DD288604A5 - Verfahren zur herstellung neuer fluorophorderivate - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung neuer Fluorophorderivate zur neuartigen Fluoreszenzmarkierung von Nucleosiden, Nucleotiden und Oligonucleotiden. Erfindungsgemaesz werden die neuen Verbindungen der allgemeinen Formel I FO(X)nR(I) mitF fluoreszierender FarbstoffX CH2n 1 bis 18R Phosphat, substituiertes Phosphat, Phosphoramidit, substituiertes Phosphoramidit, Phosphonat, substituiertes Phosphonat, Thiophosphat, substituiertes Thiophosphat, Phosphoramidat, substituiertes Phosphoramidatdurch Reaktion von Fluorophoren der allgemeinen Formel II FO(X)nYH(II) mit der fuer F, X, n erklaerten Bedeutung und YO, S, oder NH mit ueblichen Phosphorylierungs-, Phosphitylierungs- oder Phosphonylierungsmitteln erhalten.{Fluorophorderivate; Fluorescein; Fluorescein-O-hydroxyalkylether; hydroxyliertes Fluorophor; Phosphorylierungsmittel; Phosphitilierungsmittel; Phosphonylierungsmittel; p-Chlorphenylphosphorsaeureditriazolid; * * Salicoylochlorphoshit}

Description

F-0-(X)n-R (I)

mit der für F, X, und η beschriebenen Bedeutung und R = Phosphat, substituiertes Phosphat, Phosphoramidit, substituiertes Phosphoramidit, Phosphonat oder substituiertes Phosphonat, Thiophosphat oder substituiertes Thiophosphat, Phosphoramidat oder substituiertes Phosphoramidat umgesetzt werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als fluoreszierende Farbstoffe Fluorescein oder Fluorescein-O-hydroxyalkylether bzw. deren Substitutionsprodukte mit einem Alkylspacervon 1 bis 18 Methylengruppen, vorzugsweise 1 bis 10, insbesondere 4 bis, 6 Methylengruppen verwendet werden.

3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Phosphorylierung der Fluorophore mit p-Chlorphenyl-phosphorsäureditriazolid, die Phosphitylierung mit Ν,Ν'-Bis-(diisopropylamino)-O-cyanoethylphosphin oderN,N'-Bis-(diisopropylamino)0-methoxyphosphin und die Phosphonylierung mit Salicoylochlorophosphit vorgenommen werden.

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft die Herstellung neuer Fluorophorderivate die zur Fluoreszenzmarkierung von Nucleotiden, Nucleosiden und Oligonucleotiden einsetzbar sind.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Bisherige Verfahren zur chemischen nichtradioaktiven Markierung vor. Oligonucleotiden mit Fluorophoren erfordern die Einführung spezieller Ankergruppen, die danach mit allgemein bekannten reaktiven Derivaten von Fluorophoren wie Fluoresceinisothiocyanat oder lodacetamidofluorescein im Anschluß an die eigentliche Oligonucleotidsyntheso unter kovalenter Bindung des Farbstoffes umgesetzt werden. Zu dicer Ankergruppen gehören Aminogruppen am 5'-Ende des Oligonucleotids (Smith, LM.; Fung, S.; Hunkapiller, T. J.; Hunkapilldr, M.W., und Hood, L.S.; Nucl. Acids Res. 13 [1985] 2399, WO 88/00201, Smith, LM.; Fung, S. und Kaiser, R. J. jr.) verschiedene Alkylaminogruppen, die über eine Phosphorsäurediesterbindung (Tanaka, T.; Sakata, T.; Fujimoto, K., und Ikehara, M.; Nucl. Acids Res. 15 [1987] 6209; DE-OS 3642939, Sproat, B.) oder die heterocyclische Base (Sarfati, S. R.; Pochet, S.; Cureiro, C; Nansame, A.; Huynh-Dinh, T„ und Igolen, J.; Tetrahedron 4311987] 3491) in das Oligonucleotid eingeführt werden. Eine Bindung über Sulfhydrylgruppen ist ebenfalls beschrieben (DE-OS 3642939 Sproat, B.).

Eine weitere Variante zur Markierung von Oligonucleotiden oder von natürlicher DNA besteht in der Synthese von fluoreszierenden Nucleosidtriphosphaten (Prober,Ü.M.; Trainer, G.L.; Dans, R.J.; Hobbs, F.W.; Robertson, C.W.; Cagursky, R. J.; Cocuzza, A. J.; Jensen, M.A., und Baumeister, C.W.; Science 238 [1987] 336) und deren enzymatischem Einbau an einem DNA-Templat unter Verwendung eines Oligonucleotidprimers.

