DD285371A5 - Verfahren zur immobilisierung von mikroorganismen bzw. coimmobilisierung von mikroorganismen und enzymen - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Immobilisierung von Mikroorganismen bzw. Coimmobilisierung von Mikroorganismen und Enzymen, das sehr stabile Biokatalysatoren liefert, die auch in Langzeitverfahren und stoffwandelnden Prozessen in der Biotechnologie, chemischen, pharmazeutischen und Lebensmittelindustrie sowie in der Medizin eingesetzt werden koennen. Die Mikroorganismen werden zunaechst durch Bindung an Traegermaterialien vorimmobilisiert. Im Falle der Coimmobilisierung von Mikroorganismen und Enzymen werden die Mikroorganismen und Enzyme separat an ein Traegermaterial gebunden. Nach Sedimentation und Separation der vorimmobilisierten Mikroorganismen bzw. vorimmobilisierten Mikroorganismen und Enzyme im Falle der Coimmobilisierung werden diese in Mikrokapseln eingeschlossen und nach UEberfuehrung in ein fuer die Zuechtung der immobilisierten bzw. coimmobilisierten Biokatalysatoren geeignetes Milieu der gewuenschten Verwendung zugefuehrt.{Immobilisierung von Mikroorganismen; Coimmobilisierung von Mikroorganismen und Enzymen; Vorimmobilisierung; Einkapselung; Polyelektrolytkomplexe; Stoffwandlung}

Description

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Titel der ICrfindung

Verfahren zur Immobilisierung von Mikroorganismen bzw. Coimmobilisierung von Mikroorganismen und Enzymen

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Immobilisierung von Mikroorganismen bzw. Coimmobilisierung von Mikroorganismen und Enzymen zur Herstellung von Biokatalysctoren, die zur Durchführung stoffwandelnder Prozesse in der Biotechnologie, in der pharmazeutischen, chemischen und Lebensmittelindustrie sowie für den Einsatz in der Medizin geeignet sind.

Sie finden z. B. Verwendung für die Biosynthese von Medikamenten, hochwertigen Chemikalien, Enzymen usw.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Zur Durchführung biochemischer Reaktionen in der Biotechnologie, pharmazeutischen, chemischen und Lebensmittelindustrie werden verstärkt Mikroorganismen eingesetzt. In zunehmendem Maße v/erden die Mikroorganismen in immobilisierter Form verwendet, um den Einsatz derselben ökonomisch und effektiv zu gestalten. Mit Hilfe der Immobilisierung wird eine Erhöhung der mikrobiellen Produktivität, im Verhältnis zum Reaktorvolumen, eine leichtere Abtrennbarkeit des Biokatalysators vom Produkt und damit eine wesentliche Senkung des Aufwands zur Isolierung der gewünschten Produkte ermöglicht.

Zur Immobilisierung von Mikroorganismen ist eine Reihe von Methoden beschrieben worden, wie z. B. der Einschluß in Netzwerke und in Schaumstoffe, die Fixierung an porösen Trägermaterialien und die Vorkapselung. Daneben sind einige Methoden und Materialien in Kombination getestet worden.

Beim Einschluß in Netzwerke aus Gelen ist neben einer relativ geringen mechanischen Festigkeit häufig ein Auswaschen der Zellen aus den Gelen zu beobachten (Stöcklein, Eisgruber, Schmidt, Biotechnol. Lett. 5(10), 703 (1983)).

Um die Gefahr des Auswachsens von Zellen in das Medium herabzusetzen und daraus resultierende Störungen des Pr-ozesses zu vermeiden, wird in DE OS 34 32 932 ein Verfahren beschrieben, das das Auswachsen von Zellen auch bei Langzeitversuchen sicher verhindern soll. Diese Aufgabe wird dadurch gelöst, daß die Oberfläche des Biokatalysators durch eine zellenfreie Schutzschicht aus einem vernatzten, keine Durchlässigkeit für die Zellen aufweisenden den zellenhaltigen Kern umschließenden Gel gebildet wird. Dieses Verfahren liefert Gelkörper, die im allgemeinen eine begrenzte mechanische Haltbarkeit aufweisen. Finden beschriebenen Verwendungszweck, die Sektherstellung, ist jedoch die mechanische Festigkeit von untergeordneter Bedeutung, da der Biokatalysator nicht stark beansprucht wird, in anderen stoffwandelnden Prozessen spielt die mechanische Festigkeit eine bedeutende Rolle.

