DD287949A5 - Verfahren zur herstellung von verbindungen mit biologischer aktivitaet - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Verbindungen mit biologischer Aktivitaet. Biologisch aktive Verbindungen werden an wasserloesliche Polyoxyalkylenglykole und ihre Monoalkoxyether mit primaeren, aromatischen Aminogruppen nach deren Aktivierung durch Diazotierung kovalent gebunden. Die Kupplungsreaktionen werden in waeszrigen Loesungen, organischen Loesungsmitteln oder Gemischen beider durchgefuehrt. Die Reaktionstemperaturen liegen bei 10C bis 40C, und die Reaktionsloesungen sind entweder gepufferte, vorzugsweise alkalische p H-Werte besitzende Reaktionsloesungen oder saeurebindende Mittel enthaltende Reaktionsloesungen. Die neuen Verbindungen mit biologischer Aktivitaet koennen in der Medizin, Biotechnologie und anderen Zweigen der stoffwandelnden Industrie eingesetzt werden.{Verfahren; biologisch aktive Verbindungen; kovalente Bindung; Polyoxyalkylenglykole und ihre Monoalkoxyether; loeslich; Wasser; organische Loesungsmittel; aromatische Aminogruppen; Diazotierung}
Description
Anwendungsgebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung neuer Verbindungen mit biologischer Aktivität. Das Verfahren und die neuen Verbindungen werden in der Medizin, Biotechnologie und anderen Zweigen oder stoffumwandelnden Industrie eingesetzt.
Charakteristik des bekannten Standes der Technik
Umsetzungen von biologisch aktiven Verbindungen wie Biokatalysatoren, biokatalytisch inaktiven Proteinen und synthetischen Verbindungen mit biologischen Aktivitäten mit löslichen Polymeren sind besonders in den letzten Jahren verstärkt angewandte Methoden zur chemischen Modifikation dioser Verbindungen. Besondere Bedeutung haben dabei solcherart modifizierte Proteine (Trends Biotechnol. 1986,7,190-194) und auf diese Weise erhaltene polymere Derivate und Koenzymen erlangt, bei denen zum Beispiel die Koenzyme NADH beziehungsweise NADPH an Polymere wie Dextrane, Polyethylenglykol oder Kopolymere aus Methylvinylether/Maleinsäureanhydrid kovalent gebunden wurden (DE-AS 2841414). Die Gründe für die verstärkte Zuwendung zu solchen Modifizierungsreaktionen an biologisch aktiven Verbindungen bestehen darin, daß zum einen diese modifizierten Verbindung zur Aufklärung von Struktur-Wirkungs-Beziehungen herangezogen werden können und zum anderen die Eigenschaften von zum Beispiel mit wasserlöslichen Polymeren modifizierten Proteinen oder auch Pharmaka drastisch verändert werden können, so daß sich neue und ungewöhnliche Anwendungsmöglichkeiten für diese modifizierten, biologisch aktiven Verbindungen in der Medizin und Biotechnologie ergeben.
in den letzten Jahren hat sich aber gleichzeitig herausgestellt, daß es für die Synthese' ,odifizierte, biologisch aktiver Verbindungen keine universell anwendbaren und immerzu biologisch aktiver Verbind jngen führende Modifizierungsverfahren gibt und für jede biologisch aktive Verbindung ein für sie optimales Modifizierungsverfahren gefunden und erarbeitet werden muß, um eine optimale biologische Aktivität zu erreichen.
Diese allgemeine Erkenntnis trifft auch auf die chemische Modifikation von biologisch aktiven Verbindungen mit Polyoxyalkylenglykolen oder Ihren Monoalkoxyethern zu. Für deren kovalente Bindung an biologisch aktive Verbindungen stehen zudem bisher noch vergleichsweise wenige Methoden zu Verfugung, weil einerseits die Hydroxylgruppen dieser löslichen Polymeren nur wenige Kupplungsreaktionen mit den in vielen Fällen nicht stabilen, biologisch aktiven Verbindungen erlauben und andererseits die Hydroxylgruppen oftmals mit teuren oder kompliziert aufgebauten und damit schwer herstellbaren oder oft noch toxischen Reagentien aktiviert werden müssen.
