkömmlichen wässrigen Kulturmedium suspendiert, und man lässt die eingekapselten Zellen den normalen In-vitro-Stoff-wechsel erfahren. Substanzen mit einem Molekulargewicht unterhalb der oberen Permeabilitätsgrenze der Membran, die von den Zellen ausgeschieden werden, durchdringen die Membran und sammeln sich in dem Kulturmedium an. Vorteilhafterweise können hochmolekulare Substanzen, wie Serumproteine, die für die Gesundheit und Lebensfähigkeit vieler Typen von Zellkulturen aus höheren Tieren erforderlich sind, die aber im typischen Falle selbst nicht verbraucht werden, in die Mikrokapseln einverleibt werden, wo sie eingeschlossen sind und nicht in das Kulturmedium diffundieren können. Substanzen, die die Zellkultur während des Stoffwechsels verbraucht und die ein Molekulargewicht haben, das genügend niedrig ist, um die Diffusion durch die Kapselmembranen zu ermöglichen, treten aus dem Kulturmedium durch die Membranen hindurch. Stoffwechselprodukte der Zellen mit genügend kleinen Molekularabmessungen, dass sie durch die Membranen durchtreten können, diffundieren in das ausserhalb der Kapsel befindliche Medium. Wenn die interessierenden Substanzen ein Molekulargewicht unterhalb v der Obergrenze der Permeabilität haben, diffundieren sie in das Medium ausserhalb der Kapseln, aus dem sie wegen der Abwesenheit von verunreinigenden höhermolekularen Materialien, die in nicht eingekapselten Zellkulturen nach dem Stande der Technik vorhanden sind, verhältnismässig leicht geerntet werden können. Wenn die interessierende Substanz ein Molekulargewicht oberhalb der Obergrenze der Permeabilität der Membranen hat, dann sammelt sie sich in den Kapseln an, die anschliessend aus dem Medium isoliert und zerstört werden können, damit Gewinnungsverfahren angewandt werden können.

Die Erfindung unterliegt im wesentlichen keinerlei Beschränkungen hinsichtlich der Typen von Zellen, die innerhalb der Kapselmembranen eingeschlossen werden können. Speziell wird in Betracht gezogen, dass Kulturen aus den Zellen von Geweben aller höheren Tiere sowie Mikroorganismen verwendet werden können. Verschmolzene Zellen, z.B. Hybri-domzellen, oder genetisch modifizierte Zellen, die z.B. mittels der sich entwickelnden Technologie der rekombinierenden DNS erzeugt sind, können gleichfalls ohne Schwierigkeiten eingekapselt werden. Kurz, sofern ein Kulturmedium existiert, das brauchbar ist um den betreffenden Zelltyp in vitro zu erhalten, kann dieser Zelltyp erfindungsgemäss verwendet werden. Beispiele der Typen von Substanzen, die mittels des erfindungsgemässen Verfahrens erzeugt werden können, sind Insulin, Glycogen, Prolactin, Somatostatin, Thyroxin, Steroidhormone, Hypophysenhormone, Interferone, Follikel stimulierende Hormone (FSH), PTH und Antikörper.

Das Produkt von Stufe (B) umfasst eingekapselte lebensfähige Zellen, die in einem wässrigen Kulturmedium suspendiert sind. Die eingekapselten Zellen weisen Membranen auf, die durch eine Obergrenze der Permeabilität gekennzeichnet sind, die genügt, um den Durchtritt der Nährstoffe zu ermög-5 liehen, die für den Zellstoffwechsel und die fortlaufende Lebensfähigkeit erforderlich sind. Die Membranen um-schliessen lebensfähige Zellen, die in einem Medium angeordnet sind, das alle Komponenten enthält, die erforderlich sind, um den Stoffwechsel der Zellen aufrechtzuerhalten, und io die eine Grösse im Bereich oberhalb der oberen Permeabilitätsgrenze der Membran haben. Das Kulturmedium enthält Komponenten, die erforderlich sind, um die Lebensfähigkeit der Zellen aufrechtzuerhalten, und die ein Molekulargewicht unterhalb der oberen Permeabilitätsgrenze der Membranen 15 haben.

Ziel der Erfindung ist es daher, ein Verfahren zur Herstellung von durch lebende Zellen erzeugten Substanzen unter Verwendung eines Systems, bei dem die erzeugenden Zellen in einem schützenden, gesunden Mikromilieu enthalten sind, 20 das von einer semipermeablen Membran begrenzt ist, die dazu dient, Produkte des Zellstoffwechsels von hochmolekularen Materialien, die für die Lebensfähigkeit und Erhaltung der Zellen erforderlich sind, zu trennen, ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von biologisch aktiven Materialien aus 25 Zellkulturen sowie die Erzeugung von Antikörpern und biologische Reaktionen modifizierenden Mitteln, wie Hormonen, Interferonen und Lymphokinen, in einem serumfreien Medium zu ermöglichen.

Die Erfindung wird in der folgenden Beschreibung und 3o der Zeichnung beschrieben, worin Fig. 1 ein schematisches Diagramm darstellt, das den Erfindungsgedanken erläutert, und Fig. 2 eine graphische Darstellung ist, die Ergebnisse des in Beispiel 5 beschriebenen Versuches wiedergibt.

Der allgemeine Erfindungsgedanke besteht darin, eine 35 semipermeable Membran um einzelne Zellen oder Gruppen von Zellen herum vorzusehen, um ein Mikromilieu für die Zellen zur Verfügung zu stellen, das mit dem Zellkulturmedium komplett ist und durch die Membran von einem äusseren wässrigen Medium getrennt ist. Zellen von Menschen 40 oder Säugetieren benötigen im typischen Falle für ihre fortlaufende Gesundheit und Lebensfähigkeit das Vorhandensein von Serumproteinen, von denen ein Teil ein Molekulargewicht von über 65 000 bis 150 000 u haben. Bei dem Verfahren zum Züchten von nicht eingekapselten Zellen nach dem 45 Stande der Technik werden die interessierenden Materialien, die von den Zellen ausgeschieden werden, in dem Kulturmedium dispergiert und sowohl mit hochmolekularen als auch mit niedermolekularen Komponenten gemischt. Da die Mengen der von den Zellen erzeugten Produkte im typischen Falle so ziemlich klein sind, wird die Isolierung der interessierenden Substanz eine schwierige Reinigungsaufgabe. Ferner sind menschliche und Säugetier-Zellkulturen bekanntlich empfindlich gegen Verunreinigungen durch bakterielle oder andere Quellen. Dies macht es erforderlich, dass die Züch-55 tung unter Anwendung verschiedener Methoden zur Erhaltung der Sterilität ausgeführt wird und dass oft Antibiotika in das Medium eingeschlossen werden müssen.

Durch die praktische Ausführung der Erfindung werden die vorstehenden Schwierigkeiten verringert, indem man die 60 Zellen der Kultur innerhalb von semipermeablen Membranen mit einer vorgegebenen Permeabilitätsgrenze einkapselt, die im allgemeinen nicht höher als etwa 200 000 u ist, das heisst die Membran enthält Poren, die es Substanzen mit einem maximalen Molekulargewicht bei oder unterhalb der oberen 65 Permeabilitätsgrenze ermöglichen, die Membran zu passieren, während Substanzen mit einem Molekulargewicht oberhalb der oberen Permeabilitätsgrenze die Membran nicht durchqueren können. Dies ermöglicht die Einkapselung von

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Zellen zusammen mit einem Kulturmedium, das alle für die fortlaufende Lebensfähigkeit, den Stoffwechsel und sogar für die Mitose erforderlichen Komponenten enthält, und die so eingekapselten Zellen dann in einem Kulturmedium zu suspendieren, das niedermolekulare Substanzen enthält, die von den Zellen verbraucht werden, das aber nicht die erforderlichen hochmolekularen Substanzen zu enthalten braucht.

