DD290216A5 - Verfahren zur herstellung von prednisolon - Google Patents
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Prednisolon aus 1-Dehydro-11-desoxy-steroiden. Es ist dadurch charakterisiert, dasz die Ausgangsstoffe, die in 17-Stellung verestert sind und die in anderen Positionen acylierte Hydroxylgruppen enthalten koennen, mit Pilzen der Gattungen Cochliobulus lunatus 148, Absidia orchidis 409 und Absidia coerula 468 hydroxyliert und verseift werden, wobei die Fermentation nach vollendeter Hydroxylierung in einem Wasserstoffionenkonzentrationsbereich von 7 bis 9 durchgefuehrt wird.
Description
Cochliobulus lunatus 148
Absidiaorchidis409
Absidiscoerula468
verwendet werden.
3. Verfahren zur Herstellung vor. Prednisolon nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Fermentation nach vollendeter Hydroxylierung vorzugsweise in einem Wasserstoffionenkonzentrationsbereich von 7,4 bis 8,4 durchgeführt wird.
Gegenstand dor Erfindung ist die mikrobieile Transformation von 11-Desoxy-1,4-dien-steroiden der Pregnanreihe zu den entsprechenden 11 ß-Hydroxy-Derivsten. Steroide mit der funktioneilen 11 ß-Hydroxylgruppe dienen als Arzneimittel zur Behandlung der rheumatischen Arthritis, des Asthmas, von Dermatosen und anderen Krankheiten. Erst die mikrobieile Hydroxylierung zur Einführung einer OH-Gruppe in die 11 -Position des Pregnangerüstes gestattet die wirtschaftliche Herstellung der Glukokortikoide.
Charakteristik der bekannten technischen Lösungen
Von den seit 1952 bekannten Steroidtransformationen am Pregnangerüst besitzt die 11 ß-Hydroxylierung nach wie vor die größte Bedeutung. Als geeignete Mikroorganismen sind aus der Literatur die Arten Cunninghamella
Curvularia
Trichothecium und
Absidia bekannt.
So wird beispielsweise in den DE-PS1618599,2803660 und 2803661 die selektive 11 ß-Hydroxylierung von Steroiden beschrieben.
Es gelang unter Berücksichtigung der Substratspezifität der befähigten Mikroorganismen durch Abwandlung bzw. Substitution des Ausgangsmaterials hohe Ausbeuten an 11 ß-Hydroxylierungsprodukten zu erhalten (ca. 88 Gewichtsprozente). Als Mikroorganismen wurden Cuivularia-Arten eingesetzt, die bei konventionellen Bedingungen der Kulturführung und bei Reichsteins Substanz S als Ausgangssteroid unerwünschte Nebenprodukte (7,14-hydroxylierte Verbindungen gemäß US-PS2 783255) mit einer Ausbeute von weniger als 40% bilden.
Ziel der Erfindung
Das Ziel der Erfindung besteht darin, mit ausgewählten Mikroorganismen bei kontinuierlicher oder semikontinuierlicher Fermentationsführung dio Nachteile der beschriebenen technischen Lösungen bei der 11 ß-Hydroxylierung von Steroiden der Pregnanreihe zu überwinden, wobei solche Pilze eingesetzt werden sollen, die schnellwüchsig sind, in wenigen Stunden die logarithmische Wachstumsphase abschließen und in der stationären Phase bei Zuckerlimitation die Mycelform der Pellets bilden. Dabei sollen die eingesetzten Pilze in ihrem Enzymbesteck neben Hydroxylasen Esterasen besitzen, die bei den eingestellten Kulturbedingungen die Verseifung der Steroide der Pregnanreihe bewirken, damit eine nachfolgende chemische Verseifung entfallen kann. Die Pilze müssen bei F.insatz von 11-Desoxy-1,4-dien-steroiden einen hohen Steroiddurchsatz garantieren, wobei vorwiegend in 17-Stellung substituierte Steroide als Ausgangssubstanzen dienen sollen, die Zahl und Menge der Nebenprodukte gering sein und ihr Vorkommen bei der Isolierung nicht stören soll.