Das Ziel der Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Herstellung von neuen Verbindungen mit biologischer Aktivität zu entwickeln, das die Modifizierung biologisch aktiver Verbindungen mit Polyoxyalkylenglykolen und ihren Monoalkoxyethern einschließt, das durch die Verwendung billiger Aktivierung smittel zur Herstellung aktivierter Derivate der Polyoxyalkylenglykole und Ihrer Monoalkoxyether gekennzeichnet ist und das zu stabilen und modifizierten Derivaten von modifizierten Derivaten von biologisch aktiven Verbindungen führt, die in der Medizin, Biotechnologie und anderen Zweigen der stoffwandelnden Industrie eingesetzt werden können.
Aufgabe der Erfindung ist die Entwicklung eines Verfahrens zur Herstellung struktur!! neuer Verbindungen mit biologischer Aktivität durch Umsetzung biologisch aktiver Verbindungen mit aktivierten Polymere,, vom Typ der Polyoxyalkylenglykole oder ihrer Monoalkoxyether.
Erfindungsgemäß besteht das Verfahren zur Herstellung neuer Verbindungen mit biologischer Aktivität darin, daß in einem ersten Reaktionsschritt Polyoxyalkylenglykole oder Ihre Monoalkoxyether, in denen die Hydroxylgruppen teilweise oder vollständig durch primäre, aromatische Aminogruppen substituiert sind, In wäßrigen Lösungen oder organischen Lösungsmitteln durch Diazotierung in eine aktivierte Form überführt werden. Diese Diazotierungsreaktionen an aromatische Aminogruppen enthaltenden Derivaten der Polyoxyalkylenglykole und ihrer Monoalkoxyether werden nach an sich bekannten Methoden ausgeführt, vorzugsweise also mit salpetriger Säure durch Freisetzung dieser aus Natriumnitrit mit einer verdünnten Säure. Auf Grund des niedrigen Gehaltes an primären, aromatischen Aminogruppen im Vergleich zum überwiegenden Kohlenwasserstoffgerüst besonders bei den höhermolekularen Polymeren und wegen der guten Löslichkeit der Polymeren in organischen Lösungsmitteln können die Diazotierungareaktionon auch nach beschriebenen Methoden mit Vorteil und ohne Gefahren in organischen Lösungsmitteln wie Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid beziehungsweise Benzen oder Gemischen dieser Lösungsmittel untereinander oder Gemischen dieser Lösungsmittel mit halogenieren, aliphatischen Kohlenwasserstoffen wie Chloroform und Methylenchlorid durchgeführt werden.
In einem zweiten Reaktionsschritt- der kovalenten Verknüpfung -werden die durch Diazotierung aktiv!«, rten Derivate der Polyoxyalkylenglykole oder ihrer Monoalkoxyderivate in Lösungen eingetragen, die die biologisch aktiven Verbindungen gelöst oder suspendiert enthalten. Als biologisch aktive Verbindungen werden Biokatalysatoren wie Enzyme, mit Vorteil solche aus den Klassen der Oxidoreduktasen, Transferasen, Hydrolasen und Isomerasen, Mikroorganismen, tierische, pflanzliche und humane Zellen, Zellorganellen, synthetische Enzyme und Koenzyme oder biokatalytisch inaktive Proteine wie Antigene, Antikörper, Wachstumsfaktoren, Blutgerinnungsfaktoren, Interferone, Hemoproteine, Albumine, zuckerbindende P- Meine wie Lektine oder in vitro hergestellte Konjugate aus Biokatalysatoren und biokatalytisch inaktiven Proteinen oder nieder- oder hochmolekulare Effektoren wie Nukleinsäuren, Bruchstücke von Nukleinsäuren, Koenzyme, Peptide, Heptene, Hormone, Vitamine, Pharmaka, Sauerstoff bindende, aktivierende und transportierende, synthetische Verbindungen sowie Affinitätsliganden gegenüber den biologisch aktiven Verbindungen eingesetzt.