Im typischen Falle nehmen Zellen von höheren Organismen keine hochmolekularen Serumproteine und dergleichen auf, benötigen sie aber in nächster Nähe, damit ihre normalen biologischen Reaktionen weitergehen. Salze, Aminosäuren und andere niedermolekulare Faktoren, die von den Zellen aufgenommen oder dem Stoffwechsel unterworfen werden, treten frei durch die Membran hindurch und können nach Bedarf durch einfache Auswechslung des ausserhalb der Kapsel befindlichen Kulturmediums ergänzt werden. Ausgeschiedene Produkte des Zellstoffwechsels mit einem Molekulargewicht unterhalb der Obergrenze der Permeabilität der Membran sammeln sich in dem Medium ausserhalb der Kapseln an, aus dem die interessierenden Stoffwechselprodukte einfacher geerntet und isoliert werden können, weil in dem Medium keine hochmolekularen Materialien vorhanden sind. Die Ernte von interessierenden Produkten mit einem Molekulargewicht oberhalb der oberen Permeabilitätsgrenze wird ebenfalls erleichtert, da sich derartige Produkte innerhalb der Kapseln ansammeln und nicht in dem ausserhalb der Kapseln vorhandenen grossen Volumen verteilt sind.

Der Erfindungsgedanke, angewandt auf niedermolekularen Zellprodukte, ist in Fig. 1 der Zeichnung schematisch erläutert. Wie dargestellt, ist eine Zelle 10 innerhalb einer Kapselmembran 12 mit Poren 16 angeordnet. Hochmolekulare Faktoren 18 sind innerhalb der Membran 12 eingeschlos-, sen und können innerhalb der Grenzen der Membran frei in dem Medium 14 zirkulieren. Die von der Zelle benötigten Komponenten 20 sowie die Stoffwechselprodukte 22 einschliesslich der interessierenden Substanz 22' zirkulieren frei sowohl in dem Medium innerhalb der Kapseln als auch in dem Medium ausserhalb der Kapseln und durchqueren die Membran durch die Poren 16. Nach Bedarf kann das ausserhalb der Kapseln befindliche Medium entweder periodisch oder kontinuierlich zusammen mit all seinen Komponenten durch Absaugen oder dergleichen von den Kapseln selbst getrennt und durch frisches Medium ersetzt werden. Das gesammelte Medium ist im wesentlichen frei von hochmolekularen Komponenten 18, wodurch die Ernte- und Isolierungsverfahren vereinfacht werden. Ferner bleibt die Zelle 10 zu jeder Zeit innerhalb des Mikromilieus innerhalb der Kapseln geschützt.

In manchen Fällen, z.B. zur Stimulierung der Erzeugung einer besonderen interessierenden Substanz durch eingekapselte Zellen, ist es erforderlich, die Zellen hochmolekularen Komponenten auszusetzen, deren Molekülabmessungen zu gross sind, um die Membran zu durchqueren. Ein Beispiel ist die Erzeugung von Interferon aus menschlichen Fibroblasten, Leukozyten oder lymphoblastoiden Zellen, die durch Behandlung mit bestimmten Viren oder hochmolekularen Nucleinsäuren veranlasst werden, Interferon auszuscheiden. Falls die obere Permeabilitätsgrenze der Membranen niedriger ist als das Molekulargewicht des die Sekretion veranlassenden Faktors, müssen die Zellen vor der Einkapselung der Interferon-Induktion unterworfen werden, oder die Kapselmembranen müssen nach der Züchtung der Zellen selektiv zerstört werden, damit derartige hochmolekulare Materialien von der Zelle aufgenommen werden können. In der US-Patentanmeldung Nr. 243 584 vom 13. März 1981 ist ein Verfahren zur selektiven Zerstörung bestimmter Typen von Kapselmembranen offenbart, das für diese und andere Zwecke ohne Schädigung der Zellen angewandt werden kann.

Das erfindungsgemässe Verfahren hängt von der Fähigkeit ab, um Zellen herum semipermeable Membranen zu bilden, ohne gleichzeitig ihre fortlaufende Lebensfähigkeit nachteilig zu beeinflussen. Eines der geeigneten Einkapse-5 lungsverfahren wird im folgenden detailliert beschrieben.

Das Gewebe oder die Zellen, das bzw. die eingekapselt werden sollen, werden in einem wässrigen Medium suspendiert, das sich für die Erhaltung oder für das Unterhalten der fortlaufenden Stoffwechselprozesse des speziellen Gewebe-io oder Zelltyp eignet. Für diesen Zweck geeignete Medien sind im Handel erhältlich. Der durchschnittliche Durchmesser des einzukapselnden Materials kann innerhalb weiter Grenzen zwischen einigen Mikrometern und mehreren Millimetern variieren. Die besten Ergebnisse werden aber mit Kapseln mit 15 einer Grösse im Bereich von 300 bis 1000 [im erzielt. Langer-hans-Inseln von Menschen oder Säugetieren haben im typischen Falle einen Durchmesser von 50 bis 200 [im. Individuelle Zellen, wie Fibroblasten, Leukozyten, Lymphoblastoide, pankreatische ß-Zellen, a-Zellen, S-Zellen oder Gemische 20 derselben in verschiedenen Verhältnissen oder andere Gewebeeinheiten, können nach Wunsch eingekapselt werden. Auch Mikroorganismen, einschliesslich solcher, die durch rekombinierende DNS oder mittels anderer Methoden genetisch modifiziert worden sind, können eingekapselt werden. 25 Die fortlaufende Lebensfähigkeit derartiger lebender Materialien hängt u.a. von der Zugänglichkeit der erforderlichen Nährstoffe, der Sauerstoffübertragung, dem Fehlen von toxischen Substanzen in dem Medium und dem pH-Wert des Mediums ab. Bisher war es nicht möglich, derartige lebende 3o Materialien in einem physiologisch verträglichen Milieu zu erhalten, während man sie gleichzeitig einkapselte. Das Problem bestand darin, dass die für die Membranbildung erforderlichen Bedingungen für das Gewebe tödlich oder schädlich waren, und vor der Erfindung der US-Patentanmeldung 35 Nr. 24 600 bestand kein Membranbildungsverfahren, das es einem Gewebe ermöglichte, in gesundem Zustand zu überleben.

Es wurde jedoch gefunden, dass bestimmte wasserlösliche Substanzen, die mit lebendem Gewebe physiologisch verträg-40 lieh sind und wasserunlöslich gemacht werden können, um eine formbeständige, zusammenhängende Masse zu bilden, verwendet werden können, um eine «zeitweilige Kapsel»

oder schützende Sperrschicht um einzelne Zellen oder Gruppen von Zellen herum zu bilden, und dass diese zeitweilige 45 Kapsel behandelt werden kann, um eine weniger zeitweilige semipermeable Membran um die Zellen herum abzuscheiden, ohne die Zellen zu schädigen. Eine solche Substanz wird, im typischen Falle bei einer Konzentration in der Grössenord-nung von einigen Gew.-%, zu dem Kulturmedium des Geweso bes gegeben, das auch Zellen der Impfkultur, Serumkomponenten (falls erforderlich) und gegebenenfalls ein zelliges Substrat, wie Kollagen oder ein anderes hochmolekulares, in Wasser dispergierbares Material, das als Fixierungssubstrat wirkt, enthält. Bei Verwendung von Kollagen sollte die Kon-55 zentration im Bereich von etwa 10 ug/ml bis 1 mg/ml liegen, liegt aber vorzugsweise in der Grössenordnung von 100 bis 500 (ig/ml.

Die Lösung wird dann zu Tröpfchen verformt, die das Gewebe zusammen mit seinem Medium enthalten, und diese 6o werden sofort wasserunlöslich gemacht und geliert, mindestens in einer Oberflächenschicht. Danach werden die formbeständigen zeitweiligen Kapseln mit einer weniger zeitweiligen Membran versehen, die ihrerseits anschliessend selektiv zerstört werden kann, wenn man wünscht, das Gewebe ohne 65 Schädigung freizusetzen. Sofern es das zur Bildung der zeitweiligen Kapseln verwendete Material erlaubt, kann das Innere der Kapsel nach Bildung der permanenten Membran wieder verflüssigt werden. Dies erfolgt durch Wiederherstel

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lung der Bedingungen, unter denen das Material löslich ist, in dem Medium.

