DD268834A3 - Verfahren zur fermentativen herstellung von l-lysin - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Lysin. Ziel der Erfindung ist eine oekonomische Herstellung von L-Lysin auf fermentativem Wege ueber eine Erhoehung der Raum-Zeit-Ausbeute und eine betraechtliche Erhoehung der Konzentration an L-Lysin in der Fermentationsloesung. Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, bei biotechnologischen Verfahren zur Herstellung von L-Lysin die o. g. Zielstellung ueber die Sauerstoffversorgung der Fermentationskultur zu erreichen. Erfindungsgemaess wird die Aufgabe dadurch geloest, dass die Kultivierung bei hoher Naehrstoffkonzentration, einer C-Quellennachdosierung waehrend der Fermentation und einem so intensiven Sauerstoffeintrag erfolgt, dass in 15 bis 26 Stunden ein nichtlimitiertes Biomassewachstum der Mikroorganismen von mindestens 45 g/l Biotrockenmasse stattfindet und L-Lysin mit hoher Rate in die Kulturloesung ausgeschieden wird.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Lysin für den Einsatz in der Lebensmittelindustrie, in der Tierernährung sowie in der Medizin.
L-Lysin wird zur Aufwertung von Nahrungsmitteln, als Zusatz zu Viehfutter zur Ausgleichung von Aminosäureinbalancen und in der Medizin für Infusionslösungen eingesetzt und besitzt demzufolge große ökonomische Bedeutung.
Die hiosynthetische Herstellung der essentiellen Aminosäure L-Lysin erfolgt in der heutigen Zeit überwiegend durch Stämme de' Gattungen Corynebacterium und Brevibacterium. Es wurden aber auch Herstellungsverfahren unter Verwendung von Stämmen anderer Gattungen, wie Nocardia (JP-OS 75/127817), Mycobacterium, Arthrobacter, Acinetobacter (JP-OS 78/20391), Pseudomonas (JP-OS 78/96380), Bacillus (H. Hagino et al., Biotechnol. Letters 3, [1981] S.425-430) und anderer Gattungen und Arten, wie E. coli, bekannt, die mit genetischen Methoden erhalten wurden (DE-OS 3027922). Vorzugsweise werden dabei Mutanten dieser Stämme eingesetzt, die eine oder mehrere Auxotrophien für bestimmte Aminosäuren, wie Homoserin, Threonin, Methionin, Leucin, Isoleucin, aufweisen und resistent sind gegen ein oder mehrere Aminosäureanaloge, wie S-(2-Aminoethyl)-L-Cystein (AEC), a-Amino-ß-hydroxyvaleriansäure (AHV), 2-Thiazolalanin, Threo-ß-hydroxy-DL-Leucin, N-2-thionoylmethior.in und andere (DE-OS 2730964, JP-OS 80/09785, JP-OS 78/86090, JP-OS 77/51091, DD-WP 140G56). Zur Leistungssteigerung wird die Zugabe von Antibiotika oder oberflächenaktiven Stoffen in die Kulturlösung vorgeschlagen (US-PS 3929571).
Herstellungsverfahren, die mit Stämmen der Gattungen Corynebacterium, Micrococcus oder Brtjvibacterium arbeiten, verwenden überwiegend Glucose (JP-OS 79/19471), Saccharose (DD-WP 140056), Essigsäure oder NH4-Acetat (JP-OS 77/ 102497, JP-OS 80/09784), Melasse (SU-UR 075980) oder Gemische von Glucose, Essigsäure und Melasse (DE-OS 2 531999), Ethanol, n-Propanol (JP-OS 76/093122), Fettsäuren, pflanzliche und tierische Öle und Fette (JP-OS 75/127817, JP-OS 78/26391). Vor allem bei Verfahren, die Stämme anderer Gattungen zur biosynthetischen Herstellung von L-Lysin verwenden, werden auch
andere Ausgangsstoffe als C-Quellen benutzt; so z. B. n-Alkane (JP-OS 76/077919), Methanol (JP-OS 73/040043) oder Benzoesäure (JP-OS 76/05073)
Die Raum-Zeit-Ausbeuten dieser Verfahren liegen bei 50 bis 92g/l L-Lysin (als Monohydrochlorid) bei Fermentationszeiten von 48 bis 75 Stunden.
