DD289201A5 - Verfahren zur herstellung einer immunmodulierenden vakzine gegen viren - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer immunmodulierenden Vakzine gegen Viren. Sie bezieht sich auf die Herstellung einer Kombinationsvakzine mit intensivierter Wirkung und hoher Effektivitaet gegen Viren im human- und veterinaermedizinischen Bereich. Im wesentlichen beruht die Herstellung der Kombinationsvakzine auf physiologischen, leicht zu isolierenden Naturprodukten in Verbindung mit Viren bzw. Virusbestandteilen oder auch attentuierten Viren oder gentechnischen Bioprodukten in Form von gentechnisch manipulierten Mikroorganismen. Erfindungsgemaesz wird aus rohen Kartoffeln oder Weizenkeimlingen oder anderen Naturprodukten ein Extrakt gewonnen, aus dem durch unkomplizierte Zentrifugations- und Konzentrierungsschritte Lectin als Immunmodulator gewonnen wird. In lyophilisierter Form werden die Glycoproteide mit den genannten Antigenkomponenten in magensaftresistente Oralimpfstoffe oder parentale Impfstoffe ueberfuehrt. Im Gegensatz zu der Herstellung von Vakzinen ohne Lectin wird durch diese Masznahmen ein hochwirksames Praeparat hergestellt.{Bakterien; Gamma-Strahlen; Glycoproteide; Immunmodulatoren; Immunstimulatoren; Inaktivierung; Interferoninduktoren; Kartoffeln; Lectine; Lyophilisate; Vakzine; Viren; Weizen}
Description
Anwendungsgebiet der Erfindung
Die Anwendung bezieht sich auf die Herstellung einer immunmodulierenden Vakzine mit intensivierter Wirkung gegen Virusinfektionen im human- und auch veterinärmedizinischen Bereich.
Die Anwendung ist für Einrichtungen/Betriebe möglich, die Impfstoffe, Antikörper und Biostimulatoren für die Human- oder Veterinärmedizin herstellen.
Verfahren zur Herstellung von Impfstoffen gegen unterschiedlichste Virusinfektionen sind international breit im Einsatz. Dazu gehört sowohl die Produktion von parenteralen als auch von nichtparenteralen Impfstoffen. Ebenso sind Möglichkeiten des Einsatzes von Immunmodulatoren bekannt, jedoch nicht in Form von Lectinen. Verfahren zur Isolierung von Lectinen sind aber in vielseitigem Maße dargelegt.
Die spezifische Richtung der Herstellung einer Kombinationsvakzine unter Einbeziehung von Lectinisolierungen ist dagegen bisher nicht beschrieben worden. Es fehlen in der Literatur auch Hinweise auf die Lectine als Immunmodulatoren. Das betrifft im gleichen Maße parenterale und nichtparenterale Vakzinen.
Ziel der Erfindung
Ziel der Erfindung sind solche Maßnahmen, aus denen ein Verfahren resultiert, das unter Beachtung anwendungstechnischer Kriterien zur Herstellung einer Kombinationsvakzine mit intensivierter und zugleich breiter Wirkung gegen Virusinfektionen führt.
Aus den besonderen Herstellungsmaßnahmcn resultiert eine Vakzine, die neben der Bildung spezifischer Antikörper auch simultan eine Interferoninduktion und eine starke Aktivierung des Phagozytose-Killing-Systems bzw. eine Aktivierung intra- und extrazellulärer Enzyme von Alveolarmakrophagen auslöst. Im wesentlichen wird die Herstellung der Vakzine auf einem physiologischen, leicht zu isolierendem Naturprodukt in Kombination mit ebenfalls günstig zu gewinnenden Antigenen als inaktivierte Viren bzw. modifizierte Virusbestandteile oder auch als attenuierte Viren oder als gentechnische Bioprodukte beruhen, und zwar in Form einer luft-, wasser- und säureresiQtenten Endkonfektionsform, die zur oralen Applikation geeignet ist.