Die Lösungen, in denen die biologisch aktiven Verbindungen aufgelöst werden, sind bevorzugt wäßrige, gepufferte Lösungen mit pH-Werten im Bereich von 4,0 bis 12,0, vor-jgsweise von 8,0 bis 12,0. In Fällen jedoch, in denen die kovalente Bindung der aktivierten Polyoxyalkylenglykole oder ihrer Monoalkoxyether mit den biologisch aktiven Verbindungen in organischen Lösungsmitteln durchgeführt wird, werden die aktivierten Polymeren in organische Lösungsmittel eingetragen, die die biologisch aktiven Verbindungen und ein säurebindendes Mittel gelöst, suspendiert oder teilweise gelöst enthalten. Als säurebindende Mittel werden dabei in Abhängigkeit vom verwendeten Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch Trialkylamine, Heterocyclen mit endocyclischom, tertiärem Stickstoffatom, Alkalihydroxide, Alkalikarbonate, Alkalialkoholate oder Alkalisalze kondensierter Aromaten oder Heteroaromaten eingesetzt.
Die Umsetzungen mit durch Diazotierung aktivierten Polyoxyalkylenglykolen oder Monoalkoxyethern werden bei Temperaturen im Bereich von -1O0C bis +4O0C ausgeführt, und die Reaktionszeiten für diese Reaktionen liegen bei 10 Minuten bis 24 Stunden.
Die neuen Verbindungen mit biologischer Aktivität werden auf unterschiedliche Art und Weise aus den Reaktionslöuungen isoliert. Wäßrige Reaktionslösungen werden zunächst dialysiert, anschließend durch Ultrafiltration eingeengt und die Reaktionsprodukte daraus entweder durch Lyophilisation oder durch Ausfällen oder durch Extraktion gewonnen. Reaktionslösungen aus organischen Lösungsmitteln werden bei möglichst niedrigen Temperaturen eingeengt und die Reaktionsprodukte daraus durch Ausfällen isoliert. Eine andere Möglichkeit zur Isolierung der Reaktionsprodukte besteht darin, daß die engeengten Reaktionslösungen in Wasser gegossen und aus dem Lösungsmittelgemisch die Reaktionsprodukte extrahiert werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren liefert neue, modifizierte Verbindungen mit biologischer Aktivität. Ein wesentlicher Vorteil des Verfahrens besteht darin, daß die für die Modifizierung bekannter, biologisch aktiver Verbindungen verwendeten und mit primären, aromatischen Aminogruppen substituierten Polyoxyalkylenglykole oder ihre ebenso substituierten Monoalkoxyether nach einem einfachen und auch unter technischen Bedingungen leicht ausführbaren Verfahren aktiviert werden. Die Umsetzung der aktivierten Polymeren mit biologisch aktiven Verbindungen führt zu Derivaten dieser Verbindungen, die aufgrund der erhalten gebliebenen biologischen Aktivität, einer verbesserten Stabilität und veränderter Löslichkeiten mit Vorteil in der Medizin, Biotechnologie und anderen Zweigen der stoffwandelnden Industrie eingesetzt werden können. Die Erfindung wird durch Beispiele weiter erläutert.
500mg Polymeres der Struktur
werden in 15ml destilliertem Wasser gelöst. Unter Eiskühlung tropft man zu dieser Lösung 3 ml konzentrierte Salzsäure und anschließend 200μΙ einer Natriumnitridlösung, die 200mg Natriumnitrit pro Milliliter destilliertem Wasser enthält. Nach 10 Minuten Rühren unter Eiskühlung werden noch einmal 50μΙ Natriumnitritlösung gleicher Konzentration addiert. Die Lösung wird danach mit 100mg Amidosulfonsäure versetzt und unter pH-Kontrole mit eiskalter 1 normaler Natronlauge auf einen pH-Wert von 2,0 eingestellt. Diese Lösung mit dem aktivierten Polymeren wird bei O0C bis4°C zu 20 ml einer Pufferlösung addiert, die hergestellt wurde durch Auflösen von 25mg Glukoseoxidase (aus Penicillium notatum mit einer Aktivität von 43U/mg Einwaage) in 20ml 0,5 molarem Boraipuffer vom pH-Wert 9,0. Das Reaktionsgemisch wird anschließend 6 Stunden bei 4°C und danach 2 Stunden bei Umgebungstemperatur gerührt. Nach dieser Reak" - ^eit wird die Lösung gegen destilliertes Wasser dialysiert, auf etwa 5ml eingeengt und lyophilisiert. Das Umsetzungspn . oesitzt eine Aktivität von 1,4 U/mg Einwaage.