Es ist in letzter Zeit je Joch schwierig geworden, die Ausbeuten an L-Lysin und die Produktivität wesentlich zu erhöhen. Diese gilt prinzipiell für alle genannten L-Lysin bildenden Stämmen und Verfahren, unabhängig von den eingesetzten zu L-Lysin zu konvertierenden Rohstoffen, wodurch eine weitere Ökonomisierung dieser Herstellungsverfahren erschwert wird.
Ziel der Erfindung
Die Erfindung dient der ökonomischen Herstellung der essentiellen Aminosäure L-Lysin auf fermentativem Wege, wobei eine wesentliche Erhöhung der Raum-Zeit-Ausbeute und eine beträchtliche Erhöhung der Konzentration an L-Lysin in der Fermentationslösung erzielt werden soll.
Darlegung des Wesens der Erfindung
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, bei den bekannten Verfahren zur Herstellung von L-Lysin die Raum-Zeit-Ausbeute an L-Lysin über die Sauerstoffversorgung der Fermentationskultur wesentlich zu steigern.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß die Kultivierung bei hoher Nährstoffkonzentration, einer C-Quellennachdosierung während der Fermentation und einem fo intensiven Sauerstoffeintrag erfolgt, daß in 15 bis 26 Stunden ein nichtlimitiertes Biomassuwachstum der Mikroorganismen >/on mindestens 45g/l Biotrockenmasse stattfindet und L-Lysin mit hoher Rate in die Kuiturlöaung ausgeschieden wird.
Der intensive Sauerstoffeintrag bis zum Erreichen der Biomassekonzentration kann insbesondere durch Sauerstoffübertragungsgeschwindigkeiten von mindestens 6g/l χ h realisiert werden, vorzugsweise durch Verwenden von Hochleistungsferrnentoren, beispielsweise Tauchstrahlfermentoren.
Die Sauerstoffübertragungsrate wird nach Fiechter/Meyenburg, Biotechnol. & Bioeng. 10, (1968), S. 535-549 bestimmt.
Das Nährmedium enthält verzugsweise folgende Bestandteile:
— eine komplexe organische Stickstoffquelle mit einem a-NH2-N-Gehalt in der Nährlösung von 2,6 bis 4,5g/l, vorzugsweise jedoch von 3,0 bis 3,4 g/l,
— eine anorganische Stickstoffquelle, beispielsweise in Form von (NH4I2SO4, mit einem NH4-N-Gehalt in der Nährlösung von
3 bis 18g/l, vorzugsweise jedoch von 8 bis 14g/l,
— eine Phos|/horquelle, beispielsweise in Form von KH2PO4, mit einem P-Gehalt von 1,0 bis 2,0g/l, vorzugsweise 1,1 bis 1,3 g/l,
— weitere Nährsalze und Spurenelemente, z.B. MgSO4 x 7H2O1K2SO4, Fe2SO4, MnSO4, ZnSO4, NiCI,, NiSO4 χ 7H2O, Cr2(SO4I3X 18H2O, CrCI2,
— eine Kohlenhydratquelle zu Fermentationsbeginn, berechnet als Kohlenstoff, von 60 bis 105g/l, vorzugsweise von 80 bis 95g/l, sowie eine Nachdosierung während der Fermentation in der Menge, daß die Konzentration von 0,1 bis 16g/l, vorzugsweise jedoch 4 bis 8g/l, aufrechterhalten wird.
Als C-Quellen eignen sich für das erfindungsgemäße Verfahren besonders Zucker.
Als lysinbildende Mikroorganismen können bekannte Stämme der Gattungen Nocardia, Arthrobacter, Mycobacterium, Pseudomonas, Acinetobacter, Bacillus, bevorzugt aber Stämme der Gattungen Brevibacterium bzw. Micrococcus und insbesondere solche der Gattung Corynebacti rium, eingesetzt werden. Vorzugsweise wird Corynebacterium glutamicum CCM 3287, beschrieben im DD-Wr 140056, vei wendet.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann besonders wie folgt durchgeführt werden:
In bekannter Weise in mehreren Stufen angezuchtetes Impfmaterial dient zum Beimpfen des Fermentationsmediums in einem Verhältnis von 5 bis 20%, vorzugsweise von 10%.
