DD286363A5 - Verfahren zur herstellung von peptid-immunstimulantien - Google Patents

Abstract

Es wird ein Verfahren zur Herstellung von Peptidverbindungen mit der Formel I, deren pharmazeutisch annehmbaren Basen-Salzen, pharmazeutisch annehmbare Zusammensetzungen und ihre Verwendung als Mittel gegen Infektionen, worin R1 Alkyl, Cycloalkyl oder Cycloalkylmethyl ist, R2 Wasserstoff oder Alkyl ist und R3 Hydroxy oder ein Aminosaeurerest mit der Formel ist, worin X Wasserstoff, Alkyl oder Hydroxymethyl ist und n eine ganze Zahl von 0 bis 4 ist und R4 und R5 Alkyl, Wasserstoff, Benzyl oder Cyclohexylmethyl sind, offenbart. Formel und Formel 1{Verfahren; Herstellung; Peptidverbindungen; pharmazeutisch; Zusammensetzungen; Infektionen; Verwendung}

Description

worin Ri Alkyl mit zwei bis zehn Kohlenstoffatomen, Cycloalkyl mit vier bis sieben Kohlenstoffatomen oder Cycloalkylmethyl mit sechs bis acht Kohlenstoffatomen ist, R₂ Wasserstoff oder Alkyl mit einem bis drei Kohlenstoffatomen ist, R₃ Hydroxy oder ein Aminosäurerest mit der Formel

-NHCCH(CH₂)_nCO₂R₆ X

ist, worin X Wasserstoff, Alkyl mit einem bis zwei Kohlenstoffatomen oder Hydroxymethyl ist und η eine ganze Zahl von O bis 4 ist, und R₄ und R₅ jeweils unabhängig voneinander Wasserstoff, Alkyl mit einem bis sechs Kohlenstoffatomen, Cycloalkylmethyl mit sechs bis acht Kohlenstoffatomen oder Benzyl sind, dadurch gekennzeichnet, daß eine Verbindung mit der Formel

H-N D CO-R₁.

² \ / ⁵

^X CH LO

i Il -

(CH-) -CONHCH-C-R., 2 2, 3

^R2 worin R₂, R3 und R₆ wie oben definiert sind, mit einer Verbindung

R₁CO-HaI

worin die funktioneilen Gruppen, die nicht an der Reaktion beteiligt sind, geschützt sein können, und worin R₁ die obige Definition besitzt und Hai für ein Halogen steht, acyliert wird, gefolgt von dem fakultativen Schnitt des 1) selektiven Entfernens der Schutzgruppen und, auf Wunsch, des Herstellern eines pharmazeutisch annehmbaren, basischen Salzes des Produktes.

2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Acylieren mit einem Säurechlorid in Gegenwart eines tertiären Amins durchgeführt wird.

3. Verfahren nach Punkt 2, dadurch gekennzeichnet, daß die O-Benzylgruppen durch katalytische Hydrogenolyse entfernt werden.

Anwendungsgebiet der Erfindung

Diese Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von neuen, Acvlglutaminsäure enthaltenden Peptiden, die als Immunstimulantien und Mittel gegen Infektionen von Wert sind, auf pharmazeutische Zusammensetzungen hiervon und auf ihre Anwendung bei der Behandlung von Infektonen.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Das rolativ neue Gebiet der Immunpharmakologie und insbesondere der Teil daraus, der sich mit der Immunmodulation befaßt, entwickelt sich weiterhin mit hoher Geschwindigkeit. Eine Reihe natürlich vorkommender Verbindungen wurde untersucht, unter anderem als Tetrapeptid Tuftsin, das chemisch als NMHN²-L-Threonyl-L-lysyl)-L-prolyl)-L-arginin bekannt ist. Viel Aufmerksamkeit wandte man auf synthetische Peptidoglycanderivate, insbesondere auf solche, die als Muramyl-Di-peptido

bekannt sind. Für Übersichten über den weiten Bereich der <ils !mmunmodulatoren und insbesondere als Immunsiimulantien untersuchten Verbindungen sei auf Düker et al., Annu.Re, Med.Chem., 14,146-167 (1979), Lederer, J.Med. Chem., 23,819-825 (1980) und auf J. Kralovec, Drugs of the Future, 8,615-638 (1903) verwiesen

Immunstimulantien sind in einigen Patentbeschreibungen beschrieben worden:

L-Alanyl-alpha-glutarsäure-N-acyldipeptide in der deutschen Schrift 3,024,355, veröffentlicht am 15. Januar 1981, Tetra- und Pentapeptide, die D-Alanyl-L-glutamyl-Einheiten oder L-Alanyl-D-glutamyl-Einheiten enthalten, in der britischen Schrift 2,053,231, veröffentlicht am 4. Februar 1981 bzw. in der deutschen Schrift 3,024,281, veröffentlicht am 8. Januar 1981, und N-Acyl-alanyl-gamma-D-glutamyl-Tripeptidderivate, In denen die C-terminale Aminosäure Lysin oder Diaminopimelinsäure ist, in der deutschen Schrift 3,024,369, veröffentlicht am 15. Januar 1981, und Lactoyl-Tetrapeptide, die aus N-Lactylalanyl-, Glutamyl-, Diaminopimelyl- und Carboxymethylaminobestandteilen zusammengesetzt sind, in der EP-11283, veröffentlicht am 23.MaM980

Weitere immunstimulierende Polypeptide mit der Formol (A)

R¹HHNCHCO) -HN-CH-R³

I₂ ⁿ I

ν«

CO-NH-CH-R⁴ (A)

f R⁶-HN-CN-R⁵

worin R¹ Wasserstoff oder Acyl ist, R² unter anderem Wasserstoff, niederes Alkyl, Hydroxymethyl, Benzyl ist, R³ und R⁴ jeweils Wasserstoff, Carboxy und-CONR⁷R' sind, wobei R⁷ Wasserstoff, fakult. (iv durch Hydroxy substituiertes niederes Alkyl ist und R⁸ Mono-dicarboxy-niederalkyl ist, R⁵ Wasserstoff oder Carboxy ist, unter der Bedingung, daß, wenn eine der beiden Gruppen R⁴ und R⁶ Wasserstoff ist, die andere Carboxy oder-CONR⁷R⁸ ist, R⁶ Wasserstoff ist, m gleich 1 bis 3 und η gleich 0 bis 2 ist, und Derivate hiervon, worin die Carboxy- und Aminogruppen geschützt sind, sind in den US-Patenten 4,311,640 und 4,322,341, den EP-Anmeldungen 25,482,50,856,51,812,53,388,55,846 und 57419 offenbart.

Keines der in der Wissenschaft und Technik offenbarten Polypeptide besitzt eine heterocyclische Gruppe in der Stellung, die durch die variable Guppe R⁴ in der obigen Formel eingenommen wird, mit Ausnahme der US-Anmeldung Aktenzeichen Nr. 662,668, eingereicht am 19. Oktober 1984. Die US-Anmeldung Aktenzeichen Nr. 595,169, von Ives et al. am 30. März 1984 eingereicht, beschreibt Polypeptide, in denen die variable Gruppe R⁴ eine basische Aminosäureeinheit ist. Kitaura et al., J.Mod.Chem. 25,335-337 (1982) berichten, daß N²-(gamma-D-Glutamyl)-meso-2-(L), 2(D)-diaminopimelinsäure die kleinste Struktureinheit ist, die eine biologische Reaktion hervorrufen kann, welche für die Verbindung (A), worin η gleich 1 ist, R¹ CH₃CH(OH)-CO- ist, R² CH₃ ist, R³ und R⁵ jeweils-COOH sind, R⁴-CONHCH₂COOH ist und R^e H ist, charakteristisch ist. Diese Verbindung mit der Formel (A) ist als FK-156 bekannt.

Ziel der Erfindung

Die neuen erfindungsgemäß hergestellten Immunstimulantien besitzen die Formel I O

R₁CTJH D y CO₂R₄

CH L 0 1

I H

(CH₂J₂CONHCHC-R₃

^R2

oder sind oin pharmazeutisch annehmbares Basen-Salz hiervon, worin Ri Cycloalkyl mit vier bis sieben Kohlenstoffatomen oder Alkyl mit zwei bis zehn Kohlenstoffatomen ist, R] Wasserstoff oder Alkyl mit einem bis drei Kohlenstoffatomen ist, R₃ Hydroxy oder ein Aminosäurerest mit der Formel

-NHCH(CHj)_nCO₂R₆ X

ist, worin X Wasserstoff, Alkyl mit einem bis zwei Kohlenstoffatomen oder Hydroxymethyl ist und η eine ganze Zahl von 0 bis 4 ist, und R₄ und R₆ jeweils Wasserstoff, Alkyl mit einem bis sechs Kohlenstoffatomen, Cycloalkylmethyl mit sechs bis acht Kohlenstoffatomen oder Benzyl sind.

Eine bevorzugte Gruppe von Verbindungen sind jene, worin R₁ Alkyl mit fünf bis acht Kohlenstoffatomen ist, R₂ Wasserstoff ist, Rj der genannte Aminosäurerest ist, worin X, η und R₆ die obige Definition besitzen, und R₄ Wasserstoff ist. Besonders bevorzugt

sind solche Verbindungen innerhalb dieser Gruppe, in denen η gleich 0 ist und R₆ Wasserstoff, das genannte Alkyl oder

Cyclohexylmethyl ist. Ganz besonders bevorzugte Verbindungen sind jene, in denen Ri (R,S)-2-Ethyl-1 -butyl, R₅ Wasserstoff und X Methyl ist, R₁ (R,S)-3-Heptyl, R₆ Wasserstoff und X Methyl ist, R₁ (R,S)-2-Methyl-1 -pentyl, R₆ Wasserstoff und X Methyl ist, R₁ (R,S)-2-Heptyl, R₆ Wasserstoff und X Methyl ist, R₁ (R,S)-2-Ethy 1-1-pentyl, R₆ Wasserstoff und X Methyl ist, R₁ (R,S)-1-Hexyl, R₆ Wasserstoff und X Methyl ist, R₁ (R,S*)-2-Ethyl-1 -hexyl, R₆ Wasserstoff und X Methyl ist, R₁ (S)-oder (R,S)-2-Methyl-1 -hexyl, R₆ Wasserstoff und X Methyl ist, R₁ (S)- oder (R,S)-2-Ethy 1-1-hexyl, X Methyl und R₆ Wasserstoff ist und R₁1 -Hexyl, X Methyl und R₆ Wasserstoff ist. Ebenfalls ganz besonders bevorzugt ist die Verbindung, worin R₁1 -Hexyl, X Wasserstoff und η gleich 3 ist. Besonders bevorzugte Ester sind jene, worin R₁ (R,S)-2-Ethyl-1-pentyl ist, X Methyl ist und R₆ η-Butyl, i-Butyl oder Cyclohexylmethyl ist, R₁ (S)- oder

(R,S)-2-Methyl-1-hexyl ist, X Methyl ist und R₆ η-Butyl, i-Butyl oder Cyclohexylmethyl ist, und R₁ (S)- oder (R,S)-2-Ethy 1-1 -hexyl ist, X Methyl ist und R₆ η-Butyl, i-Butyl oder Cyclohexylmethyl ist.

Eine zweite bevorzugte Gruppe von Verbindungen sind jene, worin R₁ Cycloalkyl mit vier bis sieben Kohlenstoffatomen ist, R₂ Wasserstoff ist und R₁ der genannte Aminosäurerest ist, worin η gleich 0 ist, X Alkyl mit ein oder zwei Kohlenstoffatomen ist und R₄ und R₆ jeweils Wasserstoff sind. Ganz besonders bevorzugt innerhalb dieser Gruppe ist die Verbindung, worin R₁ Cyclohexyl

ist und X Methyl ist.

