DD287951A5 - Verfahren zur immobilisierung biologisch aktiver verbindungen an polyoxyalkylenglykole und ihre monoalkoxyderivate - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Immobilisierung biologisch aktiver Verbindungen an Polyoxyalkylenglykole und ihre Monoalkoxyderivate. Polyoxyalkylenglykole und ihre Monoalkoxyderivate, einschlieszlich ihrer thiolgruppenhaltigen Derivate, werden als ihre mit Chlorameisensaeureestern aktivierten Ester mit biologisch aktiven Verbindungen umgesetzt, die nukleophile Gruppen besitzen. Die Reaktionen werden in waeszrigen Loesungen, organischen Loesungsmitteln oder Gemischen dieser Loesungsmittel miteinander und untereinander bei 0C bis 150C in Gegenwart von Puffersubstanzen oder saeurebindenden Mitteln durchgefuehrt. Die erfindungsgemaeszen Immobilisate besitzen ein breites Anwendungsspektrum in der Biotechnologie, Biochemie, Pharmazie und Medizin.{Verfahren; Immobilisierung; Polyoxyalkylenglykole; mit Chlorameisensaeureestern aktivierte Polymere; biologisch aktive Verbindungen}
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Immobilisierung von biologisch aktiven Verbindungen an Polyoxyalkylenglykole und ihre Monoalkoxyderivato. Das Verfahren kann in der Biotechnologie, Biochemie, Pharmazie und Medizin angewendet werden.
Biologisch aktive Verbindungen wio Biokatalysatoren, biokatalytisch inaktive Proteine oder Pharmaka, die kovalent an lösliche oder unlösliche Trägermaterialien gebunden wurden, werden bereits in großem Umfange praktisch genutzt. Stoffwandlungsreaktionen durch biotechnologische Verfahren und auch Proteinreinigungsmethoden - auch solche im vergrößerten Maßstab -werden heute in vielen Fällen unter Einsatz unlöslich und damit wiederverwendbar gemachte, biologisch aktiver Verbindungen durchgeführt.
Aber auch synthetische Makromoleküle wie Dextrane, Polyaminosäuren, Polyvinylalkohol oder Polyoxyalkylenglykole, die in wäßrigen Systemen löslich sind, finden zunehmend Interesse und auch Anwendung in der Biotechnologie und Medizin. Koenzyme mit einem Adeninringsystem werden zum Beispiel an Typen der genannten, wasserlöslichen Polymeren kovalent gebunden und als solche Makromoleküle in biochemischen Reaktionen angewendet (BRD-Auslegeschrift 2841414). Aber auch Proteine - sowohl biokatalytisch aktive als auch biokatalytisch inaktive - wurden schon an wasserlösliche Polymere gebunden (Trends Biotechnol., 1986,4,68-73), und die Immobilisate wurden auf ihre Anwendung hin geprüft.
Eine besondere Rolle bei der Immobilisierung biologisch aktiver Verbindungen an wasserlösliche Polymere spielen Polyoxyalkylenglykole und ihre Monoalkoxyderivate. Dies ist darin begründet, daß diese Polymere sowohl in Wasser als auch in organischen Lösungsmitteln löslich sind. Mit Vorteil können diese Polymeren damit auch in den genannten Lösungsmitteln modifiziert werden zu Polymeren mit anderen funktioneilen Gruppen als den Hydroxylgruppen, die in den Grundpolymeren vorliegen. Von besonderer Bedeutung ist dabei aber auch, daß diese Polymeren zur Immobilisierung von biologisch aktiven Verbindungen in organischen Lösungsmitteln unter wasserfreien Bedingungen aktiviert werden können und damit weitaus mehr Aktivierungsmethoden der Polymeren zur Verfügung stehen, als für Polymere, die in organischen Lösungsmitteln nicht löslich sind, sondern nur in wäßrigen Systemen. Für die Polyoxyalkylenglykole und ihre Monoalkoxyderivate sind solche Aktivierungsreaktionen in organischen Lösungsmitteln beschrieben, zum Beispie! mit Cyanurchlorid als Aktivierungsmittel. Diese Aktivierungsmethode für hydroxylgruppenhaltige Polymere ist aber auf Grund der hohen Toxizität des Cyanurchlorids und seiner Substitutionsprodukte für Anwendungen von mit Cyanurchlorid aktivierten Polymeren in der Lebensmittelindustrie und auch Medizin als bedenklich einzuschätzen.