Das Fermentationsmedium enthält Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, anorganische Salze und die Vitamine B1 und Biotin als Nährstoffbestandteile in folgenden Mengen:
— komplexe organische Stickstoffquelle mit einem Gehalt an Ci-NH2-N in der Nährlösung von 2,6 bis 4,5g/l, vorzugsweise 3,0 bis 3,4g/l,
— anorganische Stickstoffquelle, beispielsweise in Form von (NH4I2SO4 mit einem NH4-N-Gehalt in der Nährlösung von 3,0 bis 18,0g/l, vorzugsweise von 8 bis 14 g/l,
— Phosphorquelle, beispielsweise in Form von KH2PO4, mit einem P-Gehalt von 1,0 bis 2,0g/l, vorzugsweise 1,1 bis 1,3g/l,
— weitere Nährsalze und Spurenelemente, z.B. MgSO4 χ 7H2O, K2SO4, MnSO4, ZnSO4, NiCI2, NiSO4 χ 7H2O, Cr2(SO4I3X 18H2O, CrCI2,
— eine Kohlenhydratquelle zu Fermentationsbeginn (berechnet als C) von 60 bis 105g/l, vorzugsweise von 80 bis 95g/l, sowie eine Nachdosierung während der Fermentation in der Menge, daß die Konzentration von 0,1 bis 16g/!, vorzugsweise jedoch
4 bis 8g/l, aufrechterhalten wird,
— Vitamin B, 0,3 bis 0,8mg/l und
— Biotin 0,1 bis0,2mg/l.
Durch intensiven Sauerstoffeintrag in 15 bis 26 Stunden erfolgt ein nichtlimitiertes Biomassewachstum der L-Lysin bildenden Mikroorganismen bis zu einer Konzentration von mindestens 45g/l Biotrockenmasse, wobei die Biomasse zu etwa 50% durch exponentiell und danach durch lineares Wachstum gebildet wird.
Am Fermentationsende wird die Nachdosierung der C-Quelle abgestellt, so daß deren Konzentration auf Null sinkt. Das Nachdosieren kann diskontinuierlich oder kontinuierlich vorgenommen werden.
Durch die beschriebene Verfahrensweise werden wesentlich höhere Raum-Zeit-Ausbeuten gegenüber den vergleichbaren herkömmlichen Verfahren erzielt. Die Raum-Zeit-Ausbeute-Steigerung kann über 100% betragen. Das Ergebnis ist für den Fachmann überraschend, weil nicht zu erwarten war, daß die Raum-Zeit-Ausbeute durch die Intensivierung des Sauerstoffeintrages in Hochleistungsfermentoren und entsprechend angepaßter Prozeßführung so bedeutend gesteigert weiden kann.
Das ganze erfindungsgemäße Verfahren oder nur der Verfahrensschritt mit der hohen Sauerstoffübergangsrate wird in einem Hochleistungsfermentor durchgeführt. Ein für das Verfahren geeigneter Hochleistungsfermentor ist der Tauchstrahlfermentor.
Die Erfindung soll anhand von Beispielen näher erläutert werden.
Die Anzucht des Impfmaterials von Corynebacterium glutamicum CCM 3287 erfolgt in an sich bekannter Art und Weise in mehreren Stufen.
Als Hauptkulturfermentor wird ein Tauchstrahlfermentor (TSF) mit einer Sauerstoffübergangsgeschwindigkeit von 10kg/m3 χ h1 eingesetzt.
Nach Befallen des Fermentors mit 1601 Nährlösung folgender Zusammensetzung:
202,5 g/l Saccharose
3.4 g/l a-NHj-Stickstoff (aus Maisquellwasser und Sojamehlhydrolysat als komplexe N-Quelle)
4.5 g/l KH2PO4 0,68g/l MgSO4X 7H2O
15,0 g/l (NH4I2SO4 0,45 mg/l Vitamin B, 0,11 mg/l Biotin
erfolgt die Sterilisation mit Dampf in an sich bekannter Art und Weise. Nach Abkühlen auf 29°C und Korrektur der Acidität der Kulturlösung auf pH 7,0 mit 25%igem NH4OH erfolgt die Beimpfung mit 15Vol.-% aus der Vorkultur. Die Biotrockenmassekonzentration beträgt nach Beimpfung 0,9g/l. Die Acidität der Kulturlösung wird über die gesamte Fermentationszeit mittels NH4OH (25%ig) über einen Regler im Bereich von pH 6,8 bis pH 7,0 konstant gehalten. Die Temperatur beträgt 29°C und der Druck0,11 MPa. Bis zur 22. Stunde wird in der Kulturlösung eine Biotrockenmassekonzentration von 48,5g/l erreicht. Zur 20. Stunde werden 101 sterilisierto Saccharoselösung mit einer Konzentration von 700g/l in den Tauchstrahlfermentor zugegeben. Ab 22. Stunde wird die Begasungsintensität reduziert, so daß die Sauerstoffübergangsgeschwindigkeit unter 6g/l x h liegt.
