DD287055A5 - Verfahren zur induzierten herstellung von 11 beta-17 alpha, 21-trihydroxypregnan-3,20-dion-verbindungen - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur induzierten Herstellung von Ungesaettigten 11b,17a,21-Trihydroxy-pregnan-3,20-dion-Verbindungen. Sie verfolgt das Ziel, diese Glukokortikoide in verbesserter Weise herzustellen. Die diesem Ziel zugeordnete Aufgabe wird durch mikrobielle Transformation der entsprechenden 11-Desoxy-Steroide (Substrate), d. h. der 17a,21-Dihydroxy-pregn-4-en-3,20-dion-Verbindungen sowie der zugehoerigen 1,4-Dien-Verbindungen, in der Weise geloest, dasz ein zur 11b-Hydroxylierung befaehigter Mikroorganismus in einem Medium, dem vor oder mit der Substratzugabe ein Induktor in Form einer in C22-Stellung mit Dicarbonsaeuren veresterten und im Ring A ungesaettigten 22-Hydroxy-bisnorcholan-3-on-Verbindung oder in Form eines Oxims einer im Ring A ungesaettigten und in C22-Stellung eine freie, veretherte oder veresterte Hydroxy- oder eine freie bzw. veresterte Carboxygruppe-tragenden Bisnorcholan-3-on-Verbindung bzw. in Form eines Oxims des Progesterons beigefuegt worden ist, fermentiert wird. Bei verfahrensgemaeszem Vorgehen kann eine hohe Glukokortikoid-Ausbeute erreicht werden, wobei die Induktoren sowie deren mikrobielle Abbauprodukte aus dem Produktgemisch wieder vollstaendig entfernt werden koennen.{11b-Hydroxylierung; mikrobielle Transformation; Mikroorganismengattungen Curvularia, Cocholiobolus; aerobe Fermentation; Hydroxylierung von Pregnanderivaten; Kortikoide; Induktion; Abtrennung des Induktors}

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur induzierten Herstellung von ungesättigten 11 ß,17 ,21-Trihydroxy-pregnan-3,20-dion-Verbindungen. Diese 11-Desoxy-Verbindungen sind auf chemischem Wege aus Diosgenin und aus Produkten des mikrobiellen Seitenkettenabbaues von Sterolen zugänglich. Die mikrobiell gewonnenen Vorstufen besitzen häufig schon die für die pharmakologischc Wirkung der Glukokortikoide wichtige 1 (2)-Doppe>bindung. Gluokokortikoide sind als Wirkstoffe mit antiinflammatorischer, antirheumatischer und antiallergischer Wirkung in die Humantherapie eingeführt. Das Anwendungsgebiet der Erfindung liegt in der pharmazeutischen Forschung und Industrie.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik Es ist bekannt, daß Glukokortikoide vom Typ der 11 ß-Hydroxy-1,4-dien-3-oxo-Verbindungen allgemein durch mikrobielle Hydroxylierung aus den entsprechenden 4-En-3-oxo-Steroiden herstellbar sind. Wegen des geringeren Umsatzes bzw. der Ausbeuteverringerung bei der mikrobiellen 11 ß-Hydroxylierung in Gegenwart der 1,4-Dien-Struktur wird die 1(2)· Doppelbindung im Verlauf der Synthese in einer zweiten mikrobiellen Reaktion als letzter Schritt eingeführt (H. J. Rehm and G.D.Reed, Biotechnology, Vol. 6a; Verlag Chemie, Weinheim 1984, Chapter 2 .Steroids"; Ed.: L.LSmith). In den Fällen, in denen bei der 11 ß-Hydroxylierung von 1,4-Dien-Verbindungen ausgegangen wurde, konnte der Substratumsatz

- wie in einer zwischenzeitlichen Verfahrenslösung bereits dargelegt - durch die Anwendung spezieller Induktoren von 0,5g/lauf 2g/l bei 79% Ausbeute gesteigert werden.

Diese technische Lösung besitze jedoch den Nachteil, daß der Induktor und/oder die mikrobiellen Umwandlungsprodukte des Induktors im Neutralteil der chemischen Aufarbeitung erscheinen und damit das Glukokortikoid-Endprodukt verunreinigen. Ziel der Erfindung

Das Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, in verbesserter Weise aus Sterolen Glukokortiode der allgemeinen Formel Il (s. Formelschema) herzustellen.