-2- 290 216 Darlegung des Wesens der Erfindung
Mit der Erfindung wird die Aufgabe gelöst, mit ausgewählten Mikroorganismen 11-Desoxy-1,4-dien-steroide wirtschaftlich zu Prednisolon zu transformieren.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Prednisolon ist dadurch gekennzeichnet, daß 11-Desoxy-1,4-diensteroide, die in 17-Stellung verestert sind und die in anderen Positionen acylierte Hydroxylgruppen enthalten können, mit Pilzen hydroxyliert und verseift werden, wobei die Fermentation nach vollendeter Hydroxylierung in einom Wasserstoffionenkonzentrationsbereich von 7 bis 9 geführt wird.
Es wurde überraschenderweise gefunden, daß speziell die Arten der Gattungen
Cochlibulus lunatus 148 Absidia orchidis 409 und Absidia coerula468
zur Einführung einer Hydroxylgruppe in die 11 ß-Stellung befähigt sind, wenn die oben genannten Verbindungen als Ausgangsmaterial dienen. Die als geeignet befundenen Pilze besitzen außerdem Esterasen, so daß die Ester, vorzugsweise Acetate der 11-Desoxy-1,4-dien-steroide als A'.isgangssubstanz dienen können.
Dabei wurde gefunden, daß die Transformation zur Einführung einer 11 ß-Hydroxylgruppe in der stationären Wachstumsphase bei einer Wasserstoff ionenkonzentration von pH 4,8 bis 5,3, die anschließende Verseifung bei pH 7 bis 9, vorzugsweise 7,4 bis 8,4 unter streng aeroben Bedingungen vorgenommen werden muß (pO2-Sättigung darf 30% nicht unterschreiten). Die Phase der optimalen 11 (3-Hydroxylierung ist erreicht, wenn mit den bekannten analytischen Methoden
- keine Kohlenhydrate
- kein organischer und anorganischer Stickstoff
mehr nachzuweisen ist und die Wasserstoffionenkonzentration einen pH-Wert von 4,8 bis 5,3 erreicht hat. Der pH-Wert wird durch Titration mit Säuren, vorzugsweise Schwefelsäure bei pH4,8 bis 5,3 gehalten. Die Hydroxylierungsreaktion ist streng sauerstoffbedürftig, der Durchsatz an Ausgangssteroid wird durch das Sauerstoffangebot limitiert.
Die Ausgangssubstanzen werden mikronisiert oder in Lösungsmitteln wie Aceton, Dimethylformamid-Wasser-Gemisch, Ethanol oder methanolischer Calciumchlorid-Lösung gelöst zugegeben. Die Zugabe kann einerseits während des Ruhestadiums der Submerskultur erfolgen, andererseits ist es möglich, beim optimalen Mycelstadium die Biomasse von der Kulturlösung abzutrennen und die Pellets in ein isotonisches Medium zu resuspendieren.
Für die Erfindung sind durch die Wahl des Mikroorganismus, eines Pilzes der Gattungen Absidia und Cochliobulus, des Nährmediums und der Fermentationsführung Bedingungen gegeben, die hohe Ausbeuten von 11 ß-hydroxylierten Verbindungen gestatten. Es wurden vollständige Transformationen der 11-Desoxy-i ,4-dien-steroide der Pregnanreihe erzielt.
Durchsätze von 0,5g bis 1,5g Ausgangssubstanz/l Kulturlösung sind möglich.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird an folgenden Ausführungsbeispielen erläutert:
Ausführungsbeispiele
Herstellung von Prednisolon aus 17-Acetoxy-21-hydroxy-pregna-1,4-dien-3,20-dion mit Cochliobulus lunatus 101 Nährlösung folgender Zusammensetzung
| Glucose | 1% |
| Maisquellwasser | 2% |
| KH2PO4 | 0,0025% |
| MgSO4 · 7 H2O | 0,02% |
| Sonnenblumenöl | 0,005% |
| AntaphronR | 0,005% |
| Aqua dest. | |
| pH-Wert | 5,0 bis 5,: |
werden in einem 15-l-Laborfermenter 35 min bei 1200C sterilisiert. Bei 300C wird mit 11 Impfmedium, das auf dem gleichen Nährboden 46 Stunden bei 200C in Kulturflaschen auf einer Rotationsschüttelmaschine (240 U/min) gewachsen ist, inoculiert.
Nach einer Wachstumsphase von 8 bis 14 Stunden (Rührung 620U/min, Belüftung 11 Luft/l Kulturlösung, Temperatur 290C ± 0,50C) ist eine Mycelbildung von 15 bis 17,5% Biomasse (3000 U/min, 3min lang) erreicht und ein pH-Wert von 4,8 bis 5,2 in der Kulturlösung gegeben.