Bis zur 40. Stunde werden weitere 5 Portionen a 101 Saccharoselösung zugegeben. Die weitere Zugabe von Saccharoselösung ab 40.Stunde erfolgt in Portionen von nur 51.
Insgesamt wurden 1151 Saccharoselösung dem Prozeß zudosiert. Nach einer Fermentationszf.it von 60 Stunden wird eine Fermentorbefüllung von 2901 mit einer L-Lysinkonzentrat!on von 105g/l L-Lysin (als Monohycrochlorid) erhalten. Der Konversionsgrad L-Lysin x HCI/Saccharose beträgt 27g L-Lysin x HCI/100g Saccharose.
Vorzucht und Hauptkulturführung entsprechend bis auf die Saccharosezuführung dem Beispiel 1.
Ab 24. Stunde wird Saccharoselösung in einer Konzentration von 700g/l kontinuierlich mit zwischengeschalteten Pausen zugegeben.
Die Dosierung erfolgt nach folgendem Schema:
| Zeit | Dosierung | Menge |
| 24.-30. h | 4 l/h | 241 |
| 30.-31. h | Dosierpause | |
| 31.-36. h | 4 l/h | 201 |
| 36.-37. h | Dosierpause | |
| 37.-42. h | 4 l/h | 201 |
| 42.-43. h | Dosierpause | |
| 43.- 48. h | 3 l/h | 151 |
| 48.-49 h | Dosierpause | |
| 49.-54. h | 3 l/h | 151 |
| 54.-55. h | Dosierpause | |
| 55.-60. h | 2 l/h | 101 |
| 60.-61. h | Dosierpause | |
| 61.-66.h | 2 l/h | 101 |
| 66.-67. h | Dosierpause | |
| 67.-72. h | 1 l/h | 51 |
Nach 72 Stunden Fermentationszeit werden 2951 Fermentorbefüllung mit einer L-Lysinkonzentration von 102 g/l L-Lysin (als Monohydrochlorid) erreicht. Der Konversionsgrad L-Lysin x HCI/Saccharose beträgt 26g L-Lysin χ HCI/100g.
Die Anzucht des Impfmaterials von Corynebacierium glutamicum erfolgt wiederum in an sich bekannter Art und Weise in zwei Stufen.
Anstelle von Corynebacterium glutamicum können Mikroorganismen der Gattungen Nocardia, Arthrobacter, Mycobacterium, Pseudomonas, Acinetobactcr, Bacillus, Brevibacterium oder Micrococcus eingesetzt werden.
Als Hauptkulturfermentor dient ein Tauchstrahlfermentor mit einer Sauerstoffübergangsgeschwindigkeit von 14,5kg/m3 χ h, der nach Sterilisation in an sich bekannter Weise 1651 Nährlösung folgender Zusammensetzung enthält:
148,0 g/l Saccharose
3,8 g/l Ci-NH2N (aus Maisquellwasser und Sojamehihydrolysat als komplexe N-Quelle) 6,3 g/l KH2PO4 0.8g/IMgSO4x7H2O 30,0 g/l (NH4)2SO4 0,5 mg/l B,-Vitarnin 0,12 mg/l Biotin
Die Beimpf ung erfolgt nach der pH-Einstellung der Kulturlösung auf pH 6,8 mit 5 Vol.-% der Vorkuitur. Die Biotrockenmassekonzentration beträgt nach Beimpfen 0,4g/l.
Bis zur 25. Stunde wird in der Kulturlösung eine Biomassetrockenkonzentration von 54,5g/l erreicht.