500mg Polymeres der Struktur
werden entsprechend Beispiel 1 aktiviert und wie dort beschrieben mit 50mg Penicillinacylase (aus Escherichia coli mit einer Aktivität von 920μΓηοΙ 6-Aminoponicillansäuro pro Stunde und mg Einwaage) umgesetzt. Nach der Aufarbeitung des Reaktionsgemisches durch Dialyse, Ultrafiltration und Lyophilisierung wird eine biokatalytisch aktive Pinicillinacylase erhalten, bei der die Aktivität von 1 mg unmodifizierter Penicillinacylase entspricht.
500g Polymeres der Struktur
werden in 10 ml frisch destilliertem Dimethy Isulfoxid gelöst und die Lösung wird auf O0C bis 4°C mit Eis abgekühlt. Unter weiterer Eiskühlung worden 3ml 32%ige Salzsäure, 4ml destilliertes Wasser und 1 ml 32%ige Salzsäure, 4 ml destilliertes Wasser und 1 pil 3 molare Natriumnitritlösung zur Lösung des Polymeren addiert. Das Reaktionsgemisch wird 15 Minuten bei 0°C bis 4°C gerührt und danach mit 150mg fester Amidosulfonsäure versetzt.
Nach weiterem Stehen der Lösung mit dem aktivierten Polymeren für 30 Minuten bei maximal 40C wird diese Lösung zu 5ml einer auf O0C bis 4°C abgekühlten Suspension eines peroxidatisch aktiven Komplexes aus 14mg Imidazol und 13mg Hämin sowie von 400mg Kaliumkarbonat getropft. Das Reaktionsgemisch wird unter Eiskühlung 5 Stunden und bei Umgebungstemperatur 2 Stunden gerührt. Die danach klare, dunkle Lösung wird in 200ml destilliertes Wasser eingetragen. Der ausgefallenen Niederschlag wird abgetrennt und verworfen. Die restliche Lösung wird dreimal mi! jeweils 25 ml Chloroform ausgeschüttelt. Aus der mit Natriumsulfat getrockneten Chloroformlösung werden nach Abdestillieren des Chloroform 185mg polymeres Derivat des Komplexes aus Hämin und Imidazol erhalten.
500mg Polymeres der Struktur
werden nach Beispiel 1 aktiviert. Die Lösung des diazotierten, polymeren Amins wird bei O0C bis 40C in einem 3 molaren Boratpuffer vom pH-Wert 9,0 eingetragen, in dem 50mg Hämoglobin (vom Rind) aufgelöst waren. Die Reaktionslösung wird 2 Stunden bei 0°C bis 4°C und 1 Stunde bei Umgebungstemperatur gerührt und danach gegen destilliertes Wasser dialysiert. Anschließend wird die Lösung durch Ultrafiltration eingeengt, und die restliche Lösung wird lyophilisiert. Nach der Lyophilisierung werden 320mg modifiziertes Hämoglobin erhalten, das durch eine Gelchromatographie an Sephadex G 25 weiter aufgereinigt werden kann.