Eine dritte bevorzugte Gruppe von Verbindungen umfaßt jene, worin R₁ Alkyl mit fünf bis acht Kohlenstoffatomen ist, R₂ Wasserstoff ist, R₃ der genannte Aminosäurerest 1st, worin X Wasserstoff oder Alkyl mit ein bis zwei Kohlenstoffatomen ist, η

eine ganze Zahl von 0 bis 4 ist und R₆ Wasserstoff ist, und R₄ Alkyl mit ein bis sechs Kohlenstoffatomen, Cycloalkylmethyl mit sechs bis acht Kohlenstoffatomen oder Benzyl ist.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich ferner auf eine pharmazeutische Zusammensetzung in Form einer Einheitsdosierung,

welche einen pharmazeutisch annehmbaren Träger und eine infektionshemmende oder die Immunstimulation bewirkende

Mengij einer Verbindung mit der Formel 1 enthält, und auf ein Verfahrenzur Behandlung einer Infektion in einem daran leidenden Menschen, welches das Verabreichen einer die Infektion hemmenden Monge einer Verbindung mit der Formel 1 umfaßt. Unter pharmazeutisch annehmbaren basischen Salzen der genannten Verbindungen mit der Formel 1 sind Salze mit

anorganischen oder organischen Basen wie z. B. Alkalimetall- und Erdalkalimetallhydroxyden, Ammoniak, Triethylamin,

Ethanolamin und Dicyclohexylamin zu verstehen. Die Konfiguration der Aminosäuregruppen, aus denen die Verbindungen mit der Formel 1 bestehen, ist im Hinblick auf die

pharmakologisc Ίβ Wirkung dieser Verbindungen von Bedeutung. Die höchste Aktivität wird in den Verbindungen mit der

Formel 1 beobachtet, die die in dieser Formel nngegebena Stereochemie besitzen. In solchen Verbindungen mit der Formel 1,

worin R₂ und X andere Gruppen als Wasserstoff sind, ist die bevorzugte Stereochemie an den Kohlenstoffatomen mit L bzw. D

angegeben. ·

Als ebenfalls innerhalb des Rahmens der vorliegenden Erfindung befindlich sind Verbindungen mit der Formel 1 zu betrachten,

in denen R₃ Alkoxy, Cycloalkoxy, Aralkoxy oder Alkoxy ist, das durch einen oder mehrere Substituenten, ausgewählt unter

Amino, Dialkylamtno, Hydroxy, Alkoxy und Halogen, substituiert ist. Die Verbindungen mit der Formel 1 werden auf eine beliebige der verschiedenen, den Fachleuten bekannten Verfahren

hergestellt. Die Methodologie umfaßt die Bildung von Peptidbindungen zwischen Aminosäuren, die ihrer Amino- und

Carboxygruppen und häufig dor Gegenwart anderer reaktiver Gruppen wegen einen Schutz dieser Gruppen und/oder die Aktivierung solcher Gruppen, insbesondere der Carboxygruppe, benötigen, um eine bestimmte Reaktion zu ermöglichen oder

um diese Reaktion zu optimieren.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Im allgemeinen werden zwei Wege bei der Synthese der Verbindungen mit der Formel 1 beschritten. Das erste Verfahren nutzt die Verknüpfung des Fragmentes

Il

R.CNH D .CO₂R₄

ar L

(CH-)-CONHCHCO₀H 2 2,2

^R2

mit dem Aminosäurefragment

D H₁NCH(CH₂I_nCO₂R₆

Das zweite, erfindungsgemäße Verfahren umfaßt die Acylierung des Peptids H₂N D CO₂R₄

ar L ο

I H

)₂CONHCHC-R₃

*2

mit der entsprechenden Säure R)CO]H.

In den hier vorgestellten Beispielen werden bestimmte Schutz- und Aktivierungsgruppen im einzelnen erläutert. Der Fachmann wird jedoch bemerken, daß auch andere Schutz- oder Aktivierungsgruppen hätten verwendet werden können. Die Wahl einer bestimmten Schutzgruppe hängt großenteils von der Verfügbarkeit der benötigten Reagenzie, ihrer Wirkung auf die Löslichkeit der „geschützten" Verbindung, der Leichtigkeit ihrer Entfernung und von der Gegenwart anderer Gruppen, die durch ihre Verwendung beeinflußt werden könnten, d. h. von ihrer Selektivität oder ihrer Entfernbarkeit, ab.

Es wird beispielsweise bei vielen Reaktionen notwendig oder zumindest wünschenswert sein, die Aminogruppen und/oder die Carboxygruppen zu schützen. Der Syntheseweg, der für die Peptidsynthese ausgewählt wird, kann die Entfernung der einen oder der anderen oder beider Schutzgruppen erfordern, um weitere Umsetzungen an der regenerierten Amino- oder Carboxygruppe möglich zu machen, d. h. die Schutzgruppen, die man verwendet, reagieren reversibel und sind in den meisten Fällen unabhängig voneinander entfernbar. Außerdem hängt die Wahl der Schutzgruppe für eine bestimmte Aminosäure von der Rolle dieser Aminogruppe im Gesamtreaktionsschema ab. Aminoschutzgruppen mit unterschiedlicher Labilität, d. h. die unterschiedlich leicht zu entfernen sind, werden zum Einsatz kommen

Dasselbe gilt im Hinblick auf die Carboxyschutzgruppen.

Solche Gruppen sind in der Literatur bekannt und hier sei auf die Übersichtsartikel von Bodansky et al., .Peptide Synthesis", 2. Auflage, John Wiley and Sons, N. Y. (1976), Greene, ,Protective Groups in Organic Synthesis", John Wiley and Sons, N. Y. (1981), McOmie, .Protective Groups in Organic Chemistry", Plenum Press, N. Y. (1973) und auf Sheppard in .Comprehensive Organic Chemistry, The Synthesis and Reactions of Organic Compounds", Pergamon Press, N. Y. (1979), herausgegeben von E.Haslam, Teil 23.6, S.321-339, verwiesen.

Üblicherweise verwendete Amino- und Carboxyschutzgruppen sind den Fachleuten bekannt. Vertreter für Aminoschutzgruppen, die auf keinen Fall diese Gruppe einschränken sollen, sind die folgenden: z.B. Benzyloxycarbonyl; substituiertes oder unsubstituiertes Aralkyl wie Benzyl, Trityl, Benzhydryl und 4-Nitrobenzyl; Benzyliden; Arylthio wie z. B. Phenylthio,. Nitrophenylthio und Trichlorphenylthio; Phosphorylderivate wie x. B. Dimethylphosphoryl und 0,0-Dibenzylphosphoryl; Triallylsilylderivate wie Trimethylsilyl; und andere, die z. B. Im US Patent 4,322,341 beschrieben sind und die durch das Zitat hier summarisch einbezogen sind. Die bevorzugte Aminoschutzgruppe ist Benzyloxycarbonyl. Verfahren, um eine bestimmte Aminogruppe mit dieser Gruppe zu substituieren, sind gut bekannt. Im allgemeinen umfassen sie das Acylieren der entsprechenden Aminoverbindung mit Benzyloxycarbonylchlorid (Chlorameisensäurebenzylester) in einem reaktionsinerten Solvens, z. B. Wasser, Methylenchlorid, Tetrahydrofuran, in Gegenwart einer Base (eines Säureakzeptors), z. B. von Natriumoder Kaliumhydroxid, wenn Wasser das Solvens ist, und, wenn ein organisches Solvens verwendet wird, in Gegenwart eines tertiären Amins wie z. B. eines Ct_4-Trialkylamins oder von Pyridin. Wird ein wäßriges Solvenssystem verwendet, hält man den pH der Reaktionsmischung bei etwa pH8-10 und vorzugsweise bei pH9. Wenn alternativ die Reaktante, d. h. die Verbindung, in der eine Aminogruppe geschützt werden soll, basische Gruppen enthält, kann sie als Säureakzeptor fungieren. Die Acylgruppe R₁CO wird mit Hilfe von Standardverfahren für die Acylierung in das Peptid eingeführt, z. B. durch Umsetzen des Peptids mit dem entsprechenden Säurechlorid oder -bromid in einem reaktionsinerten Solvens. Bevorzugte Bedingungen sind eine wasserfreie Umgebung und die Zugabe einer geeigneter! Base, z. B. einer organischen Base, vorzugsweise eines tertiären Amins wie Triethylamin, N-Methylmorpholin oder Pyridin. Das bevorzugte Solvens ist Methylenchlorid. Vertreter für Carboxyschutzgruppen sind verschiedene Ester, z. B. Silylester einschließlich Trialkylsilylester, Trihalogensilvester und Halogenalkylsilylester; bestimmte Kohlenwasserstoffester, z. B. C)_i-Alkyl-, insbesondere t-Butylgruppen, Benzyl-und substituierte Benzylester, Be.izhydryl und Trityl; Phenacyl- und Phtalimidomethylester; bestimmte substituierte Kohlenwasserstoffester wie Chlormethyl, 2,2,2-Trichlorethyl, Cyanomethyl; Tetrahydropyranyl; Methoxymethyl; Methylthiomethyl; geschützte Carbazoylgruppen, z. B. -CONH-NHR⁰, worin R° eine Aminoschutzgruppe, wie sie oben offenbart wurde, insbesondere Benzyloxycarbonyi ist; und andere, die im US Patent 4,322,341 beschrieben sind und die durch das Zitat hier summarisch einbezogen sind. Eine besondere bevorzugte Carboxyschutzgruppe ist die t-Butoxycarbonylgruppe. Die geschützten Amino- und Carboxygruppen werden mittels den Fachleuten bekannter Verfahren in die ungeschützten Amino- und Carboxygruppen umgewandelt. Die Benzylgruppe, die bevorzugte Schutzgruppe für Carboxygruppen (als Teil der geschützten Carbazoylgruppe) wird durch katalytische Hydrierung über Pail· .dium, insbesondere über Palladium/Aktivkohle entfernt. Alternativ werden diese Schubgruppen mit Hilfe von Trifluormethansulfonsäure in Trifluoressigsäure und zur Unterdrückung der Alkylierung in Gegenwart von Anisol entfernt, die t-Butoxycarbonylgruppe wird leicht durch Behandeln mit Dioxan, das mit Chlorwasserstoff gesättigt wurde, entfernt.

Die Aktivierung von Carboxygruppen zur Beschleunigung einer gegebenen Reaktion ist eine den Fachleuten bekannte Methode. Besonders günstig für die hier beschriebene Reaktionsabfolge ist die Verwendung von Anhydriden, insbesondere von cyclischen Anhydriden, und von aktivierten Estern, wie z. B. von denen, die sich von N-Hydroxyphtalimid und N-Hydroxysuccinimid ableiten, die beide für Peptidsynthesen benutzt werden.

Die aktivierten N-Hydroxysuccinimidester beschleunigen nachfolgende Reaktionen an den genannten Estergruppen. Wie der Fachmann bemerken wird, könnten auch andere Aktivierungsgruppen verwendet werden. Eine Gruppe, die besondere Aufmerksamkeit findet, ist die N-Hydroxyphtalimidogruppo, die genauso wie die NHydroxysuccinimidogruppe angewendet wird. In beiden Fällen wird ein dehydratisierend wirkendes Verknüpfungsmittel zur Bildung der aktivierten Ester eingesetzt.

Vertreter für solche Verknüpfungsreagentien sind 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinoethyl)-carbodiimid-metho-p-Toluolsulfonat, Dicyclohexylcarbodiimid, Ν,Ν'-Carbonyldiimidazol, N-O-DimethylaminopropyD-N'-ethylcarbodiimid-Hydrochlorid, Ethoxyacetylen, Diphenylketen und N-Ethyl-S-phenylisoxazolen-S'-sulfonat. Die Reaktionsbedingungen bei der Verwendung solcher Verknüpfungsreagentien sind in der Literatur ausführlich beschrieben. Im allgemeinen umfassen sie die Verwendung eines reaktionsinerten Solvens und Temperaturen im Bereich von Raumtemperatur bis 100°C. Die oben erwähnten Carbodiimid-Reagentien werden bevorzugt, da sie sich bei Umgebungstemperatur anwenden lassen und befriedigende Ausbeuten der gewünschten Ester liefern.