In dieser Patentschrift wird zudem festgestellt, daß sich das Verfahren der Mikrokapselung für die Immobilisierung von Zellen nicht eignet aufgrund der Toxizität der zu verwendenden Lösungsmittel und der daraus resultierenden geringen Katalysatorakxivität, und daß auch bei dieser Methode das Auswachsen von Zellen nicht sicher verhindert werden kann.

Von Mosbach (Phil. Trans. R. Soc. Lond. B300, 355 (1983)) wird ebenfalls festgestellt, daß bei der Einkapselung von Mikroorganismen im Vergleich zum Einschluß in Netzv/erken die Anzahl Zellen, die ins Medium wachsen können, weiter reduziert ist, daß aber dennoch die in die Membran inkorporierten Zellen Eiomasse nach außen abgeben können.

In DE-OS 30 12 233 wird ein Verfahren zur Immobilisierung von chemisch oder biologisch aktiven Stoffen, lebendem Gewebe und Einzelzellen beschrieben, bei dem zunächst die Materialien in einem Gel eingeschlossen und anschließend die sauren Gruppen an der Oberfläche der Gelmatrix mit einem aminogruppenhaltigen Polymer umgesetzt v/erden, so daß sich eine Membran ausbildet. Als nachteilig sind die geringe Widerstandsfähigkeit der so gebildeten Membran gegenüber proteolytischem Angriff anzusehen, die eine begrenzte Lebensdauer der Kapseln bedingt, und die Anwesenheit einer großen Anzahl freier Aminogruppen an der Oberfläche, die neben der Verklumpungsgefahr der Kapseln bei Einsatz anionischer Substrate zu einer Akkumulation derselben an der

Oberfläche führt.

In den letzten Jahren wurden in zunehmendem Maße Mikroorganismen verschiedener Species und/oder Enzyme zusammen immobilisiert (Coimmobilisierung), nachdem anfangs jeweils nur ein bestimmter Mikroorganismus bzw. ein bestimmtes Enzym an oder in einer Matrix immobilisiert worden war, von denen einige in einer weiterentwickelten Form zusammen in einem Reaktor eingesetzt wurden, Die Coimmobilisierung von Mikroorganismen und Ei zymen ermöglicht es, den Einsatzbereich immobilisierter Mikroorganismen zu verbreitern, indem andere, normalerweise nicht durch den betrachteten Mikroorganismus verwertete Substrate mit Hilfe der coimmobilisicrten Enzyme in eine Form überführt werden, dip vom betreffenden Mikroorganismus umgesetzt werden kann. Bei Auswahl einer geeigneten Sequenz von Enzymen können auf diese Weise mehrstufige Reaktionen katalysiert werden.

Nach einem Verfahren von B. llägerdal und K. Hosbach (US 4,524,137 zur Coimmobilisierung von Mikroorganismen und Enzymen wird das Enzym kovalent an das Trägermaterial gebunden, das zum Einschluß der Mikroorganismen dient. Als nachteilig sind bei dieser Methode die relativ geringe mechanische Festigkeit der Gelperlen und das Problem des Auswaschens von Zellen aus den Gelen beim Einsatz in Langzeitversuchen anzusehen.