Das zur Bildung der zeitweiligen Kapseln verwendete Material kann ein beliebiges nichttoxisches, wasserlösliches Material sein, das durch eine Veränderung der ionischen Umgebung oder der ionischen Konzentration in eine formbeständige Masse übergeführt werden kann. Das Material sollte auch mehrere leicht ionisierbare anionische Reste, z.B. Car-boxylgruppen, enthalten, die durch Salzbildung mit Polymeren, die mehrere kationische Gruppen enthalten, reagieren können. Wie weiter unten erklärt werden wird, ermöglicht es die Verwendung eines Materials dieses Typs, ohne Schwierigkeiten in den Oberflächenschichten der zeitweiligen Kapsel eine permanente Membran mit einer vorbestimmten Obergrenze der Permeabilität abzuscheiden.

Die zurzeit bevorzugten Materialien zur Bildung der zeitweiligen Kapsel sind saure, wasserlösliche, natürliche oder synthetische Polysaccharidgummis. Derartige Materialien sind im Handel erhältlich. Sie werden im typischen Falle aus pflanzlichem Material extrahiert und werden häufig als Additive für verschiedene Nahrungsmittel verwendet. Natrium-alginat ist das zurzeit bevorzugte wasserlösliche Gummi. Algi-nate mit Molekulargewichten im Bereich oberhalb von 150 000 u können zwar verwendet werden, vermögen aber wegen ihrer molekularen Abmessungen und ihrer Viskosität gewöhnlich nicht, die am Ende gebildeten Kapselmembranen zu durchdringen. Alginàte mit niedrigeren Molekulargewichten, z.B. 50 000 bis 80 000 u, können durch Diffusion durch eine Membran mit genügender Porosität leichter aus dem Volumen innerhalb der Kapsel entfernt werden und werden daher bevorzugt. Andere verwendbare Gummis sind saure Fraktionen von Guargummi, Carrageenan, Pektin, Tragantgummi oder Xanthangummi.

Diese Materialien weisen glykosidisch verknüpfte Saccha-ridketten auf. Ihre freien Säuregruppen liegen oft in der Alkalimetallsalzform, z.B. der Natriumform, vor. Wenn ein mehrwertiges Ion, wie Calcium oder Aluminium, gegen das Alkalimetallion ausgetauscht wird, werden die wasserlöslichen Polysaccharidmoleküle «vernetzt» unter Bildung eines wasserunlöslichen, formbeständigen Gels, das durch Entfernung dieser Ionen durch Ionenaustausch oder mit Hilfe eines Sequestriermittels wieder löslich gemacht werden kann. Obgleich im wesentlichen jedes beliebige mehrwertige Ion, das mit dem sauren Gummi ein Salz zu bilden vermag, verwendbar ist, werden vorzugsweise physiologisch verträgliche Ionen, z.B. Calcium, verwendet. Dies trägt dazu bei, das Gewebe im lebenden Zustand zu halten. Auch andere mehrwertige Kationen können verwendet werden. Magnesiumionen bewirken keine Gelierung von Natriumalginat.

Eine Lösung mit typischer Zusammensetzung umfasst gleiche Volumen einer Zellkultur in ihrem Kulturmedium und einer 1- oder 2%igen Lösung von Gummi in physiologischer Kochsalzlösung. Wenn man Natriumalginat verwendet, wurde eine 1,2- bis l,6%ige Lösung erfolgreich verwendet. Wenn die einzukapselnden Zellen dem Typ angehören, die an einem Fixierungssubstrat fixiert sein müssen, um eine Mitose zu erfahren, und wenn die Zellen innerhalb der Kapseln gezüchtet werden sollen, können Kollagen oder andere hochmolekulare, in Wasser dispergierbare Proteine oder Polypeptide, entweder natürliche oder synthetische, in die Zellkultur einverleibt werden und werden dann innerhalb des Volumens der endgültig gebildeten Kapsel eingeschlossen. Wenn ein Polymer mit mehreren kationischen Gruppen, z.B. Polylysin, für diesen Zweck verwendet wird, reagieren die kationischen Gruppen mit anionischen Gruppen in dem wasserlöslichen Gummi unter Bildung einer im wesentlichen wasserunlöslichen Grundmasse, die mit dem Gummi verflochten ist. Die bevorzugten Konzentrationen derartiger Materialien liegen in der Grössenordnung von 100 bis 500 (ig/ml der Suspension (einschliesslich der Gummilösung).

In der nächsten Stufe des Einkapselungsprozesses wird die das Gewebe enthaltende Gummilösung in Tröpfchen mit 5 der gewünschten Grösse übergeführt. Danach werden die Tröpfchen sofort geliert, um formbeständige, vorzugsweise, aber nicht notwendigerweise, sphärische oder sphäroide Massen zu bilden. Die Tropfenbildung kann in bekannter Weise ausgeführt werden. Es folgt ein Beispiel eines solchen Verfah-lo rens.

Ein Röhrchen, das eine wässrige Lösung mehrwertiger Kationen, z.B. eine 1,5%ige Calciumchloridlösung, enthält, wird mit einem Stopfen versehen, der einen Tropfenbildungsapparat enthält. Der Apparat besteht aus einem Gehäuse mit i5 einer oberen Luftaufnahmedüse und einem langgestreckten Hohlkörper, der durch Reibungskraft in dem Stopfen befestigt ist. Eine 10-ml-Spritze, die mit einer Fortschaltpumpe versehen ist, wird oben auf dem Gehäuse montiert, wobei z.B. eine mit Teflon beschichtete Nadel mit einem Innendurch-20 messer von 0,25 mm durch die ganze Länge des Gehäuses hindurchreicht. Das Innere des Gehäuses ist so konstruiert, dass die Spitze der Nadel einem dauernden laminaren Luftstrom ausgesetzt ist, der als Luftmesser wirkt. Im Gebrauch wird die Spritze mit der Lösung, die das einzukapselnde 25 Material enthält, gefüllt und die Fortschaltpumpe betätigt, um in Inkrementen Tröpfchen der Lösung aus der Spitze der Nadel hinauszutreiben. Jeder Tropfen wird durch den Luftstrom «abgeschnitten» und fällt annähernd 2,5 cm hinab in die Calciumchloridlösung, wo er sofort durch Absorption von 30 Calciumionen geliert. Der Abstand zwischen der Spitze der Nadel und der Oberfläche der Calciumchloridlösung ist in diesem Falle genügend gross, damit die Natriumalginat-Zell-Suspension die physikalisch günstigste Form animmt, nämlich eine Kugel (maximales Volumen bei minimaler Oberflä-35 che). Die Luft innerhalb des Röhrchens entweicht durch eine Öffnung in dem Stopfen. Dies führt zur «Vernetzung» des Gels und zur Bildung einer hochviskosen, formbeständigen schützenden zeitweiligen Kapsel, die das suspendierte Gewebe und sein Medium enthält. Die Kapseln sammeln sich 40 in der Lösung als getrennte Phase an und können durch Absaugen abgetrennt werden.

