DD290213A5 - Verfahren zur herstellung von l-lysin auf fermentativem wege - Google Patents
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Herstellung der essentiellen Aminosaeure L-Lysin auf fermentativem Wege. Die Aufgabe, hohe Lysinbildungsraten bei L-Lysin-bildenden Mikroorganismen-Staemmen auch in Reaktoren mit relativ geringem Leistungseintrag und damit niedrigen Kennwerten fuer Sauerstoffversorgung und Durchmischung zu realisieren, wird in der Weise geloest, dasz nach Fermentationsbeginn in der Hauptwachstumsphase eine Verknuepfung der Prozeszzustandsgroeszen p H-Wert und Sauerstoffpartialdruck erfolgt, indem eine mit dem aktuellen Sauerstoffpartialdruckwert korrelierte voruebergehende Absenkung bzw. Anhebung der Aciditaet der Kulturloesung vorgenommen wird, die in eine Fermentationsphase mit Festpunktregelung des p H-Wertes uebergeht. Durch das erfindungsgemaesze Verfahren werden gegenueber herkoemmlichen Verfahren zur fermentativen Herstellung von Lysin mit ausschlieszlicher Festpunktregelung des p H-Wertes hoehere Lysinbildungsraten realisiert und der reaktorspezifische Leistungseintrag in wesentlich oekonomischerer Weise ausgenutzt.{essentielle Aminosaeure L-Lysin; fermentatives Verfahren; Leistungseintrag; Sauerstoffversorgung; Sauerstoffpartialdruck; Kulturloesung; p H-Wert; Steuerung}
Description
Anwendungsgebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein biotechnologisches Verfahren zur Herstellung der essentiellen Aminosäure L-Lysin. Diese wird in der Medizin zur Ergänzung von Infusionslösungen, in der Nahrungsmitti lindustrie zur Aufwertung von Lebensmitteln und in großen Mengen in der Futtermittelindustrie zum Ausgleich von Aminosäure-Inbalancen im Eiweißanteil des Viehfutters benötigt. Das Verfahren zu ihrer Herstellung kann in der mikrobiologischen Fermentationsindustrie angewandt werden.
Charakteristik des bekannten Standes der Technik
Die fermentative Herstellung der essentiellen Aminosäure L-Lysin erfolgt überwiegend du/ch Mikroorganismen-Stämme der Gattungen Corynebacterium und Brevibacterium. Es wurden aber auch Herstellungsverfahren unter Verwendung von Stämmen anderer Gattungen wie z. B. Mycobacterium, Arthrobacter, Acinetobacter (JP-OS78/20391), Bacillus (Hagino, H. et al., Biotechnol. Letters, 3,1981, S.425-430) und Escherichia coli (DE-OS3027922) ausgearbeitet. Zur Leistungssteigerung der Verfahren wurden dabei Mutanten und Selektanten eingesetzt, die eine oder mehrere Auxotrcphien für bestimmte Aminosäuren wie z. B. Homoserin, Methionin, Threonin, Leucin oder Isoleucin besitzen und Resistenz gegenüber bestimmten Aminosäureanaloga wie z.B. S-(2-Aminoethyl-L-cystein),a-Amino-ß-hydroxyvaleriansäure,2-Thiazolalanin,Threo-ß-hydroxy-DL-Leucin(DE-OS2730 964; JP-OS80/09 785; JP-OS78/86 090; DD-WP140 056) aufweisen. Zur Leistungssteigerung wurde auch die Zugabe von Antibiotika oder oberflächenaktiver Stoffe vorgeschlagen (US-PS3929571; CS192746). Zur weiteren Leistungssteigerung wurden weiterhin gentechnisch manipulierte Stämme (wie z. B. beschrieben in den Patentschriften US4346170; FR2482622; JP Appl.80/65007) und solche Stämme, die durch Protoplastenfusion geeigneter ' Ausgangsstämme gewonnen wurden (GB2103617; JP Appl.81 /125006), eingesetzt.