In EP 0 041 6.10 wird von C. H. Boehringer Sohn, Ingelheim die Bindung des Enzyms an Hefezellen vorgeschlagen. Diese Methode ist jedoch nicht bei allen Mikroorganismen-Species anwendbar, da die meisten Mikroorganismen durch die Irnmobilisierungsprozedur des Enzyms inaktiviert werden. Darüber hinaus wird die Größe der Zellen nicht wesentlich verändert, so daß die Rückhaltung des Coimmobilisats in kontinuierlichen Fermentatxonsprozessen sehr schwierig ist.

Von W. Hartmeier und A. Heinrichs wird in DE 35 34 983 ein Verfahren zur Coimmobilisierung von Mikroorganismen und Enzymen beschrieben, bei dem die Mikroorganismen und Enzyme zugleich in einer polymeren Matrix eingeschlossen werden, die in situ mit einer entgegengesetzt geladenen, somipermeablen Membran überzogen wird. Bei diesem Verfahren wird die Anzahl Zellen, die bei Langzeitfermentationen ins Medium auswachsen können, gegenüber dem alleinigen Einschluß in ein Gelnetzwerk reduziert. Es kann aber dennoch nicht verhindert v/erden, daß beim Eintropfen der

Mikroorganismen/Enzym/Alginatlösung in die Calciumchlorid/ Methacrylat/Acrylat-Copolymer-Lösung Mikroorganismen in die Membran inkorporiert werden, die Ursache für das Auswachsen von Mikroorganismen ins Außenmediu.n sein können. Bei den an dieser Stolle dargestellten Methoden zur Immobilisierung von Mikroorganismen bzw. Mikroorganismen und Enzymen ist festzustellen, daß sie im Falle des Geleinschlusses von vornherein eine geringe mechanische Festigkeit besitzen und daß bei den bekannten Verfahren zur Einkapselung von Mikroorganismen bzw. Mikroorganismen und Enzymen dieselben in die Kapselmembran inkorporiert werden und durch Wachstums- und Zellteilungsvorgänge der vitalen Objekte eine beträchtliche Verminderung der Kapselfestigkeit verursacht wird.

Ziel der Erfindung

Ziel· der Erfindung sind stabile enkapsulierte Biokatalysatoren, deren Stabilität auch im Falle der Einkapselung proliferierender Systeme nicht durch Wachstums- und Zellteilungsvorgänge derselben herabgesetzt wird und die in biotechnologischen Verfahren eingesetzt werden können.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung immobilisierter oder coimmobilisierter Biokatalysatoren mit hoher Operationsstabilität auf dem Wege der Enkapsulierung von Mikroorganismen oder Mikroorganismen und Enzymen zu finden, das den Einbau der zu immobilisierenden. Biokatalysatoren in die Kapselwand verhindert und Kapseln mit hoher Membranfestigkeit erzeugt.

Erfindungsgemäß wird das dadurch erreicht, daß die zu immobilisierenden Mikroorganismen, beispielsweise Hefen und Bakterien, schonend an ein Trägermaterial gebunden werden zürn Zwecke der Vorimmobilisierung, daß das Enzym/die Enzyme im Falle der Coimmobilisierung von Mikroorganismen und Enzymen separat an ein Trägermaterial gebunden werden, die sedimentierten und separierten Vorimmobilisate in einer wäßrigen Lösung aus C Hulosesulfat suspendiert werden, die Suspension in eine wäßrige Polydimethyldiallylammoniumchlorid-Lösung eingetropft wird, und die immobilisierten Biokatalysatoren nach Abschluß des Einkapselungsprözesses in bekannter Weise abgetrennt und in ein für die Züchtung der Mikroorganismen geeignetes Milieu eingebracht werden. Zur Vorimmobilisierung werden die Mikroorganismen entweder adsorptiv unter Verwendung eines physiologisch kompatiblen Mediums oder kovalent an ein Trägermaterial gebunden, das vorzugsweise ein unlösliches Material darstellt

Im Falle der kovalenten Bindung der Mikroorganismen an das Trä-

germaterial wird vorzugsweise Glutardialdehyd in einem physiologisch kompatiblen Medium verwendet, der in Konzentrationen zwischen 0,1 bis 5 % eingesetzt wird.