In der nächsten Stufe des Verfahrens wird durch «Vernetzung» von Oberflächenschichten eine semipermeable Membran um die Oberfläche der zeitweiligen Kapseln herum 45 abgeschieden. Dies kann erfolgen, indem man die gelierten zeitweiligen Kapseln einer wässrigen Lösung eines Polymeren aussetzt, das kationische Gruppen enthält, die mit den anionischen funktionellen Gruppen der Gelmoleküle reaktionsfähig sind. Polymere, die mit Säure reaktionsfähige Gruppen, wie so freie Imin- oder Amingruppen, enthalten, werden bevorzugt. In dieser Situation wird das Polysaccharidgummi durch Wechselwirkung (Salzbindungsbildung) zwischen den Car-boxylgruppen und den Amin- oder Imingruppen vernetzt. Die Permeabilität kann innerhalb gewisser Grenzen gesteuert 55 werden, indem man das Molekulargewicht des verwendeten vernetzenden Polymeren in geeigneter Weise ausgewählt und indem man die Konzentration der Polymerlösung und die Dauer der Einwirkung reguliert. Eine Lösung eines Polymeren mit niedrigem Molekulargewicht dringt innerhalb einer 60 gegebenen Zeit weiter in die zeitweiligen Kapseln ein als ein hochmolekulares Polymer. Der Grad des Eindringens des Vernetzungsmittels wurde in Beziehung zu der resultierenden Permeabilität gesetzt. Im allgemeinen ist die Porengrösse um so grösser, je höher das Molekulargewicht und je geringer die 65 Eindringung ist. Allgemein können Polymere mit Molekulargewichten im Bereich von 3000 bis 100 000 u oder mehr verwendet werden, und zwar in Abhängigkeit von der Dauer der Reaktion, der Konzentration der Polymerlösung und dem

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gewünschten Grad der Permeabilität. Eine erfolgreiche Kombination von Reaktionsbedingungen bei Verwendung eines Polylysins mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von etwa 35 000 u umfasste die Reaktion einer 0,0167% Poly-lysin enthaltenden physiologischen Kochsalzlösung unter Rühren während zwei Minuten. Dies ergab Membranen mit einer oberen Permeabilitätsgrenze von etwa 100 000 u. Die optimalen Reaktionsbedingungen, die sich für die Steuerung der Permeabilität bei einem gegebenen System eignen, können im Hinblick auf die vorstehenden Richtlinien leicht empirisch festgelegt werden. Unter Anwendung dieses Verfahrens ist es möglich, die obere Permeabilitätsgrenze der Membranen auf einen vorgegebenen Wert unter etwa 200 000 u einzustellen.

Beispielsweise von geeigneten vernetzenden Polymeren sind Proteine und Polypeptide, die entweder natürlich oder synthetisch sein können und freie Amino- oder Iminogruppen enthalten, Polyäthylenamine, Polyäthylenimine und Poly-vinylamine. Polylysin, sowohl in der D-Form als auch in der L-Form, wurde erfolgreich verwendet. Auch Proteine, wie Polyarginin, Polycitrullin oder Polyornithin, sind verwendbar. Polymere mit einer Positiven Ladungsdichte im höheren Bereich, z.B. Polyvinylamin, haften stark an den anionischen Gruppen der Gelmoleküle unter Bildung beständiger Membranen, aber die Membranen lassen sich ziemlich schwer zerstören.

Die Behandlung mit einer verdünnten Lösung von Gummi verknüpft die freien Aminogruppen auf den Oberflächen der Kapseln, die andernfalls den Kapseln eine Neigung zum Zusammenklumpen verleihen könnten.

An diesem Punkt des Einkapselungsverfahrens können Kapseln gesammelt werden, die eine semipermeable Membran aufweisen, die eine gelierte Lösung von Gummi, ein mit dem Zelltyp verträgliches Kulturmedium, Zellen und gegebenenfalls eine innere Matrix von Kollagen oder einem anderen Fixierungssubstrat enthalten. Da innerhalb der Kapseln und durch die Membranen hindurch eine Massenübertragung begünstigt werden soll, wird das Gel vorzugsweise wieder zu seiner wasserlöslichen Form verflüssigt. Dies kann geschehen, indem man die Bedingungen, unter denen das Gummi flüssig ist, wieder herstellt, z.B. indem man das Calcium oder die anderen mehrwertigen Kationen aus dem inneren Gel entfernt. Das Medium in den Kapseln kann einfach wieder löslich gemacht werden, indem man die Kapsel in mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung eintaucht, die Alkalimetallionen und Wasserstoffionen enthält. Die einwertigen Ionen tauschen sich gegen die Calciumionen oder anderen mehrwertigen Ionen innerhalb des Gummis aus, wenn die Kapseln unter Rühren in die Lösung eingetauchst werden. Natriumci-tratlösungen können für den gleichen Zweck verwendet werden und dienen dazu, die mehrwertigen Ionen zu sequestrieren.

Zellkulturen, die wie oben beschrieben eingekapselt worden sind, können in einem Kulturmedium suspendiert werden, das spezifisch darauf ausgerichtet ist, alle Anforderungen des betreffenden Zelltyps zu erfüllen, und unterliegen weiterhin normalem In-vitro-Stoffwechsel. Wenn die Kultur ein Milieu mit hochmolekularen Komponenten, wie Serumkomponenten, benötigt, können diese aus dem Medium ausserhalb der Kapseln weggelassen werden. Im typischen Fall haben die Komponenten, die normalerweise von den Zellen aufgenommen werden, ein verhältnismässig geringes Molekulargewicht und diffundieren leicht durch die Kapselmembranen in das Mikromilieu der Zellen, wo sie durch die Zellmembran hindurchdringen. Stoffwechselprodukte der Zellen, die in das Medium innerhalb der Kapsel ausgeschieden werden, diffundieren gleichfalls durch die Kapselmembran hindurch und sammeln sich im Medium ausserhalb der Kapsel an, wenn sie ein Molekulargewicht unterhalb der Obergrenze der Permeabilität der Kapselmembran haben.

Die eingekapselten Zellen können unter Bedingungen z.B. der Temperatur, des pH-Wertes und des ionischen Milieus gezüchtet werden, die gleich sind wie bei herkömmlichen Kulturen. Die von den Zellen erzeugten Produkte können ebenfalls aus dem Medium ausserhalb der Kapsel oder aus den Kapseln in herkömmlicher Weise geerntet werden. Jedoch hat das hier offenbarte Kulturverfahren die folgenden Vorteile:

1. Die Zellen der Kultur sind gegen Scherkräfte und mechanische Schädigung und gegen Verunreinigung durch Faktoren mit Abmessungen oberhalb der oberen Permeabilitätsgrenze der Membranen geschützt. Dies bedeutet, dass die Anforderungen an die Handhabung und Sterilität, die normalerweise mit Züchtungsverfahren verbunden sind, etwas gelockert werden können, da Mikroorganismen die eingekapselten Zellen nicht erreichen können und mit Viren infizierte Zellen keine anderen Zellen zu infizieren brauchen.

2. Die Kapseln immobilisieren die Zellen innerhalb eines Milieus, in das hochmolekulare Materialien eingeschlossen sind, und trotzdem werden niedrigermolekulare Zellennährstoffe und -produkte leicht entfernt und eingeführt. Dies erlaubt es, das Nährmedium nach Wunsch intermittierend oder kontinuierlich zu sammeln und zu ergänzen, ohne die Zellen zu stören.

3. Interessierende Substanzen, die durch die Zellen erzeugt werden, lassen sich leichter gewinnen. Ausgeschiedene Zellprodukte mit Molekülabmessungen, die genügend klein sind, um die Kapselmembranen zu durchdringen, sammeln sich in dem Medium ausserhalb der Kapseln im Gemisch mit Nährstoffen. Jedoch werden hochmolekulare Serumkomponenten und dergleichen nicht in das Medium ausserhalb der Kapseln freigesetzt, was die Gewinnung eines interessierenden Zellproduktes vereinfacht. Ausgeschiedene Zellprodukte mit Molekülabmessungen oberhalb der oberen Permeabilitätsgrenze der Membranen sammeln sich innerhalb der Kapseln an. Natürlich können Zellprodukte, die nicht durch die Zellmembran ausgeschieden werden, ebenfalls von Interesse sein. Diese können in relativ konzentrierter Form gewonnen werden, indem man die Kapseln isoliert und anschliessend die Membranen selektiv zerstört, z.B. unter Anwendung der folgenden angegebenen Methode, und erforderlichenfalls die Zellmembranen zerstört.