Darlegung des Wesens der Erfindung
Die Aufgabe, die durch die Erfindung gelöst wird, besteht darin, solche Maßnahmen anzugeben, daß ein natürlicher Immunmodulator in einer solchen spezifischen Form hergestellt wird, der in Verbindung mti inaktivierten bzw. aufgeschlossenen oder zum Teil abgebauten Viren oder gereinigten Virusbestandieilen oder auch attenuierten Viren oder gentechnischen Bioprodukten zu einem qualitativ neuartigen Impfstoff mit breiter Wirkspezifitä't gegen Virusinfektionen bzw. zu einer deutlichen Aktivierung von intra- und extrazellulären Enzymen von Alveolarmpkrophagen bzw. starken Aktivierung des Phagozytose-Killing-Systems und zugleich Interferoninduktion führt
Diese Maßnahmen sind ausgerichtet auf die
- einfache Herstellung des Immunmodulators aus Naturprodukten (z. B. Kartoffeln, Weizenkeimlinge) in Form von Lectinen, die spezifische Bindungsstellen für Kohlenhydratstrukturen besitzen und unterschiedlich mit Zellen reagieren, aber keine pathologischen Reaktionen auslösen
- leichte Kombinierbarkeit mit inaktivierten bzw. zum Teil gespaltenen/gereinigten Viren/Virusbestandteilen bzw. attenuierten Viren oder gentechnischen Bioprodukten (Mikroorganismen)
- Anwendungsfreundlichkeit des Impfstoffes ohne Nebenwirkungen
- intensivierte Wi>kung in dieser Kombination
- gute Lagerfähigkeit des Impfstoffes
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß aus den erwähnten Naturprodukten ein Preßsaft/Präparat gewonnen und gegebenenfalls mit einem Antioxidans versetzt wird und durch unkomplizierte Zentrifugations- und Konzentrierungsschritte ein lyophilisierter Immunmodulator erhalten wird, der in geringen Konzentrationen nach Kombination mit den genannten Bestandteilen und nach Erzeugung einer magensaftresistenten Endkonfektionsform einen optimal wirksamen Oralimpfstoff ergibt.
Überraschenderweise wurde gefunden, daß gerade diese Lectin-Antigen-Kombinationen (beispielsweise 2-20μg Immunmodulator in Form des Lectins und beispielsweise 20Mg Hämagglutinin aus Influenzaviren) diese hohen Wirkungen gegen Virusinfektionen bringen können.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich für die Herstellung optimal wirkender Oralimpfstoffe für die Anwendung im Human- und Veterinärbereich und kann nach Gewinnung entsprechend gereinigter Komponenten auch auf parenterale Impfstoffe übertragen werden.
Ausführungsbeispiele
Für die Herstellung einer Kombinationsvakzine gegen eine Infektion mit !nfluenzaviren Stamm A/Leningrad/360/86 sind folgende Piäparationsschritte notwendig:
a) Herstellung des Immunmodulators (Rohlectin) aus Kartoffeln
- Mechanische Zerkleinerung roher Kartoffeln und Gewinnung des Preßsaftes. Gegebenenfalls Zusatz von 0,2mg L-Ascorbinsäure zu 10ml Preßsaft und Zenirifugation für 20min bei 6000g.
- Prüfung des Überstandes (lectinhaltig) auf seinen Lectingehalt durch Agglutinationstiter gegen unbehandelte Erythrozyten (vorzugsweise human, Blutgruppe B).
- In Abhängigkeit von der Lebendkeimzahl (> 10Vml) Kaltsterilisation mit Kobalt-60-Gammastrahlen (< 1OkGy).
- Lyophilisation (vorheriges Tieffrieren auf -40°C) und erneute Bestimmung des Lectingohaltes: Ermittlung des Lectingehaltes in pg (mit Hilfe eines Referenzlectins).
- Einstellen auf einen Lectingehalt, der unbehandelte Human-B-Erythrozyten 1:4 noch agglutiniert (4HAU).
b) Herstellung des Antigens
Mit einer sterilen Nadel werden lOtägige embryonierte Hühnereier oberhalb der Luftsackgrenze geöffnet und mit einer Virusverdünnung beimpft (Stamm A/Leningrad/360/86). Es folgt eine Nachbrütungsperiode (50h, 360C). Anschließend werden die Embryonen abgetötet: (20 ± 4) h bei (4 ± 2)CC, und aus den desinfizierten Eiern wird die Allantoisflüssigkeit mittels einer Pumpe über eine Kanüle in eine Infusionsflasche gesaugt. Die virushaltige Allantoisflüssigkeit wird durch Zentrifugation bis max. 5000g von Zellresten und Eibsstandteilen befreit und bei Temperaturen von +40C gelagert. Nach 24stündiger Einwirkung von HCHO 1:12500 erfolgt eine Inaktivierung der Influenzaviren mittels Gamma-Strahlen (Kobalt-60; 9,9kGy) bei 220C. Nach Zugabe von max. 5Vol.-% Milch (mit ca. 1,5% Gesamtfett) als Stabilisator wird die Allantoisflüssigkeit in einer kommerziellen Anlage lyophilisiert
Kombinationsvakzine
Die Lyophilisate werden so gemischt, daß auf 10pg Lectin aus Weizonkeimlingen 10pg Hämagglutinin von Influenzaviren Stamm A/Leningrad/360/86 kommen (= Kombinationsvakzine). Die Lyophilisate werden unter Zumischung von physiologisch indifferenten Hilfsstoffen in bekannter Weise zu Preßlingen, z. B. Tabletten, Drageekernen, verarbeitet, wobei hierunter
erfindungsgemäß auch Granulate, Pellets oder mit Tabletten, Drageekernen, Granulaten bzw. Pellets oder auch mit Pulvergefüllte Gelatinekapseln zu verstehen sind. Das Mischungsverhältnis zwischen der erfindungsgemäßen Kombinationsvakzineund den Tablettenhilfsstoffen liegt zwischen 1:100 und 100:1, vorzugsweise zwischen 1:20 und 20:1.