Als unlösliches Trägermaterial wird insbesondere Aminomethylpolystyrsn mit einem Partikeldurchmosser von 5 bis 200 /um zum Einsatz gebracht.

Die Temperatur während des Vorimmobilisierungsprozesses wird zwischen 277 K und der·Stabilitätsgrenze der zu immobilisier,enden Mikroorganismen gewählt.

Im Falle der Coimmobilisierung von Mikroorganismen und Εηζ'Λ ion erfolgt die Bindung des Enzyms/der Enzyme entweder adsorptiv oder kovalent an einem Trägermaterial, das vorzugsweise ein unlösliches Material darstellt, in einer wäßrigen Lösung bei ρί!~ Werten zwischen 3,5 und S, bei Temperaturen von 277 K bis zur Stabilitätsgrenze der Enzyme und bei einer Reaktionsdauer von min bis 24 Stunden. Als Kupplungsreagens wird vorzugsweise Glutardialdehyd mit einer Konzentration zwischen 0,1 bis 10 %, vorzugsweise jedoch 2,5 %. Als unlösliches Trägermaterial werden vorzugsweise aminogruppenhaltige Polystyrenderivate mit einem Partikeldurchmesser vqn 5 bis 200 /am verwendet.

Die Temperatur bei der sich anschließenden Einkapselung der sedirnentierten und separierten Vorimrnobilisate wird ebenfalls zwischen 273 K und der Stabilitätsgrenze der zu immobilisierenden Biokatalysatoran gewählt.

Die Cellulosesulfatkonzentration für die Einkapselung der Vorimmobilisate liegt zwischen 5 und 100 g/l, die Konzentration der Polydimethyldiallylammoniumchlorid-Lösung gleichfalls zwischen 5 und 100 g/l.

Die Verweilzeit der immobilisierten Mikroorganismen oder Mikroorganismen und Enzyme liegt zwischen 30 Sekunden und 12 Stunden. Mach Abtrennung der erfindungsgemäß hergestellten immobilisierten Biokatalysatoren von der Polydimethyldiallylamrnoniumchlorid-Lösung werden diese in ein für die Züchtung der immobilisierten Biokatalysatoren geeignetes Üilieu überführt und anschließend der gewünschten Verwendung zugeführt.

Somit liefert das erfindungsgemäße Verfahren immobilisierte Biokatalysatoren, die sich durch eine hohe Vitalität, Aktivität und Operationsstabilität auszeichnen, die auch im Falle der Einkapselung vitaler, proliferieronder Systeme bei Langzeitversuchen nicht durch V/achstums- und Zellteilungssvorgänge derselben oder

Auswaschen vermindert wird. Die Bindung des ICnzyms/der Enzyme schützt dieses vor Abbauprozessen und Inaktivierung. Die Vorimmobilisierung gewährleistet, daß keine Mikroorganismen in die Kapselwand inkorporiert v/erden und die Oberfläche des immobilisierten bzw. coimmobilisierton üiokatalysators frei von Mikroorganismen ist. Somit ist das Risiko des Auswachsens von Mikroorganismen in das Kulturmedium, das beim Einschluß von Mikroorganismen in Gelnetzwerke nicht verhindert v/erden kann und zu Störungen des Prozesses führt, ausgeschlossen. Von Vorteil ist weiterhin eine erhöhte mechanische Stabilität der Biokatalysatoren gegenüber der von Gelnetzwt;rken.

Im Falle der Coimmobilisierung von Invertase und Yarrowia lipolytica-Zellen wird es möglich, Saccharose als Substrat einzusetzen, die normalerweise nicht von diesen Zellen verwertet werden kann, jedoch ein wesentlich preiswerteres Substrat als das eigentliche Substrat Glucose darstellt.

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Das erfindungsgemäße Verfahren soll anhand nachfolgender Bei spiele erläutert werden.