Darlegung des Wesens der Erfindung Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein verbessertes mikrobielles Verfahren zur Herstellung von ungesättigten 11 ß,17

^i-Trihydroxy-pregnan-S^O-dion-Verbindungen (wiez.B. die 1,4-Dehydro-Verbindung Prednisolon) zu beschreiben, das diese

Produkte bei hohem Steroldurchsatz, effektiver Sterolverwertung und wesentlich kürzeren Fermentationszeiten in hohen Ausbeuten liefert. Erfindungsgemäß wird das Verfahren in seinem Grundzug wie folgt durchgeführt:

11-Desoxy-Steroide (Substrate), d.h. die 17 ,21-Dihydroxy-pregn-4-en-3,20-dion-Verbindungen sowie die zugehörigen 1,4-

Dien-Verbindungen werden unter Einsatz eines zur 11 ß-Hydroxylierung befähigten Mikroorganismus aus einer der Mikroorganismengattungen Curvularla,Cochollobolus,Abs!dia,Cunnighamella oder Tieghemella und unter Verwendung eines Induktors fermentiert, wobei vor oder mit der Substratzugabe der Induktor in Form einer in C₂₂-Stellung mit einer Dicarbonsäure

veresterten und im Ring A ungesättigten 22-Hydroxy-bisnorcholan-3-on-Ve»bindung oder in Form eines Oxims einer im Ring Aungesättigten und in C₂₂-Stellung eine freie, veretherte oder veresterte Hy. iroxy- oder eine freie bzw. veresterte Carboxygruppetragende Bisnorcholan-3-on-Verbindung bzw. in Form eines Oxims des Progesterons entsprechend der allgemeinen Formel Izugesetzt wird. Nach Beendigung der Fermentation wird entweder aus der alkalisch eingestellton Kulturflüssigkeit das jeweiligeungesättigte 11 ß17 ^i-Trihydroxy-pregnan^O-dion direkt isoliert oder bei der Gewinnung aus der sauren Kulturflüssigkeitder Induktor durch eine alkalische Behandlung entfernt.

Im weiteren Ausbau des Verfahrens wird zur 11 ß-Hydroxylierung der im Zusammenhang mit früheren Anmeldungen des Zentralinstitüts bereits hinterlegte Stamm Cochllobulus lunatus m 118, der in der Hinterlegungsstelle für Mikroorganismen der DDR, ZIMET der AdW, Beutenbergstr. 11, Jena, DDR - 6900, unter der Hinterlegungsnummer ZIMET 43797 deponiert ist,

eingesetzt. Als Induktor wird entweder eine in C₂₂-Stellung mit einer Dicarbonsäure veresterte und im Ring A ungesättigte22-Hydroxy-bisnorcholan-3-on-Verbindung oder ein 3-Carboxymethoxim einer im Ring A ungesättigten und in C₂₂-Stellung einefreie, veretherte oder veresterte Hydroxy- oder eine freie bzw. veresterte Carboxygruppe-tragendo Bisnorcholan-3-on-

Verbindung Zugesetzt. Besonders vorteilhaft wird a¹ .iuktor das Hemisuccinat des 22-Hydroxv-bisnorchol-4-en-3-ons oder des 22-Hydroxy-

bisnorchola-1-4-dien-3-ons oder ein 3-Carboxymethoxim des 22-Hydroxybisnorchol-4-en-3-ons oder des 22-

Hydroxybisnorchola-1,4-dien-3-or λ bzw. des 22-Carboxybisnorchol-4-en-3-ons oder des 22-Carboxybisnorchola-1,4-dien-3-ons

zugesetzt.

Bei verfahrensgemäßem Vorgehen wird eine hohe Glukokortikoid-Ausbeute (vgl. Ausführungsbeispiele) durch den Einsatz der

gewählten Induktorderivate erreicht, wobei die Induktoren sowie deren mikrobielle Abbauprodukte aus dem Produktgemischwieder vollständig entfernt werden können.

