DD287040A5 - Neue fluophorderivate, verfahren zu ihrer herstellung und deren verwendung zur herstellung neuartiger fluoreszenzmarkierter nucleoside, nucleotide und oligonucleotide - Google Patents

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung neuartig fluoreszensmarkierter Nucleoside, Nucleotide und Oligonucleotide, die in der Gentechnik und Molekularbiologie als Sonden und Primer, insbesondere zur manuellen und automatischen Sequenzanalyse einsetzbar sind. Erfindungsgemaesz werden Fluorophorderivate der allgemeinen Formel I:FO(X)nR(I) mit F fluoreszierender Farbstoff, X CH2, n 1 bis 18, R Phosphat, substituiertes Phosphat, Phosphoramidit, substituiertes Phosphoramidit, H-Phosphonat, substituiertes Phosphonat, Thiophosphat, substituiertes Thiophosphat; Phosphoramidat, substituiertes Phosphoramidat unter fuer den Kettenaufbau von Oligonucleotiden ueblichen Bedingungen mit Nucleosiden, Nucleotiden oder Oligonucleotiden direkt zu Verbindungen der allgemeinen Formel II, mit der fuer F, X und n erklaerten Bedeutung sowie Y O, S, NH und R1 3- bzw. 5-Oligonucleotid bzw. Nucleotid oder Nucleosid umgesetzt. Formel III{Fluorophorderivate; Fluorescein; Fluorescein-O-hydroxyalkylether; Phosphorylierungsmittel; Phosphitilierungsmittel; Phosphonylierungsmittel; fluoreszenzmarkierte Nucleotide; Nucleoside und Oligonucleotide}

Description

I-- O -(Xi11- Y- Γ-·-·π--ίϊν (II)
mit der für F, X, und η arklärten Bedeutung und für Y = O, S, NH sowie R1 = 3'- oder 5'-Oligonucleotid bzw. Nucleosid oder Nucleotid umgesetzt werden. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Fluorophorphosphortriester, -phosphoramidite, -H-phosphonate, -thiophosphite und -thiophosphate eingesetzt werden.
Anwendungsgebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung neuartig fluoreszenzmarkierter Nucleoside, Nucleotide und Oligonucleotide, die in der Gentechnik und Molekularbiologie als Sonden und Primer, insbesondere zur manuellen und automatischen Sequenzanalyse einsetzbar sind.
Charakteristik des bekannten Standes der Technik
Bisherige Verfahren zur chemischen nichtradioaktiven Markierung von Oligonucleotiden mit Ruorophoren erfordern die Einführung spezieller Ar.kergruppen, die danach mit allgemein bekannten reaktiven Derivaten von Fluorophoren >m Anschluß an die eigentliche Ollgonucleotldsynthese unter kovalenter Bindung des Farbstoffes umgesetzt werden. Zu diesen Ankergruppen gehören Aminogruppen am 5'Ende des Oligonucleotids (Smith, L M.; Fung, S.; Hunkapiller, M. W.; Hunkapiller, T. J„ und Hood, '.. S.; Nucl. Acids Res. 13 [1985] 2399; WO 88/00201, Smith, L.M.; Fung, S., und Kaiser, R. J. jr.) verschiedene Alkylaminogruppen, die über eine Phospordiesterbindung (Tanaka, T; Sakata, T.; Fujimoto, K., und Ikehara, M.; Nucl. Acids Res. 15 [1987] 6209; DE-OS 3642939 Sproat, B.) oder die heterocyclische Base (Sarfati, S. R.; Pochet, S.; Cureito, C; Nansame, A.; Hynh-Dinh, T., und Igolen, J.; Tetrahedron 43 (1987) 3491) in das Oligonucleotid eingeführt werden. Eine Bindung über Sulfhydrylgruppen ist ebenfalls beschrieben (OE-OS 3642939; Sproat, B.). Eine weitere Variante zur Markierung von Oligonucleotiden oder von natürlicher DNA besteht in der Synthese von fluoreszierenden Nucleosidtriphosphaten (Prober, J.M.; Trainer, G.L; Dans, R. J.; Hobbs, F.W.; Robertson, C.W.; Cagursky, R.J.; Cocuzza, A. J.; Jensen, M.A. und Baumeister, C.W.; Science 238 [1987) 336) und deren enzymatischen Einbau an einem DNA Template unter Verwendung eines Oligonucleotidprimers. Die aufgeführten Verfahren zur Fluoreszenzmarkierung von Oligonucleotiden oder DNA erfordern neben dem Aufwand zur Synthese dieser Verbindungen, zusätzliche experimentelle Arbeit zum Einführen dar Ankergruppen bzw. zur Darstellung der Spacer bei Kopplung über eine Aminoalkylphosphorsäurediesterbindung. Die Synthese der fluoreszierenden Nucleosidtriphosphate für den enzymatisch^ Einbau erfordert ebenfalls einen erheblichen experimentellen Aufwand. Nachteilig wirkt sich w?!terhin aus, daß das zu markierende Oligonucleotid nach der eigentlichen Synthese gelelekfrophoretisch aufgereinigt und nach erfolgtem Umsatz mit dem entsprechenden Farbstoff nochmals über eine Ausschlußchromatographie von nicht umgesetztem Farbstoff und unmarkiertem Oligonucleotid getrennt werden muß. Das erfordert einen hohen Zeitaufwand.