Ausführungsbeispiele Beispiel 1

0,2 g Polystyren Wofatit UF 93 (Partikeldurchmesser 100 bis 200-yum) v/erden mit 0,5 ml Zollsuspension der Hefe Yarrowia lipolytica (1 mg HTH/ml) und 15 ^r,l Vollmedium nach Behrends 12 h mäßig gerührt.

Dann läßt man das Polystyron sedimentieren und trennt den Überstand ab. Mach mehrmaligem Waschen mit VJasser wird das Pclystyren erneut sedimentiert und, wie in Beispiel 3 beschrieben, verwendet.

Beispiel 2

0,2 g Polystyren Wofatit UF 93 (Partikeldurchmesser 100 bis 200 um) werden 2 h mit wäßrigem Glutardialdehyd (2,5%ig in £?GKEKSEN-Phosphatpuf for pH 7,0) gerührt. Das aktivierte Trägermaterial wird anschließend mit Wasser bis zur völligen Entfernung des überschüssigen Glutardialdehyds gewaschen. Dann rührt man das aktivierte Polystyren 3 h mit 0,5 ml einer Zellsuspension der Hefe Yarrowia lipolytica (1 mg HTM/ ml) und 3 ml SÖRENSEK-Phosphatpuffer pH 7,0.

Das Polystyren wird erneut mit Wasser gewaschen und sedimentiert.

Der Zell-Träger-Komp.lex wird, wie in Beispiel 3 beschrieben, verwendet.

Beispiel 3

0, 5 g des Sediments der voriinmobilisierten Hefe Yarrowia lipolytica gemäß Beispiel 1 und 2 werden in 5 ml 2,2%iger CeI-lulosesulfatlösung (Cellulosesulfat mit einem DS von 0,43) suspendiert und möglichst homogen verteilt.

Dann wird diese Suspension in 50 ml einer Lösung von l,2%igem Polydimeth}Idiallylammoniumchlorid mit einer Molmasse von

40000 unter leichtem Rühren getropft und mindestens 5 min langsam gerührt.

Nach Abtrennung des Fällbads von den gebildeton Mikrokapseln werden diese zweimal mit 50 ml sterilem destillierten Wasser gewascnen.

Zur Kultivierung werden 20 g der so erhaltenen Kapseln in einem 500-ml-Fermenter eingesetzt. Hach einer Kultivierungsdauer von 2Λ h ist das Kulturmedium aufgezehrt und das ZeIlwachstum abgeschlossen. Die Zellmasse im Kapselinneren ist. auf eine Konzentration von 15 mg HTii/ml Immobilisat angewachsen. Das Außenmedium ist nichb getrübt, d, h. frei von Hefezellen. Diese Kapseln v/erden in einem kontinuierlichen Fermentationsprozeß zur Produktion von Citronensäure einge-

Das erfindungsgemäße Verfahren wurde analog mib Bakterien der Species Pseudomonas aeruginosa ausgeführt.

Beispiel 4

0,2 g Polystyren Wofatit UF 93 (Partikeldurchmesser 5 bis 100 /um) v/erden mit 3 ml 2,5%iger Glutardialdehyd-Lösung in SÖRENSEN-Phosphatpuffer pH 7,0 2 Ii bei Löumtemperatur gerührt. Das aktivierte Trägermaterial wird anschließend mit Wasser bis zur völligen Entfernung des überschüssigen GIutardialoehyds gewaschen. Anschließend wird das aktivierte Polystyren mit 300 U Invertase in 3 ml SÖRENSEN-Phosphatpuffer pH 7,0 4 h bei Raumtemperatur gerührt und danach mit 25 mi! Matriumacetatpuffer pH 5,0/1 M NaCl und 25 mi' N^- triumacetatpuffer pH 5,0 gewaschen, bis kein Protein mehr im Waschwasser nachweisbar ist.

Der Invcrtase-Polystyren-Komplex wird, wie in Beispiel 6 beschrieben, verwendet.

