DD286721A7 - Verfahren zur gewinnung von protein a - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein mikrobielles Verfahren zur Gewinnung von Protein A aus Kulturfiltraten von Staphylokokken oder von anderen, vorzugsweise rekombinanten bakteriellen Protein A-Produzenten. Ihr Anwendungsgebiet liegt in der technischen Mikrobiologie; als Anwendungsgebiet des verfahrensgemaesz hergestellten Proteins kommen die Biotechnologie (z. B. Isolierung von Antikoerpern) sowie die Humanmedizin (Therapeutikum, Diagnostikum) in Betracht. Mit der Erfindung wird das Ziel verfolgt, fuer die verschiedenen erwaehnten Verwendungszwecke hochgereinigtes Protein A bereitzustellen. Die diesem Ziel zugeordnete Aufgabe wird in der Weise geloest, dasz, nachdem ein zur Protein A-Biosynthese befaehigter Bakterienstamm in an sich bekannter Weise submers kultiviert sowie seine Biomasse im Anschlusz an die Fermentation, gegebenenfalls nach Zellaufschlusz, von der Kulturloesung separiert worden ist, der dann anfallende Kulturueberstand mit einem weitporigem Kieselgel (Porengroeszen zwischen 10 nm und 50 nm) behandelt sowie von dem beladenen Adsorbens, gegebenenfalls nach einem Waschschritt, das Zielprotein bei extremen p H-Werten mit Loesungen von ein- oder mehrwertigen Alkoholen, von Ketonen, von Aminen oder von Amiden eluiert und aus den erhaltenen Eluaten mittels Ionenaustauschchromatographie als hochgereinigtes Produkt isoliert wird.{Protein A; Kulturueberstand einer Submersfermentation; Behandlung mit weitporigem Kieselgel ; Elution mit Loesungen von Alkoholen, von Ketonen, von Aminen oder von Amiden; hochgereinigtes Produkt; Biotechnologie; Humanmedizin}
Description
Hierzu 1 Seite Abbildung 1
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von reinem Protein A aus Kulturfiltraten von Staphylokokken oder von anderen, vorzugsweise rekombinanten bakteriellen Protein Α-Produzenten. Protein A ist ein natürlicherweise von vielen Staphylokokken gebildetes zelluläres Protein, welches spezifisch Immunglobuline vom IgG-Typ an ihrem jeweiligen Fc-Abschnitt (Fc - fragment crystalline) zu binden vermag. Protein A wird in der serologischen Diagnostik alo markierte Sonde (Enzym-, Fluoreszenz· oder radioaktive Markierung) für den Nachweis spezifischer Antikörper herangezogen. Weitere Anwendungen liegen in der Möglichkeit, durch an unlösliche Träger kovalent gebundenes Protein A Antikörper - auch monoklonal - zu isolieren. F" 'iließlich liegen auch Ansätze zur therapeutischen Nutzung von trägerfixiertem Protein A bei Autoimmun-Erkrankungenvor.
Das Anwendungsgebiet der Erfindung liegt somit in der technischen Mikrobiologie, das Anwendungsgebiet von Protein A, d. h. des verfahrensgemäß hergestellten Produkts, liegt einerseits in der Biotechnologie sowie andererseits in der Humanmedizin (Therapoutikum, Diagnostikum).
Mikrobielle Verfahren zur Herstellung von Protein A sind seit 1971 bekannt (siehe A.Arvidson et al., Acta Pathol. Microbiol. Scand., 79B, 1971,399). Als native Protein A-Bildnsr wurden hierbei Staphylococcus aureus-Stämme eingesetzt, und zwar zunächst solche Produzenten, in denen das Produkt nahezu vollständig zellwandgobundon vorliegt. Sehr bald konnte für die Biosynthese aber auch S.aureus-Stammaterial eingesetzt werden, welches das Protein A in das Kulturmedium sezerniert (A. Forsgren et al., J. Bacteriol. 107,1971,245; G. Masuda et al., Infect. Immun. 2,1975,245).