Trotz dieser Bemühungen ist es aber zunehmend schwieriger geworden, die Ausbeuten an Lysin und insbesondere die Produktivität deutlich zu erhöhen.
Insbesondere treten bei der Umsetzung der mikrobiologisch-genetisch fixierten Produktbildungspotenz der Produktionsstämme in den technischen Maßstab ökonomische Probleme auf, da die eingesetzten Großfermentoren über einen hohen Leistungseintreg verfügen müssen, um diese Hochleistungsstämme durch angepaßte Sauerstoffversorgung und Durchmischung mit hohem Substrattransfer zur maximalen Lysinausscheidung zu führen.
Die durch diesen notwendigen hohen Leistungseintrag erforderlichen erheblichen Energiekosten verringern die ökonomische Effektivität des Verfahrens. Außerdem bedeutet hoher Energieeintrag in Rührfermentoren auch eine entsprechend hohe Scherkraftbelastung der Zellen mit potentiell negativen Folgen für die Produktsynthese oder Produktausscheidung.
Ziel der Erfindung
Ziel der Erfindung ist die Herstellung der Aminosäure L-Lysin in ökonomisch vorteilhafter Weise.
Darlegung des Wesens der Erfindung
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein solches biotechnologisches L-Lysin-Herstellungsverfahren zu beschreiben, bei dem die physiologischen Bedingungen der Lysinsynthese so geführt werden, daß trotz reaktorbedingter Begrenzung des Leistungseintrages und damit auch begrenzter Sauerstoffversorgung und Durchmischung eine hohe, stetige
Lysin-Synthesegeschwindigkeit und damit hohe Produktionsausbeuten in verhältnismäßig kurzen Fermentationszeiten erzielt werden.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe in ihrem Grundzug wie folgt gelöst:
Die Herstellung von L-Lysin auf fermentativem Wege erfolgt durch kontaminationsfreie Kultivierung des jeweils eingesetzten L-Lysin-bildenden Mikroorganismen-Stammes in Nährlösungen mit assimilierbaren Kohlenstoff·, organischen und anorganischen Stickstoffquellen sowie mit Salzen und Vitaminen in Reaktoren. Hinsichtlich Nährbodenpräparation, Impfmaterialanzucht, Kalibrierung der Meßsonden, Reaktor- und Nährbodensterilisation sowie Rückführung auf Prozeßtemperatur wird die Fermentation in an sich bekannter Weise vorbereitet und nach Zugabe des Impfmaterials unter Beobachtung des Zusammenhangs von Absinken des Sauerstoffpartialdruckes (Kurzbezeichnung: pO2-Absinken) und Acidiints-
Änderung gestartet (Schritt I). Die Kultivierung erfolgt bei Temperaturen von 26°C bis 380C; sie wird insgesamt für eine Dauer von 48 Stunden bis 120 Stunden durchgeführt.
Nach Erreichen eines pC^-Schwellenwertes im Bereich von 10% bis 40% des Sättigungswertes wird in der Hauptwachstumsphase der Kultur die Acidität der Fermentationslösung sukzessive wahlweise solange abgesenkt oder angehoben, bis der pO2-Wert wieder steigende Tendenz aufweist (Schritt II). Anschließend wird die Acidität als nach wie vor einzige Stellmaßnahe zur Beeinflussung des pO2-Wertes der Fermentationslösung sukzessive in jeweils entgegengesetzter Richtung solange geändert, bis der pO2-Wert wieder den Bereich des jeweils festgesetzten pO2-Schwellenwertes erreicht hat; danach wird die Fermentation unter Festpunktregelung der Acidität auf dem hierbei erreichten pH-Niveau zu Ende geführt (Schritt III).