Nach Abschluß der Verknüpfungsreaktionen, die zu den Endprodukten führen, können die verschiedenen Schutzgruppen nach den entsprechenden, voranstehend diskutierten Verfahren entfernt und die Verbindungen mit der Formel 1 isoliert werden. Dia pharmazeutisch annehmbaren basischen Salze der Verbindungen mit der Fc rmel 1, worin R₃ Hydroxy ist oder R₄ oder Rs Wasserstoff ist, werden erhalten, indem man eine Lösung, vorzugsweise eine wäßrige Lösung, die diese Verbindungen enthält, mit einer Base, z. B. einer der oben aufgezählten, versetzt, vorzugsweise in stöchiometrischen Anteilen. Die Salze werden durch Eindampfen oder Ausfällen isoliert.

Die Produkte dieser Erfindung sind für Säuger einschließlich Menschen als Mittel für die klinische und therapeutische Behandlung von Krankheiten von Wert, die durch verschiedene pathogene Mikroorganismen, insbesondere durch gramnegative Bakterien, verursacht werden. Sie sind außerdem als Immunstimulantien in Säugern einschließlich Menschen wertvoll, die wegen einer vorhandenen oder klinisch induzierten Immunsuppression einem gesteigerten Infektionsrisiko ausgesetzt sind. Das Testverfahren unter Verwendung von männlichen CjH/HoN-Mäusen aus dem Charles River Breeding Laboratory ist im folgenden dargestellt. Die Mäuse wurden vor ihrer Verwendung 5 Tage lang akklimatisiert und dann entweder subkutan (SC) oder oral (PO) mit verschiedenen Verdünnungen (100,10,1 und 0,1 mg/kg) der Testverbindung oder eines Placebos (pyrogenfreie Salzlösung) mit einem Volumen von 0,2ml behandelt. Die Behandlungsvorschrift wurde von dem verwendeten Infektionsorganismus abhängig gemacht: -24 und 0 Stunden vor der Infektion mit Klebslella pneumonia in normalen Mäusen und -3,-2 und -1 Tag vor der Infektion mit Escherichia coil oder Staph. aureus in Mäusen mit immunsuppression. Die Infektion wurde im Fall von K. pneumonlae intramuskulär (IM) in die Hüfte gesetzt oder, im Fall von E. coil und Staph. aureus, intraperitoneal (IP) verabreicht. Ein Volumen von 0,2 ml wurde für die Infektion benutzt. Die Mortalität wurde für K. pneumonlae nach 7 Tagen und für die anderen beiden Mikroorganismusinfektionen nach 3 Tagen bestimmt.

KulturprSparatlon: K. pneumonlae, E. coil oder Staph. aureus: Die Kultur wurde zur Reinheitsuntersuchung von gefrorenem Blutkonzentrat auf Hirn-Herz-lnfusionsagar(BHl-Agar) übertragen. Drei Kolonien wurden aus der 18 Stunden alten Plattenkuitur herausgenommen und in 9ml BHI-Kulturbrühe gegeben. Man ließ

die Kulturbrühe 2 Stunden bei 37*C auf einem Rotationsschüttler wachsen und strich anschließend 0,2 ml auf der Oberfläche mehrerer BHI-Agar-Schrägkulturen aus. Nach einer 18stündigen Inkubation bei 37"C wurden die Schrägkulturen mit

BHI-Medium gewaschen, die Kulturdichte wurde mit einem Spectronic 20 eingestellt und die entsprechende Verdünnung

hergestellt, um ein LD90-Infektionsniveau in normalen Mäusen zu erreichen.

Will man die erfindungsgemäßen Verbindungen als Mittel gegen Infektionen oder als Immunstimulantien verwenden, so

werden sie bequemerweise auf oralem, subkutanem, Intramuskulärem, Intravenösem oder intraperitonealem Wege verabreicht, im allgemeinen in Form einer Zusammensetzung. Solche Zusammensetzungen t ntsprechen der pharmazeutischen Praxis.

Beispielsweise können sie in Form von Tabletten, Pillen, Pulvern oder Granulaten, die Träger wie Stärke, Milchzucker, bestimmte Arten von Tonerde etc. enthalten, verabreicht werden. Sie können in Kapseln gegeben werden, vermischt mit denselben oder

äquivalenten Trägern. Sie können auch in Form oraler Suspensionen, Lösungen, Emulsionen, Sirupe und Elixiere verabreicht werden, die Aroma- und Färbemittel enthalten können. Für die orale Verabreichung der erfindungsgemäßen therapeutischen

Mittel eignen sich Tabletten oder Kapseln mit einem Gehalt von etwa 50 bis etwa 500 mg für die meisten Anwendungen. Der Arzt wird die Dosis bestimmen, die für einen einzelnen Patienten am besten geeignet sein wird, und diese wird mit dem Alter,

den Gewicht und der Reaktion dieses Patienten und mit dem Verabreichungsweg schwanken. Der bevorzugte Bereich für die orale Dosierung, in einzelnen oder geteilten Dosen, reicht von etwa 1,0 bis etwa 300mg/kg/Tag. Die bevorzugte parenteral

Dosis beträgt etwa 1,0 bis etwa 100 mg/kgAfag, der stärker bevorzugte Bereich etwa 1,0 bis etwa 20mg/kg/Tag. Diese Erfindung stellt auch pharmazeutische Zusammensetzungen zur Verfugung, einschließlich von Einheitsdosierungs- Formen, die für die Nutzung der hier beschriebenen Verbindungen in den hier offenbarten Anwendungsbereichen von Wert sind. Die Dosierungsform kann in einzelnem oder mehrfachen Dosen verabreicht werden, wie oben angemerkt, um die Tagesdosierung, die für einen bestimmten Zweck wirksam ist, zu erreichen. Die folgenden Beispiele sind einzig zum Zweck der näheren Erläuterung angegeben. Um kurz gefaßt zu bleiben, werden die

folgenden Abkürzungen für Peakformen in den NMR-Spektren verwendet: s = Singulett, d - Dublett, t = Triplett, q = Quartett, m = Multiple«. Die Ausdrücke „Mol" und „Millimol" werden mit „m" bzw. .mm" abgekürzt.

Ausführungsbelsplole

Beispiel 1 N-lsovaleryl-D-gamma-glutamyl-glycyl-D-alanin

D (Ri ° (CHj)iCHCH,-, R₂ = H und R₃ = -NHCH (CH,)CO₂H)

1A. Glycyl-D-alanlnbenzylester-Hydrochlorld

Zu einer kalten Lösung (O⁰C) aus 100ml Methylenchlorid mit 10g (57 mm) N-t-Butyloxycarbonylglycin, 20g (57mm) D-Alaninbenzylester-p-Toluolsulfonsäuresalz und 5,77g (57mm) Triethylamin wurden 12,3g (60mm) Dicyclohexylcarbodiimid gegeben und man ließ die entstandene Reaktionsmischung auf Raumtemperatur aufwärmen. Nach 18 Stunden wurde die Mischung filtriert und das Filtrat im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde in 200ml Ethylacetat gelöst und die organische Phase wurde mit 2,5%iger Salzsäure, Wasser, einer gesättigten Natriumhydrogencarbonatlösung und einer Salzlösung

gewaschen. Die organische Phase wurde abgetrennt, über Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Zu dem entstandenen Öl gab man 200ml mit Chlorwasserstoff gesättigtem Dioxan. Nach 30 min wurden 400ml Diethylether zugegeben, und das Produkt wurde unter Stickstoff abfiltriert, 10,9g (70% Ausbeute).

1B. N-t-Butoxycarbonyl-D-gamma-glutamyl-lalphabenzyleiterl-hydroxytucclnamldetter

Zu 1500ml Methylenchlorid, das 50g (143mm) N-t-Butoxycarbonyl-D-gamma-glutaminsäure-alpha-benzylester und 17,3g

(150mm) N-Hydroxysuccinamid enthielt, gab man 30,9g (15mm) Dicyclohexylcarbodiimid und ließ die entstandene

Reaktionsmischung bei Raumtemperatur 18 Stunden lang rühren. Die Feststoffe wurden abfiltriert und das Filtrat im Vakuum

eingeengt. Der Rückstand wurde mit Diethylether ausgerührt und der Feststoff unter Stickstoff abfiltriert, 43,7g (68%

Ausbeute).

1C. D-'gamma-GlutamyMalpha-benzyletterl-glycyl-D-alanln-benzyleiter-Hydrochlorld Man ließ eine Lösung aus 4,3 g (9,45 mm) N-t-Butoxycarbonyl-D-gamma-glutamyl-lalpha-benzylesterl-hydroxysuccinamidester, 2,71 g (9,92mm) Glycyl-D-alaninbenzylester-Hydrochlorid und 1,0g (9,92mm) Triethylamin in 100ml Methylenchlorid bei Raumtemperatur 18 Stunden lang rühren und engte sie anschließend im Vakuum ein. Der Rückstand wurde in 200 ml Ethylacetat gelöst und die Lösung wurde mit 2,5%iger Salzsäure, Wasser, 10%igem Kaliumcarbonat und einer Salzlösung gewaschen. Die organische Phase wurde abgetrennt, über Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde mit 200ml mit Chlorwasserstoff gesättigtem Dioxan versetzt und 2 Stunden lang gerührt. Die Lösung wurde im Vakuum zur Trockne eingeengt und der Rückstand mit Diethylether ausgerührt. Der Feststoff wurde unter Stickstoff abfiltriert, 3,41g (73%).

1D. N-lsovaleryl-O-gamma-glutemyl-glycyl-D-alanln

Zu einer Lösung ν/>n 1,0g (2,03mm) D-gamma-GlutamyMalpha-benzylesterl-glycyl-D-alaninbenzylester-Hydrochlorid und 616mg (6,09mm) Triethylamin in 50ml Methylenchlorid wurden 490mg (4,06mm) Isovaleriansäurechlorid gegeben und die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur 80Stunden lang gerührt. Das Methylenchlorid wurde im Vakuum abgedampft und der Rückstand wurde in Ethylacetat gelöst. Die entstandene Lösung wurde mit 2,5%iger Salzsäure, Wasser, 10%igem Kaliumcarbonat, Wasser und einer Salzlösung gewaschen. Die organische Phase wurde abgetrennt, über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde mit Diethylether ausgerührt, unter Stickstoff abfiltriert (910 mg) und 700mg wurden in 50ml Methanol gelöst. Palladiumhydroxid (200mg) wurde der Lösung zugesetzt, und die Mischung wurde unter einer Wasserstoffatmosphäre von 50psi 3 Stunden lang geschüttelt. Der Katalysator wurde abfiltriert und das Solvens im Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde in Wasser gelöst und lyophilisiert, wobei man 364 mg (65% Ausbeute) des gewünschten Produktes erhielt.

Das NMR-Spektrum (DMSO-d,) zeigte Absorptionen bei 8,25-8,05 (m, 3H), 4,33-4,12 (m, 2 H), 3,72 (d, J = 6Hz, 2H), 2,21 (t, J = 8Hz,2H), 1,88-1,68(m, 1 H),2,08-1,9(m,4H), 1,28(d, J = 9Hz,3H)und0,9(d, J = 7Hz,6H)ppm.