Mit der Arbeit von S. Löfdahl, M. Uhlen et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 80,1983,697 wurde erstmals ein Verfahren bekannt gemacht, in dem rekombinante Mikroorganismen-Stämme, und zwar zunächst E.coli-Stämme, zur mikrowellen Herstellung von Protein A herangezogen worden rind. Inzwischen sind jedoch auch weitere Verfahrenslösunen zur Produktion dieser Substanz unter Rückgriff auf rekombinante Bakterienstämme, so unter Rückgriff auf Bacillus subtills-Stämme, angegeben worden (S. R. Fahnenstock & K. E. Fisher, Appl. Envir. Microbiol., 53,1987,379).
In allen bisherigen Verfahren zur Gowinnung von Protein A werden im Aufarbeitungs- bzw. Roinigungsabschnitt ausschließlich affinitätechromatographische Methoden verwendet, wobei die Zielsubstanz an Gamma-Globulin, jeweils fixiert an einen festen Träger, im Neutralbereich gebunden wird und anschließend durch Azidit&tserniedrigung auf Werte um pH 3,0 eluiert wird (Feinreinigung mittels Affinitätschromatographie an immobilisiertem Gamma-Globulin).
Diese Aufarbeitungslöjungen sind vergleichsweise uneffoktiv, da die in ihnen benutzten Träger erst nach einer speziellen Modifizierung, d. h. nach einem Aktivierungsschritt, einsetzbar sind, weiterhin lediglich eine beschränkte Lebensdauer aufweisen, schwer zu sterilisieren sowie durch bakterielle Verunreinigungen zerstörbar sind. Außerdem ist ihre Bindungsknpazität nicht sehr hoch (1 Milligramm Gamma-Globulin kann theoretisch nurO,3 Milligramm Protein Abinden; nach der Immobilisierung des Globulins kann häufig nur noch ein Bruchteil dieser theoretischen Kapazität genutzt werden), und bei wiederholter Verwendung der Träger ist ein beständiger Schwund ihrer Bindungskapazität zu registrieren. Weiterhin ist es in diesen Verfahren schließlich erforderlich, das erhaltene Protein A nachfolgend durch Gelchromatographie von Spaltprodukten zu befreien.
Die Erfindung verfolgt das Ziel, für die genannten verschiedenen Verwendungsrwecke hochgereinigtes Protein A bereitzustellen.
werden kann.
verfügbarer, zur Biosynthese dieses Proteins befähigter rekombinanter Mikroorganismus (vorzugsweise ein rekombinanter
enthält, für dio Dauer von 8 Stunden bis 30 Stunden bei Temperaturen von 250C bis 40°C sowie pH-Werten im Bereich zwischen
pH 6,0 und pH 8,0 kultiviert. Vorzugsweise wird für den Fermentationsansatz hierbei ein Dialysatnährboden herangezogen. Die erhaltene Biomasse wird nach Beendigung der Fermentation, gegebenenfalls im Anschluß an einen Zellaufschluß, von der Kulturlösung abgetrennt. Der hierbei anfallende Protein A-haltige Kulturübersland (das gewonnene Protein A-haltige Kulturfiltrai) wird anschließend mit einem weitporigen Kieselgel mit Porengrößen im Bereich von 10nm bis 50nm behandelt. Als silikatisches Adsorbens dieser Beschaffenheit wird verfahrensgemäß bevorzugt ein weitporiges Kieselgel obiger Spezifität
aus der Sortenklassifizierung B1 oder aus der Sortenklassifizierung Si 100 oder aus der Sortenklassifizierung Si 300 oder aus der Sortenklassifizierung XWP500