Es wurde bei diesem verfahrensgemäßen Vorgehen überraschend gefunden, daß die zur Stabilisierung des pOrWertes der Kulturlösung durchgeführte Absenkung der Anhebung des pH-Wertos der Kulturlösung nicht nur ohne Nachteile für die Lysinbildung ist, sondern daß sogar eine effektivere Stoffwechseleinstellung mit dem Ergebnis einer intensiveren Lysin-Bildung fixiert wird, die zu höheren Lysin-Ausbeuten führt.
In der weiteren Ausgestaltung des Verfahrens wird zur Kultivierung bevorzugt Lysin-bildendes Zellenmaterial von Corynebacterium glutamicum bereitgestellt. Die Fermentation wird mit Zugabe des vorzugsweise über 2 Vorkultur-Stufen angezogenen Impfmaterials im Verhältnis von etwa 10% im Anschluß an die Einstellung der Acidität auf einen Anfangswert im Bereich von pH 6,5 bis oH 7,2 und auf der Festlegung der maximalen Sauerstoffübergangsrate des Fermentors gestartet. Die
Festlegung dieser Übergangsrate wird entsprechend der Anlagenausstattung durch Einstellung der Belüftungsrate von 1:1:1 bis 1,5:' ' Liter Luft pro Liter Nährlösung und pro Minute, des Innendrucks bis zu 1,5 MPa und den reaktorspezifischen Ur ' Bedingungen, festnelegt durch Reaktorgeometrie, Rührergeometrie, Fördermengen von Pumpen bei Außenkreisläufen, realisiert. Bezogen auf die stationäre Sulfitoxidation liegt diese maximale Sauerstoffübergangsr?te im Bereich von 3g bis 6g Sauerstoff pro Liter und Stunde.
Der jeweils gewählte p02-Schwellonwert wird 2 Stunden bis 24 Stunden nach Fermentationsbeginn erreicht. Die Absenkung bzw. Anhebung der hierbei im Freilauf erreichten Acidität wird mittels Zugabe von verdünnter Säure, vorzugsweise verdünnter Schwefelsäure, bzw. von verdünnter Lauge, vorzugsweise verdünnter Ammoniumhydroxid-Lösung, vorgenommen. Die Aciditäts-Änderung in Schritt Il wird über eine Dauer von 0,5 Stunden bis 4,0 Stunden erstreckt; hierbei wird die Acidität wahlweise auf einen Wert im Bereich von pH 4,0 bis pH 6,0, vorzugsweise im Bereich von pH 4,8 bis pH 5,5, abgesenkt bzw. auf einen Wert im Bereich von pH 7,5 bis pH 9,0, vorzugsweise im Bereich von pH 7,8 bis pH 8,5, angehoben.
Die gegenläufige Aciditäts-Änderung in Schritt III des Verfahrens, d.h. nachdem der pO2-Wert der Fermentationslösung wieder ansteigt, wird in der weiteren Ausgestaltung des Verfahrens über eine Dauer von mindestens einer Stunde erstreckt. Nach Ablauf dieser Zeitspanne, wenn der pO2-Wert wieder den Bereich des anfänglich jeweils festgesetzten pO2-Schwellenwertes erreicht hat, wird die Acidität auf die Rege'schwelle im physiologisch günstigsten Bereich von pH 6,6 bis pH 7,4, bevorzugt jedoch im Bereich von pH 6,8 bis pH 7,2, eingestellt. Dieser Sollwert wird bis zum Ende der Fermentation mittels einer in an sich bekannter Weise automatisch arbeitenden pH-Festpunktregelung durch Zugabe von Säure bzw. Lauge aufrechterhalten.
Durch die beschriebene Verfahrensweise werden Phasen mit kritischen pO2-Werten, die sonst zu Stoffwechselumschaltungen mit erheblichen Lysin-Minderausbeuten führen, vermieden. Weiterhin werden die Maßnahmen zur Verhinderung dieser kritischen pO2-Werte, wie beispielsweise eine Intensivierung des Leistungseintrages durch Drehzahlerhöhung, nicht in Anspruch genommen. Zusätzlich wird durch die beschriebene Verfahrensweise eine stabile Lysin-Bildungsrate in einer Höhe eingestellt, die im Vergleich zu herkömmlichen Verfahren der Herstellung dieser Aminosäure, insbesondere zu solchen mit ausschließlicher Fcstpunktregelung der Acidität, zu einer bis zu 15% höheren Lysin-Ausbeute führt.