Beispiel 2 Ausgehend vom entsprechenden Säurechlorid und D-gamma-Glutamyl-falpha-benzylesterl-glycyl-D-alaninbenzylester- Hydrochlorid und unter Anwendung des Verfahrens aus Beispiel 1D wurden die folgenden Verbindungen hergestellt:

Il

R₁CNH

(ch₂)₂conhch₂conhchco₂h

CH₃

Ri Smp-.'C NMR, ppm CH₁(CH₂Jr- >175 (DMSO-d,)8,17-8,22(m,2H),4,35-4,13(m,2H),3,83(d,J = 6Hz,2H),

22,2 (t, J = 6 Hz, 2 H), 2,15 (t, J = 6Hz, 2 H), 2,08-1,65 (m, 2 H), 1,45-1,18(m,17H)und0,90(t,J = 7Hz,3H)

(CH₁I₂CH- >110(Zers.) (DMSOd,) 8,2-8,08 (m, 2 H), 8,02 (d, J = 9Hz, 1H), 4,3-4,1 (m,2H),3,72

(d, J = 7 Hz,2 H), 2,53-2,40 (m, 1 H), 2,22 (t, J =« 9 Hz, 2 H), 2,10-1,7 (m, 2 H), 1,28(d,J = 9Hz,3H)und1,08-0,9{m,6H)

(DMSO-d,) 8,3^-7,9 (m, 3 H), 4,33-4,17 {rn, 2 H), 3,72 (d, J = 5 Hz, 2 H), 2,3-2,1 (m,2H)und 2,10-1,0 (m, 16Hi

CH₁(CH₂I₂- >110(Zers.) (DMSCVd,) 8,25-8,05 (m, 3 H), 4,35-4,22 <m, 2H), 3,72 (d, J = 6Hz, 2H), 2,22

(t,J - 8Hz,2H),2,12(t,J = 8Hz,2H),2,08-1,77(m,2H), 1,55(q,J = 8Hz, 2H),U8(d,J = 8Hz,3H)undO,88(t,J = 7Hz,3H)

CH₁(CHj)₄- >190(Zers.) (DMSO-d,) 8,33-8,0 (m, 3 H), 4,35-4,1 (m, 2 H), 3,7 (d, J = 6Hz, 2H), 2,17 (t,

J = 8 Hz, 2 H), 2„ (t, J = 8 Hz, 2 H), 2,05-1,63 (m, 2 H), 1,48 (t, J =· 7 Hz, 2 H), 1,2-1,1 (m,7H)und 0.85 (t,J = 7Hz,3H)

CH₁(CH₂If- >180(Zers.) (D₂O) 4.42-4,28 (m, 2 H), 3.91 (s, IH), 2,4 (t, J = 7 Hz, 2 H), 2,27 (t, J = 7Hz,

2H), 2,22-1,94 (m, 2H), 1,65-1,55 (m, 2 H), 1,39 (d, J = 8Hz,3H), 1,34-1,17 (m,8H)undO,73(m,3H)

Smp.,X

NMR, ppm

CH,(CHj)jCHCHr-(s) (DMSO-d,) 8,27-8,03 (m, 3 H), 4,32-4,1 (m, 2 H), 3,72 (d, J = 6Hz, 2H), 2,22 (t,J = 10Hz₍2H),2,27-1,68{m,6H),1,42-1.0(m,10H)und0,94-O,8(m,6H)

CH,(CH,)jCH-(R. S) (DMSO-d,) 8.22-8,0 (m, 3 H), 4,32-4,1 (m, 2 H), 3,8-3,6 (m, 2 H), 2,28-1,68 (m,6H), 1.6-1,0 (m,12H)und 0,94-0,7 (m,6H)

Hj(CH₂»,CH-(DMSO-d,) 8,29-7,97 (m, 3 H), 4,33-4,1 (m, 2 H), 3,81-3,59 (m, 2 H), 2,32-1,65 (m, 6 H), 1,65-1,17 (m,8H) und 1,02-0,68 (m, 6 H)

^(₈)VCH₂-SO^₆) 8,3-8,0 (m, 3 H), 4,32-4,1 (m, 2 K, 3,85-3,62 (m, 2 H), 2,21 (t, J » 8Hz,2H),2,02(d,J = 8Hz,2H),2,01 l,9(m,1H),1,85-1,5(m,8H), 1,28(d,J = 8Hz,3H) und 1,28-0,8 (rr,5H)

(CH,CHjCH,),CHCH₂ (DMSO-d«) 8,18-8,0 (m, 3 H), 4,31-4,1 (m, 2 H), 3,84-3,6 (m, 2 H), 2,22 (t, J β 6Hz,2H),2,07(d,J = 8Hz,2H),2,03-1,7(m,3H), 1,4-1,15(m, 11 H)und 0,87(t,J = 6Hz,6H)

(CH₁CH₂J₂CHCH₂-(DMSO-d,) 8,27-7,95 (m, 3 H), 4,3-4,1 (m, 2 H), 3,78-3,6 (m, 2 H), 2,3-1,57 (m,8H),1.46-1,13(m,8H)und0,84(t,J = 8Hz,6H)

9H,

CH₁JCHj)₁CHCHr (R.S)

CH,

CHj(CHj)₁CHCH₂-(R,S) (DMSOd,) 8,18-8,0 (m, 3H), 4,24-4,06 (m, 2 H), 3,74-3,56 (m, 2 H), 2,17(t,J = 9Hz,2H).2,12-2,0(m,1H),2,0-1,64(m,4H),1,24(d,J = 6Hz, 7H), 1,14-0,98 (m, 2H) undO,81(d, J = 6Hz,6H)

(DMSO-d,) 8,2-8,04 (m, 3 H), 4,26-4,08 (m, 2 H), 3,76-3,6 (m, 2 H), 2,28-1,64 (m, 7 H), 1,4-0,96 (m, 7 H) und 0,96-0,74 (m, 6H)

(CH₁)JCH(CH,)

CHj(CHj)₄CH-

,',CH-(R.S) (DMSO-d,) 8,24-7,95 (m, 3H), 4,3-4,08 (m, 2 H), 3,81-3,59 (m, 2H), 2,21 (t,J = 6Hz),2,11 (t,J = 8 Hz, 2 H), 2,05-1,38 (m, 7 H), 1,27 <d,J = 8Hz,3K), 1,17-1,05 (m,2H) und 0,86(d,J = ΙΟΗζ,βΗ)

(DMSO-d,) »»,24-8.0 (m, 3H), 4,33-4,11 (m, 2 H), 3,79-3,6 (m, 2 H), 2,41-2,29(m, 1H), 2,22 (U = 8Hz,2H), 2,11-1,66 (m, 2 H), 1,59-1,43 (m,1H),1.38-1,11(m,11H),1,06-0,95(m,3H)und0,87(t,J = 6Hz,3

CH₁(CHj)₁CHCH₂-(R,S) (DMSO-d,) 11,24-8,02 (m, 3 H), 4,32-4,11 (m, 2 H), 3,84-3,6 (m, 2 H), 2,24(t,J = 'J Hz, 2 H), 2.08 (d, J = 8 Hz, 2 H), 2,03-1,63 (m, 4 H), 1,44-1,11 (m, 12 H) und 0,97-0,71(m, 6 H)

(CH₃),CH(CH,)₄-

9H,

CH₁(CHj)₄CHCH₂-(R.S) (DMSO-d,) 8,24-8,04 (m, 3 H), 4,28-4,1 (m, 2 H), 3,76-3,6 (m, 2 H), 2,18(t, J = 6Hz,2H),2,1 (t,J = 6Hz,2H),2,04-1,86(m,1 H), 1,84-1,66 (m, 1 H), 1,56-1,38 (m, 3 H), 1,23(d, J = 6Hz,3H), 1,2-1,06(m,3H) und 0,82(d,J = 6Hz,6H)

(DMSOd,) 8,23-7,98 (m, 3 H), 4,3-4,13 (m, 2 H), 3,81-3,61 (m, 2 H), 2,22(I,J = 8Hz,2H),2,18-1,68(m,6H),1,45-1.07(m,12H)und 0,98-0,8 (m, 6H)

(CH₁I₂CH(CH₂I₂CHCHj-(R,S) (DMSO-d,) 8,37-8,03 (m, 3 H), 4,31-4,1 (m, 2 H), 3,78-3,6 (m, 2 H), 2,26(t,J = 8Hz,2H),2,2-1.36(m,7H),1,3(d,J = 8Hz, 5H), 1,26-1,05 (m, 2 H) und 1,05-0,73 (m, 9H)

9 (CHj)₂CHCHjCHCHr-(DMSO-d,) 8,23-7,98 (m, 2 H), 4,3-4,13 (m, 2H), 3,81-3,61 (m, . 1)), 2,21 (t,J = 8Hz,2H),2,15-2,0(m,2H),1,9(t,J = 8Hz,2H),1,85-1,52 (m, 3 H), 1,4-1,22 (m, 3 H), 1,22-0,94 (m, 3 H) und 0,94-0,80 (m, 6 H)

CH^H₂

CH₁(CH₂)JCHCH₂-(R,S) (DMSOd,) 8,25-7,98 (m, 3 H), 4,3-4,08 (m, 2 H), 3,81-3,62 (m, 2H), 2,22 (t, J = 8 Hz, 2 H), 2,06 (d, J = 8 Hz, 2 H), 2,02-1,89 (m, 1 H), 1,87-1.65 (m, 2 H), 1,41-1,06 (m, 11H.¹ und 0,<!3-0,7 (m, 6 H)

(DMSO-d,) 8,33-7,95 (m, 3 H), 4,3-4,06 (m, 2 H), 3,83-3,59 (m, 2 H), 2,21 (I, J = 8Hz,2H),2,11(s,3H),2,08-1,87(m,1 H), 1,87-1,35 (m,8H), 1,25(d,J = 8Hz,3H)und1,22-0,98(m,3H)

R₁ Smp.,°C NMR, ppm

(CH,CH₂),CH(CHj)r- - (DMSO-d,) 8,21-8,0 (m, 3 H), 4,32-4,1 (m, 2 H), 3,83-3,6 (m, 2 H),

2,21 (t,J = 8Hz,2H),2,11 (t.J = 8 Hz, 2 H), 2,05-1,89 (m,1 H), 1,87-1,67 (m,iH),1,57-1.38(m,3H),1,38-1,08(m,9H)und0,83(t,J = 6Hz,6H)

CH, - (DMSO-de)8,24-7,97{m,3H),4,33-4,1{m.2H),3.86-3,59(m,2H), CH₃(CHj)₂CH(CH₂J₂- 2,35-2,08 (m, 4 H), 2.08-1,9 Im, 1 Hi, 1,89-1,67 (m, 1 H), 1,63-1,46 (m, 1 H)

(R,S) 1,46-1,02 (m, 11 H) und 0,98-0,73 (m, 6 H)

.CH₃CH₂ - (DMSO-d₄) 8,2-7,94 (m, 3 H), 4,26-4,06 (m, 2 H), 3,76-3,56 (m, 2 H),

CH₃(CHj)₄CHCH₂- 2,16(t,J = 6Hz,2H),2,1-1,84(m,3H),1,84-1.6(m,2H)₍1,24(d,J = 6Hz,

(R,S) 9 H), 1,12-0,92 (m, 3 H) und 0,92-0,64 (m, 9 H)

CH₃ - (DMSO-d,) 8,23-8,0 (m, 3H), 4,32-4,06 (m, 2 H), 3,72 (d, J = 8Hz, 2 H), CH₃(CH₂J₆CHCH₂- 2,22(t,J = 10Hz,2H),2,16-1,7(m,6H),1,42-1,08(m,14H)und

(R,S) 0,92-7,0 (m, 6 H)

C₂H₆ - (DMSO-d,) 8,2-8,0 (m, 3 H), 4,24-4,16 (m, 2 H), 3,74-3,60 (m, 2 H), CH₃(CH₂J₃CHCH, 2,18(t,J = 7,2 H), 2,02 (d, J = 7,2H),2,02-1,6im,3H),1,26(d,J = 6,3H),

(S) 1,26-1,08 (m. 8 H) und 0,92-0,74 (m, 6 H)

Beispiel 3 N-(3-(S)-Methylheptanoyl)-D-gamma>glutamyl-L-alanyl-D-alanln

D (Ri « (S) CH₃(CH₂JiCH(CH])CHf, R₂ ° CH₁, R, - -NHCH(CH₃)CO₂H)

3A. N-t-Butoxycarbonyl-L-alanyl-D-alaninbenzylester

Zu einer Lösung aus 23,0g (0,121 m) N-t-Butoxycarbonyl-L-alanin, 42,6g (0,121 m) D-Alaninbenzvlester-p-Toluolsulfonsäuresalz und 17 ml (0,121 m) Triethylamin in 400ml kaltem (O⁰C) Methylenchlorid wurden tropfenweise 2'..,Og (0,121 m) Oicyclohexylcarbodiimid in 100ml Methylenchlorid zugesetzt. Nachdom man Ober Nacht hatte rühren lassen, filtrierte man die Feststoffe ab und engte das Filtrat zu einem Öl ein. Der Rückstand wurde in 400ml Ethylacetat gelöst, das mit einer 1%igen Salzsäurelösung, einer 10%igen Kaliumcarbonatlösung, Wasser und einer Salzlötung gewaschen wurde. Die organische Phase wurde abgetrennt, über Magnesiumsulfat getrocknet und zu einem Öl eingeengt. Der Rückstand wurde mit Diethylether ausgorührt und der entstandene Feststoff wurde unter Stickstoff abfiltriert, 16,0 g. Weitere 12,7 g des gewünschten Produktes kristallisierten auo dem Filtrat aus.