eingesetzt. Dieser Verfahrensschritt gründet sich auf den Befund, daß silikatische Adsorbentien obiger Spezifität, also weitporige Kieselgele, das Protein A aus Kulturüberständen von Mikroorganismen vollständig zu binden vermögen. Im folgenden Verfahrensschritt wird von dem nunmehr beladenen weitporigen Kieselgel obiger Spezifität des Protein A, erforderlichenfalls nachdem in einem Waschgang im alkalischen Milieu Fremdproteine eliminiert worden sind, mit einer Lösung eines ein- oder mehrwertigen Alkohols oder eines Ketons oder eines Amins oder eines Amids abgelöst; und aus den hierbei erhaltenen Eluaten wird mittels lonenaustauschchromatographie schließlich das Protein A in hochreiner Form isoliert. In ihrer weiteren Ausgestaltung ist die Erfindung darüber hinaus dadurch charakterisiert, daß das weitporige Kieselgel der joweils gewählten Sortenklassifizierung in einer Menge von 0,2kg bis 2,0kg pro 1001 in den nach Fermentation und Biomasse-Separation anfallenden Protein A-haltigen Kulturüberstand eingerührt wird. Sollte danach im Verfahen ein Waschgang erforderlich sein, so wird bei pH-Werten von pH 8,0 bis pH 9,5 hierfür eine ethanolische Lösung mit Soda-Zusatz, vorzugsweise eine Lösung von 10ml bis 15ml Ethanol pro 100ml Wasser mit 1 % Soda-Zusatz, eingesetzt. Für die nachfolgende Ablösung der Zielsubstanz von dem beladenen weitporigen Kieselgel wird nun entweder
- bei pH 10,5 eine alkalische Ethylenglykol-Lösung, gegebenenfalls mit Zusatz von Glycin, von Tris(hydroxymethyl)aminomethan, von Triethylamin bzw. von Polyoxyethylsorbitanmonolaurat, oder
- bei pH 2,0 eine saure Ethylenglykol-Lösung, gegebenenfali« mit einem der voranstehend genannten Zusätze, oder
- bei pH 2,0 eine saure Ethanol-Lösung, gegebenenfalls mit einem der voranstehend genannten Zusätze, oder
- bei pH 2,0 eine saure Aceton-Lösung, gegebenenfalls mit einem der voranstehond genannten Zusätze, oder
- bei pH 10,0 Ms pH 11,0 eine Ethanolamin-Lösung, gegebenenfalls mit einem der voranstehend genannten Zusätze, oder
- bei pH 10,5 eine Formamid-Lösung, gegebenenfalls mit einem der voranstehend genannten Zusätze, oder
- bei pH 2,0 bis pH 10,5 eine Harnstofflösung, gegebenenfalls mit einem der voranstehend genannten Zusätze, als Elutionsmittel verwendet.
gebundene Protein A abschließend vom Ionenaustauscher eluiert sowie - gegebenenfalls nach einer erneuton Dialyse -lyophilisiert. Zur Abtrennung des Elutionsmittels sowie von oventuell vorhandenen Verunreinigungen (von Pigmenten,
der voranstehend angegebenen tortenklassifizierungen jeweils herangezogene weitporige Kieselgel in einer Menge von 0,2kgbis 2,0kg pro 1001 in den Protein A-haltigen Kulturüberständen eingerührt. Nach Beendigung des Rührens sedimentiert dasjeweils verwendete silikatische Adsorbens obiger Spezifität innerhalb weniger Minuten quantitativ. Zu seiner Waschung wirdeine Lösung von 10ml bis 15ml Ethanol pro 100ml Wasser mit 1 % Soda-Zusatz verwendet. Das nach dem Elutionsschrittwiedergewonnene Kieselgel kann, wie entsprechende Kontrollversuche ergeben haben, noch wenigstens 15 Male für denverfahrensgomäßen Adsorptionsschritt eingesetzt werden.
vorgenommen, so wird zur Abtrennung sowohl des jeweiligen Elutionsmittels (ausgewählt au s der voranstehend angegebenen
vorgenommen, so wird vorzugsweise eino DEAE-Cellulose eingesetzt; dioso w!rd bei pH-Werten über pH 5,5 verwendet.
ein relatives Molekulargewicht von etwa 50000 zeigt.