Ausführungsbeispiele Beispiel 1
Vegetatives Zellmaterial von Corynebacterium glutamicum wird zum Beimpfen des auf pH 7,0 eingestellten und sterilisierten Vorkulturmediums der Zusammensetzung (g r'):Saccharose:20,0m Maisquellwasser (40% Trockensubstanz): 45,0 verwendet. Die Kultivierung erfolgt in oOOml-Rundkolben mit 50ml Nährlösung bei 29°C auf einem Reziprokschüttler (f = 220min"1). Die Kultivierung erfolgt in 500ml-Rundkolben mit 50ml Nährlösung bei 290C auf einem Reziprokschüttler (f = 220 min"1). 10 ml dieser 24 Stunden alten Vorkultur dienen als Impfmaterial für 300 ml Nährlösung der zweiten Vo/kultur folgender Zusammensetzung (pro Liter): Saccharose: 25,0g, Maisquellwasser (40% Trockengewicht): 55,0g, Vitamin B1: 0,25mg, Biotin: 60pg. Die Kultivierung dieser zweiten Vorkultur erfolr t in 2,51-Flaschen bei 29°C auf einem Rundschwingtisch (f = 180min"'). Die Kulturlösung dieserzweiten Vorkultur dient zum Beimpfen von 31 Nährlösung folgender Zusammensetzung ineinemölLaborfermentor: .
| Saccharose | 185,Og · Γ |
| Maisquellwasser (40%TS) | 20,Og-I- |
| Sojamehlhydrolysat | 210,0 g-|- |
| (NH4),SO4 | 12,0g·|- |
| MgSO4-7,12O | 0,3g-r |
| KH2PO4 | 2.OgI- |
| Biotin | 50,0 μg· |
| Vitamin Β, | 200,0 ug- |
Die Acidität der Nährlösung wird vor der Sterilisation auf pH 6,8 eingestellt. Nach Beimpfung erfolgt erneut eine pH-Korrektur auf 6,8. Die Drehzahl des Rührers beträgt 800min"' und die Belüftungsrate 1801 · h"\ Mit fortschreitendem Wachstum des Mikroorganismus erreicht der pO2-wert nach 4,75 Stunden den Schwellenwert von 30% Sättigung, unterhalb dessen die pO2-abhängige Absenkung des pH-Wertes der Kulturlösung realisiert wird. Durch Zudosieren von 10%iger Schwefelsäure wird der bis zu diesem Zeitpunkt selbsttätig auf 7,2 angestiegene pH-Wert abgesenkt. Der Verlauf dieser pH-Absenkung und der nachfolgenden Anhebung durch Zudosieren von 20%iger Ammoniumhydroxidlösung in Abhängigkeit vom aktuellen pO2-Wert ist aus der folgenden Tabelle ersichtlich:
pO2 pH
| tF | ts |
| (h) | (h) |
| 4,75 | 0 |
| 5,00 | 0,25 |
| 5,50 | 0,75 |
| 6,00 | 1,25 |
| 6,50 | 1,75 |
| 7,00 | 2,25 |
| 7,50 | 2,75 |
| 8,00 | 3,25 |
| 8,50 | 3,75 |
| 9,00 | 4,25 |
| 30,0 | 7,20 | pO2-Sc!iwellenwert |
| 24,0 | 6,80 | |
| 22,0 | 6,30 | |
| 19,0 | 6,00 | |
| 17,0 | 5,70 | |
| 14,5 | 5,45 | pOj-Minimalniveau |
| 15,0 | 5,40 | und extremal |
| 18,0 | 5,65 | verschobener |
| 25,0 | 6,25 | pH-Wert |
| 28,0 | 6,80 |
lf: Fermentationszeit
ts: Zeit nach Beginn der Steuerung des pH-Wertes
Im weiteren Verlauf der Fermentation wird die bisherige Steuerung des pH-Wertes der Kulturlösung durch eine Festpunktregelung bei pH 6,8 ersetzt. Zur 34. und 55. Stunde erfolgt je eine Zugabe von Saccharose von 100g als separat sterilisierte, konzentrierte Lösung. Nach Ablauf von 72 Stunden Fermentation werden in der Kulturlösung 66,2 g Lysin (als Lysin · HCI) pro Liter bestimmt.