Die in den aufgeführten Verfahren zur Fluoreszenzmarkierung von Oligonucleotiden oder DNA eingesetzten Farbstoffe erfordern neben dem Aufwand zur Synthese dieser Verbindungen zusätzliche experimentelle Arbeit zum Einführen der Ankergruppen bzw. zur Darstellung der Spacer bei Kopplung über eine Aminoalkyl-phosphorsäurediesterbindung. Die Synthese der fluoreszierenden Nucleosidtriphosphate für den enzymatischen Einbau erfordert ebenfalls einen erheblichen experimentellen Aufwand. Nachteilig wirkt sich weiterhin aus, daß das zu markierende Oligonucleotid nach der eigentlichen Synthese gelelektrophoretisch aufgereinigt und nach erfolgtem Umsatz mit dem entsprechenden Farbstoff nochmals über eine Ausschlußchromatographie von nicht umgesetztem Farbstoff und unmarkiertem Oligonucleotid getrennt werden muß. Das erfordert einen hohen Zeitaufwand.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung hat das Ziel, neue Synthesebausteine zu finden, mit deren Hilfe Nucleoside, Nucleotide und Ollgonucleotide mit geringem Aufwand ohne Nutzung von speziellen Ankergruppen im Laufe der normalen Oligonucleotidsynthese in guter Ausbeute mit Fluorophoren markiert werden können.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, neue Synthesebausteine auf der Basis von Fluorophoren für die Herstellung nichtradioaktiv markierter Nucleoside, Nucleotide und Oligonucleotide zu entwickeln. Es wurde gefundervdaß die neuen Fluorophorderivate der allgemeinen Formel I

F-O-(XIn-R (I)

mit F = fluoreszierender Farbstoff X = CH2 η = Ibis 18

R = Phosphat, substituiertes Phosphat, Phosphoramidit, substituiertes Phosphoramidit H-Phosphonat, subsitulertes H-Phosphonat.Thiophosphat, substituiertes Thiophosphat.Phosphoramidat, substituiertes Phosphoramidat

durch Umsetzung von Fluorophoren der allgemeinen Formel Il

F-O-(XJn-YH (II)

mit der für F, X, und η erklärten Bedeutung und Y = O, S, oder NH mit üblichen Phosphorylierungs-, Phosphitylierungs- oder

H-Phosphonylierungsmitteln erhalten werden, Zur Phosphorylierung der Fluorophore wird bevorzugt p-Chlorphenyl-phosphorsäureditriazolid, zur Phosphitylierung

insbesondere N,N'-Bis-(diisopropylamino)-0-methylphosphin oder zur H-Phosphonylierung vorzugsweise

Salicoylochlorophosphit eingesetzt. In der zur Anknüpfung an Nucleoside, Nucleotide und Oligonucleotide erforderlichen Struktur entspricht das Farbstoffderivat der

allgemeinen Formel I den in der Oligonucleotidsynthese verwendeten Syntheseintermediaten und ist wie diese Verbindung analog einfach handhabbar.

Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich dadurch aus, daß ausgehend von einem nach üblichen Verfahren synthetisierten Oligonucleotid, ohne zusätzliche Ankergruppen im Kohlenhydratteil als auch in der heterocyclischen Base, die Einführung der

neuen erfindungsgemäßen Fluorophorderivate direkt im Verlauf der Oligonucleotidsynthese möglich ist.

Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich weiterhin durch eine milde Reaktionsführung aus. Die entstehenden Produkte

sind von hoher Reinheit und in hoher Ausbeute erhältlich. Die dargestellten Stoffe sind neuartig und können zur Markierung von

DNA-Sonden, Sequenzierungsprimern u.a. in der Gentechnik und Molekularbiologie, insbesondere bei der Sequenzierung von

genetischen Strukturen nach dem chemisch degradierenden oder dem Kettenabbruchverfahren zum Einsatz gebracht werden.

AusfOhrungsbelsplele Die Erfindung soll anhand von Beispielen näher erläutert werden, ohne sie zu beschränken. Beispiel 1 Darstellung des Alkylierungsreagenzes 4-Chlor-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-butanol-1

2,2g 4-ChlorbutanoM werden in 30ml absolutem Pyridin gelöst und unter Rühren 7,44g 4,4'-Dimethox»-:ritylchlorid zugegeben.