- Zur Bindung dos Protein A au; Mikroorganismen-Kulturübersts'nden der dargelegten Art wird ein extrem kostengünstig bereitstollbares Adsorptionsmaterial eingesetzt.
- Die zur Adsorption verwendeten weitporigen Kieselgele sind einfach sterilisierbar; sie werden von Bakterien nicht angegriffen und Jodes von ihnen sedimentiert, falls es etwa durch Einrühren in einen Protein A-haltigen Kulturüberstand gegeben wird, innerhalb weniger Minuten vollständig.
- Mildem dargelegten Verfahren können Protein A-haltige Kulturüborstände aller Art-ob trüb, verfärbt oder mit Bakterien verunreinigt - sowie in Volumina aller Größenklassen ohne Zusaüaufwand behandelt werden.
- Das vcifahrensgemäß gewonnene Protein A ist arm an Spaltstücken, so daß die Nachschaltur.g einer Gelfiltration nicht erforderlich ist.
-4- 286 721 Ausfuhrungsbelsplele
40 Liter einer nach Fermentation in Hefedialysat-Pepton-Nährboden erhaltenen Kultur von Staphylococcus aurdus Cowan l/M werden zur Abtötung für 15 Minuten auf 80"C erhitzt. Dannch wird die Bakterienbiomasse im Separator abgetrennt. In den Kulturüberstand - er enthielt in diesem Beispielfall 89mg/l Protein A - werden SOOg trockenes weitporiges Kie-algel der Sortenklassifizierung B1 (Feuchtgewicht 1550g) bei Zimm »(-temperatur gegeben und für 30 Minuten bis 60 Minuten eingerührt. Nach dem Abstellen dds Rührers setzt sich das beladene K ieselgol B1 in etwa 5 Minuten quantitativ ab. Der Überstand wird verworfen; das boladene Kieselgel wird intensiv mit Wasser gewaschen und in ein β-1-Gefäß (etwa Becherglas o.a.) überführt. Anschließend wird in 2 Portionen nochmals mit je 2 Liter oiner 1%igen Soda-Lösung in 15%igem ethanolischern Wasser bei pH 9,0* ± 0,5 unter Rühren gewaschen. Das gesamte Protein A bleibt dabei gebunden; der Hauptteil der Fremdproteine w rd jedoch entfernt. Von diesem beladenen Kieselgel werden je 1 g Feuchtmasse, woran 2,3 mg Protein A gebunden waren, m.t je 5 ml der in Tabelle 1 angeführten Elutionsmittel Ethanol, Glycin, Ethylenglykol, Ethanolamin, Formamid srwie Harnstoff gemischt und nach 2stündiger Inkubation bei den in Tabe'le 1 genannten extremen pH-Werten dio Protein A-Kcnzentration im Überstand bestimmt (Mancini-Technik). Die Ergebnisse sind gleichfalls in Tabelle 1 ausgewiesen.
abgetrennt und der Rdihe nach mit 500ml Wasser und mit 250ml Karbonatpi'ffer (1 % Natriumkarbonatlösung in 15% Ethanolhaliigem Wasser; pH 0,0 ± 0,5) gewaschen. Die Elution e;folgt in der Art von Beispiel 1 mit 100ml einer einmolaren Lösung von
mit Karbonatpuffer. Zur Elution, die wiederum in der Art von Beispiel 1 erfolgt, wird das eingesetzte beladene weitporige
(eingestellt mit KCI) versetzt.
BolspleU
10g weitporiges Kiesolgel der Sortenklassifizierung XWP500 werden bei Zimmertemperatur über 60 Minuten in 1 Liter
gewaschen und danach mit 100ml 50%igem Ethylenglykol-Wasser, welches 0,1 M Glycin enthält (pH 10,5; eingestellt mit NaOH) eluiert.