3 B. L-Alanyl-D-alanlnbenzyleiter-Hydrochlorld

Eine Suspension aus 28,7g N-t-Butoxycarbonyl-L-alanyl-D-alaninbenzylester in 150ml mit Chlorwasserstoff gesättigtem Dioxan wurde hergestellt und die Mischung wurde 4 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Solvens wurde im Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde mit Diethylether ausgerührt. Der entstandene Feststoff wurde abfiltriert, nochmals in Methylenchlorid gelöst, und die Lösung wurde auf etwa 150ml eingeengt. Man fügte Ether hinzu und filtrierte den Feststoff unter Stickstoff ab, 22,0 g.

3C. N-t-ButoxycarbonylD-gamma-glutamyKalpha-benzyletterl-L-alanyl-D-alanlnbenzyleiter Zu einer auf 0*C gekühlten Suspension von 5,0g (9,64 mm) N-t-Butoxycarbonyl-D-gamma-glutamin(alpha-benzylester)-Dicyclohexylamin und 2,76g (9,64 mm) L-Alanyl-D-alaninbenzylester-Hydrochloridin 100 ml Methylenchlorid wurden 2,0ml desselben Solvens zugesetzt. Nachdem über Nacht bei Raumtemperatur gerührt worden war, wurden die Feststoffe abfiltriert und das Filtrat im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde mit 150ml Ethylacetat versetzt, die Feststoffe wurden abfiltriert, und das Filtrat wurde mit 1%iger Salzsäure, einer 10%igen Kaliumcarbonatlösung, Wasser und einer Salzsäure gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und zu einem weißen Feststoff eingeengt, der nach Ausrühren mit Ether und Abfiltration 4,1 g des newünschten Produktes lieferte.

3D. D-gamma-glutamyKalpha-benzylesterH-alanyl-D-alanlnbenzyleiter-Hydrochlorld Zu einer Suspension von 4,1 g (7,21 mm) N-t-Butoxycarbonyl-D-gamma-glutamyHalpha-benzylesterl-L-alanyl-D-alaninbenzylester in 50ml Dioxan wurden 100ml mit Chlorwasserstoff gesättigtes Dioxan hinzugefügt, und die Reaktionsmischung wurde 3 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Soivons wurde im Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde mit Diethylether ausgerührt, 3,5g.

Zu 1,0g (1,98mm) D-gamma-Glutamyl(alpha-benzylester)-L-alanyl-D-alaninbenzylester und 0,833ml (5,93mm) Triethylamin in 50ml Methylenchlorid wurden 390mg (2,37mm) 3-(S)-Methylheptanoylchlorid zugesetzt, und die Reaktionsmischung wurde unter Stickstoff 45 min lang gerührt. Die Reaktionsmischung wurde in 150ml Ethylacetat gegossen, und die organische Phase wurde mit 10%iger Salzsäure, einer 10%igen Kaliumcarbonatlösung, Wasser und einer Salzlösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wurde mit Ether ausgerührt und unter Stickstoff abfiltriert, 900mg.

3 F. N-O-fSl-Methylheptanoyll-D-gamma-glutamyl-L-alanyl-D-alanln

Eine Mischung aus 200mg Palladiumhydroxid auf Aktivkohle und 900 mg N-(3-(S)-Methylheptanoyl)-D-gamma-

glutamyl(alphabe^r.zylester)-L-alanyl-D-alaninbenzylester in 50ml Methanol wurde in einer Wasserstoffatmosphäre bei 50psi eine Stunde lang geschüttelt. Der Katalysator wurde abfiltriert, und das Solvens wurde im Vakuum entfernt. Wasser wurde zum

Rückstand gegeben und unter vermindertem Druck entfernt, wobei man 492mg des Produktes als weißen Feststoff erhielt,

Smp.165-168°C.

Das NMR-Spektrum (DMSOd₆) zeigte Absorptionen bei

8,21-7,98 (m, 3H). 4,41-4,1 (m, 3H), 2,3-2,06 (m, 4H), 2,06-1,56 (m, 6H), 1,43-1,02 (m, 11 H) und 1,02-0,73 {m, 6H) ppm.

Beispiel 4 N-(3-(S,R)-Ethylhexanoyl)-D-gamma-glutamyl(alpl, >-n-butyl-ester)-glycyl-D-alanln

(R, «* CH](CH₁I₁CH(C₂Ht)CH₇-, R₁ = H,

D R, m -NHCH(CH₁)CO₁H, R₄ = R-C₄H₁)

4A. N-t-Butoxycerbonyl-D-gamma-glutaminlalpha-n-butyleiterJ-DIcyclohexylamlnsalz Eine Lösung aus 39,5g (0,172 m) N-t-Butoxycarbonyl-D-glutaminsäureanhydrid in 75ml trockenem Tetrahydrofuran wurde bei 0"C innerhalb eines Zeitraums von zwei Stunden zu einer Lösung aus 47 ml (0,561 m) n-Butanol und 34,3ml (0,172m) Dicyclohexylamin in 300ml Ether zugetropft. Man ließ die Reaktionsmischung bei O⁰C 3 Stunden lang rühren und bewahrte sie über Nacht im Kühlschrank auf. Der Feststoff wurde abfiltriert, in Ethanol aufgeschlämmt und nochmals abfiltriert, 43,3 g.

4B. D-gamma-GlutamyMelpha-n-butyleiterl-glycyl-D-alanln-banzylester-Hydrochlorld Das Produkt aus Beispiel 4A(IOg, 0,021 m) und 6,7g (0,024m) Glycyl-D-alaninbenzylester-Hydrochlorid wurden unter Stickstoff in 200ml Methylenchlorid suspendiert und auf 0°C gekühlt. Dicyclohexylcarbodiimid (4,25g, 0,021m) wurde zugesetzt, und man ließ die Mischung über Nacht auf Raumtemperatur kommen. Das Harnstoff-Nebenprodukt wurde abfiltriert, und das Solvens wurde im Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde mit Ethylacetat vorsetzt und filtriert. Das Filtrat wurde nacheinander mit Wasser, 2,5%iger Salzsäure, Wasser, 10%igem Kaliumcarbonat und Salzlösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet, das Solvens wurde im Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde in 300ml Dioxan, das mit Chlorwasserstoff gesättigt war, gelöst. Nach vierstündigem Rühren bei Raumtemperatur wurde das Solvens entfernt, und der Rückstand in Ethylacetat-Hexan (1:1) ausgerührt und abfiltriort, 7,4g.

4C. N-O-IS.Rl-Ethylhexanoyl-D-glutamyKalpha-n-butylesterl-glycyl-D-alanln

Zu dem Produkt aus Beispiel 4B (1,0g, 2,35mm) und 0,99ml (7,05mm) Triethylamin in 50ml Methylenchlorid wurden 460mg

(2,83mm) 3-(S,R)-Ethylhexanoylchlorid gegeben, und dio Reaktionsmischung wurde unter Stickstoff über Nacht gerührt, üas

Solvens wurde im Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde in Ethylacetat gelöst. Die organische Phase wurde nacheinander

mit 10%iger Salzsäure, Wasser, 10%igem Kaliumcarbonat und Salzlösung gewaschen. Die organische Phase wurde abgetrennt und über Magnesiumsulfat getrocknet und das Solvens wurde im Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde in 10ml Ethanol gelöst und mit 170mg 10%igem Palladiumhydroxid unter einer Wasserstoffatmosphäre mit einem Initialdruck von 50psi 1,5 Stunden lang geschüttelt.

Der verbrauchte Katalysator wurde abfiltriert, und das Solvens wurde im Vakuum entfernt, 100mg.

NMR(DMSO-de):

NMR(DMSO-d,):8,18(d,J = 6,1H), 8,10 (d, J = 6,1 H), 8,02 (t, J = 5,1H), 4,28-4,10(m,2H),4,00(t,J = 6,2H), 3,78-3,56 (m,2H),

2,18(t, J = 6,2H). 2,02(d, J ·= 6,2H),2,00-1,60(m, 3H), 1,58-1,42(m, 2H), 1,28-1,08(m, 8H), 1,24(d, J = 6,3H),0,92-0,76(m,

Beispiel5 Unter Anwendung des allgemeinen Verfahrens des Beispiels 4 und ausgehend von den entsprechenden Reagentien wurden die

folgenden Verbindungen hergestellt:

Il

RjCNH

(CH₂)₂CONHCH₂CONHCh(CH₃)CO₂H

NMR

3-Methylheptanoyl	Methyl
3-Ethylheptanoyt	Methyl
3-Methylheptanoyl	Ethyl
• 3-Ethylheptanoyl	Ethyl
3-Methylhoptanoyl	Is uityl
3-Ethylheptanoyl	lsobutyl
3-Ethylhexanoyl	lsobutyl
3-Ethylhexanoyl	Methyl
3-Ethylhexanoyl	Ethyl
3-Methylheptanoyl	Butyl
3-Ethylheptflnoyl	Butyl

Beispiel β Ν-Ο-ΐΡ^Ι Rj - -HNCH(CH))CO₁C₂Hk R₁-H

NMR (DMSO-d_e):8,23(d,J-6,iH),8,15(d,J = e,1H), 8.09 (t,J = e,14),4,2&-4,14

(m,2H);3,72(d, J = 6,2H),3,61(s,1H), 2,23 (t,J = 7,2^,2.16-1.70 (m,6H), 1,34-1,04{m,8H),1,25(d,J = 7,3 H). 0.92-0,76 (m, 6 H).

NMR(DMSO-d,):8,19(d,J = 6,1H),8,11(d,J = 6,1H),8,03(t,J = 6,1H),

4.24-4,10(m.2H),3,74-3,62(m,2H),3,57(s,3H),2,18(t.J = 9,2H),2,01(ds,J = 6, 2H), 1,97-1,60 (m,3H),1,32-1,10{m,8H),1,23(d, J = 7,3 H), 0,90-0,72 (m, 6 H)

NMR (DMSO-d,): 8,24-8,02 (m, 3 H), 4,26-3,96 (m, 2 H), 4,04 (q, J = 9,2 H),

3,76-3,66 (m, 2 H), 2,17 (t, J = 7,2 H), 2,12-1,63 (m, β H); 1,74-0.94 (m, 6 H), 1.23(d,J = 5,3H).1,l3(t,J = 9,3H),0.88-0.72(m,6H)

NMR(DMSO-d,):8,16(d,J = 6,1H),8,09(d,J = 6,1H),8,02(t,J = 6,1H).