Die Mischung läßt man 4h bei Raumtemperatur rühren und stoppt anschließend durch Zugabe von · /enig Methanol. Danach

wird eingeengt, in Chloroform aufgenommen und mit Wasser gewaschen. Die organische Phase tr< cknet man über

Natriumsulfat, engt i.V. ein und codestilliert bis zur Pyridinfreiheit mit Toluen. Ausbeute 5,9g (71 % der Theorie) Beispiel 2 Darstellung des hydroxyalkylierten Farbstoffes 6-(0-hydroxybutyl)-fluoresceinmethylester

1 g Fluoresceinmethylester wird in 20ml Dimethylformamid gelöst und mit 20ml absolutem Benzen, 0,52g K2CO3,0,02g Kl und 1,64g 4-Chlor-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-butanol-1 in der angegebenen Reihenfolge versetzt. Die Reaktionsmischung läßt man 20h am Rückfluß sieden. Nach Abkühlung dampft man zunächst das Benzen und anschließend bei ca. 80⁰C das

Dimethylformamid ab. Der Rückstand wird in Chloroform aufgenommen und mehrmals mit Wasser gewaschen. Nach Trocknung der organischen Phase über Natriumsulfat wird die Lüsung unter Rühren und Kühlen mit 1%iger Trifluoressigsäure

versetzt. Nach 10min engt man ein und codestilliert den Rückstand mit Ethanol. Die Reinigung des Produktes erfolgt durch

Chromatographie an Kieselgel (Eluent Chloroform/Methanol, 9/1, v/v, Rf; 0,48) Ausbeute: 0,4g (33% der Theorie)

1H-NMR (CDC13, TMS als interner Standart):

(ppm) 1,73 (m, 4H); 2,7 (s, 1 H); 3,62 (s, 3H); 3,74 (t, 2H); 7,26 (m, 1 H)

Beispiel 3 Darstellung des Phosphoramldites

167mg F-(CH2)4-OH (F = Fluoresceinmethylester) werden in 20ml absolutem Methylenchlorid gelöst und unter Rühren mit 28mg Dilsopropylammonlumtetrazolid und 0,12ml Bis(diisopropylaminomethoxyphosphin versetzt. Man läßt 1 h bei

Raumtemperatur rühren. Danach wird auf 50ml verdünnt und mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung und Wasser

gewaschen. Nach Trocknung der organischen Phase über Natriumsulfat engt man ein und trocknet im Ölpumpenvakuum über

Phosphorpentoxid. Ausbeute: 200mg (81 % der Theorie) Beispiel 4 Darstellung des Phosphates

100mg F-(CH 2)4-OH (F = Fluoresceinmethylester) werden dreimal mit je 10ml absolutem Dioxan kodestilliertund in 12ml

Dioxan aufgenommen. Zu dieser Lösung gibt man 0,5ml Lutidin und 1 ml einer einmolaren Lösung von Salicoyiochlorophosphit

in absolutem Dioxan. Nach einer Stunde wird 1 ml Wasser addiert und weitere 30 min gerührt. Die Reaktionslösung wird zur

Trockne eingeengt. Der Rückstand wird in Chloroform aufgenommen und mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung,

einmolarem Triethylammoniumhydrogencarbonatpuffer (pH 8) und Wasser in der angegebenen Reihenfolge gewaschen. Nach

Trocknen der organischen Phase mit Natriumsulfat, Filtration und Einengen wird das Phosphonat im Vakuum über Phosphorpentoxid getrocknet. Dünnschichtchromatographie (Chloroform/Methanol 9/1 v/v) Rf = 0,3 Beispiel 5 Darstellung des S-O-ß-Hydroxyethyl-fluoresceinmethylesters

1 g (2,9mmol) Fluoresceinmethylester werden mit 0,968g (5,8mmol) Essigsäure-ß-brommethylestor und 1,3g Silber(l)oxid in 50 ml Acetonitril drei Stunden am Rückfluß gekocht. Die Lösung wird nach Abkühlen filtriert und eingeengt. Das Rohprodukt wird über Säulenchromatographie an Kieselgel (Eluent Chloroform/Methanol: 98/2, v/v) gereinigt.

Vom so erhaltenen S-O-IAcetyl-ß-hydroxyethyOfluoresceinmethylester wird die Acetylgruppe mit 10 ml Chlorwasserstoff-Methanol (4 g HCI pro Liter) im Verlauf von 2 h abgespalten.

Das Produkt kann wie im Beispiel 3 phosphitlliert bzw. wie im Beispiel 4 phosphonyliert werden. Massenspektrum: M (m/e:402)

Claims (1)

1. Verfahren zur Herstellung neuer Fluorophorderivate, dadurch gekennzeichnet, daß Fluorophore der allgemeinen Formel Il

F-O-(XJn-YH (II)

mit F = fluoreszierender Farberstoff

X = CH2

η = Ibis 18

Y = O, NH oder ü

mit üblichen Phosphorylierungs-, Phosphitylierungs- bzw. Phosphonylierungsmitteln nach bekannten Verfahren zu Verbindungen der allgemeinen Formel I