BeUpIeI 5
1 500g feuchtet, belailenes, gewaschenes woitporiges Kieselgel der Sortenklassifizierung B1, an das aus 40 Liter Kulturmedium(30mg/l) 1,2g Proteiri A gebunden sind (für die Gewinnung dieses Mediums, für den Adsorptions- und für den Waschschrittsiehe Beispiel 1), Waiden mit 5 Liter 0.05M Glycin in 50%igern Ethylenglykol-Wesser bei pH 10,5 auf einer Fritte eluiert, und der
über eine Säule (ücm Durchmesser; 7 cm Höhe) von CM-Cellulose.equilibriert mit Puffer A (0,1 M Essigsäure mit 2,7 ml 25%igem
wird mit Puffer B (0,1 M Essigsäure mit 7,5rr.l 25%igem Ammoniak; pH 5,6; Leitfähigkeit 7,5 mS/cm) eluiort. Das Elu&t wird gegen
(entspricht oiner relativen Ausbeute von 50%).
In 40 Liter Kulluf überstand mit 30my/I Protein A, erhalten nach Beispiel 1, worden 500g trockenos woitporigos Kiosolgol dor Sortenklaisifizierung B1 eingebr<icht, und die Suspension wird 60 Minuten gerührt. Das beladene weitporige Kieselgel wird gowaschen und das Protein A nach dnr Vorschrift von Beispiel 5 mit 0,05 M Glycin in Ethylenglykol-Wasser eluiort. Für den Schlußschritt werden die Protein A-haltigcn Eluate vereinigt, und dio Acidität wird mit HCI auf pH <t,4 eingestellt. Das sich bildend1» Pr äzipitat wird abzontrifugiert; danach worden in den Überstand 200 ml CM-Cellulose, equilibriertrnil Puffer A (0,0153 M Zitronensäure plu3 0,022M Phosphat; pH 4,4), eingerührt, und die Cellulose wird anschließend in eino Chromatographiosäulo gespult. Nach Waschen mit Puffer A wird das Protein A mit Hilfe eines linearen Gradienten von je 500ml Puffer A und 500ml Puffer B (0,0113Ni Zitronensäure plus 0.029M Phosphat; pH 5,6) von der CM-Cellulose eluiert. Dio aktiven Fraktionen worden vereinigt und mit Ammoniumsulfat bei 70%iger Sättigung gefällt; das Präzipitat wird in Wasser gelöst und danach gegen Wasser sowie zuletzt gegen 0,01 M Ammoniumkarbonat dial/siert
Nach der Lyophilisation wurde eine Protdi Α-Ausbeute von 724 mg erreicht (entspricht einer relativen Ausbeute von 60%).
5 Liter eines Protein A-haltlgen Ethylenglykol-Eluates, erhalten unter Rückgriff auf beladenes weitporiges Kieselgel der Sortenklassifizierung B1 nach Beispiel 5, mit einem Wirkstoff-Gehalt von insgesamt 700mg Protein A werden nach Einstellen des pH-Wertes auf pH 7,5 Ober eine DEAE-Cellulose-Säule (5cm Durchmesser χ 7cm Höhe) gegeben, die mit 0,05 M Tris-HCI; pH 7,5; equlllbriert worden war. Nach Spülen mit diesem Puffer erfolgt die Elution mit einem Zusatz von 0,5 M NaCI.
Nach Dialyse des Eluates gegen Wasser wurde eine Endausbeute von 520mg Protein A, vom Kulturfiltrat-Gehalt ausgerechnet, erhalten (entsnricht einer relativen Ausbeute von 74%).
Nach Beispiel 1 gewonnenes, Protein A-haltiges, gewaschenes Feuchtmasse-Kieselgel der Sortenklassifizierung B1 (1 550 g) mit 3,2g Protein A wird zur Elution in 3 Portionen von je 1,5 Liter 50%lger Ethanollösung in 0,1 M Glycin-Puffer; pH 2,0; oingerührt (Rührdauer 30 Minuten) und nach dem Absetzen abdekandiert. Die Eluate werden vereinigt, und der pH-Wert wird mit HCI auf pH 4,4 eingestellt.