4. Das Volumen innerhalb der Kapseln stellt ein Milieu zur Verfügung, das für die Zellteilung gut geeignet ist. Es wurde beobachtet, dass Suspensionskulturen innerhalb der Kapseln eine Mitose erfahren. Fixierungsabhängige Zellen, die in normalen Kulturen in einer zweidimensionalen einfachen Schicht wachsen, vermehren sich unter Bildung einer erheblichen Menge von Zellen innerhalb der Kapsel. Derartige Zellen verwenden die Innenoberflächen der Membran als Substrat und/oder fixieren sich an den hochmolekularen Materialien, die oben genannt wurden und die innerhalb der Kapseln angeordnet sind. Dies führt zu signifikanten Zunahmen der Zelldichte, verglichen mit herkömmlichen Kulturen. Die fortlaufende Lebensfähigkeit derartiger Zelltrauben wird durch die Tatsache begünstigt, dass die Verhältnisse von Oberfläche zu Volumen der Kapseln ziemlich gross sein können, so dass alle Zellen Zugang zu den erforderlichen Nährstoffen, Sauerstoff usw. haben.

In bestimmten Situationen ist es vorteilhaft, die Kapselmembranen selektiv zu zerstören, um die Zellen ohne Schädigung freizusetzen. Eines der bemerkenswerten Beispiele ist die Herstellung von Interferon. Zellen, die Interferon zu erzeugen vermögen, müssen bei der Vorbereitung für das Interferon-Erzeugungsstadium bestimmten Viren oder Nucleinsäuren ausgesetzt werden. Bei mehreren Interferon-

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Induktionsverfahren werden der Kultur auch Reagentien zugesetzt, um die Proteinsynthese zu hemmen. Demzufolge muss das Wachstumsstadium des Züchtungsprozesses unter Bedingungen ausgeführt werden, die von denen der Interfe-ron-Induktionsstufe ganz verschieden sind. Wenn die für die Interferon-Induktion verwendeten Substanzen ein Molekulargewicht oberhalb der oberen Durchlässigkeitsgrenze der Kapselmembran haben (wie im Falle von Virusinduktionen), kann der Induktionsprozess nicht in der eingekapselten Zellkultur ausgeführt werden. Demzufolge müssen Interferon erzeugende Zellen, wenn sie innerhalb der Kapsel gezüchtet worden sind, durch Zerstören der Membran freigesetzt werden, um sie dem Induktionsprozess zu unterwerfen.

Zellen, die in Membranen des oben dargelegten Typs eingeschlossen sind, können mittels eines Verfahrens freigesetzt werden, bei dem im Handel erhältliche Reagentien, deren Eigenschaften die eingekapselten Zellen nicht in signifikanter Weise nachteilig beeinflussen, verwendet werden. Zuerst werden die Kapseln von ihrem Suspendiermedium abgetrennt, gründlich gewaschen, um alle auf dem Äusseren der Mikro-kapseln vorhandenen Verunreinigungen zu entfernen, und dann unter Rühren in einer gemischten Lösung von einatomigen, mehrwertigen Kationen, wie Caliumionen, und einem zerstörenden Polymer mit mehreren anionischen Resten, wie einem Salz einer Polysulfonsäure oder Polyphosphorsäure, dispergiert. Für diese Stufe wird Heparin, ein natürliches sul-foniertes Polysaccharid, bevorzugt. Die anionische Ladungsdichte des zerstörenden Polymeren sollte gleich wie die Ladungsdichte des ursprünglich zur Bildung der Membranen verwendeten polyanionischen Materials oder vorzugsweise grösser sein. Das Molekulargewicht des Polymeren sollte mindestens vergleichbar sein mit dem Molekulargewicht des Polymeren mit mehreren kationischen Gruppen, das zur Bildung der Membran verwendet wurde, und ist vorzugsweise grösser. Innerhalb der Suspension von Kapseln in der gemischten Lösung konkurrieren die Calciumionen mit den polykationischen Polymerketten, die zur Bildung der Membran verwendet wurden, um anionische Gruppen auf dem wasserlöslichen Gummi. Gleichzeitig konkurriert das Heparin oder andere Polymer mit mehreren anionischen Gruppen, das in der Lösung gelöst ist, mit dem Gummi in der Membran um die kationischen Gruppen auf den Polymerketten. Dies führt zu einem in Wasser dispergierbaren oder vorzugsweise wasserlöslichen Komplex von z.B. Polylysin und Heparin und zur Assozierung der einatomigen Kationen mit den Molekülen des Gels.

Diese Stufe macht die Membran bei der anschliessenden Einwirkung eines Sequestriermittels, das den Zerstörungspro-zess durch Aufnahme von einatomigen Ionen aus dem Gel zu Ende führt, löslich. Falls Bruchstücke von Kapselmembranen in dem Medium verbleiben, könnnen sie leicht von den Zellen getrennt werden.

Die zurzeit bevorzugte Lösung für die erste Stufe des selektiven Zerstörungsprozesses enthält 1,1% (Gew./Vol.) Calciumchlorid und zwischen 500 und 1500 Einheiten Heparin pro ml der Lösung. Zu dieser Lösung wird ein Volumen von Mikrokapseln zugesetzt, das genügt, um zwischen etwa 20 und 30% des Gesamtvolumens der Dispersion auszumachen. Calciumchlorid und Heparin werden für die Zerstörung der Membranen von Zellen enthaltenden Kapseln bevorzugt, da beide Reagentien mit den meisten Zellen physiologisch verträglich sind und daher die Möglichkeit einer Zellschädigung minimieren. Gemische von Aluminiumsalzen oder Salzen anderer mehrwertiger Kationen (aber keine Magnesiumionen) können ebenfalls zusammen mit den Polysulfonsäure-oder Polyphosphorsäuresalzen des oben beschriebenen Typs verwendet werden.

Im allgemeinen können die Konzentrationen der einatomigen Ionen und des anionischen Polymeren, die in dieser Stufe angewandt werden, innerhalb weiter Grenzen schwanken. Die optimalen Konzentrationen können leicht empirisch bestimmt werden und hängen von der Einwirkungszeit sowie 5 von dem zur Bildung der Membranen verwendeten speziellen Polymeren ab.

Das zurzeit bevorzugte Sequestriermittel zur Ausführung der selektiven Zerstörung ist Natriumeitrat, obgleich auch andere Alkalimetallcitrate und Alkalimetallsalze der Äthylen-io diamintetra-Essigsäure verwendet werden können. Wenn Natriumeitrat verwendet wird, liegt die optimale Konzentration in der Grössenordnung von 55 mMol pro Liter. Es wird bevorzugt, das Citrat oder andere Sequestriermittel in isotonischer Kochsalzlösung zu lösen, um die Zellschädigung zu 15 minimieren.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1 Insulin-Erzeugung 20 Langerhans-Inseln werden aus menschlichen Leichen oder tierischem Pankreas erhalten und bei einer Konzentration von annähernd 103 Inseln pro ml zu einer kompletten Gewebekultur (CMRL-1969, Connaught Laboratories, Toronto, Canada) gegeben. Die Gewebekultur enthält alle 25 Nährstoffe, die für die fortgesetzte Lebensfähigkeit der Inseln erforderlich sind, sowie die Aminosäuren, die von den ß-Zel-len zur Herstellung von Insulin verwendet werden. 0,4 ml einer Suspension von 103 Inseln pro ml werden dann zu 0,5 ml einer l,2%igen Lösung von Natriumalginat (Sigma 30 Chemical Company) in physiologischer Kochsalzlösung gegeben.

Dann wird eine l,5%ige Calciumchloridlösung verwendet, um Tröpfchen der Lösung in der oben dargelegten Weise zu gelieren. Tröpfchen mit einem Durchmesser in der Grössen-35 Ordnung von 300 bis 400 um, die aus der Spitze der Nadel austreten, gelieren sofort beim Eintritt in die Calciumchloridlösung. Die gelierten Kapseln werden dann in ein Becherglas übergeführt, das 15 ml einer Lösung enthält, die 1 Teil 2%iger 2-(Cyclohexylamino)-äthansulfonsäure-Pufferlösung in 40 0,6%igem Kochsalz (isotonisch, pH 8,2), verdünnt mit 20 Teilen l%igem Calciumchlorid, enthält. Nach 3minütigem Eintauchen werden die Kapseln zweimal in l%igem Calciumchlorid gewaschen.