Ziel der Erfindung ist es, ein neues Verfahren zur Immobilisierung biologisch aktiver Verbindungen an Polyoxyalkylenglykole und ihre Monoalkoxyderivate zu erarbeiten, daß nichttoxischc beziehungsweise wenig toxische Aktivierungsmittel verwendet und stabile Immobilisate ergibt.
Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein Vt -fahren zur Immobilisierung biologisch aktiver Verbindungen zu erarbeiten, bei denen diese an mit nichttoxischen oder wenig xischen Aktivierungsmitteln aktivierten, hydroxylgruppenhaltigen oder thiolgruppenhaltigen Polyoxyalkylenglykolen c >r ihren ebenso substituierten Monoalkoxyderivaten kovalent gebunden werden. Erfindungsgemäß wird die Aufgabe da -urch gelöst, daß die biologisch aktiven Verbindungen mit geeigneten, durch Chlorameisensäureester aktivierte Polymere mit Hydroxylgruppen oder Thiolgruppen vom Typ der Polyoxyalkylenglykole oder ihrer Monoalkoxyderivate, in wäßrigen Lösungen oder organischen Lösungsmitteln beziehungsweise Gemischen organischer Lösungsmittel oder Gemischen aus wäßrigen Lösungen und organischen Lösungsmitteln im Zeitraum von 30 Minuten bis 12 Stunden bei Reaktionstemperaturen von OX bis 150°C, gegebenenfalls in Gegenwart von Puffersubstanzen oder anderen säurebindenden Mitteln umgesetzt werden. Als aktivierte Polymere werden vorzugsweise mit Chloramei jensäure-N-hydroxysuccinimidester, Ci\lorameisensäure-1 -hydroxybenztriazolester oder N-(Chlorcarbonyloxy)-5-noi bornen^.S-dikarboximid aktivierte, hydroxylgruppenhaltige oder thiolgruppenhaltige Polyoxyalkylenglykole oder mit den gleichen Aktivierungsgruppen substituierte Monoalkoxyderivate dieser Polymeren eingesetzt. Für die erfindungsgei laßen Immobilisierungsreaktionen kommen aber auch andere Chlorameisensäureester in Frage, zum Beispiel mit C> ilorameisensäurep-nitrop) enylester oder Chlorameisensäure-2,4,6-trichlorphenylester aktivierte Polyoxyalkylenglykole oder ihre Monoalkoxyderivate und ihre thiolgruppenhaltigen Analoga, vor allem dann, wenn die Immobilisate außerhalb der Medizin und Nahrungsmittelindustrie verwendet werden sollen.
Als biologisch aktive Verbindungen können eine Vielzahl nieder· und hochmolekulare Verbindungen eingesetzt werden. Weitere Voraussetzung für das Gelingen der Immobilisierungsreaktionen, neben ihrer biologischen Aktivität, ist lediglich das Vorliegen funktioneller Gruppen mit nukleophilen Eigenschaften. Solche biologisch aktiven Verbindungen sind unter anderem Biokatalysatoren wie Enzyme, vorzugsweise aus den Klassen der Hydrolasen, Oxidoreduktasen, Transferasen und Isomerasen Mikroorganismen oder Zellen, beziehungsweise biokatalytisch inaktive Proteine wie Antikörper, Antigene, Hemoproteine, Albumine und andere oder niedermolekulare Verbindungen wie verschiedene Hormone, Vitamine, Koenzyme, Pharmaka, Synzyme und Affinitätsliganden, wie sie zum Beispiel in der Affinitätschromatographie benutzt werden. Da sich die mit Chlorameisensäureestern aktivierten Polymeren durch eine hohe Reaktivität auszeichnen, werden erfindungsgemäß auch instabile, biologisch aktive Verbindungen an diesen Polymeren immobilisiert, da die Anwendung auch milder Reaktionsbedingungen wie niedrige Reaktionstemperaturen oder kurze Reaktionszeiten zu Immobilisaten mit hoher biologischer Aktivität führt.