Nach Filtration des trüben Niederschlags werden in den Überstand für den Schlußschritt des Verfahrens 400 ml CM-Celluloso, equilibriert mit 0,1 M Ammoniumacetat; pH 4,4; eingerührt. Die beladene Cellulose wird anschließend auf eine Fritte gespült und mit dem Equilibrierungspuffer gewaschen. Die erneute Elution erfolgt mit 2 Liter von 0,1 M Lösung des gleichen Puffers; pH 5,6; enthaltend 1,0 M NaCI, und aus dem Eluat wird das Protein A mit Ammoniumsulfat bei 70%iger Sättigung gefällt, dialysiert sowie schließlich lyophylosiert.
Ausbeute: 1,9g Protein A
(entspricht einer relativen Ausbeute von 60%).
1500g Feuchtmasse von Protein A-haltigem Kieselgel der Sortenklassifizierung B1, gewonnen nach Beispiel 1, an welches aus 40 Liter Kulturfiltrat 3,6g Protein A gebunden waren, wird im Elutionsschritt mit 3 Portionen von je 1,5 Liter 50%iger Acetonlösung, enthaltend 0,1 M Glycin; pH 2,0; je 30 Minuten gerührt, und die Eluate werden anschließend vereinigt. Nach Einstellen des pH-Wertes auf pH 4,4 und 2'entrifugation des trüben Niederschlags erfolgt die weitere Reinigung an CM-Cellulose gemäß Beispiel 8.
Ausbeute: 2,5g Protein A
(entspricht einer relativen Ausbeute von 69%).
Feuchtes beladenes weitporiges Kieselgel dor Sortenklassifizierung B1, erhalten in einer Menge von 100g nach Beispiel 1, an welches 0,29g Protein A gebunden sind, wird im Elutionsschritt mit 3 Portionen (von je 100ml) 50%igem Formamid ausgerührt, und die gewonnenen Überstände werden vereinigt. Das Eluat wird gegen 0,1 M Amrnoniumacetatpuffer; pH 4,4; clialysiort und wie im Beispiel 8 an CM-Cellulose feingereinigt.
Ausbeute: 250mg Protein A
(entspricht einer relativen Ausbeute von 86%).
Feuchtes bolsdenos weitporiges Kieselgel der Sortenklassifizierung B1, erhalten in einer Menge von 100g nach Beispiel 1, an welches 0,29g Protein A gebunden sind, wird im Elutionsschritt mit 3 Portionen (von je 100ml) 0,5M Ethanolamin; pH 10,5; ausgerührt, und die erhaltenen Überstände werden vereinigt. Nach Dialyse gegen 0,1 M Ammoniumacetatpuffer; pH 4,4; erfolgt die Foinreinigung wiederum an CM-Cellulose wie in Beispiel 8
Ausbeute: 230mg Protein A
(entspricht einer relativen Ausbeute von 80%).
Feuchtes beladones weitporiges Kieselgel der Sortenklassifiziorung B1, erhalten in einer Menge von 100g nach Beispiel 1, an welches erneut 0,29g Protein A gebundon sind, wird im Elutionsschritt mit 3 Portionen (von je 100ml) 0,1 M Glycinpuffer in 50%igem Ethylenglykol; pH 2,0; ausgerührt, und die Eluate werden vereinigt. Der pH-Wert des Gesamt-Eluats wird mit 4 N NaOH auf pH 4,4 eingestellt; danach wird diese Lösung gemäß der Vorschrift von Beispiel 8 an CM-Cellulose feingereinigt. Ausbeuto: 177mg Protein A
(entspricht einer relativen Ausbeute von 61 %).