Die Kapseln werden dann in 32 ml einer Lösung überge-45 führt, die 1 Teil l%iges Polylysin (durchschnittliches Molekulargewicht 35 000 u in 80 Teilen physiologischer Kochsalzlösung enthält. Nach 3 Minuten wird die Polylysinlösung abdekantiert. Die Kapseln werden mit l%igem Calciumchlorid gewaschen und gegebenenfalls wieder 3 Minuten lang in so einer Lösung von Polyäthylenimin (Molekulargewicht 40 000 bis 60 000) suspendiert, die durch Verdünnen einer 3,3%igen Polyäthylenimin-Vorratslösung in Morpholinopropansulfon-Säurepuffer (0,2molar, pH 6) mit genügend l%igem Calciumchlorid, damit sich eine Endpolymerkonzentration von 0,12% 55 ergibt, hergestellt ist. Die resultierenden Kapseln, die «permanente» semipermeable Membranen haben, werden dann zweimal mit l%igem Calciumchlorid und zweimal mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und mit 10 ml 0,12%iger Alginsäurelösung gemischt.

60 Die Kapseln klumpen nicht zusammen, und viele enthalten Langerhans-Inseln. Das Gel auf der Innenseite der Kapseln wird wieder verflüssigt, indem man die Kapseln 5 Minuten lang in ein Gemisch aus Kochsalzlösung und Citratpuffer (pH 7,4) eintaucht. Schliesslich werden die Kapseln im 65 CMLR-69-Medium suspendiert.

Unter dem Mikroskop stellt man fest, dass diese Kapseln eine sehr dünne Membran enthalten, die eine Insel ein-schliesst, in der einzelne Zellen sichtbar sind. Molekühle mit

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einem Molekulargewicht bis etwa 100 000 u können die Membranen durchqueren. Dies ermöglicht es, dass Sauerstoff, Aminosäuren, Nährstoffe und Plasmakomponenten, die im Kulturmedium verwendet werden (das heisst niedermolekular Komponenten von fötalem Kälberplasma), die Insel erreichen und dass Insulin ausgeschieden wird.

Nach wiederholten Waschbehandlungen mit physiologischer Kochsalzlösung werden Mikrokapseln, die nach dem obigen Verfahren erhalten wurden und annähernd 15 Inseln enthalten, in 3 ml CMRL-1969 suspendiert. Als sie 8 Tage alt waren, schieden die Kapseln in Gegenwart von 600 mg Glucose pro dl in einem Ansatz in 1,5 Stunden 67 Einheiten Insulin pro ml in das ausserhalb der Kapsel befindliche Medium aus. Bei einem zweiten Ansatz wurden in der gleichen Zeit 68 Einheiten Insulin pro ml erzeugt. 1 Woche alte Kapseln schieden in dem gleichen Medium, aber in Gegenwart von 100 mg Glucose pro dl in einem ersen Ansatz in 1,2 Stunden 25 Einheiten Insulin pro ml und in einem zweiten Ansatz 10 Einheiten Insulin pro ml aus.

Beispiel 2

Herstellung von Interferon-ß

Menschliche Fibroblasten, die durch Behandlung von menschlichem Vorhautgewebe mit Trypsin und Äthylendi-amintetra-Essigsäure während 5 Minuten bei 37 °C in bekannter Weise erhalten wurden, werden in einem kompletten Wachstumsmedium (CMLR-1969, Connaught Laboratories) suspendiert, das mit 40 Vol.-% gereinigtem fötalem Kälberserum, 0,8% Natriumalginat (Sigma) und 200 ug gereinigtem Kalbshautkollagen pro ml ergänzt ist. Die Zelldichte der Suspension beträgt etwa 1,5 x 107 Zellen pro ml. Zeitweilige Alginatkapseln werden wie in Beispiel 1 dargelegt gebildet. In Oberflächenschichten der Kapseln werden semipermeable Membranen abgeschieden, indem man die Kapseln in einer 0,005%igen (Gew./Vol) wässrigen Lösung von Polylysin (Molekulargewicht 43 000 u) 3 Minuten lang suspendiert.

Die resultierenden Kapseln werden in CMLR-1969, das mit 10% fötalem Kälberserum ergänzt ist, suspendiert. Die vorstehenden Stufen werden alle bei 37 °C ausgeführt. Nach Bebrüten bei der gleichen Temperatur findet man bei Untersuchung der Kapseln unter dem Mikroskop, dass sie Fibroblasten enthalten, die innerhalb der Mikrokapseln eine Mitose erfahren haben und eine dreidimensionale fibroblastische Morphologie aufweisen.

Nach 4- bis 5tägiger Bebrütung werden die eingekapselten Fibroblasten einer Interferon-ß-Superinduktionsmethode nach dem Verfahren von Vilcek unterworfen. Unter einer 5%igen Kohlendioxydatmosphäre (95% Luft) wird die Kapselsuspension in Gegenwart von 100 ug Poly I-Poly C pro ml, einer doppelsträngigen RNS (bekanntes Interferon-ß-Induk-tionsmittel), das von PL Biochemicals, Milwaukee, Wisconsin erhältlich ist, und 50 jig Cycloheximid pro ml (Proteinsyntheseinhibitor, Calbiochem, La Jolla, California) 1 Stunde lang bei 37 °C bebrütet. Nach 1 Stunde werden die suspendierten Kapseln in dem Medium (CMLR-1969), das 50 ug Cycloheximid pro ml enthält, gewaschen und dann unter einer 5%igen Kohlendioxydatmosphäre wieder 3 Stunden lang bei 37 °C in der gleichen Lösung suspendiert. Am Ende dieser Bebrütung wird die Waschstufe wiederholt, worauf die Kapseln wieder in dem Medium, das 50 ug Cycloheximid pro ml und 5 ug Actimomycin D pro ml (ein bekannter RNS-Syn-theseinhibitor, Calbiochem) enthält, suspendiert und unter einer 5%igen Kohlendioxydatmosphäre 2 Stunden lang bei 37 °C bebrütet. Die Kapseln werden dann zweimal in dem Medium gewaschen und bei 37 °C 18 bis 24 Stunden lang im serumfreien Medium suspendiert; während dieser Zeit scheiden die Fibroblasten Interferon-ß aus, das ein Molekulargewicht in der Grössenordnung von 21 000 u hat und aus dem Medium ausserhalb der Kapseln geerntet werden kann.

Beispiel 3 5 Herstellung von Interferon-ß

Die Verfahrensweise von Beispiel 2 wird wiederholt, wobei aber die Kapselmembranen von der Induktion selektiv zerstört werden, so dass das Poly I-Poly C leichter Zugang zu den Fibroblasten findet. Das Zerstörungsverfahren wird folio gendermassen ausgeführt:

Man lässt Portionen von 10 ml der Mikrokapselsuspen-sion, die etwa 500 bis 1000 Kapseln pro ml enthält, sich absetzen und saugt das Suspensionsmedium ab. Die Kapseln werden zweimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (pH 15 7,4) gewaschen. Die gewaschenen Kapseln werden dann mit einem aliquoten Teil von 3,0 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung, die 1000 Einheiten Heparin pro ml und 1,1% (Gew./Vol.) Calciumchlorid enthält, gemischt. Die Suspension wird 3 Minuten lang bei 37 ° C gerührt; danach lässt man 20 die Kapseln sich absetzen, saugt die überstehende Flüssigkeit ab und wäscht die Kapseln zweimal mit 3,0 ml 0,15 molarem Kochsalz. Nach Absaugen der zweiten Waschlösung werden die Kapseln mit 2,0 ml einer gemischten Lösung gemischt, die gleiche Volumenmengen 110-mmolares Natriumeitrat und 25 0,15 molares Natriumchlorid enthält (pH 7,4). Das Gemisch wird von Hand 1 Minute lang verwirbelt, um die Auflösung der Membranen zu veranlassen, wonach die Zellen zweimal in dem Medium gewaschen werden.