4,22-4,08 (m, 2 H), 4,02 (q, J = 7,2 H), 3,74-3,54 (m, 2 H), 2,16 (t, J = 7,2 H), 2,00 (d,J = 6,2H),1.96-1,58{m,3H),1,30-1,08(m,8H),1,21(d,J = 7,3H),1,13 (t, J = 7,3 H), 0,88-0,70 (m, 6 H)

NMR {DMSO-d_e): 8,14 (d, J = 6,1 H), 8,08-7,98 {m, 2 H), 4,20-4,04 (m. 2 H), 3,75

(d,J«e,2H),3,e8-3.54(m2H),2,14(t,J = 6,2H),2,08-1.64(m.6H* 1,28-O,96{m, 6H),1,19(d,J = 7,3H),0,88-0,70(m,12H)

NMR(DMSO-d,):8,21(d,J = 6,iH),8,14-8,04(m,2H),4,24-4,08{m,2h: 3,79

(d,J = 6,2H), 3,72-3.58 (m, 2 H), 2,19 (t, J = 7,2H), 2.03 (d, J = 6,2H). 1,99-1/50 (m,4H)_/1,32-1,10(m,8H).1,23(d,J = 6,3H),0.92-0,72(m,12H)

NMR (DMSO-d,): 8,18 (d, J = 6,1 H), 8,10-8,00 (m, 2 H), 4,26-4,08 (m, 2 H), 3,79

(d, J « 6,2 H), 3,72-3,58 (m, 2 H), 2,18 (t, J = 6,2 H), 2,02 (d, J = 6,2 H), 1,98-1,62 (m, 4 H), 1,34-1,08 (m, 6 H), 1,23 (d, J = 7,3 H), 0,96-0,72 (m, 12 H)

NMR{DMSO-d,):8,21(d,J=7,1H),8,10(d,J = 7,1H),8,05(t,J = 6,1H),

4,26-4,10 (m, 2 H), 3,76-3,60 (m, 2 H), 3,59 (8,3 H), 2,18 (t, J = 6,2 H), 2,02 (d, J = 6,2 H), 2,00-1,60 (m, 3 H), 1,32-1,08 (m, 7 H), 0,90-0,72 (m, β H)

NMR (DMSO-d«): 8,22 (d, J - 7,1 H), 8,18-8,06 (m. 2 H), 4,26-4,10 (m, 2 H), 4,06

(q, J = 5,2 H), 3.78-3,58 (m, 2 H), 2,20 (t, J = 6,2 H), 2,04 (d, J = 6,2 H), 2,02-1,60 (m, 3 H), 1,26-1,20 (m, 7 H), 1,18 (t, J = 6,3 H), 0,90-0,78 (m, 6 H)

NMR (DMSO-d,): 8,20 (d, J - 7,1 H), 8,16-8,04 (m, 2 H), 4,24-4,06 (m, 2 H), 4,00

(t,J»e,2H),3,74-3,56(m,2H),2,17(t,J'-e,2H),2,12-1,60(m,5H),1,58-1,40(m, 2H),1.3e-1,O0(m,8H),1,21(d_/J-e,3H),0,90-O,74(m,9H)

NMR(OMSO-d,):8,16(d,J = 7,1H),8,11(d,J=J,1H),8.03(t,J = 5 1H),

4,26-4,09 (m, 2 H), 3,99 (t, J = 7,2 H), 3,79-3,58 (m, 2 H), 2,17 (t, J = 6,2 H), 2,01 (d, J = 6,2 H), 2,00-1,60 (m. 3 H), 1,58-1.42 (m, 2 H), 1,36-1,08 (m, 10 H), 1,24 (d,J = 5,3 H), 0,92-0,72 (m, 9 H)

> CH₁(CHi)₂CH(C₂H₁)CH₇-, R₂ - H,

6A. D-g«mma-Glutamyl(alpha-benzyle»teri glycyl-D-alanln-ethyleiter-Hydrochlorld Zu einer Suspension von 14,8g (0,0285m) N-t-Butoxycarbonyl-D-gammaglutaminsäure-alpha-benzylester· Dicyclohexylamlnsalz und 6g (0,0285m) Glycyl-D-alaninethylester-Hydrochlorld in 200ml Methylenchlorid wurden 5,6g (0,0270m) Dicyclohexylcarbodiimid gegeben, und die Mischung wurde unter einer Stickstoffatmosphäre über Nacht gerührt. Der Harnstoff wurde abfiltriert und das Solvens im Vakuum entfernt. Man versetzte den Rückstand mit 300 ml Ethylacetat, filtrierte und wusch das Filtrat nacheinander mit 2,5%iger Salzsäure, Wasser, 10%iger Kaliumcarbonatlösung und Salzlösung. Die organische Phase wurde abgetrennt, über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum eingeengt. Der ölige Rückstand wurde in 450ml mit Chlorwasserstoff gesättigtem Dioxan gelöst. Die Lösung wurde 2 Stunden lang gerührt, und das Solvens wurde im Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde mit Ether ausgerührt und abfiltriert, 11,2g.

6B. N-(3-(R,S)-Ethylhexanoyl)-D-gamma-glutamyl-glycylDa!anlnethyleiter Zu dem Produkt aus Beispiel 6A(1,0g, 2,33mm) und 0,98ml (6,98mm) Triethylamin in 30ml Methylenchlorid wurden unter einer Stickstoffatmosphäre 378mg (2,33mm) 3-(R,S)-Ethylhexanoylchlorid gegeben. Nach eineinhalbstündigem Rühren bei Raumtemperatur wurde die Mischung in 100ml Ethylacetat gegossen, und die organische Phase wurde nacheinander mit 10%iger Kaliumcarbonatlösung und Salzlösung gewaschen. Die organische Phase wurde abgetrennt, über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum eingeengt. Der weiße, feste Rückstand Wurde in 30ml Methanol gelöst und unter Zusatz von Palladiumhydroxid unter einer Wasserstoffatmosphäre mit einem Initialdruck von 50psi geschüttelt. Nach 2 Stunden wurde der Katalysator abfiltriert, das Filtrat zur Trockne eingeengt, und der Rückstand wurde mit Ether ausgerührt und abfiltriert, 27bmg.

NMR (DMSO-d,) 8,26 (d, J = 9,1H),8,14-8,02(m,2H),4,31-4,00(m,2H),4,06(q,J = 10,2H), 3,78-3,60 (m, 2H), 2,17 (t, J = 8, 2 H), 2,08-1,65 (m. 1 H), 2.03 (d, J = β, 2 H), 1,82-1,53 (m, 3 H), 1,40-0,96 (m, 5 H), 1,23 (d, J « 6,3 H), 1,14 (t, J = 10,3 H), 0,90-0,64 (m,6H).

SeUpIeI 7

Ausgehend von den entsprechenden Reagentien und unter Anwendung des Verfahrens der Beispiele 6A-6B wurden die

folgenden Verbindungen hergestellt:

O R₁CNH D

C I

jCONHCH^CONHCH (CH₃) CO₃R₅

NMFj

NMR (DMSO-d,): 0,24 (d, J = 6,1 H), 3,10-8,00 (m, 2 H), 4,30-4,18 (m, 1 H),

4,18-4,08 (m, 1 H), 3,86-3,72 (m, 2 H), 3,72-3,58 (m, 2 H), 2,1 β (t, J - 6,2 H), 2,12-1,64 (m,6H), 1,52-1,00 (m,6H), 1,27 (d, J = 7,3H), 0,90-0,76 (m, 12 H)

NMR (DMSO-d,): 8,2'J (d, J » 6,1 H),8,08-7,99 (m, 2 H), 4.29-4,17 (m, 1 H),

4,17-4,07(m,1H),3,83-3,71(m,2H),3,71-3,58(m,2H),2,15(t,J-7,2H), 2,04-1,60 (m, 4 H), 2,00 (d, J = 6,2 H), 1,31-1,09 (m, β H), 1,25 (d, J = 6,3H), 0,90-0,72 (m, 12 H)

NMR (DMSO-d,): 8,23 (d, J - Ö, 1 H), 8.08-7,98 (m, 2 H), 4,29-4,18 (m, 1 H),

4,18-4,07 (m, 1 H), 3,86-3,72 <m, 2 H), 3,70-3.57 (m, 2 H), 2,15 (t, J = 7,2 H), 2,04-1,59 (m, 4 H), 2,00 (d, J = 6,2H), 1,30-1,11 (m, 8 H), 1,25 (d, J = 6,3H), 0,89-0,70 (m, 12 H)

NMR !DMSO-d,): 8,25 (d, J - 6,1 H), 8,13-8,00 {m, 2 H), 4,32-4,20 (m, 1 H),

4,20-4,08 (m, 1 H), 3,91-3,76 (m, 2 H), 3,76-3,59 (m, 2 H), 2,18 (t, J = 6,2 H), 2.13-1,48(m,8H), 1,-6-1,0Km, 12H), 1,27 (d. J = 6,3H), 1,02-0,76 (m,8H)

NMR (DMSO-d,): 8,25 (d, J = 6,1 H), 8,13-8,00 (m, 2 H), 4,32-4,20 (m, 1 H)..

4,20-4,08 (m, 1 H), 3,32-3,74 (m, 2 H), 3,74-3,59 (m, 2 H), 2,18 (t, J - 6,2 H), 2,09-1,86 (m, 1 H), 2,03 (d, J = 6, ? H,¹,1,82-1,43 (m, 8 H), 1,36-1,01 (m, 9 H), 1,27 (d, J = 6,3 H), 1,01-0,70 (m, 8 H)

NMR (DMSO-d,): 8,26(d, J = 6, IH), 8,12-8.02 (m,2H),4,31-4,i9(m, IH),

2,19-4,08 (cn, 1 H), 3,93-3,72 (m, 2 H), 3,72-3,58 (m, 2 H), 2,18 (t, J = 6,2 H), 2,08-1,86 (m, 1 H), 2,03 (d, J = 6,2 H), 1,82-1,48 (rr, 8 H), 1,34-1,02 (m, 11 H). 1,27 (d, J - 6,3 H)₁1,00-0,74 (m, 8 H)

NMR(DMSO-d,):8,25(d,J-e,1H),8,12-8,00(m,2H),4,28-3.9e(m,2H),

4,03(q,J = 7,2H),3,74-3,56(m,2H),2,ie(t,J = 9,2H),2,11-1,e2(m.6H), 1,32-O,98(m,6H),1,24(d,J = 7,3H),1,14(t,J = 7,3H),0,88-O,76(m,6H)

NMR(DMSO-d«):8,28(d,J = 6,1H), 8,16-8,04 (m,2H), 4,32-4,04 (m,2H).4,10

(q, J = 6,2 H), 3,78-3,64 (m, 2 H), 2,22 (t, J = 6,2 H), 2,11-1,92 (m, 1 H). 2,07 (d,J-6,2H), 1.86-1,64(m,2H).1,4C-1,14(m,8H),1,30(d,J-6,3H), 1,21 (t, J = 6,3 H), 0,94-0,76 (m 6 H).