Ziel der Erfindung
Die Erfindung hat das Ziel, Nucleoside, Nucleotide und Oligonucleotide mit goringem Aufwand, ohne Nutzung von speziellen Ankergruppen im Laufe der normalen Oligonucleotidsynthese in guten Ausbeuten mit Fluorophoren zu markieren.
Darlegung des Wesens der Erfindung Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, mit Hilfe neuartiger Synthesebausteine ein Verfahren zur Herstellung nichtradioaktiv
markierter Nucleoside, Nucleotide und Oligonucleotide zu entwickeln. Die Einführung von neuartigen Fluorophorderivaten erfolgt auf einfachem Weg, ohne Nutzung spezieller Ankergruppen oder spezieller Schutzgruppentechniken im Verlauf der
Oligonucleotldsynthese. Es wurdo gefunden, daß sich die Fluorophorderivate der allgemeinen Formel I
F-O-(X)n-R (I)
F = fluoreszierender Farbstoff
η = Ibis 18
R s= Phosphat, substituiertes Phosphat, Phosphorairwdit, substituiertos Phosphoramidit, H-Phosphonat, substituiertes
H-Phosphonat, Thiophosphat, substituiertes Thiophosphat, Phosphoramidat, substituiertes Phosphoramidat unter für den Kettenaufbau von Oligonucleotiden üblichen Bedingungen mit Nucleosides Nucleotiden oder Olignucleotiden direkt im manuellen, semiautomatischen und vollautomatischen Syntheseregime zu Verbindungen der allgemeinen Formel Il
Ci
Il
: · - i) iX)t,- V- P-Ok1 dl)
II...
mit der für F, X und η erklärten Bedeutung und für Y = 0, S, NH sowie R, = 3'- oder 5'-Oligonucleotid, Nucleosid oder Nucleotid umsetzen lassen.
Die Verbindungen der allgemeinen Formel I können durch Umsetzung von Fluorophoren der allgemeinen Formel III
F-O-(X)n-YH (ill)
mit der für F, X, η und Y erklärten Bedeutung mit üblichen Phosphorylierungs-, Phosphitylierungs- oder
Phosphonylierungsmitteln erhalten werden. Dio Herstellung der neuen Fluorophorderivate der allgemeinen Formel I ist Gegenstand einer gesonderten Patentanmeldung. Derfluoreszlerende Farbstoff in der Verbindung I ist vorzugsweise Fluorescein oder Fluorescoin-O-hydroxyalkylether mit einem Alkylspacer von 1 bis 18 Methylengruppen, vorzugsweise 1 bis 10 Methylengruppen, insbesondere 4 bis 6 Methylengruppen. Zur Phosphylierung der Fluorophore wird bevorzugt p-Chlorphenyl-phosphorsäureditriazolid, zur Phosphitylierung
vorzugsweise N,N'-Bis-(diisopropylamino)-cyanoethylphosphin oder zur H-Phosphylierung vorzugsweise
Salicoylchlorphosphit eingesetzt. In seiner Struktur entspricht das Farbstoffderivat der allgemeinen Formel I den in der Oligonucleotidsyntheso verwendeten Syntheseintermediaten und ist wie diese Verbindungen analog einfach handhabbar. Beim vorzugsweisen Einsatz des N,N'-Bis-
(diisopropylamino)-O-cyanoethylphosphins als R in der Verbindung der allgemeinen Formel I erfolgt die Umsetzung mit dem trägerfixierten oder in Lösung befindlichen Oligonucleotid, Nucleosid oder Nucleotid in Gegenwart schwacher Säuren, vorzugsweise Tetrazol, in aprotisch polaren Lösungsmitteln, vorzugsweise Acetonitril.