Die Zellen werden dann in dem Medium suspendiert, 30 dem in Beispiel 2 beschriebenen Induktionsverfahren unterworfen und dann wieder wie in Beispiel 2 beschrieben eingekapselt. Die Kapselsuspension wird dann in einem serumfreien Medium 18 bis 24 Stunden lang bebrütet; während dieser Zeit wird von den Zellen Interferon-ß ausgeschieden, 35 durchdringt die Kapselmembranen und sammelt sich in dem ausserhalb der Kapseln befindlichen Medium ein

Wenn die Beispiele 2 und 3 mit Poly I-Poly C (5S) (Sedimentationswert, Poly I und Poly C erwärmt zur Bildung von doppelsträngiger RNS) ausgeführt wird, so ergeben sich die 40 folgenden Werte der Interferon-ß-Erzeugung, ausgedrückt in Einheiten Interferon-ß/105-Zellen :

1. 2.

Beispiel 2 25 25

■»5 Beispiel 3 2500 2500

Wenn die Beispiele 2 und 3 mit Poly I-Poly C (12S) (Sedimentationswert, doppelsträngig wie gekauft) ausgeführt werden, ergeben sich die folgenden Werte der Interferon-ß-50 Erzeugung, ausgedrückt in Einheiten Interferon-ß/105-Zellen:

1. 2.

Beispiel 2 25 25

Beispiel 3 2500 2500

55

Es wird angenommen, dass die hundertfache Zunahme der erzeugten Menge bei Anwendung der Verfahrensweise von Beispiel 3 gegenüber Beispiel 2 mindestens zum Teil darauf zurückzuführen ist, dass der Poly I-Poly C in dem Verfah-60 ren von Beispiel 3 einen besseren Zugang zu den Zellen hat.

Beispiel 4

Die Verfahrensweise von Beispiel 2 wird wiederholt, wobei aber Kapseln, die kein Kollagen enthalten, verwendet 65 werden. Die eingekapselten Zellen wurden in einer herkömmlichen einschichtigen Kultur gezüchtet, mit Trypsin behandelt und mit Poly I-Poly C (5S) der Induktion unterworfen und gleichzeitig in Mikrokapseln eingekapselt. Es wurde gefun

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den, dass das ausserhalb der Kapseln vorhandene Medium 2500 Einheiten Interferon-ß/105-Zellen enthält.

Beispiel 5

Monoklonale Antikörper

Von Herman Eisen beim MIT erhaltene Hybridom-Zellen wurden bis zu einer Dichte von 3,0 x 106 Zellen pro ml gezüchtet. Diese Zellen wurden aus Mäusemilzzellen und Mäusemyelomzellen in einer Weise verschmolzen, wie jetzt aus dem Stande der Technik gut bekannt ist, und stellten eine unsterbliche Zellinie dar, die in der Kultur Antikörper gegen Dinitrophenyl-Rinderserum-Albumin erzeugte. Aliquote Teile von 3 ml der Zellsuspension wurden durch Zugabe von 2,1 ml der Suspension, die 1,4% Natriumalginat enthielt, zu 0,6 ml fötalem Kälberserum und 0,3 ml physiologischer (150-mmolarer) Kochsalzlösung erhalten. Tröpfchen der Suspension wurden sofort in Calciumchloridlösung geliert und dann mit einer 0,016 gew.-%igen Lösung von Poly-L-lysin behandelt. Das Innere der resultierenden Kapseln wurde dann durch Eintauchen in eine Lösung von 1 Teil 110 mmola-rem Natriumeitrat und 3 Teilen 150 mmolarer Kochsalzlösung während 6 Minuten wieder verflüssigt. Die Hybridom-zellen enthaltenden Kapseln wurden dann in einem Gemisch aus RPMI-1640-Medium (Gibco) das 20% durch Wärme inaktivierten Kälberserum enthielt, suspendiert.

Die Zelldichten der eingekapselten und nicht eingekapselten Hybridomkulturen und die sowohl von den eingekapselten als auch von den nicht eingekapselten Kulturen erzeugten Mengen an monoklonalen Antikörpern wurde periodisch bestimmt. Die Ergebnisse sind graphisch in Fig. 2 dargestellt.

Beispiel 6

Interferon-a aus Leukozyten

30 ml «buffy coats», erhalten vom amerikanischen Roten Kreuz, wurden mit 3,0 ml 5%iger Äthylendiamintetra-Essig-säure behandelt und wiederholt 10 Minuten lang bei 4 °C 0,83%igem Ammoniumchlorid ausgesetzt, um die roten Blutkörperchen zu lysieren. Zwischen den Ammoniumchloridbehandlungen wurde 5 Minuten lang zentrifugiert (1200 Umdrehungen pro Minute bei 4 °C), um Bruchstücke von den zurückbleibenden intakten Leukozyten abzutrennen. Die Zellen wurden dann im MEM (minimales essentielles Medium, serumfrei - Gibco), verdünnt um einen Faktor 100, suspendiert und 15 Minuten lang mit Tryptanblau angefärbt. Eine Zellzählung, die mit einer Probe ausgeführt wurde, ergab,

dass etwa 1,3 x 109 Leukozyten pro 30 ml «buffy coat» überlebten. Die Zellen wurden dann bei einer Dichte von 1 x 107 Zellen pro ml in dem Medium, das mit 2% durch Wärme inaktiviertem fötalem Kälberserum ergänzt war, suspendiert.

Die Induktion erfolgte, indem man die Zellsuspension bei 37 °C unter Rühren 1 Stunde lang Sendaiviren (verschiedene Konzentrationen in Hämagglutinierungseinheiten pro ml -Flow Laboratories, Md.) aussetzte. Das Virus wurde dann durch Zentrifugieren bei Raumtemperatur von den Zellen getrennt, und die Zellen wurden wieder in gleichen Volumen MEM mit 4% durch Wärme inaktiviertem fötalem Kälberserum und 1,4% Natriumalginat suspendiert. Wie oben dargelegt, wurden Kapseln gebildet und dann wieder in serumfreien und serumhaltigen Medien suspendiert. Es gab keine signifikanten Unterschiede hinsichtlich der Mengen an Interferon, die in dem ausserhalb der Kapseln befindlichen Medium dieser Testproben nachgewiesen wurden. Die Interferon-Erzeugungswerte waren auch in nicht eingekapselten Vergleichskulturen gleich hoch. Die Ergebnisse dieser Versuche sind unten angegeben :

Sendaivirus

Erzeugtes Interferon

(HA-Einheiten/ml)

(Einheiten/107-Zellen)

600

10

300

20

150

33

75

50

Beispiel 7 io Interferon-a aus Lymphoblastoiden

Namalwa-Zellen von der American Type Culture Collection wurden sowohl in herkömmlicher Kultur als auch innerhalb von Mikrokapseln in RPMI-1640-Medium, das mit 10% durch Wärme inaktiviertem fötalem Kälberserum ergänzt 15 war, gezüchtet. Teile der Zellsuspensionen wurden dann Interferon-Induktions- und -Produktionsverfahren unterworfen, wobei ein Teil eingekapselt war und der andere nicht eingekapselt war. Die Kulturen enthielten im wesentlichen die gleiche Anzahl von Zellen. 25 mg Bromdesoxyuridin in dop-20 pelt destilliertem Wasser pro ml wurden sowohl zu der eingekapselten als auch zu der nicht eingekapselten Kultur zugesetzt, um die Mitose zu hemmen. Nach 36stündigem Bebrüten bei 37 °C wurden die Zellen beider Kulturen gewaschen und dann in RPMI-1640-Medium suspendiert, das mit 2% durch 25 Wärme inaktiviertem fötalem Kälberserum ergänzt war.