In einem Vergleichsversuch, in dem der pH-Wert der Kulturlösung nicht in Abhängigkeit vom aktuellen Sauerstoffpartialdruck durch Zugabo von Säure abgesenkt wurde, sondern durch Eigensäuerung der Kultur nach Erreichen eines Wertes von pH 5,5 dieser durch eine festeingestelltc Sollwertregelung gehalten wird und in dem in der Nährlösung aufgrund der maximalen festgelegten Sauerstoffübergangsrate 180g Sojamehlhydrolysat pro Liter bei sonst gleichen Versuchsbedingungen eingesetzt wurden, konnten nach Ablauf von 72 Stunden Fermentation 00,7 g Lysin (als Lysin · HCI) pro Liter bestimmt werden.
Die Anzucht der ersten und zweiten Vorkultur erfolgt wie im Beispiel 1 beschrieben.
Der Inhalt zweier Schüttelflrschen der zweiten Vorkultur wird vereinigt und dient zum Beimpfen von 101 Nährlösung, sterilisiert in an sich bekannter Weise, folgender Zusammensetzung:
| Saccharose | 185,0 g-Γ' |
| Maisquellwasser (40 %TS) | 20,Og-I-' |
| Sojamehlhydrolysat | 230,0 g-r1 |
| (HN4I2SO4 | 12,OgI"1 |
| MgSO4-7H2O | 0,4 g-r1 |
| KH2PO4 | 2,5 g-r1 |
| Biotin | 60.0 ug-Γ |
| Vitamine, | 250,0g I"1 |
Die Acidität der Kulturlösung wird nach Beimpfen auf einen pH-Wert von 6,8 eingestellt. Die Drehzahl des Rührers beträgt 640U · min"1, die Belüftungsrate 6001 · h~'. Nach Erreichen eines pO2-Wertes von 35% Sättigung vier Stunden nach Fermentationsbeginn erfoit die Absenkung des pH-Wertes durch Zudosierung von 12,5%igsr Schwefelsäure. Der Verlauf dieser Absenkung und der nachfolgenden Wiederanhebung des pH-Wertes durch Zudosierung von 25%iger Ammoniumhydroxidlösung ist aus der folgenden Tabelle ersichtlich:
| tf | ts | PO2 | pH |
| (h) | Ih) | (%) | |
| 4,0 | 0 | 35,0 | 7,25 |
| 4,5 | 0,5 | 26,5 | 6,86 |
| 5,0 | 1,0 | 23,0 | 6,35 |
| 5,5 | 1,5 | 20,5 | 6,05 |
| 6,0 | 2,0 | 18,0 | 5,65 |
| 6,5 | 2,5 | 18,0 | 5,50 |
| 7,0 | 3,0 | 18,0 | 5,55 |
| 8,0 | 4,0 | 22,0 | 5,85 |
| 9,0 | 5,0 | 26,0 | 6,05 |
| 10,0 | 6,0 | 29,5 | 6,35 |
| 11,0 | 7,0 | 30,0 | 6,45 |
| 12,0 | 8,0 | 32,0 | 6,75 |
| 13,0 | 9,0 | 34,0 | 6,85 |
| tF: Fermentationszeit | |||
| ts: Zeit nach Beginn der Steuerung des pH-Wertes |
Der weitern Verlauf der Fermentation erfolgt wie im Beispiel 1 beschrieben, außer daß zur 34. und 55. Stunde je 330g Saccharose als separat sterilisierte, konzentrierte Lösung zudosiert wird. Nach 72 Stunden Fermentation werden in der Kulturlösung 62,0g Lysin (als Lysin · HCI) pro Liter bestimmt.