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Beispiel 5

0,2 g Polystyren Wofatit Ul' 93 (Partikeldurchmesser 5 bis 100 ^m) werden mit 800 U Inverhase in 3 ml SÖRENSEN-Phosphatpuffer pH 7,0 4 h bei Raumtemperatur gerührt und anschließend mit 25 mM Natriumacetatpuffer pH 5,0/1 M NaCl und 25 mM Natriumacetatpuffer pH 5,0 gewaschen, bis kein Protein mehr ir.i Waschwasser nachweisbar ist. Der Invertase-Polystyren-Kornplex wird, wie in Beispiel G beschrieben, verwendet.

Beispiel 6

0,5 g des Sediments der vorimmobilisierten Hefe Yarrowia lipolytica gemäß Beispiel 1 und 2 sowie 0,2 g des Sediments der polystyrengebundenen Invertase gemäß Beispiel 4 und 5 v/erden in 5 ml 2,2^?öiger Celluloscsulfatlösung (Cellulosesulfat mit einem DS von 0,43) suspendiert und möglichst hoino.jen verteilt.

Dann wird diese Suspension in 50 ml einer Lösung von l,2£igem Polydimethyldiallylarnmoniumchlorid mit einer Molmasse von 40000 unter leichtem Rühren getropft und mindestens 5 min langsam gerührt.

Nach Abtrennung des Fällbads von den gebildeten Mikrokapseln werden diese zweimal mit 50 ml sterilem destillierten Wasser gewaschen.

Zur Kultivierung werden 20 g der so erhaltenen Kapseln in einem 500-ml-Fermenter eingesetzt, fach einer Kultivierungsdauer von 24 h ist das Kulturmedium aufgezehrt und das Zellwachstum abgeschlossen. Die Zellmasse im Kapselinneren ist auf eine Konzentration von 15 mg HTM/ml Immobilisat angewachsen. Das Außenmedium ist nicht getrübt, d. h. frei von Hefozellcn. Diese Kapseln werden in einem kontinuierlichen Fermentation.sprozeß zur Produktion von Citronensäure mit Saccharose als Substrat eingesetzt.

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Beispiel 7

50 rnl einer 2,2%igen Cellulosesulfatlösung (Cellulosesulfat mit einem DS von 0,43) werden 10 min bei 121 C autoklaviert. Dann Dann v/erden 0,5 ml des Sediments gemäß Beispiel 3 bzv/. 6 in 5 ml des autoklavieren Cellulosesulfat^ suspendiert und homogen verteilt. Diese Suspension wird in 50 ml einer Lösung von 0,25 % Polydimethyldiallylammoniumchlorid mit einer Molmasse von 40000 unter leichtem Rühren getropft und mindestens 40 min gerührt. Danach wird das Fällbad 1 : 1 mit Wasser verdünnt. Die Kapseln werden weitere 80 min unter leichtem Rühren im Fällbad bewegt. Nach Abtrennung des Fällbades werden die Kapseln ohne weitere Behandlung sofort dem Kultivierungsprozeß zugeführt, wie es in Beispiel 3 und 6 beschrieben wurde.

Claims (16)