vor Umwelteinflüssen und vor Verdauungssäften des Magens in bekannter Technologie mit einem Überzug versehen, der den
1 bis 3 magensaftresistente Tabletten im Zeitraum von 1 bis 3 Monaten per os verabreicht. Eine andere Applikationsform, z. B. in
a) Herstellung eines Immunmodulators (Rohlectin) aus Weizenkeimlingen
- 50g Weizenkeime werden mit 250ml Extraktionsmittel extrahiert. Extraktionsmittel: 2%ige Ameisensäure.
- Der Überstand wird 20min bei 5000g zentrifugiert und anschließend nochmals filtriert = Rohlectin.
- Prüfung des Lectingehaltes durch Agglutination von gewaschenen und sonst unbehandelten B-Erythrozyten (human).
- Im Falle der Verwendung als Immunmodulator Lyophilisation des Rohlectins (vorheriges Tieffrieren auf ca. -40°C) und erneute Ermittlung der biologischen Aktivität des Lectins (Agglutinationstiter).
- Einstellen des Lectingehaltes auf einen Titer von 1:4 (4 HAU) gegen unbehandelte B-Erythrozyten (human) (mit physiologischer Kochsalzlösung).
b) Herstellung des Antigens
Bis zur Gewinnung der Allantoisflüssigkeit mit Influenzaviren Stamm B/Yamagata/6/88 wird nach Beispiel 1 verfahren. Dann erfolgt nach Einwirkung von HCH01:12000 eine Konzentrierung der virushaltigen Allantoisflüssigkeit mittels einer Ultrafiltrationsmembran. Die abschließende Inaktivierung der Influenzaviren geschieht durch Gammastrahlen (Kobalt 60; 8,OkGy). Nach Zugabe von Stabilisatoren (5 Vol.-% Milch mit 2% Fett und 3,3 Vol.-% Gelatinelösung 5%ig) wird das Konzentrat in einer kommerziellen Anlage lyophilisiert. Das weitere Vorgehen erfolgt wie unter Beispiel 1 angegeben.
attenuierte bzw. rekombinierte Influenzaviren der Typen A, B oder C zum Einsatz.
Etwa 61 Zellkulturflüssigkoit, deren Human-Fl-Zellen zur Vermehrung des Adenovirus Typ 2 nach einem üblichen Verfahren dienten, werden 15 min bei 2000 U/min in einer Kühlzentrifuge zentrifugiert. Das Sediment wird in 150 ml phosphatgepufferter physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen, mit dem doppelten Volumen Chloroform zur Analyse versetzt und 30min bei Zimmertemperatur mechanisch geschüttelt. Nach erneuter Zentrifugation kann die obere wäßrige Phase aseptisch entnommen werden. Zu diesem Viruskonzentrat werden mindestens 2 mg Lectin aus Kartoffeln gegeben, vermischt und zur Gewinnung eines hochtitrigen Antiserums gegen Adenovirus Typ 2 portioniert. Dazu wird die Kombinationsvakzine Hauskaninchen unterschiedlicher Rassen intravenös zu je 2 ml wiederholt nach einem üblichen Immunisierungschema appliziert. Im Vergleich zu einem Antigen ohne Lectin induziert die Kombinationsvakzine mehrfach höhere Serumantikörper-Titer.
Poliovirus eines kommerziellen Poliomyelitis-Impfstoffes wird nach einem üblichen Verfahren mittels Gamma-Strahlung inaktiviert. Nach Zugabe von Lectin, das nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren präpariert wurde, im Verhältnis von 1 pg LectinMOOpg Protein werden diese Komponenten gemischt. Dieses Gemisch wird in einer Anlage im technischen Maßstab lyophilisiert. Das Lyophilisat wird im Verhältnis von 1:1 mit Lactose vermischt und zu Tabletten von etwa 100g verpreßt.