In einer Fermentation unter gleichen Versuchsbedingungen, in der der pH-Wert der Kulturlösung nicht in Abhängigkeit vom aktuellen pO2-Wert verändert wurde, sondern selbsttätig 9,5 Stunden nach Fermentationsbeginn auf pH 5,6 gesunken war und dort durch Sollwertregelung bh zum Wiederanheben auf pH 6,8 mit nachfolgender fester Sollwertregelung zur 22. Stunde gehalten worden war, wurde zui 5. Stunde bei Erreichen eines pO2-Wertes von 12,0% Sättigung die Drehzahl des Rührers auf 700U · min"1 erhöht. Zur 8. Stunde erfolgte eine weitere Erhöhung auf 900U · min"' und zur 22. Stunde eine Rückführung auf 640U min"1.
Nach 72 Stunden Fermentation wurden pro Liter Kulturlösung 54,0g Lysin (als Lysin HCI) bestimmt.
Claims (3)
1. Verfahren zur Herstellung von L-Lysin auf fermentativem Wege durch Kultivierung L-Lysinbildender Mikroorganismen-Stämme in Nährlösungen mit assimilierbaren Kohlstoff-, organischen und anorganischen Stickstoffquellen, Salzen und Vitaminen bei Temperaturen von 260C bis 380C für die Dauer von 48 Stunden bis 120 Stunden, gekennzeichnet dadurch, daß man
- die Fermentation unter Beobachtung des Zusammenhangs von pO2-Absinken und Aciditäts-Änderung startet (Schritt I),
- nach Erreichen eines pO2-Schwellenwertes im Bereich von 10% bis 40% des Sättigungswertes die Acidität der Fermentationslösung sukzessive wahlweise solange absenkt oder anhebt, bis der pO2-Wert wieder steigende Tendenz aufweist (Schritt II),
- anschließend die Acidität der Fermentationslösung sukzessive in jeweils entgegengesetzter Richtung solange ändert, bis der pO2-Wert wieder den Bereich des jeweils festgesetzten pCy Schwellenwertes erreicht hat, und danach die Fermentation unter Festpunktregelung der Acidität auf dem hierbei erreichten pH-Niveau zu Ende führt (Schritt III).
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß man in Schritt Il die Acidität wahlweise auf einen Wert im Bereich von pH 4,0 bis pH 6,0 absenkt bzw. auf <?inen Wert im Bereich von pH 7,5 bis pH 9,0 anhebt.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß man in Schritt III für die Festpunktregelung der Acidität einen Sollwert im Bereich von pH 6,6 bis pH 7,4 wählt.
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD30906987A DD290213A5 (de) | 1987-11-16 | 1987-11-16 | Verfahren zur herstellung von l-lysin auf fermentativem wege |
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| DD30906987A DD290213A5 (de) | 1987-11-16 | 1987-11-16 | Verfahren zur herstellung von l-lysin auf fermentativem wege |
Publications (1)
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| DD290213A5 true DD290213A5 (de) | 1991-05-23 |
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1182261A1 (de) * | 2000-08-24 | 2002-02-27 | Ajinomoto Co., Ltd. | Verfahren zur Herstellung von basischen Aminosäuren |
| US7790422B2 (en) | 2004-10-07 | 2010-09-07 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing basic substance |
-
1987
- 1987-11-16 DD DD30906987A patent/DD290213A5/de not_active IP Right Cessation
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| US7790422B2 (en) | 2004-10-07 | 2010-09-07 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing basic substance |
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