Die Zugabe von 10g 1-Dehydro-RSS-17-acetat, gelöst in 500ml methanolischer CaCI2-Lösung, erfolgt ab der
8. Fermentationsstunde kontinuierlich über einen Zeitraum von 12 Stunden. In der Regel ist bei Einhaltung des Fermentationsregimes 24 bis 36 Stunden nach abgeschlossener Zugabe die Transformation vollzogen.
Der Transformationsverlauf wird mit dünnschichtchromatographischen Methoden verfolgt. Er ist beendet, wenn keine Ausgangssubstanz mehr nachweisbar ist.
Nach vollständigem Umsatz wird der Versuch aufgearbeitet:
Nach Abfiltrieren des Mycets wird das Kulturfiltrat dreimal mit 0,8 Vol.-% iMethylenchlorid extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte werden im Vakuum eingeengt und das erhaltene Öl in 300ml Essigester gelöst und von unlöslichen Bestandteilen abgetrennt. Der organische Extrakt wird dreimal mit 150ml 0,1 N NaOH, anschließend mit Wasser bis zur neutralen Reaktion
gewaschen, über Natriumsulfat getrockn 3t und bis zur beginnenden Kristallisation eingeengt. Nach 18 Stunden bei 5°C wird das
kristallisierte Produkt abgetrennt und getrocknet. Man erhält so 7,3 eines Kristallgemischs, das neben geringen Verunreinigungen im wesentlichen Prednisolon enthält.
Das Kristallgemisch wird in 600ml Methanol bei Raumtemperatur gelöst. Nach Sättigung mit Stickstoff werden 520mg KOH zugegeben, und es wird 40min bei Raumtemperatur gerührt. Die entstandene klare Lösung wird mit 1N Essigsäure neutralisiert und mit 4 g Aktivkohle verrührt. Nach dem Filtrieren und Einengen der Reaktionslösung wird aus 6 ml Chloroform umkristallisiert. Das erhaltene Produkt besteht aus 6,5g Prednisolon mit einer Ausbeute von 70%.
Hersteilung von Prednisolon aus 17a,21-(1'-Ethoxy-ethyliden-dioxy)-pregna-1,4-dien-3,20-dion (17a,21-Orthoester) mit Cochliobulus lunatus
Eine in einem 2,5-l-Erlenmeyer-Kolben enthaltene Nährlösung folgender Zusammensetzung
| Glucose | 1% |
| Maisquellwasser | 2% |
| MgSO4-7 H2O | 0,002% |
| KH2PO4 | 0,0075% |
| Aquadest. | |
| pH | 5,0 bis 5,: |
wird mit 10% einer 22 Stunden alten Kulturlösung beimpft, die wie folgt gewonnen wurde: Aus einer Sporen-Iyophil-Konserve des Stammes Cochliobulus lunatus wird durch Zugabe von physiologischer Kochsalzlösung eine Suspension und mit je 0,5ml davon eine submerse Vermehrungspassage im 500ml Erlenmeyer-Kolben angelegt. Die Nährlösung hat dabei folgende Zusammensetzung:
| Glucose | 2,5% |
| Maisquellwasser | 0,5% |
| Pepton | 0,25% |
| NaNO3 | 0,12% |
| KH2PO4 | 0,01 % |
| MgSO4 · 7 H2O | 0,002% |
| Aqua dcst. | |
| pH | 6,5 bis 6 |
Die erste submerse Vorzuchtstufe des Stammes Cochliobulus lunatus wird 64 bis 68 Stunden bei 260C ± 0,50C auf einer Rotationsschüttelmaschine, wie bei Beispiel 1 beschrieben, kultiviert. 10ml der ersten Vorzuchtstufe dienen zum Beimpfen der zweiten Vermehrungspassage (250ml Nährlösung im 2,5-L-Erlenmeyer-Kolben). Die Nährlösung hat folgende Zusammensetzung:
| Glucose | 1,5% | 22 bis 24 Stunden. |
| Maisquellwasser | 1% | |
| KH2PO4 | 0,025% | |