200 mg Polymeres der Struktur
werden entsprechend Beispiel 1 aktiviert. Die Lösung mit dem diazotierten, polymeren Amin wird bei O0C bis 40C in einen 3 molaren Boratpuffer vom pH-Wert 8,0 eingetragen, in dem 25mg NADH aufgelöst waren. Die Reaktionslösung wird 2 Stunden bei 0°C bis 4°C und 30 Minuten bei Umgebungstemperatur gerührt. Danach wird die Lösung gegen destilliertes Wasser dialysiert, durch Ultrafiltration eingeengt und das Reaktionsgemisch wird gelchromatographisch mit Sephadex G 50 aufgetrennt. Das modifizierte NADH fällt in einer Ausbeute von 62 mg an. Es bestitzt auch als polymeres Derivat des NADH die für das reduzierte NADH typischen Absorptionsbanden bei 267nm und 340nm.
Claims (5)
1. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen mit biologischer Aktivität, dadurch gekennzeichnet, daß biologisch aktive Verbindungen mit wasserlöslichen - und primäre, aromatische Aminogruppen enthaltenden- Polyoxyalkylenglykolen und ihren Monoethern, nach Aktivierung der primären, aromatischen Aminogruppen durch Diazotierung, in wäßrigen Lösungen oder organischen Lösungsmitteln, beziehungsweise in gepufferten, wäßrigen Lösungen mit pH-Werten von 4 bis 12, !beziehungsweise in organischen Lösungsmitteln in Gegenwart säurebindender Mittel, beziehungsweise in Gemischen aus wäßrigen, gegebenenfalls gepufferten und/oder mit säurebindenden Mitteln versetzten, Lösungen und organischen Lösungsmitteln bei Temperaturen im Bereich von -100C bis 400C innerhalb von 10 Minuten bis 24 Stunden umgesetzt und aus den Reaktionslösuiigen die neuen Verbindungen mit biologischer Aktivität nach an sich bekannten Verfahren isoliert werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als biologisch aktive Verbindungen Biokatalysatoren wie Enzyme, Mikroorganismen, tierische, pflanzliche und humane Zellen, Zellorganellen, synthetische Enzyme und Koenzyme oder biokatalytisch inaktive Proteine wie Antigene, Anti'nrper, Wachstumsfaktoren, Blutgerinnungsfaktoren, Interferone, Hemoproteine, Albumine, zuckerbindende Protev<e oder in vitro hergestellte Konjugate aus Biokatalysatoren und biokatalytisch inaktiven Proteinen oder nieder- oder hochmolekulare Effektoren wie Nukleinsäuren, Bruchstücke von Nukleinsäuren, Koenzyme, Peptide, Haptene, Hormone, Vitamine, Pharmaka, Sauerstoff bindende, aktivierende und transportierende, synthetische Verbindungen sowie Affinitätsliganden eingesetzt werden.
3. Verfahren nach Anspruch i und 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Biokatalysatoren Enzyme aus den Klassen der Oxidoreduktasen, Transferasen, Hydrolasen oder Isomerasen eingesetzt werden.
4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß als orga: tische Lösungsmittel vorzugsweise aprotische Lösungsmittel wie Dimethylformamid und Dimethylsulfoxid oder hydroxylgruppenfreie Lösungsmittel, zum Beispiel Chloroform, Benzen und Däoxan verwendet werden.
5. Verfahren nach Anspruch 1 bis A1 dadurch gekennzeichnet, daß als säurebindende Mittel Trialkylamine, Heterocyclen mit endocyclischem, tertiärem Stickstoffatom, Alkalyhydroxide, Alkalikarbonate, Alkalialkoholate oder Alkalisalze kondensierter Aromaten und Heteroaromaten verwendet werden.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD33271889A DD287949A5 (de) | 1989-09-15 | 1989-09-15 | Verfahren zur herstellung von verbindungen mit biologischer aktivitaet |
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| DD287949A5 true DD287949A5 (de) | 1991-03-14 |
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ID=5612327
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| Country | Link |
|---|---|
| DD (1) | DD287949A5 (de) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1995022991A3 (en) * | 1994-02-28 | 1995-10-12 | Nycomed Imaging As | Block copolymers |
-
1989
- 1989-09-15 DD DD33271889A patent/DD287949A5/de not_active IP Right Cessation
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