Ausfiihrungsbelsplele Die nachfolgenden Beispiele sollen das erfindungsgemäße Verfahren erläutern, ohru es in irgendeiner Weise einzuschränken. Beispiel 1

Herstellung von Prednisolon aus 17 •Acetoxy-21-hydroxy-pregna-1,4-dien-3,20-dion in Schüttelkulturen Mit einer Lyophilkonserve des Stammes Cochllobutut lunatus m 118, gelöst in 1,5ml Aqua de3t., werden Hafermehl-Agar-Eprouvetten beimpft (Hafermehl 2,0%, Agar 2,0%, pH natursauer) und 11 Tage bis 14 Tage bei 29⁰C inkubiert. Mit 5ml Aqua dest. wird das versporte Mycel einer Eprouvette abgeschwemmt und zur Beimpfung von 500-ml-Rundkolben a 50ml Vorkulturmedium 1:30g Glucose, 5g Maisquellwasser lyophilisiert, 2g NaNO₃,1 g KH₂PO₄,2g K₂HPO₄,0,5g MgSO₄ x 7H₂O, 0,02g FeSO₄ x 7H₂O und 0,5g ZnCI₁ je 1000ml Aqua dest. (pH) 6,7). Nach einer Inkubation von 70 Stunden bei 28°C auf einer Rotationsschüttelmaschine (180U/min) werden mit dieser Submerskultur im Verhältnis 1:10 500-ml-Rundkolben a 60ml bzw. 2-l-Steilbrustflaschen mit Impfstutzen a 200ml Vorkulturmedium Il (VK II: Glucose 2%, Maisquellwasser lyophilisiert 2%, FeSO₄ x 7 H₂O 0,002%, pH 6,0) mit dieser zweiten submersen Vorzuchtstufe im Verhältnis 1:10. Mit je 5 ml der zweiten submersen Vorzuchtstufe werden 40 500-ml-Rundkolben beimpft. Sofort danach werden 50mg 20S-Hydroxy-bisnorchola-1,4-dien-3-carboxymethoxim, gelöst in 0,2ml Methanol, je Rundkolben zugegeben. Nach 6 Stunden Schütteln auf einer Rotationsschüttelmaschine (240 U/min) bei 28⁰C erfolgt je Rundkolben die Zugabe von 100 mg 17 -Acetoxy-21-hydroxypregna-1,4-dien-3 20-dion, gelöst in 0,75ml Methanol/Aceton im Volumenverhältnis 1:1 (v:v). Nach 48stündiger Fermentation wird der pH-Wert der Kulturlösung mit in-Natronlauge auf pH 8,5 eingestellt, 3mal mit Chloroform extrahiert, die Extrakte mit Wasser neutral gewaschen und bis zur Kristallisation eingeengt, wobei 3,28g Prednisolon erhalten werden (88% d.Th.).

Beispiel 2 Herstellung von Prednisolon-17-Acetat aus 17 -AcetoxY-21-hydroxy-pregna-1,4-dien-3,20-dionimLaborfermentor Eine Vorkultur von des Mikroorganismus C. lunatus mit 118 wird unter den Bedingungen des Beispiels 1 angezüchtet. Zur Fermentation wird ein Lüborfermentor mit einer Füllung von 21 Fei mentationsmedium gemäß Beispiel 1 benutzt. Die Beimpfung

geschieht mit 200ml VK Il aus einer 2-l-Steilbrustflasche, die Induktion mit 0,25g 20S-Hydroxy-bisnorchola-1,4-dien-3-carboxymethoxim gelöst in 5ml Methanol. Die Substratzugabe erfolgt gestaffelt:

2Λ g 17 -Acetoxy-2'i-hydroxy-pregna-1,4-dien-3,20-dion werden unmittelbar nach der Beimpfung und die gleiche Menge nocheinmal nach 12 Stunden, gelöst in 12 ml Aceton, zu der Kulturlösung hinzugegeben. Der Fermentation wird bei 28°C, 620U/minund einer Belüftung von 11 Luft/l Kulturlösung insgesamt 30 Stunden bei pi\ 4,5 durchgeführt. Die Kulturlösung wirdanschließend dreimal mit Chloroform extrahiert, die Extrakte eingoengt und aus Ethylacetat kristallisiert. Man erhält 3,9g

Prednisolon-17-Acetat (75% d.Th.).