NMR (DMSOd,): 8,27 (d, J = 8,1 H), 8,14-8,02 (m. 2 H), 4,32-4,10 (m, 2 H),

4,10-3,94 (m, 2 H), 3,78-3,60 (m, 2 H), 2,18 (t, J = 6,2 H), 2,04 (d, J - 6,2 H), 2,04-1,62 (m,3H),1,60-1,46(m,2H), 1.38-1,10(m, 12H), 1,27 (d, J = 6,SH), 0,90-0,75 (m, 9 H)

NMR(DMSO-d,):8,30(d,J = 8,1H),8,i5-8,04(rn,2H),4,45-4,12im,2H),

4,12-3,98 (m, 2 H), 3,78-3,65 (m, 2 H), 2,22 (t, J = 7,2 H», 2,18-1,69 (m. 7 H), 1,61-1,48 (m, 2 H), 1,40-1,11(m, 11 H), 0,97-0,80 (m, 9 H)

NMR (DMSO-d,): 8,22 (d, J = 7,1 H), 8,12-8,0|m.2H).4,*-4,16(m,2H), 4,08-3,95

(m, 2 H), 3,75-3,62 (m, 2 H). 2,18 (t, J = 6,2 H), 2,02 (d, J = 6,2 H), 2,04-1,62 (m, 3 H).

1,60-1,46(m,2H),1,38-1,1(m,15H),und0,9-0,75(m,9H)

NMR (DMSO-d,): 8,28 (d, J = 8,1 H), 8,14-8,04 (m, 2 H), 4,34-4,10 (m, 2 H),

4 10-3,95 (m, 2 Hi, 3,75-3,62 (m, 2 H), 2,19 (t, J = 6.2 H), 2,04 (d, J = 6,2 H), 2,04-1,60(m,3H),1,6O-1,45(m,2H),1,40-1,10(m,13H),0,90-O,7e(m,!jH)

Beispiele Das Verfahren aus Boispiel 6 wurde, ausgehend vcn den entsprechenden Reagentien, nochmals wiederholt, mit der Ausnahme,

daß die Hydrierung nicht ausgeführt wunie, wobei die folgenden Verbindungen entstanden:

3-Methylheptanoyl	Isobutyl
3-Ethylhexenoyl	Isobutyl
3-Ethylheptanoyl	Iso-butyl
3-Methylheptanoyl	Methyl- cyclohexyl
3-Ethylhexanoyl	Mathyl- cvclohexyl
3-Ethylheptanoyl	Methyl- cyclohexyl
3-Methylheptanoyl	Ethyl
3-Ethylheptanoyl	Ethyl
3-Ethylheptanoyl	Butyl
3-S-Methylheptanoyl	Butyl
3-S-Ethylheptanoyl	Butyl
3-Ethylhexanoyl	Butyl

Il

CO₃R₄

₂CONHCB₂CONHCH

R, FU Re NMR

3-Ethyl- Butyl Butyl NMR (DMSO-d,): 8,27 (d, J = 7,1 H), 8,20 (d. J = 7,1 H), 8,07 (t, J = 7,1 H),

hexanoyl 4,37-4,13 (m, 2 H), 4,02 (t, J = 6,4 H), 3,80-3,62 (m, 2 H), 2,20 (t, J= β, 2 H),

2,05 (d, J = 6,2 H), 2,02-1,64 (m, 3 H), 1,60-1,47 (m,4 H), 1,40-1,13 (m, 13 H),

0,95-0,77 (m, 12 H)

3-Ethyl- Butyl But: NMR{DMSO,-d,):8,27(d,J = 7.1H),8,20(d,J = 7,1 H), 8,06 (t, J = 6,1 H),

heptanoyl 4,36-4,13 Im', 2 H), 4,02 (t, J = 6,4 H), 3,80-3,60 (m, 2 H), 2,20 (t, J = 6,2 H),

2,04 (d, J = 6,2 H), 2,00-1.60 (m, 3 H), 1,60-1,49 (m, 4 H), 1.40-1,10 (m, 15 H),

0,95-0,72 (m, 12 H)

3-Metbyl- Butyl Butyl NMR(DMSO-d„):8,26(d,j = 7,1 H),8,19(d,J = 7,1 H), 8,07 (t, J = 6,1 H),

heptanoyl 4,32-4,11 (m, 2 H), 4,02 (t, J = 5,4 H), 3,79-3,59 (m, 2 H), 2,20 (t, J = 6,2 H),

2,14-1.68 (m,5H), 1,61-1,46 (m, 4 H), 1.40-1,06 (m, 13 H), 0,95-0,81

(m,12H)

3-S- Benzyl Banzyl NMR(DMSO-d,):8,33(d,J = 7.1H),8,24(d,J = 7,1H),8,08(t,J = 5,1H),

Methyl- 7,33 (s, 10 H), 5,08 (s, 4 H), 4,40-4,22 (m, 2 H), 3,80-3,60 (m, 2 H), 2,21

heptanoyl (t, J = 5,2 H), 2,14-1,64 (m, 5 H), 1,26 (d, J = 7,3 H), 1,22-0,98 (m, β H),

0,88-0,73 (m, 6 H)

Beispiel 9 Krittallines N-IS-ISI-Methylheptanoyll-D-gammaglutamyl-glycyl-D-slanin

N-ß-fSI-MethylheptanoyD-D-gamma-glutamyKalpha-benzylesterl-glycyl-D-alaninbenzylester (30,8g) wurde in 300ml absolutem Ethanol in einem Autoklaven mit 21 Fassungsvermögen aufgeschlämmt. 5%iges Pd/C, (1,54 g, 50% Wasserfeuchtigkeit) wurde zugegeben und die Mischung wurde bei vierfachem Atmosphärendruck 1 Stunde lang hydriert; innerhalb dieser Zeit war die Wasserstoffaufnahme vollständig. Der Katalysator wurde abfiltriert, erst über Papier, dann über 0,45 Micro Nylon Milipore, wobei man 100-150 ml Ethanol für das Umgießen und Auswaschen verwendete. Die vereinigten Filtrate und Waschflüssigkeiten wurden zu einem feuchten, weißen Feststoff eingeengt, der in 150 ml einer heißen 1:10· Mischung aus absolutem Ethanol und Acetonitril gelöst wurde. Die Lösung wurde durch heißes Filtrieren geklärt, granuliert und filtriert, v/obei man kristallines, kompaktes, nicht elektrostatisch aufgeladenes Titelprodukt, 20,1 g (94 %), erhielt, das durch sein IR-Spektrum (Nujol-Verreibung) charakterisiert wurde, welches größere, scharf aufgelöste Peaks bei 3340,3300,2900,2836, 1725,1650,1628,1680,1532,1455,1410,1370, ,' 280,1240,1216 und 1175cm'¹ umfaßte.

Dieses kristalline Produkt (9,4g) wurde weiter gereinigt, indem es in 1000ml siedendem Aceton 1 Stunde lang in Lösuno gehalten wurde. Die Lösung wurde auf Raumtemperatur gekühlt und mit einer Spur der oben erwähnten Kristalle geimpft. Nach 6stündigem Rühren wurde das Titelprodukt., das dieselben Charakteristika des IR-Spektnjr.is besaß, unter geringstmöglichem Waschen mit Aceton abfiltriert und im Vakuum bei 35⁰C getrocknet, 7,25 g.

Beispiel 10 N-IS-tRl-MethyM-heptenoyll-D-gamma-glutamyllalpha-benzylesterl-glycyl-D-alanlnbenzylester Nach dem Vorfahren aus Beispiel 1D lieferten 2,77g (5mm) D-gamma-Glutamyllalpha-benzylesterl-glycyl-D-alaninbenzylester- Hydrochlorid und das aus 747mg (5mm) 3-(R)-Methyl-4-heptensäure hergestellte Säurechlorid die Titelverbindung. Beispiel 11 N-O-ISJ-Methyl-H-heptanoyD-D-gamma-glutamyl-glycyl-D-alanln Eine Mischung aus 500 mg des Produktes aus Beispiel 10 und 26 mg 5%lges Palladium auf Aktivkohle (mit 50% Wasserfeuchtigkeit) in 125ml Ethanol wurde unter einer Wasserstoffatmosphäre mit einem Initialdruck, der das Vierfache des Atmosphärendrucks betrug, 2,5 Stunden lang geschüttelt. Der Katalysator wurde abfiltrieit und das Solvens im Vakuum entfernt. Das Produkt wurde nach dem Verfahren des Beispiels 9 gereinigt und war in jeder Hinsicht mit dem Produkt jenes Seispiels identisch. Herstellungsverfahren A Cyclohexylacetylchlorid A1. Cyclohexylesslflsftureethylester Zu 4,9g 60%igem Natriumhydrid in Öl gab man ausreichend Hexan, um das Öl aufzulösen. Zu dem ölfreien Natriumhydrid gab

man unter Stickstoff 100ml Tetrahydrofuran und anschließend eine Lösung aus 22,2ml Triethylphosphonacetat in 80ml trockenem Tetrahydrofuran. Nach einstündigem Rühren bei Raumtemperatur gab man 10,5ml Cyclohexanon in 40ml

Tetrahydrofuran hinzu und ließ die Reaktionsmischung über Nacht bei Raumtemperatur rühren. Die Reaktionsmischung wurde

in Wasser gegossen und mit Diethylether extrahiert. Die organische Phase wurde mit 1N Natriumhydroxidlösung, Wasser und

Salzlösung gewaschen. Die organische Phase wurde abgetrennt, über Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingeengt. Der Rückstand wurde in 250ml Methanol gelöst, mit 1,5g 10%igem Palladiumhydroxid auf Aktivkohle versetzt, und die Mischung

wurde unter einer Wasserstoffatmosphäre von 50psi Stunden lang geschüttelt. Der Katalysator wurde abfiltriert und das Filtrat im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde bei 45-50'C/0,4 Torr destilliert und lieferte dabei 15,4g (90% Ausbeute) des gewünschten Zwischenproduktes.

A2. Cyclohexylacetylchlorid

Zu 100ml Methanol, das 15,4 g Cyclohexylessigsäureethylester enthielt, gab man 15,2g Kaliumhydroxid und erhitzte die Lösung 3 Stunden lang zum Rückfluß. Das Methanol wurde im Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde mit Wasser versetzt. Die Lösung wurde mit Diethylether extrahiert, und dann mit 10%iger Saizsläure angesäuert. Die angesäuerte Lösung wurde mit frischem Ether extrahiert und die organische Phase wurde abgetrennt und mit Wasser und Salzlösung gewaschen. Das Entfernen dos Solvens nach dem Trocknen ergab einen flüssigen Rückstand.

Der Rückstand wurde in 60ml Methylenchlorid gelöst und mit 18 ml Oxalyichiorid versetzt. Nach vierstündigem Rühren bei Raumtemperatur wurde die Reaktionsmischung im Vakuum eingeengt, und der Rückstand wurde destilliert, 45-50°C/0,4 Torr, 12,6g (86% Ausbeute).

Herstellungsverfahren B

Nach dem allgemeinen Herstellungsverfahren A und ausgehend von Triethylphosphonacetal und dem entsprechenden Aldehyd oder Keton wurden die folgenden Säurechloride hergestellt:

R,COCI

Sdp.'C/Torr

(CH₃Cn₂CHj)₂CHCH/ (CH₃CH₂I₂CHCH₂-

CH₃

CH₃(CH₂J₃CHCHj-(R,S)

CH₃

CH₃(CHj)₂CHCHj-(R,S)

(CH₃I₂CH(CH₂),-

CH3CH2

CH₃(CH₂I₃CHCH₂ (R₁S)

CH₃

CH₃(CHj)₄(CHCH₂ <R.S)

(CH₃CH₂)JCH(CH₂),-

CH,

CH₃(CH₂)JCH(CHj)₂-(R,S)

CHjCH,

CH₃(CHj)₄CHCH₂ (R,S)

CH₃(CH₂IiCHCH₂- <R,S)

CH,

(CH,),CH(CHi),CHCH₂ (R₁S)

(CHj)₂CHCH₂CHCH₂-(R₁S)

³I ²

CH,(CH,),CHCH,-^{3 2} *f

60-65/0,4 22-25/0,5 23-30/0,5

22-25/0,6

24-31/0,7 34-37/0,5

45-47/0,6

25-30/0,0

32-36/0,4 30-38/0,6

63-65/0,95 89-92/0,5 46-50/0,5 30-34/0,5

31-35/0,7

Herstellungsverfahren C

6-Methylheptanoylchlorid

C1. 3-Hydroxy-4-methyl-1-penten

Zu 90ml auf 6⁰C gekühltem 1,0M Vinylmagnesiumbromid in Tetrahydrofuran gab man tropfenweise 6,3ml Isobutyraldehyd in 30ml Tetrahydrofuran hinzu und ließ anschließend die Mischung auf Raumtemperatur aufwärmen. Nach 2 Stunden wurde die Reaktionsmischung zu einer gesättigten Ammoniumchloridlösung gegeben und mit Ether extrahiert. Die Etherextrakte wurden vereinigt, mit einer gesättigten Ammoniumchloridlösung, einer gesättigten Natriumhydrogencarbonatlösung und einer Salzlösung gewaschen und Ober Magnesiumsulfat getrocknet. Das Solvens wurde im Vakuum entfernt, und man erhielt 6,0g des gewünschten Produktes.