Zur 26. Stunde wird die Fermentationslösung aus dem Tauchstrahlfcrmentor mittels Sterilluft in einen sterilisierten 400-I-Rührfermentor gedruckt, in dem die Rührerdrehzahl auf 350U/min, der Luftdurchsatz auf 3,5 mVh eingestellt und die Fermentation so bis zur 65. h weitergeführt wird.
Die Prozeßparamter pH-Wert, Temperatur sowie die pH-Regelung und die Saccharoselösungszugabe entsprechen dem Beispiel 1; der Druck beträgt 0,14MFa.
insgesamt werden bei einer Fermentationszeit von 65 Stunden 1361 Saccharoselösung und 14 kg Saccharose in kristalliner Form zudosiert, wobei die kristalline Saccharose ab 45. Stunde zugegeben wird. Die Endbefüllung beträgt 2901 mit einer L-Lysinkonzentration von 120g/l L-Lysin (als Monohydrochlorid).
Der Konversionsgrad L-Lysin x HCI/Saccharose beträgt 26g L-Lysin χ HCI/100g Saccharose.
Claims (7)
1. Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Lysin durch aerobe Kultivierung von L-Lysin bildenden Mikroorganismen bei pH 5 bis 8 und Temperaturen von 27 bis 350C in einem Nährmedium, das Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Salze und Vitamine enthält, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung der Mikroorganismen bei intensivem Sauerstoffeintrag, hoher Stickstoffkonzentration und einer C-Quellennachdosierung erfolgt.
2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Sauerstoffeintrag bis zur
26. Kultivierungsstunde durch Sauerstoffübergangsgeschwindigkeiten von mindestens 6g/l x h realisiert wird.
?.. Verfahren nach den Punkten 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein Nährmedium verwendet wird, das eine komplexe organische Stickstoffquelle mit einem a-NH2-N-Gehalt in der Nährlösung von 2,6 bis 4,5g/l, vorzugsweise jedoch von 3,0 bis 3,4g/l, enthält.
4. Verfahren nach den Punkten 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die weiteren Komponenten des Nährmediums in diesem wie folgt enthalten sind:
— eine anorganische Stickstoffquelle, beispielsweise in Form von (NH4I2SO4, mit einem NH4-N-Gehalt in der Nährlösung von 3 bis 18g/l, vorzugsweise jedoch von 8 bis 14g/l
— eine Phosphorquelle, beispielsweise in Form von KH2PO4, mit einem P-Gehalt von 1,0bis2,0g/l, vorzugsweise 1,1 bis 1,3 g/l
— weitere Nährsalze und Spurenelemente, z. B. MgSO4 x 7 H2O, K2SO4, FeSO4, ZnSO4, NiSO4 x 7H2O, Cr2(SO4J3 x 18H2O, CrCI2, NiCI2
— eine Kohlenhydratquelle zu Fermentationsbeginn, berechnet als Kohlenstoff, von 60 bis 105g/l, vorzugsweise von 80 bis 95g/l, sowie eine Nachdosierung während der Fermentation in der Menge, daß die Konzentrationvon 0,1 bis 16g/l, vorzugsweise jedoch 4 bis 8g/l, aufrechterhalten wird.
5. Verfahren nach den Punkten 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß Mikroorganismen der Gattungen Nocardia, Arthrobacter, Myoobacterium, Pseudomonas, Acinetobacter, Bacillus, bevorzugt aber Stämme der Gattungen Brevibacterium bzw. Micrococcus und insbesondere solche der Gattungen Corynebacterium, verwendet werden.
6. Verfahren nach den Punkten 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus Corynebacterium glutamicum CCM 3287 verwendet wird.
7. Verfahren nach den Punkten 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das gesamte Verfahren oder nur der Verfahrensschritt mit der hohen Sauerstoffübergangsrate in einem Hochleistungsfermentor, insbesondere in einem Tauchstrahlfermentor, durchgeführt wird.
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD25173983A DD268834A3 (de) | 1983-06-03 | 1983-06-03 | Verfahren zur fermentativen herstellung von l-lysin |
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| DD (1) | DD268834A3 (de) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2669935A1 (fr) * | 1990-11-30 | 1992-06-05 | Ajinomoto Kk | Procede et appareil pour la regulation de la concentration de source de carbone dans la culture aerobie d'un micro-organisme. |
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-
1983
- 1983-06-03 DD DD25173983A patent/DD268834A3/de not_active IP Right Cessation
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