1. Pa csntanSprüche

   1. Verfalircn zur Immobilisierung von Mikroorganismen bzw. Coimmobilisierung von Mikroorganismen und Enzymen durch Vorirnmobilisierung und Einkapselung, gekennzeichnet dadurch, daß die Mikroorganismen zur Vorimrnobilisierung bzw, das Enzym/die Enzyme und die zu immobilisierenden Mikroorganismen separat an ein Trägermaterial gebunden werden, anschließend die sedimcntierten und separierten Vorimmobilisate in einer wäßrigen Lösung aus Cellulosesulfat suspendiert werden, die Suspension in eine wäßrige Polydimethyldiallylammoniumchlorid-Lösunq eingetropft wird, und die erhaltenen immobilisierten bzw. komplexen immobilisierten (coimmobilisierten) Biokatalysatoren in bekannter V7eise abgetrennt und in ein für die Züchtung der immobilisierten bzw. coimmobilisierten Biokatalysatoren geeignetes Milieu eingebracht werden.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1 gekennzeichnet dadurch, daß das Enzym/die Enzyme adsorptiv oder kovalent an einem Trägermaterial in einer wäßrigen Lösung bei pH-Werten zwischen 3,5 und 8, bei Temperaturen von 277 K bis zur Stabilitätsgrenze der Enzyme und bei einer Reaktionsdauer von 30 min bis 24 Stunden gebunden v/erden.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2 gekennzeichnet dadurch, daß zur kovalenten Bindung der Enzyme, an das Trägermaterial vorzugsweise Glutardialdehyd als Kupplungsreagens verwendet wird.
4. 4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3 gekennzeichnet dadurch, daß die Konzentration des Glutardialdehyds 0,1 bis 10 %, vorzugsweise 2,5 % beträgt.
5. 5. Verfahren nach Anspruch 1 gekennzeichnet dadurch, daß die zu immobilisierenden Mikroorganismen zur Vorimmobilisierung adsorptiv an ein Trägermaterial unter Verwendung eines physiologisch kompatiblen Mediums gebunden v/erden.
6. 6. Verfahren nach Anspruch 1 gekennzeichnet dadurch, daß die Vorirnmobilisierung der Mikroorganismen durch kovalento Bindung an ein Trägermaterial erfolgt.
7. 7. Verfahren nach Anspruch 1 und 6 gekennzeichnet dadurch, daß zur kovalenten Bindung der Mikroorganismen an ein Trägermaterial vorzugsweise Glutardialdehyd in einem physiologisch kompatiblen Medium verwendet wird.
8. 8. Verfahren nach Anspruch 1, 6 und 7 gekennzeichnet dadurch, daß die Konzentration des Glutardialdehyds zur Vorimmobilisierung der Mikroorganismen 0,1 bis 5 % beträgt .
9. 9. Verfahren nach Anspruch 1 und 5 bis 8 gekennzeichnet dadurch, daß die Temperatur während des Vorimmobilisierungsprozesses der Mikroorganismen von 277 K bis zur Stabilitätsgrenze der zu immobilisierenden Mikroorganismen reicht.
10. 10. Verfahren nach Anspruch 1 bis 9 gekennzeichnet dadurch, daß vorzugsweise ein unlösliches Trägermaterial verwendet wird.
11. 11. Verfahren nach Anspruch 1 bis 10 gekennzeichnet dadurch, daß als unlösliches Trägermaterial vorzugsweise Aminornethylpolystyren verwendet wird.
12. 12. Verfahren nach Anspruch 1 bis 11 gekennzeichnet dadurch, daß der Partikeldurchmesser der Polystyrenkugeln von 5 bis 200 pm. reicht.
13. 13. Verfahren nach Anspruch 1 gekennzeichnet dadurch, daß eine Konzentration des Cellulosesulfats bei der Einkapselung der Vorimmobilisate von 5 bis 100 g/1 eingesetzt wird.

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14. 14. Verfahren nach Anspruch 1 und 13 gekennzeichnet dadurch, daß für die Einkapselung der Vorimmobilisate eine Konzentration des Polydimethyldiallylainmoniurnchlorids zwischen 5 und 100 g/l verwendet wird.
15. 15. Verfahren nach Anspruch 1, 13 und 14 gekennzeichnet dadurch, daß die Temperatur bei der Einkapselung der Vorimmobilisate von-273 K bis zur Stabilitätsgrenze der einzukapselnden Vorimmobilisate reicht.
16. 16. Verfahren nach Anspruch 1 und 13 bis 15 gekennzeichnet dadurch, daß die Verwcilzeit der immobilisierten !Mikroorganismen in der Polydimethyldiallylammoniurnchlorid-Lösung von 30 Sekunden bis 12 Stunden gewählt wird.