In Abhängigkeit von der Stabilität und Löslichkeit der biologisch aktiven Verbindungen - die aktivierten Polyoxyalkylenglykolo und ihre Monoalkoxyderivate sind sowohl in wäßrigen Lösungen als auch in organischen Lösungsmitteln löslich -werden die Immobilisierungsreaktionen unter den verschiedenartigsten Reaktionsbedingungen ausgeführt. Eine Möglichkeit besteht darin, daß in Pufferlösungen mit pH-Werten von 5 bis 12, vorzugsweise von 7 bis 9, bei O0C bis 30°C gearbeitet wird und die Reaktionszeit in diesen Fällen 1 Stunde bis 12 Stunden beträgt. Weiterhin werden die Immobilisierungsreaktionen in wäßrigen Lösungen, Gemischen dieser mit organischen Lösungsmitteln, organischen Lösungsmitteln oder Gemischen organischer Lösungsmittel bei O0C bis 10O0C bei Reaktionszeiten von 1 Stunde bis 12 Stunden und in diesen Fällen vorwiegend in Gegenwart eines säurebindenden Mittels durchgeführt. Eine weitere erfindungsgemäße Immobilisierungsvariante ist dadurch gekennzeichnet, daß Biokatalysatoren und hierbei bevorzugt Enzyme, in organischen Lösungsmitteln oder Gemischen organischer Lösungsmittel in Anwesenheit säurebindender Mittel bei O0C bis 1000C im Verlauft) von 1 Stunde bis 8 Stunden mit den aktivierten Polymeren umgesetzt werden.
Für die Bindung der bei den Immobilisierungsreaktionen freigesetzten Mineralsäure werden neben Puffersystemen auch andere säurebindenden Verbindungen verwendet. Dazu gehören zum Beispiel tertiäre Amine, Heterocyclen mit endocyclischem, tertiärem Stickstoffatom, Alkalihydroxide, Alkalikarbonate, Alkalialkoholate oder Alkalisalze kondensierter Aromaten oder Hoteroaromaten.
Die Isolierung der an Polyoxyalkylenglykole und ihre Monoalkoxyderlvate immobilisierten, biologisch aktiven Verbindungen ist nach verschiedenen Methoden möglich. Eine Möglichkeit besteht in der Dialyse, Ultrafiltration und Lyophilisisrung der . Reaktionslösungen. Eine andere Möglichkeit im Ausfällen mit organischen Lösungsmitteln oder anorganischen Salzen, notwendigenfalls nach Dialyse der Reaktionslösungen. Und schließlich können die Immobilisate, nachdem die Reaktionslösungen mit einer ausreichenden Menge Wasser versetzt wurden, zunächst mit in Wasser nicht löslichen oder mischbaren, organischen Lösungsmitteln extrahiert werden und aus derorganischen Phase durch Verdampfen der organischen Lösungsmittel oder Einengen derselben und Versetzen der restlichen Lösungen mit Ether oder Petrolether durch Ausfällung isoliert werden. Bei besonderen Reinheitsanforderungen werden die Immobilisate mit Hilfe chromatographischer Methoden weiter gereinigt.
Nach dem erfindungsgemäßen Immobilisierungsverfahren werden eine Vielzahl stabiler und neuer Immobilisate von biologisch aktiven Verbindungen mit Polyoxyalkylenglykolen und ihren Monoalkoxyderivaten synthetisiert. Auf Grund der großen Reaktivität der mit Chlorameisensäureestern aktivierten Polymeren sind die Umsetzungen unter milden Reaktionsbedingungen möglich, die zu Immobilisaten führen, die in der Medizin und Nahrungsmittelindustrie eingesetzt werden können. Weitere Einsatzgebiete für die sowohl in Wasser als auch in organischen Lösungsmitteln löslichen Polymeren sind die Biotechnologie, Chemie und Pharmazie
Die Erfindung wird durch Beispiele weiter erläutert.
10mg Penicillinacylase werden in 15ml eines 0,1 molaren Boratpuffers vom pH-Wert 8,0 gelöst. Zu dieser Lösung werden 0,4g mit N-(Chlorkarbonyloxy)-5-norbornen-2,3-dikarboximid aktiviertes Polyethylenglykol (MG 6000) in fester Form addiert bei einerTemperatur vo.i 4°C. Die anfängliche Suspension und spätere Lösung wird auf Zimmertemperatur erwärmt und 3 Stunden bei dieser Temperatur gerührt. Die Lösung wird danach gegen destilliertes Wasser dialysiert, eine Ultrafiltration unterworfen, und die restliche Lösung wird lyophilisiert.