Claims (6)
1. Verfahren zur Herstellung einer immunmodulierenden Vakzine gegen Viren, gekennzeichnet dadurch, daß aus rohen geschälten oder ungeschälten Kartoffeln durch mechanische Zerkleinerung und durch Gewinnung eines Preßsaftes aus diesen sowie gegebenenfalls durch Zusatz von Antioxidantien, vorzugsweise von 0,5 bis 20 mg !.-Ascorbinsäure pro 11 Preßsaft, und anschließender Zentrifugation bis max. 10000g für 20min in Form desÜberstandes ein Roh-oder Reinpräparat (Roh- oder Reinlectin), das gegebenenfalls noch pasteurisiert/sterilisiert werden kann, erhalten wird und zum Zwecke längerer Lagerhaltung und Weiterverarbeitung/Verwendung als Impfstoffkomponente nach vorherigem Tieffrieren auf etwa -4O0C lyophilisiert wird oder daß aus Weizenkeimlingen, getrocknet bei 35-4O0C oder im nativen Zustand, mit organischen Säuren, vorzugsweise Ameisen- oder Essigsäure, oder anderen Extraktionsmitteln wie Salzsäure oder phosphatgepufferte physiologische Kochsalzlösung ein Rohextrakt hergestellt wird und der dekantierte Überstand bis max. 10000g über einen Zeitraum von max. 30min zentrifugiert und anschließend filtriert wird und nach Bestimmung des im Filtrat enthaltenen Immunmodulators, und zwar in Form des Lectins durch Agglutination von gewaschenen und sonst unbehandelten B-Erythrozyten (human), gegebenenfalls noch pasteurisiert/sterilisiert werden kann und lyophilisiert wird oder daß aus den Samen von Erdnuß, Schnabelbohne, Erbsenstrauch, Besenginster, Pfaffenhütchen, Sojahohne, Goldregen, Linse, Limabohne, Gartenbohne, Schnurbaum, Stechginster, Vogelwicke, Pferde-, Saubohne, Kermesbeere, Erbse, Robinie bzw. weiteren Naturprodukten Lectine in modifizierter Weise gewonnen und lyophilisiert werden und die resultierenden Lectine mit einer biologischen Aktivität, die zwischen 2-50 μg an reinem Lectin/Dosis entsprechen können, mit lyophilisierten inaktivierten Viren bzw. Virusbestandteilen oder auch attenuierten Viren oder gentechnischen Bioprodukten in Form von gentechnisch manipulierten Mikroorganismen oder Präparaten, die gegebenenfalls vor der Lyophilisation noch mit Stabilisatoren vermischt werden, und diese Kombinationen schließlich in Form von Tabletten, Dragees, Granulat oder Kapseln in eine luft-, wasser- und säureresistente Umhüllung aus beispielsweise Celluloseacetatphthalat, mit einem Weichmacher und organischen Lösungsmitteln, eingeschlossen werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß bei den Kombinationen noch Bakterien bzw. modifizierte Bakterienbestandteile mitverarbeitet werden.
3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß mit hochgereinigten Präparaten auch Vakzinen für die parenterale Applikation hergestellt werden können.
4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 3, gekennzeichnet dadurch, daß bei der Herstellung eines Gemisches von Lectin und Antigen die spezifische Bindung zwischen diesen Komponenten derart ausgenutzt wird, indem durch die Zugabo von Lectinen eine Präzipitation und damit Reinigung und Konzentrierung der Viren erfolgt.
5. Verfahren nach den Ansprüchen 1,3 und 4, gekennzeichnet dadurch, daß durch eine Kopplung zwischen Lectinen und Virusantikörpern oder Virustatika ein gezieltes Hinführen an/in die Lymphozyten erreicht wird und damit einer allgemeinen Immunsuppression entgegengewirkt wird.
6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, gekennzeichnet dadurch, daß aus den gesteigert gebildeten Antikörpern hochspezifische Antikörper-Präparate hergestellt werden.
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| DD33494389A DD289201A5 (de) | 1989-11-28 | 1989-11-28 | Verfahren zur herstellung einer immunmodulierenden vakzine gegen viren |
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| DD289201A5 true DD289201A5 (de) | 1991-04-25 |
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6541001B1 (en) | 1999-08-24 | 2003-04-01 | Teva Pharmaceutical Industries, Ltd. | Vaccine composition and method of using the same |
| EP1635793A4 (de) * | 2003-06-12 | 2006-12-20 | Won-Bong Park | Zusammensetzung für einen enterischen überzug aus einem natürlichen, lectin enthaltenden produkt |
-
1989
- 1989-11-28 DD DD33494389A patent/DD289201A5/de not_active IP Right Cessation
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