| MgSO4 -7 H2O | 0,02% | |
| Aquadest. | ||
| pH | 6,5 bis 6,7. | |
| jcuiiiyuiiyun öiiiu. Temperatur | 26°C±0,5°C | |
| Belüftung: | ||
| Rotationsschüttelmaschine (240 U/min, Amplitude 4 cm) | ||
| Kulturzeit |
Bei folgenden Kulturbedingungen der Transformationsstufe:
Temperatur 290C ± 0,50C
Belüftung
Rotationsschüttelmaschine (240 U/min, Amplitude 4cm)
ist 8 bis 10 Stunden nach Beimpfen die Glucoselimitation erreicht und ein pH-Wert von 4,5 bis 4,8 gegeben. Zu diesem Zeitpunkt erfolgt die I.Zugabe von 125mg 17a,21-Orthoester, gelöst in 2,5ml methanolischer CaCI2-Lösung unter aseptischen Bedingungen. Dieser Prozeß wird noch dreimal wiederholt, so daß in einem Ansatz von 500 ml 500 mg 17a,21-Orthoester enthalten sind. Nach 24 bis 30 Stunden ist die Hydroxylierungsstufe b sendet, und der Fermentationsverlauf wird für weitere 16 bis 20 Stunden so gestaltet, daß eine Wasserstoffionenkonzentration von pH7,5 bis 8,5 gegeben ist, bei der die vollständige Verseifung des Prednisolonacetats zu Prednisolon erfolgt
Nach vollständigem Umsatz wird der Versuch wie f< Igt aufgearbeitet:
Das Mycel wird aus der Fermentationslösung abgo snnt und das Filtrat erschöpfend mit 3 Vol.-% Essigester extrahiert. Die vereinigten Extrakte werden unter vermindertem Druck zum Öl konzentriert und zur Entfernung unlöslicher Bestandteile in Methanol gelöst. Die filtrierte Methanollösung wird zur Trockne eingeengt, in 17 ml Chloroform gelöst und dreimal mit je 5ml einer gesättigten Natriumacetat-Lösung gewaschen. Nach dem Trocknen mit Natriumsulfat wird die Chloroformlösung mit 10ml Isopropanol versetzt und im Vakuum bis zur beginnenden Kristallisation eingeengt. Nach 24 Stunden Stehen bei 50C wird der Kristallbrei abgesaugt, mit eiskaltem Isopropanol gewaschen und getrocknet. Ausbeute: 382,6mg Prednisolon (88%)
Herstellung von Prednisolon aus 17,21-Diacetoxy-pregna-1/-dien-3,20-dion d-Dehydro-RSS-IV^I-diacetat) mit Cochliobulus lunatus
Nach Beispiel 2 werden einer 10 Stunden alten Kultur von Co'hliobulus lunatus 500mg 1-Dehydro-RSS-17,21 -diacetat portionsweise zugesetzt. Dieser Ansatz wird wie folgt aufgearbeitet:
Die Kulturlösung wird filtriert und das Filtrat dreimal mit 2,5Vo,' ·% Butyiacetat extrahiert. Die vereinigten Extrakte werden unter vermindertem Druck zum Öl eingeengt und in 22 ml Chloroform gelöst, dem 4Vol.-% Methanol zugesetzt wurden. Die Lösung wird zur Abtrennung der Nebenprodukte über eine Kieselgelsäuie ipgeben. Aus der Hauptfraktion erhält man beim Einengen 290,2mg Prednisolon als weiße Kristalle (Ausbeute 69%).
Herstellung von Prednisolon aus 17,21-Dihydroxy-pregna-1,4-dien-3,20-dion (1-Dehydro-RSS) mit Cochliobulus lunatus Nach Beispiel 2 werden einer 10 Stunden alten Kulturvon Cochliobulus lunatus 125mg 1-Dehydro-RSS zugegeben. Nach 72 Stunden wird dünnschichtchromatographisch 52% Prednisolon gebildet. Zwei stärker polare Produkte als Prednisolon liegen zu 18% vor, daneben st noch 17%der Ausgangssubstanz vorhanden.