Feuchtes boladenes weitporiges KioselgeldorSoitenklassifizierung B1, erhallen in einer Menge von 100g nach Beispiel 1, an welches gleichfalls 0,29g Protein A gebunden sind, wird im Elutionsjchritt mit 3 Portionen (von jo 100ml) 0,1 M Glycinpuffer; pH ?,0; enthaltend 6 M Harn stoff, a jsgerührt, und die Überstände werden vereinigt. Diesem Eluat worden zwecks Dialyse zunächst Wassei sowie danach Ammüniumsulfat bis zur 50%igen Sättigung zugegeben. Das präzipitierte Protein A wird nochmals diclysiert gegen 0,02M Ammoniumbikarbonei sowio schließlich lyophilisiert. Ausbeute: 205mg Protein A
(entspricht einer relativen Ausboute von 71 %).
(Sortenklassifizierung B1; Feuchtmasse)
(Es wurde 1 g Kieselgel mit je 5ml Elutionsmittel für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert und das eluierte Protein A im
| Elutionsmittel | ψ | Ethanol 30%-0,1 M Glycin | pH | mg |
| Ethanol 30%-0,1 M Glycin | Protein A | |||
| Aceton 50%-0,1 M Glycin | imEluat | |||
| Aceton 30%-0,1 MGIycin | 9,5 | 0 | ||
| Ethylenglykol50%-0,1 M Glycin | 2,0 | 1,35 | ||
| Ethylenglykol50%-0,1 MGIycin | 2,0 | 2,7 | ||
| Ethylenglykol 50 %~ 0,05 M TRIS | 2,0 | 2,0 | ||
| Formamid 50% | 10,5 | 1,5 | ||
| Ethanolamin 0,5 M | 2,0 | 1,6 | ||
| Ethanolamin 1,0M | 9,5 | 0,9 | ||
| Harnstoffe M | 7,0 | 2,7 | ||
| Tween20(1%)-0,1 MGIycin | 10,7 | 2,0 | ||
| 11,0 | 2,0 | |||
| 7,0 | 1,7 | |||
| 10,5 | 0,6 |
Claims (13)
1. Verfahren zur Gewinnung von Protein A auf mikrobiellem Wega, indem
- ein zur Protein Α-Biosynthese befähigter Stamm der Art Staphylococcus aureus oder ein rekombinanter Mikroorganismus mit dieser Fähigkeit submers in einem Nährmedium, welchos eine Kohlenstoff- und eine Stickstoffquelle sowie Mineralsalze enthält, für die Dauer von 8 Stunden bis 30 Stunden bei Temperaturen von 250C bis 4O0C sowie pH-Werten im Bereich von pH 6,0 bis pH 8,0 kultiviert,
-* nach Beendigung der Fermentation, gegebenenfalls im Anschluß an einen Zellaufschluß, die erhaltene Biomasse abgetrennt und
- im Schlußschritt des Gesamtverfahrens aus den dann vorliegenden Eluaten mittels lonenaustauschchromatographie das reine Produkt isoliert
wird, gekennzeichnet dadurch, daß
a) der Protein A-haltige Kulturüberstand mit einem weitporigen Kieselgel mit Porengrößen im Bereich von 10nm bis 50nm behandelt und
b) das Zielprodukt vom nunmehr beladenen Kieselgel obiger Spezifität mit einer Lösung eines ein- oder mehrwertigen Alkohols oder eines Kotons oder eines Amins oder eines Amids abgelöst
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß weitporiges Kieselgel obiger Spezifität
aus der Sortenklassifizierung B1 oder
aus der Sortenklassifizierung Si 100 oder
aus der Sortenklassifizierung Si 300 oder
aus der Sortenklassifizierung XWP500
in einer Menge von 0,2kg bis 2,0kg pro 1001 in den besagten Kulturüberstand eingerührt wird.
aus der Sortenklassifizierung Si 100 oder
aus der Sortenklassifizierung Si 300 oder
aus der Sortenklassifizierung XWP500
in einer Menge von 0,2kg bis 2,0kg pro 1001 in den besagten Kulturüberstand eingerührt wird.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß das beladene Kieselgel obiger Spezifität vor dem Ablösungsschritt im alkalischen Milieu einem Waschvorgang unterzogen wird.