Soll das neuartige Fluorophorderivat mit Hilfe des Phosphotriesterverfahrens an das Oligonucleotid gebunden werden, setzt
man das polymer gebundene bzw. in Lösung befindliche üblich geschützte Oligonucleotid mit freier 3'· bzw. δ'-HydroKylgruppe mit der Verbindung der altgemeinen Formel I mit der für F, X und η erklärten Bedeutung und für R = Phosphat, substituhrte
Phosphat, vorzugsweise Phosphorsäure-p-chlor (oder o-chlor)-plienylester in Gegenwart von Sulfonsäurechloriden oder
-azoliden vorzugsweise Triisopropylbenzensulfonsäurechlorid in Gogenwart von nucleophilen Katalysatoren, vorzugsweise
N-Methylimidazol, in aprotischen polaren Lösungsmitteln, vorzugsweise Pyridin, um. Bei Anwendung des H-Phosphonatverfahrens wird die Verbindung der allgemeinen Formel I mit der für F, X und η erklärten Bedeutung und in der für R = Phosphonat bzw. substituiertes Phosphonat steht, mit dem polymer gebundenen bzw. in Lösung
befindlichen üblich geschützten Oligonucleotid mit freier 3'- bzw. 5'-Hydroxylfunktion in Gegenwart von Aktivierungsreagentien wie Sulfonsäure- bzw. Carbonsäurechloriden, vorzugsweise Pivaloylchlorid oder Adamantoylchlorid, in polar aprotischen
Lösungsmitteln oder deren Gemischen, vorzugsweise ein Gemisch von Pyridin und Acetonitril, umgesetzt. Im Fall einer automatisierten Synihesestrategie kann der für die normale Nucleotidverlängerung der Oligonucleotidkette
verwendete Synthesecyclus genutzt werden und zur Gewährleistung einer möglichst quantitativen Markierung beliebig oft wiederholt werden.
In der beschriebenen Art und Weise lassen sich erfindungsgemäß auch Nucleoside und Nucleotide markieren. Nach erfolgter Kopplung des Fluorophors an das Nucleosid, Nucleotid oder Oligonucleotid und Ausbildung der Internucleotidbindung kann das Syntheseprodukt in für unmarkierte Oligonucleotide üblicherweise aufgearbeitet werden. Dazu
werden die alkalilabilen Schutzgruppen durch Behandlung mit Basen, vorzugsweise einer wäßrigen konzentrierten Lösung von
Ammcniak, in einem Temperaturbereich von 5 bis 60°C, vorzugsweise bei 5O0C, im Verlauf von 12 bis 60h, vorzugsweise im Verlauf von 15h, abgespalten. Die so erhaltenen markierten Oligonucleotide lassen sich sowohl über Gelelektrophorese auf Acrylamid als auch durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie aufreinigen und in die für den biologischen Einsatz
erforderlichen Form bringen.
Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich dadurch aus, daß ausgehend von einem nach üblichen Verfahren synthetisierten Oligonucleotid, ohne zusätzliche Ankergruppen im Kohlenhydratteil, als auch in der heterocyclischen Böse, die Einführung von
neuen erfindungsgemäßen Fluorophorderivaten direkt im Verlauf der Oligonucleotidsynthese möglich ist.
Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich weiterhin durch eine milde Reaktionsführung aus. Die unkomplizierte Wiederholbarkeit der Anknüpfung sichert eine quantitative Markierung des Oligonucleotids. Die entstehenden Produkte sind von hoher Reinheit und in hoher Ausbeute erhältlich. Die Bindung zwischen Fluorophor und dem Oligonucleotid ist überraschenderweise gegenüber milden sauren und alkalischen Bedingungen stabil und erlaubt somit die Abspaltung von am Oligonucleotid vorhandenen Schutzgruppen ohne Beeinflussung der Bindung des Fluorophors. Die dargestellten Stoffe sind neuartig und können als DNA-Sonden oder als Primer in der Gentechnik und der Molekularbiologie, insbesondere bei der Sequenzierung von genetischen Strukturen nach chemisch degradation Verfahren oder dem Kettenabbruchverfahren zum Einsatz gebracht werden. Die fluorimetrische Bestimmung der erfindungsgemäß markierten Verbindungen kann mit der bisher üblichen Technik zur Fluoreszenzmessung erfolgen.
Ausfuhrungsbeispiele Die Erfindung soll anhand von Beispielen näher erläutert werden, ohne sie zu beschränken. Beispiel 1 Darstellung des Phosphoramidites
187mg F-(CHj)4-OH (F = Fluoresceinmethylester) werden in 20ml absolutem Methylenchlorid gelöst und unter Rühren mit 28mg Diisopropylammoniumtetrazolid und 0,12ml Bis-(diisopropylamino)-methoxyphosphir) versetzt. Man läßt die
Reaktionsmischung 1 h bei Raumtemperatur rühren. Danach wird auf 50ml verdünnt und mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung und Wasser gewaschen. Nach Trocknung der organischen Phase über Natriumsulfat engt
man ein und trocknet im Ölpumpenvakuum über Phosphorpentoxid. Man erhält 200mg des Produktes (83% der Theorie).