Herstellung von Prednisolon aus 17a,21-(1'-Ethoxy-ethyliden-dioxy)-pregna-1,4-dien-3,20-dion (17a,21-Orthoester) mit Absidia orchidis409
2,5-l-Steilbrustflaschen mit 500ml Nährlösung folgender Zusammensetzung:
| Glukose | 1,5% |
| Maisquellwassar (Trockengewicht) | 0,3% |
| Pepton für bakt. Zwecke | 0,2% |
| MgSO4 | 0,025% |
| KH2PO4 | 0,025% |
| Aqua dest auf | 11 |
| pH | 5,0 bis 5,2 |
wurden mit 10% einer 22 Stunden alten Kulturlösung beimpft, die wie folgt gewonnen wurde: Aus einer Sporen-Iyophil-Konserve des Stammes Absidia orchidis wird durch Zugabe physiologischer Kochsalzlösung eine Suspension bereitet und mit je 0,5ml davon wird eine submerse Vermehrungspassage in 500ml Erlenmoyer-Kolben beimpft. Die Nährlösung hat folgende Zusammensetzung:
| Glucose | 0,5% |
| Maisquellwasser (Trockengewicht) | 1,5% |
| Pepton | 0,1 % |
| Aqua dest. auf | 11 |
| pH | 5,2 bis 5,4. |
Die submerse Vorzuchtstufe wird 22 Stunden bei 25°C auf einer Rotationsschüttelmaschine kultiviert (240 U/min, Amplitude 4cm).
Die Kulturbedingungen der Transformationsstufe entsprechen denen der Vorzuchtstufe. Nach 34 bis 36 Stunden Wachstum hat sich das Mycel in Form von Pellets entwickelt. Der Feuchtmycelgehalt beträgt 15 bis 17,5% (3000U/min, über 3min). Zu diesem Zeitpunkt erfolgt die I.Zugabe in Form von 125mg 17a,21-Orthoester gelöst in 2,5ml ammoniakalischerMethanollösung. Dieser Prozeß v: j noch dreimal wiederholt. 24 bis 30 Stunden nach der letzten Zugabe ist die Hydroxylierung vollständig, und es werden die Fermentationsbedingungen für die biologische Verseifung eingestellt: Belüftung: 1,51 Luft/l Kulturlösung, pH-Wert 7,5 bis 8,5, Temperatur 28°C. 18 bis 22 Stunden währt der Verseifungsprozeß. Das gebildete freie Prednisolon wird, wie bei Beispiel 2 beschrieben, isoliert und rein gewonnen.
Herstellung von Prednisolon aus 17a,21 -Orthoester mit Absidia coerula 468
Wird nach Beispiel 5 anstelle der Absidia orchidis dor Pilz Absidia coerula 468 eingesetzt, so wird unter denselben Bedingungen Prednisolon erhalten.
Herstellung von Prednisolon aus 17a-Monoacetat und 17a,21-Diacetat der 1-Dehydro-RSS mit Absidia orchidis 409 und Absidia coerula 468
Dienen das 17a-Monoacetat bzw. das 17a,21 -Diacetat der 1-Dehydro-RSS für die Pilze Absidia orchidis 409 und Absidia coerula 468 als Ausgangsmaterial und man verfährt wie bei Beispiel 5 beschrieben, so wird Prednisolon in einer Bildungsweise von 75 bis 85% erhalten.
Claims (2)
1. Verfahren zur Herstellung von Prednisolon aus i-Dehydro-11-desoxy-steroiden, dadurch gekennzeichnet, daß die Ausgangsstoffe, die in 17-Stellung verestert sind und die in anderen Positionen acylierte Hydroxylgruppen enthalten können, mit Pilzen hydroxyliert und verseift werden, wobei die Fermentation nach vollendeter Hydroxylierung in einem Wasserstoffionenkonzentrationsbereich von 7 bis 9 geführt und anschließend in bekannter Weise das Prednisolon isoliert wird.
2. Verfahren zur Herstellung von Prednisolon nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur mikrobiellen Transformation die Pilze
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD28160785A DD290216A5 (de) | 1985-10-10 | 1985-10-10 | Verfahren zur herstellung von prednisolon |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD28160785A DD290216A5 (de) | 1985-10-10 | 1985-10-10 | Verfahren zur herstellung von prednisolon |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DD290216A5 true DD290216A5 (de) | 1991-05-23 |
Family
ID=5572056
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DD28160785A DD290216A5 (de) | 1985-10-10 | 1985-10-10 | Verfahren zur herstellung von prednisolon |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DD (1) | DD290216A5 (de) |
-
1985
- 1985-10-10 DD DD28160785A patent/DD290216A5/de not_active IP Right Cessation
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