4. Verfahren gemäß Anspruch 3, gekennzeichnet dadurch, daß im Waschvorgang bei pH-Werten zwischen pH 8,0 und pH 9,5 eine ethanolische Lösung mit Soda-Zusatz eingesetzt wird.
5. Verfahren gemäß Anspruch 4, gekennzeichnet dadurch, daß im Waschvorgang eine Lösung von 10ml bis 15ml Ethanol pro 100ml Wasser mit 1 % Soda-Zusatz eingesetzt wird.
6. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2 sowie gegebenenfalls 3 bis 5, gekennzeichnet dadurch, daß Protein A vom beladenen Kieselgel obiger Spezifität mit alkalischer Ethylenglykol-Lösung bei pH 10,5 abgelöst wird.
7. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2 sowie gegebenenfalls 3 bis 5, gekennzeichnet dadurch, daß Protein A vom beladenen Kieselgel obiger Spezifität mit saurer Ethylenglykol-Lösung bei pH 2,0 abgelöst wird.
8. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2 sowie gegebenenfalls 3 bis 5, gekennzeichnet dadurch, daß Protein A vom beladenen Kieselgel obiger Spezifität mit saurer Ethanol-Lösung bei pH 2,0 abgelöst wird.
9. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2 sowie gegebenenfalls 3 bis 5, gekennzeichnet dadurch, daß Protein A vom beladenen Kieselgel obiger Spezifität mit saurer Aceton-Lösung bei pH 2,0 abgelöst wird.
10. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2 sowie gegebenenfalls 3 bis 5, gekennzeichnet dadurch, daß Protein Avom beladenen Kieselgel obiger Spezifität mit Ethanolamin-Lösung im alkalischen Milieu abgelöst wird.
11. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2 sowie gegebenenfalls 3 bis 5, gekennzeichnet dadurch, daß Protein A vom beladenen Kieselgel obiger Spezifität mit Formamid-Lösung bei pH 10,5 abgelöst wird.
12. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2 sowie gegebenenfalls 3 bis 5, gekennzeichnet dadurch, o'aß Protein A vom beladeneii Kieselgel obige/ Spezifität mit Harnstofflösung bei pH 2,0 bis pH 10,5 abgelöst wird.
13. Verfahren gemäß Anspruch 6 bis 12, gekennzeichnet dadurch, daß bei der Ablösung da? jeweilige Elutionsmittel mit einem Zusatz
von Glycin oder
von Tris(hydroxymethyl)aminomethan oder
von Triethylamin oder
von Polyoxyethylsorbitanmonolaurat
eingesetzt wird.
eingesetzt wird.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD31616588A DD286721A7 (de) | 1988-05-30 | 1988-05-30 | Verfahren zur gewinnung von protein a |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD31616588A DD286721A7 (de) | 1988-05-30 | 1988-05-30 | Verfahren zur gewinnung von protein a |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DD286721A7 true DD286721A7 (de) | 1991-02-07 |
Family
ID=5599552
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DD31616588A DD286721A7 (de) | 1988-05-30 | 1988-05-30 | Verfahren zur gewinnung von protein a |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DD (1) | DD286721A7 (de) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5451660A (en) * | 1993-12-13 | 1995-09-19 | Genentech, Inc. | Method for purifying polypeptides |
-
1988
- 1988-05-30 DD DD31616588A patent/DD286721A7/de not_active IP Right Cessation
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5451660A (en) * | 1993-12-13 | 1995-09-19 | Genentech, Inc. | Method for purifying polypeptides |
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| ENJ | Ceased due to non-payment of renewal fee |