Dünnschichtchromatographie (Chloroform/Methanol 9/1 v/v) Ri = 0,65 Beispiel 2 Darstellung des Phosphonates
100mg F-(CHj)1-OH (F = Fluoresceinmethylester) werden dreimal mit je 10 ml absolutem Dioxan kodestilllert und in 12 ml
Dioxan aufgenommen. Zu dieser Lösung gibt man 0,5ml Lutidin und 1 ml einer einmolaren Lösung von Salicoylochlorophosphit
in absolutem Dioxan. Nach einer Stunde wird 1 ml Wasser addiert und weitere 30 min gerührt. Die Reaktionslösung wird zur
Trockne eingeengt. Der Rückstand wird in Chloroform aufgenommen und mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung,
einmolarem Triethylammoniumhydrogencarbonatpuffer (pH 8) und Wasser in der angegebenen Reihenfolge gewaschen. Nach
Trocknen der organischen Phase mit Natriumsulfat, Filtration und Einengen wird das Phosphonat im Vakuum über Phosphorpentoxid getrocknet. Dünnschichtchromatographie (Chloroform/Methanol 9/1 v/v) Ri = 0,3 Beispiel 3 Markierung eines Oligonucleotides nach der Phosphoramiditmethode (Maßstab 1 pmol) Die Markierung erfolgt im Verlauf der Oligonucleotidsynihese. Dazu wird eine 0,1 molare Lösung der im Beispiel 1 hergestellten Verbindung in absolutem Acetonitril je nach Bauart des DNA-Syntheseautomaten an entsprechender Position installiert und der Farbstoff nach dem angegebenen Synthesecyclus angekoppelt: Schritt Operation Zeit(s)
1 Waschen mit Acetonitril 60
2 Trocknen mit Argon 20
3 Farbstoffderivat und 0,5molare Lösung von Tetraiol
in Acetonitril in Reaktionsgefäß 10
4 Reaktion 30
5 Entfernen der Reaktionslösung 5
6 Waschen mit Acetonitril 10
7 Entfernen des Acetonitrile mit Argon 10
8 Oxydation mit Ij/HjO/Pyridin/TMF 40
9 Entfernen der Oxidationslösung 10
10 Waschen mit Acetonitril 30
Die Schritte 2 bis 6 lassen sich zur Vervollständigung der Reaktion beliebig oft wiederholen. Beispiel 4 Aufarbeitung des markierten Oligonucleotids Der Träger mit dem fixierten Oligonucleotid wird 60h boi Raumtemperatur mit konzentriertem Ammoniak versetzt und die
überstehende gelbe fluoreszierende Lösung eingeengt. Die Reinigung des so erhaltenen Rohproduktes kann über
Gelelektrophorese auf Polyacrylamid in der bekannte,ι / rt und Weise erfolgen, wobei sich markiertes und unmarkiertes Derivat
deutlich im Laufverhalten unterscheiden. Das markierte Oligonucleotid erscheint beim Betrachten des Gels auf einem
Transilluminator bei einer Wellenlänge von 310nm als schwach fluoreszierende Bande, die ausgeschnitten und in für
unmarkierte Oligonucleotide üblicher Weise eluiert wird. (Entsalzung an RP18 Kieselgel oder Sephadex)
Markiertes und unmarkiertes Oligonucleotid unterscheiden sich ferner durch die Retentior.szeiten in der Hochdruckflüssigkeitschromatographie und lassen sich mit ihrer Hilfe trennen.

Claims (1)

1. Verfahren zur Herstellung neuartig fluoreszenzmarkierter Nucleoside, Nucleotide und Oligonucleotide, dadurch gekennzeichnet, daß Fluorophorderivate der allgemeinen Formel (I)
F-O-(X)n-R (I)
F = fluoreszierender Farbstoff
X = CH2
η = 1 bis 18
R = Phosphat, substituiertes Phosphat, Phosphoramidit, substituiertes Phosphoramidit, H-Phosphonat, substituiertes H-Phosphonat, Thiophosphonat, substituiertes Thiophosphat, Phosphorarnidat, substituiertes Phosphoramidat
unter für den Kettenaufbau von Oligonucleotiden üblichen Bedingungen mit Nucleosides Nucleotiden oder Oligonucleotiden direkt zu Verbindungen der allgemeinen Formel (II)
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