C2. 6-Methyl-4-heptylsfiureethylester

Eine Mischung aus 18,2g 3-Hydroxy-4-methyl-1 -penten, 200ml Ameisensäuretriethylorthoester und 500ml p-Toluolsulfonsäure wurde mit 400ml Toluol versetzt und über 4-A-Molekularsieb 24 Stunden lang zum Rückfluß erhitzt. Das Solvens wurde im Vakuum entfernt und der Rückstand wurde destilliert. Die bei 45-64°C/0,5 Torr übergehende Fraktion ergab 7,5g des gewünschten Produkts.

C3. 6-Methylheptans8ureethyle«ter

Zu 7,5g 6-Methyl-4-heptylsäureethylester in 75ml Methanol wurden 700 mg 10%iges Palladiumhydroxid auf Aktivkohle gegeben, und die Mischung wurde unter einer Wasserstoffatmosphäre bei 50psi 1,5 Stunden lang geschüttelt. Der Katalysator wurde abfiltriert, und das Solvens wurde im Vakuum entfernt, was 5,7g des gewünschten Produktes ergab.

C4. 6-Methylheptanoylchlorid

Nach dem Herstellungsverfahren A2 lieferten 5,7g 6-Methylheptansäureethylester 2,0g des gewünschton Produktes, Sdp.

30-34X/0,5 Torr.

Herstellungsverfahren D 2-Methylheptanoylchlorld DI. 2-Methylheptantaure

Zu einer kalten (O⁰C) Lösung aus 100ml trockenem Tetrahydrofuran, das 11,8ml trockenes Diisopropylamin und 55ml 1,6M n-Butyllithium enthielt, gab man 5,4ml n-Heptansäure und ließ die Mischung bei Raumtemperatur eine Stunde lang rühren. Die entstandene Lösung wurde auf O⁰C gekühlt und mit 7,2ml Methyliodid versetzt. Die Reaktionsmischung wurde unter Stickstoff 1,5 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt und anschließend in 10%ige Salzsäure gegossen und mit Diethylether (3x 100ml) extrahiert. Die Extrakte wurden vereinigt, mit 10%iger Salzsäure, Wasser, 20%lgem Natriumhydrogensulfit und einer Salzlösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Solvens wurde im Vakuum entfernt, und der Rückstand, 5,61 g, wurde in Methanol, das 5,1 g Kaliumhydroxid enthielt, gelöst. Nachdem über Nacht gerührt worden war, wurde das Methanol entfernt und der Rückstand in IaOmI Wasser gelöst. Die wäßrige Phase wurde mit Ether (2x 100ml) gewaschen und mit 10%lger Salzsäure angesäuert. Das Produkt wurde mit Ether extrahiert, mit einer 20%igen Natriumhydrogensulfitlösung und Salzlösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Entfernen des Ethers lieferte 5,0g des Produktes in Form einer gelben Flüssigkeit.

D2. 2-Methylheptanoylchlorld

Es wurden 5 g 2-Methylheptansäure und 7,6ml Oxalylchlorid eingesetzt und das Herstellungsverfahren A2 verwendet, und man erhielt 3,3g des gewünschten Produktes, Sdp. 32-34°C/0,6 Torr.

Herstellungsverfahren E

3-(S)-Methylheptanoylchlorld

E1. 3-(R)-Methylglutari8uremonomethylester

In einen 5l fassenden Vierhalskolben, ausgestattet mit einem Rührer und einer pH-Elektrode, wurden 2,51 0,1 M Kaliumhydrogenphosphatpuffer, pH7,0, und anschließend 150mg Schweineleberesterase und 150g 3-Methylglutarsäuredimethylester gegeben. Der pH der Mischung wurde bei etwa 6,85 gehalten, indem in regelmäßigen Abständen 10%ige Kaliumcarbonatlösung zugesetzt wurde. Nach 2,5 Stunden wurde die Reaktionsmischung mit 10%iger Salzsäure auf pH 2 angesäuert, und das Produkt wurde mit Diethylether extrahiert. Die Extrakte wurden vereinigt, über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum zu 114g des gewünschten Produktes eingeengt, [alpha|_D = -1,48 (CH₃OH, c = 0,086g/ml).

E2. 3-(R)-Methyl-5-hydroxy~entans8uremethylester

Zu 114g 3-(R)-Methylglutarsäuremonomethylester in 715ml auf O⁰C gekühltem, trockenem Tetrahydrofuran gab man langsam 391 ml einer 2 M Lösung von Borandimethylsulfid in Tetrahydrofuran. Nach Beendigung der Zugabe wurde die Reaktionsmischung über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde gekühlt und langsam mit 50ml Wasser versetzt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ether extrahiert (3 χ 100ml), und die Extrakte wurden vereinigt, mit Wasser, einer gesättigten Natriumhydrogencarbonatlösung und einer Salzlösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Entfernen des Solvens ergab 37g des gewünschten Produktes.

E3. 3-(R)-Methyl-5-(t-butyldlmethyltllyloxy)pentaniauremethylester

Zu einer Lösung aus 37g (0,253ml) 3-(R)-Methyl-5-hydroxypentansäuremethylester und 37g (0,543m) Imidazo! in 500ml Dimethylformamid gab man 37 g (0,249 m) t-Butyldimethylsilylchlorid und ließ die Reaktionsmischung bei Raumtemperatur 2 Stunden lang rühren. Die Reaktionsmischung wurde in Wasser gegossen und mit Ether (4x 100ml) extrahiert. Die vereinißten

Extrakte wurden mit 10biger Salzsäure, einer gesättigten N.itriumhydrogencarbonatlösung, Wasser und einer Salzlösung gewaschen und Ober Magnesiumsulfat getrocknet. Entfern an des Solvens ergab 121,88g Rohprodukt, das nach Destillation 107,12g reines Produkt, Sdp. 80-81 °C/0,4 Torr, ergab.

E4. 3-(S)-M*thvl-5-(t-liutyldimethyl$iloxy)-1-pentanol Unter Stickstoff gab mim zu 8,5g (0,224m) Lithiumaluminiumhydrid in 250ml Diethylether 53,5g (0,206m) 3-{R)-Methyl-5-(t-

butyldir.iethylsilyloxy)pentansäuremethylester in 125ml (Ether. Die Reaktionsmischung wurde eine Stunde lang bei O⁰C gerührt und anschließend tropfenweise mit 8,4ml Wasser, 8,4ml >siner15%igen Natriumhydroxidlösung und 25,2ml Wasser versetzt.

Die Feststoffe wurden abfiltriert und die organische Phaso wurde abgetrennt und mit Wasser, 2,5%iger Salzsäure und einer Salzlösung gewaschen. Die organische Phase wurde übet Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum zu 46g Produkt

eingeengt.

E5. 3-(R)-Methyl-5-(t-butyldimethylsilyloxy)-1-pentanal

Zu 66,3g Oxalylchloriil in 300ml trockenem, auf -60⁰C gekühltem Methylenchlorid gab man unter einer Stickstoffatmosphäre tropfenweise74,81 g Dimethylsulfoxid in 100ml trockenem Methylenchlorid hinzu. Nach 15min wurden 92,0g 3-(S)-Methyl-5-(tbutyldimethylsilyloxylpentanol in 250ml desselben Solvens zugetropft. Nach 30min gab man bei -6O⁰C 206,1 g Triethylamin zu und entfernte anschließend das Kühlbad. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur 1,5 Stunden lang gerühn. und dann in Wasser gegossen und mit Methylenchlorid extrahiert. Die Extrakte wurden mit 2,5%iger Salzsäure, einer gesättigten Natriumhydrogencarbonatlösung, Wasser und einer Salzlösung gewaschen und dann über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Solvens wurde entfernt, und der Rückstand wurde in Ethijr gelöst und nochmals wie vorher gewaschen und getrocknet. Entfernen des Ethers lieferte 90,9g des gewünschten Produktes.

Eβ. 5-(S)-Methyl-7-(tbutyldlmethylillyloxy)-2-hepten

Zu einer Suspension aus 80g (0,2155m) Triphenylethylphosphoniumbromid in 800ml trockenem, auf O⁰C gekühltem Tetrahydrofuran wurden 165,7ml einer 1,3M Lösung au ι n-Butyllithium (0,2155m) in demselben Solvens zugegeben. Nach 2 Stunden wurden 4Sg (0,196m) 3-(R)-Methyl-5-(t-butyldimethylsilyloxy)-1-pentanal in 200ml trockenem Tetrahydrofuran zu der Reaktionsmischung zugetropft. Man ließ die Reaktionsmischung 2 Stunden lang bei Raumtemperatur rühren, goß sie anschließend in Wasner und extrahierte mit Ether. Die vereinigten Extrakte wurden mit Wasser und einer Salzlösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Entfernen des Solvens im Vakuum ergab ein gelbes Öl, das nach Destillieren 37,4g Produkt, Sdp. 74-79°C/0,2-O,1 Torr, lieferte.

E7. 3-(S)-Methyl-1-heptanol

Zu einer Lösung aus 74,8g 5-(S)-Methyl-7-(t-butyldimethylsilyloxy)-2-hepten in 500ml Methanol wurden 7,5g 10%iges Palladiumhydroxid auf Aktivkohle gegeben und die Mischung wurde unter einer Wasserstoffatmosphäre bei 50psi 1,5 Stunden lang geschüttelt. Der Katalysator wurd" ibfiltriert, und das Solvens wurde im Vakuum entfernt, 30g.

E8. 3-(S)-Methylheptan»fiure

Zu 10g 3-(S)-Methyl-l-heptanol in 175ml Aceton tropfte man über 45min hinweg bei 15-20°C Jones Reagens hinzu. Nach 15min wurden 15ml Isopropanol zugesetzt, und es wurde 30min weitergeführt. Die Reaktionsmischung wurde in Wasser gegossen und das Produkt mit Ether extrahiert. Die Extrakte wurden vereinigt, mit Wasser, einer Natriumhydrogensulfitlösung und einer Salzlösung gewaschsn und über Magnesiumsulfat getrocknet. Entfernen des Solvens lieferte 10g des Produkts in Form einer Flüssigkeit, Sdp. 84-B8°C/0,4 Torr, Ialpha]₀ - -4,46 (CH₃OH, c = 0,105g/ml).

E9. 3-(S)-Methylhe(itanoylchlorid Nach dem Herstellungsverfahren A2 lieferten 5,0g 3-(S)-Methylhoptansäure und 7,5ml Oxalylchlorid 2,9g des gewünschten Säurechlorids, Sdp. 29-32 "C/0,25 Torr.

Claims (1)

1. Verfahren zum Herstellen einer Verbindung mit der Formel
O

Il

R₁CNH D CO₂R₄
CH LO

I Il

(CH.)-CONHCHC-R,