BeUpIeO

Herstellung von Prednltolon aus 17 -Acetoxy-21 -hydroxy-pregna-1,4-dlen-3,20-dion unter Verwendung eines C₂₂-Alkohol-Hemlsuccinates als Induktor

Unter den Bedingungen des Beispiels 1 wird die Hauptkultur 6 Stunden mit 0,1 g/l des 22-Hemisucinats des 22-Hydroxybisnorchola-1,4-dien-3-ons induziert, in ober beschriebener Weise fermentiert, bei pH 10,5 extrahiert und das gebildete Prednisolon aufgearbeitet. Es werden 83,9% reines Prednisolon gewonnen.

R, = O; N-O-R,

R₂ = 0!CH₂OR₄JCOORe

R₃ = H;C_nH_2nCOOH,n = 1-8

R₄ = H; CO(CH₂J_nCOOH, η = 0,1,2; Alky I oder eine andere Äthergruppierung

R₆ = H; Alkyl

CmC Einfach-oder Doppelbindung

Λ/C

CmC Einfach-oder Doppelbindung A, B und C = M; OH; Cl; F; CHj R = Struktur Ila oder Mb	H2C-O-X	H; Acyl Alkyl H; Alkyl	H2	•	,C-O
Ha	I "
Il 11 B X> Nl

0-Y

Claims (5)

1. Verfahren zur induzierten Herstellung von ungesättigten 11ß,17 ^i-Trihydroxy-pregnan-S^O-dion-Verbindungen auf mikrobiologischem Wege aus 11-Desoxy-Steroiden (Substrate) unter Einsatz eines zur 11 ß-Hydroxylierung befähigen Mikroorganismus aus einer der Mikroorganismengattungen Curvularia, Cocholipbolus, Absidia, Cunnlghamella oder Tieghemella sowie unter Einsatz von Induktoren, gekennzeichnet dadurch, daß man

- vor oder mit der Substratzugabe einen Induktor

_ · in Form einer in C₂2-Stellung veresterten und im Ring A ungesättigten 22-Hydroxybisnorcholan-3-on-Verbindungoder

• in Form eines Oxime einer im Ring A ungesättigten und in C₂j-Stellung eine freie, veretherte oder veresterte Hydroxy- oder eine freie bzw. veresterte Carboxygruppe-tragende Bisnorcholan-3-on-Verbindungoder

• in Form eines Oxims des Progesterons entsprechend der allgemeinen Formel I zusetzt und

- nach Beendigung der Fermentation entweder aus der alkalisch eingestellten Kulturflüssigkeit das jeweilige ungesättigte 11 ß,17 ,21-Trihydroxy-pregnan-3,20-dion direkt isoliert oder bei der Gewinnung aus der sauren Kulturflüssigk~it den Induktor durch eine alkalische Behandlung entfernt.

2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß man als Induktor eine in C₂₂-Stellung mit einer Dlcarbonsäure veresterte und irn Ring A ungesättigte 22-Hydroxy-bisnorcholan-3-on-Verbindung zusetzt.

3. Verfahren nach Punkt 2, gekennzeichnet dadurch, daß man als Induktor das Hemisuccinat des 22-Hydroxy-bisnorchol-4-en-3-ons oder des 22-Hydroxy-bisnorchola-1,4-dien-3-ons zusetzt.

4. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß man als Induktor ein 3-Carboxymethoxim einer im Ring A ungesättigten und in C₂j-Stellung eine freie, veretherte oder veresterte Hydroxy- oder ei he freie bzw. veresterte Carboxygruppe-tragende Bisnorcholan-3-on-Verbindung zusetzt.

5. Verfahren nach Punkt 4, gekennzeichnet dadurch, daß man als Induktor ein 3-Carboxymethoxim des 22-Hydroxybisnorchol-4-en-3-ons oder des 22-Hydroxybisnorchola-1,4-dien-3-ons bzw. des 22-Carboxybisnorchol-4-en-3-ons oder des 22-Carboxybisnorchola-1,4-dien-3-ons zusotzt.