0,6g mit N-fChlorkarbonyloxyJ-succinimid aktiviertos w.w'-Dimercapto-polyethylenglykol (MG 6000) werden in 25ml trockenem Benzen gelöst. Zu dieser Lösung werden 0,5g Imidazol und 20mg Lipase aus Rhizopus arrhizus addhrt. Das Reaktionsgemisch wird 3 Stunden bei 6O0C gerührt, danach filtriert und das Benzen im Vakuum bei Umgebungstemperatur abdestilliert. Der Rückstand wird in 0,1 molarem Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 aufgenommen, die Lösung wird gegen destilliertes Wasser dialysiert, ultrafiltriert und der Rest der Lösung wird lyophilisiert. Der Rückstand wird gelchromatographisch mit Sephadex G100 weiter aufgereinigt, wobei eine biokatalytisch aktive und modifizierte Lipase als erste Fraktion von der Chromatographiesäule eluiertwird
Ausbeute: 43mg
1 g mit N-(Chlorkarbonyloxy)-5-norbornen-2,3-dikarboximid aktiviertes Monomethoxy-polyethylenglykol (MG 5000) wird in 15ml destilliertem Dimethylsulfoxid gelöst. Zu dieser Lösung werden bei 4°C 50mg in 50ml 0,2 molarem Boratpuffer vom pH-Wert 8,0 aufgelöstes Hemoglobin addiort. Das Reaktionsgemisch wird auf Zimmertemperatur erwärmt und 3 Stunden bei dieser Temperatur gerührt. Danach wird die Lösung gegen destilliertes Wasser dialysiert, ultrafiltriert, und lyophilisiert. Eine weitere Reinigung des modifizierten Hemoglobins erfolgt durch Gelchromatographie an einer Säule, die mit Sephadex G25 gefüllt ist
Ausbeute: 220mg
1 g mit N-(Chlorkarbonyloxy)-5-norbornen-2,3-dikarboximid aktiviertes Monomethoxy-polyethylenglykol (MG 5000) wird in 15ml destilliertem Dimethylsulfoxid gelöst. Bei 40C werden 50mg in 25ml 0,1 molarem Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 suspendierte Zellen vom Mikroorganismus Trichosporon cutaneum addiert. Die Suspension wird auf Zimmertemperatur erwärmt und 6 Stunden bei dieser Temperatur vorsichtig bewegt. Danach werden die modifizierten Zellen abfiltriert, mit obigem Phosphatpuffer gewaschen und bei 4°C unter sterilen Bedingungen gelagert.
0,3g Eisen(lll)-protoporhurin IX und 0,8g Histamin werden in 15ml frisch destilliertem Dimethylformamid gelöst. Zu dieser Lösung wird 1 g mit i-Chlorkarbonyloxy-4-nitrobenzen aktiviertes Polyethylenglykol (MG 6000) in fester Form addiert. Die Lösung wird 3 Stunden bei 60°C gerührt und nach dem Abkühlen in 100 ml destilliertes Wasser eingetragen. Nach dem Filtrieren wird die Lösung dreimal mit jeweils 20ml Chloroform extrahiert. Die vereinigten Chloroformphasen werden mit Natriumsulfat getrocknet und auf etwa 10ml eingeengt. Dieser Rest wird mit 100ml Petrolether versetzt, und der ausgefallenen Niederschlag wird gesammelt und bei Umgebungstemperatur getrocknet
Ausbeute: 520 mg
Beispiel β
dem 500mg mit N-(Chlorkarbonyloxy)-5-norbornen-2,3-dikarboximid aktiviertes Polyethylenglykol (MG 6000} aufgelöst waren.