Die eingekapselte Kultur wurde dann behandelt, um die Kapselmembranen selektiv zu zerstören. Die Kapseln wurden dreimal in physiologischer Kochsalzlösung gewaschen, bei 37 °C 10 Minuten lang in einer Lösung, die 1000 Einheiten 30 Heparin pro ml und 1,1% Calciumchlorid enthielt, bebrütet und dann wieder in Kochsalzlösung gewaschen. Die gewaschenen Kapseln wurden dann bei 37 °C 5 Minuten lang mit einer verdünnten Lösung von Natriumeitrat in physiologischer Kochsalzlösung bebrütet. Durch Rühren der Kapselsus-35 pension in diesem Zeitpunkt lösen sich die Membranen auf und setzen die Namalwa-Zellen frei. Die Zellsuspension wird dann zentrifugiert, um Rückstände zu entfernen, und mehrere Male mit Citrat/Kochsalz-Lösung gewaschen.

Beide Kulturen wurden dann bei einer Dichte von 4o 1,0 x 106 Zellen pro ml in frischem RPMI-1640-Kulturme-dium suspendiert, das mit 2% durch Wärme inaktiviertem fötalem Kälberserum und Puffer (pH 7,4) ergänzt war.

Dann wurde der Bankowski-Stamm des Newcastle-Disease-Virus in Fruchtwasser sowohl zu der herkömmlichen 45 Kultur als auch zu der vorher eingekapselten Kultur gegeben. Das Virus hatte eine Konzentration von 1,0 x 108 pfu/ml und wurde von den Poultry Health Laboratories, Davis, California, erworben. 1 ml des Virus wurde pro 10 ml Zellsuspension zugesetzt. Die Kulturen wurden 24 Stunden lang bei 37 ° C so bebrütet.

Die herkömmliche Kultur wurde dann in 5 Teile (unten mit 1 bis 5 bezeichnet) geteilt, und die vorher eingekapselte Kultur wurde in 4 Teile (unten mit 6 bis 9 bezeichnet) geteilt. Jeder der 9 aliquoten Teile der Kultur wurde dann nach den 55 unten angegebenen Behandlungen auf die Produktion von Interferon untersucht,

1. unbehandelt;

2. wieder in RPMI-1640-Medium mit 2% durch Wärme inaktiviertem fötalem Kälberserum suspendiert;

60 3. wieder in serumfreiem RPMI-1640-Medium suspendiert;

4. zusammen mit RPMI-1640-Medium und 5% durch Wärme inaktiviertem fötalem Kälberserum eingekapselt; Kapseln in serumfreiem Medium suspendiert; 65 5. zusammen mit RPMI-160-Medium und 5% durch Wärme inaktiviertem fötalem Kälberserum eingekapselt; Kapseln in Medium mit 2% fötalem Kälberserum suspendiert;

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6. wieder in serumfreiem Medium suspendiert;

7. wieder in Medium, das 2% durch Wärme inaktiviertes fötales Kälberserum enthält, suspendiert;

8. zusammen mit Medium plus 5% durch Wärme inaktiviertem fötalem Kälberserum eingekapselt; Kapseln in ser- 5 umfreiem Medium suspendiert;

9. zusammen mit Medium plus 5% durch Wärme inaktiviertem fötalem Kälberserum eingekapselt; Kapseln in Medium plus 2% Serum suspendiert.

Die folgende Tabelle gibt die Menge an Zellen an, die in 10 jeder der Zellkulturen 1 bis 9 erforderlich ist, um eine Einheit Interferon-a zu erzeugen:

Zellkultur

Menge an Zellen

Zellkultur

Menge an Zellen

1

30

6

40

2

45

7

40

3

-

8

1000, 360

4

680

9

200, 100

5

2000

G

2 Blatt Zeichnungen

Claims

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1. Verfahren zur Herstellung von durch lebende Zellen erzeugte Substanzen, dadurch gekennzeichnet, dass man

A. die Zellen innerhalb von Membranen mit einer gegebenen Obergrenze der Permeabilität einkapselt;

B. die eingekapselten Zellen in einem wässrigen Kulturmedium suspendiert;

C. die Zellen in vitro den Stoffwechsel erfahren und die Substanz ausscheiden lässt; und

D. die Substanz entweder aus dem wässrigen Medium oder aus dem Inneren der Kapseln erntet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Einkapselungsstufe (A) ausführt, indem man die Membran durch Reaktion zwischen kationischen Gruppen auf Polymerketten und anionischen Gruppen auf einem wasserlöslichen Gummi unter Bildung einer wasserunlöslichen, Salzbindungen aufweisenden Matrix bildet.

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PATENTANSPRÜCHE

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Einkapselungsstufe (A) ausführt, indem man a) die Zellen in einem wässrigen Medium suspendiert, das mit den Zellen physiologisch verträglich ist und ein wasserlösliches Gummi mit mehreren anionischen Resten enthält;

b) aus der Suspension die Zellen enthaltende Tröpfchen bildet;

c) die Tröpfchen einer Lösung von mehrwertigen, physiologisch verträglichen Kationen aussetzt, um die Tröpfchen als diskrete, formbeständige, wasserunlösliche zeitweilige Kapseln zu gelieren; und d) Oberflächenschichten der zeitweiligen Kapseln vernetzt, um semipermeable Membranen um die Tröpfchen herum zu bilden, indem man die Kapseln einem Polymeren aussetzt, das mehrere kationische Gruppen enthält, die mit anionischen Resten reaktionsfähig sind.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass man ausserdem das Gel innerhalb der in Stufe (b) erzeugten Membran wieder löslich macht.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die erzeugte Substanz ein Molekulargewicht unterhalb der vorgegebenen oberen Permeabilitätsgrenze der Membran hat und dass man die Substanz durch die Membranen in das wässrige Medium diffundieren lässt und aus diesem erntet.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass man die Zellen zusammen mit einem vollständigen Zellkulturmedium einkapselt, das genügt, um die Zellen zu erhalten und die Biosynthese der Substanz in vitro zu ermöglichen.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das in Stufe (B) verwendete wässrige Medium ein vollständiges Zellkulturmedium ist, das genügt, um die Zellen zu erhalten und die Biosynthese der Substanz in vitro zu ermöglichen.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, bei dem die Zellen eine Komponente mit einem Molekulargewicht oberhalb der oberen Permeabilitätsgrenze der Membranen benötigen, damit die Biosynthese der Substanz in vitro möglich ist, dadurch gekennzeichnet, dass man zusätzlich diese Komponente zusammen mit den Zellen einkapselt.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen menschliche oder Säugetierzellen sind.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass man die Zellen innerhalb der Kapsel zusätzlich eine Mitose erfahren lässt.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10,

dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen genetisch modifizierte Zellen sind.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11,

dadurch gekennzeichnet, dass man in der Einkapselungsstufe

(A) sphäroide Mikrokapseln mit einem Durchmesser unterhalb 0,5 mm erzeugt.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12,

dadurch gekennzeichnet, dass man in der Stufe (D) eine Substanz erntet, die aus Insulin, Glucagon, Prolactin, Somatosta-tin, Thyroxin, Steroidhormonen, Hypophysenhormonen, Interferonen, FSH und PTH gewählt ist.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12,

dadurch gekennzeichnet, dass man in der Stufe (D) eine Substanz erntet, die aus Hormonen, Interferonen, Lymphokinen und Antikörpern gewählt ist.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, bei dem die in Stufe (A) eingekapselten Zellen Kontakt mit einer Komponente benötigen, die ein Molekulargewicht oberhalb der oberen Permeabilitätsgrenze der Membranen hat, um die Produktion der Substanz aufrechtzuerhalten, dadurch gekennzeichnet, dass man diese Komponente zusammen mit den Zellen in der Stufe (A) einkapselt und dass das in Stufe

(B) verwendete wässrige Kulturmedium im wesentlichen frei von dieser Komponente ist.

"16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15,

dadurch gekennzeichnet, dass die vorgegebene Obergrenze der Permeabilität unterhalb 1,5 x IO5 u liegt.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16,

dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen Hybridomzellen sind, dass die erzeugte Substanz monoklonale Antikörper mit einem Molekulargewicht oberhalb der vorgegebenen Obergrenze der Permeabilität der Membran sind und dass man die Antikörper aus dem Inneren der Kapsel erntet.