Unter pH-Kontrolle, derpH-Wert der Lösung sollte durch Zutropfen von geringen Mengen 0,01 normaler Natronlauge Im Bereich von pH-Wort 4 bis pH-Wert 5 gehalten werden, wird die Lösung 3 Stunden bei 2O0C bis 300C gorührt. Die Lösung wird anschließend gegen destilliertes Wasser dlalyslert und mit Natriumhydrogenkarbonat versetzt, so daß sie einen pH-Wert von 8,0 erreicht. Danach werden 2g Natriumdithionit zur Lösung addiert und das modifizierte Koenzym wird innerhalb 20 Minuten bei 50°C reduziert. Die Lösung wird erneut gegen destilliertes Wasser dialysiert, danach auf pH-Werte zwischen 10 und 11 gebracht und60 Minuten auf 6O0C bis 7O0C erhitzt. Die Löseng wird abgekühlt, gegen eine 0,01 molare Kaliumchloridlösung vom pH-Wert 8,0 dialysiert, ultrafiltriert und lyophilisiert
Ausbeute: 185 g
Claims (7)
1. Verfahren zur Immobilisierung biologisch aktiver Verbindungen an Polyoxyalkylenglykolen und ihren Monoalkoxyderivaten, dadurch gekennzeichnet, daß biologisch aktive Verbindungen mit durch Chlorameisensäureester aktivierte Polyoxyalkylenglykole oder ihre ebenso aktivierten Monoalkoxyderivate sowie ihre thiolgruppenhaltigen Analoga in wäßrigen Lösungen oder organischen Lösungsmitteln oder Gemischen dieser miteinander und untereinander im Verlaufe von 30 Minuten bis 12 Stunden bei Reaktionstemperaturen im Bereich von O0C bis 1500C, gegebenenfalls in Gegenwart von Puffersubstanzen oder säurebindenden Mitteln, umgesetzt werden und die mit Polyoxyalkylenglykolen oder ihren Monoalkoxyderivaten modifizierten, biologisch aktiven Verbindungen aus den Reaktionslösungen nach an sich bekannten Verfahren isoliert und gereinigt werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als biologisch aktive Verbindungen Biokatalysatoren wie Enzyme, Mikroorganismen, tierische, pflanzliche und humane Zellen, Zellorganellen, synthetische Enzyme und Koenzyme oder biokatalytisch inaktive Proteine wie Antigene, Antikörper, Wachstumsfaktoren, Blutgerinnungsfaktoren, Interferone, Hemoproteine, Albumine, zuckerbindende Proteine oder in vitro hergestellte Konjugate aus Biokatalysatoren und biokatalytisch inaktiven Proteinen oder nieder- und hochmolekulare Effektoren wie Nukleinsäuren, Bruchstücke von Nukleinsäuren, Koenzyme, Peptide, Haptene, Hormone, Vitamine, Pharmakfi, Sauerstoff bindende, aktivierende und transportierende, synthetische Verbindungen sowie Affinitätsliganden eingesetzt werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzungen in Pufferlösungen mit pH-Werten von 5 bis 12 bei O0C bis 300C im Verlaufe von 1 Stunde bis 12 Stunden ausgeführt werden.
4. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzungen in wäßrigen Lösungen, Gemischen dieser mit organischen Lösungsmitteln, organischen Lösungsmitteln oder Gemischen organischer Lösungsmittel bei O0C bis 1000C in Gegenwart säurebindender Mittel im Verlaufe von 1 Stunde bis 12 Stunden erfolgen.
5. Verfahren nach Anspruch 1,2 und 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzungen von Biokatalysatoren, vorzugsweise von Enzymen, in organischen Lösungsmitteln oder Gemischen organischer Lösungsmittel in Gegenwart eines säurebindenden Mittels bei 00C bis 1000C im Verlaufe von 1 Stunde bis 8 Stunden erfolgen.
6. Verfahren nach Anspruch 1,2,4 und 5, dadurch gekennzeichnet, daß als säurebindende Mittel tertiäre Amine, Heterocyclen mitendocyclischem, tertiärem Stickstoffatom, Alkalihydroxide, Alkalikarbonate, Alkalialkoholate oder Alkalisalze kondensierter Aromaten und Heteroaromaten eingesetzt werden.
7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß als Biokatalysatoren Enzyme aus Jen Klassen der Oxidoreduktasen, Transferasen, Hydrolasen und Isomerasen eingesetzt werden.
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1989
- 1989-09-15 DD DD33272089A patent/DD287951A5/de not_active IP Right Cessation
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