DD290351A5

DD290351A5 - Verfahren zur herstellung von makrolid-verbindungen

Info

Publication number: DD290351A5
Application number: DD89335848A
Authority: DD
Inventors: Laverne Dwaine Boeck; Hang Chio; Tom Edward Eaton; Otis Webster Godfrey Jr; Karl Heinz Michel; Walter Mitsuo Nakatsukasa; Raymond Che-Fong Yao
Original assignee: Eli Lilly And Company,Us
Priority date: 1988-12-19
Filing date: 1989-12-18
Publication date: 1991-05-29
Also published as: RO106065B1; GT198900078A; ZA899680B; MX18755A

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Makrolid-Verbindungen, die als neue Gruppe derartiger Verbindungen wertvolle Wirkstoffe in Insektiziden und Mitiziden darstellen. Die als A83543 bezeichneten Verbindungen lassen sich durch Zuechtung von Staemmen der Spezies Saccharopolyspora spinosa in Kulturmedien mit assymilierbaren Quellen fuer Kohlenstoff, Stickstoff und anorganischen Salzen unter aeroben Submersbedingungen herstellen.{Makrolid-Verbindungen; Insektizide; Mitizide; Bekaempfung von Ektoparasiten; A83543-Verbindungen; Saccharopolyspora spinosa; Verfahren; Herstellung}

Description

Hierzu 16 Seiten Zeichnungen

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Makrolid-Verbindungen, die zur Bekämpfung von Insekten und Milben angewendet werden.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Veröffentlichungen, die der vorliegenden Erfindung als Stand der Technik zugrunde liegen, sind zur Zeit nicht bekannt.

Ziel der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, neue Mittel zur Bekämpfung von Insekten und Milben bereitzustellen.

Es besteht oin ernsthaftes Bedürfnis nach neuen Insektiziden und Mitiziden, da die zu bekämpfenden Organismen rasch gegen die derzeit eingesetzten Insektizide und Mitizide resistent werden. Die Resistenz gegenüber Insektiziden bei Arthropoden ist weit verbreitet, wobei mindestens 400 Spezies gegenüber einem oder mehreren Insektiziden resistent sind.

Die Entwicklung von Resistenzen gegenüber älteren Insektiziden, wie DDT, Carbamate und Organophosphate, ist bekannt. Es sind aber auch bereits Resistenzen gegenüber einigen neueren Pyrethroid-Insektiziden und Mitiziden entstanden. Daher besteht ein Bedürfnis nach neuen Insektiziden und Mitiziden.

Die Bekämpfung von Ektoparasiten, wie Fliegen, Zecken, Stechfliegen (biting flies) und dgl., stellt ein seit langem erkanntes wichtiges Problem in der landwirtschaftlichen Tierhaltung dar. Die traditionellen Behandlungsmethoden zur Behandlung von Haustieren bestehen im topischen Aufbringen von Insektiziden; z. B. die bekannten Desinfektionsbäder für Schafe. Derartige Behandlungsverfahren sind immer noch weit verbreitet. Derzeit bemüht man sich, Verbindungen aufzufinden, die den Tieren vor allem auf oralem Wege verabreicht werden können und mit denen Ektoparasiten bekämpft werden können, wobei die Parasiten vergiftet werden sollen, wenn sie das Blut der behandelten Tiere aufnehmen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Vorfahren zur Herstellung der Verbindung A83543 der Formel I RO

in der R, H oder eine Gruppe der Formeln

-V_nCH₃

..,ι OR²

(CH₃)NH-^ CH₃ O

(b)

(D

(C)

bedeutet;

R² eine Gruppe der Formel

R⁵O O-

or

(d)

bedeutet,

R¹, R³, R⁶, R^e Wasserstoff oder Methyl bedeuten; und R⁴ Methyl oder Ethyl bedeutet; oder von phytologisch verträglichen Salzen davon, sofern R nicht Wasserstoff bedeutet; dadurch gekennzeichnet, daß man einen Stamm von Saccharopolyspora spinosa aus der Gruppe NRRL18395, NRRL18537, NRRL18538 oder NRRL18539 bzw. eine A83543-bildende Mutante davon in einem Kulturmedium, das assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthält, unter aeroben Submersbedingungen züchtet, bis eine gewinnbare Menge an A83543 gebildet worden ist.

Das orfindungsgemäß hergestellte Fermentationsprodukt wird als „A83543" bezeichnet, das die Einzelkomponenten A83543 A, A83543B, A83543C, A83543D, A83543E, A83543F, A83543G, A83543H und A83543 J enthält. A83543 und die einzelnen A83543-Komponenten eignen sich zur Bekämpfung von Insekten, insbesondere der Spezies Lepidoptera, wie Spodoptera eridania, und der Spezies Diptera, wie Schmeißfliege, Stechfliege und Moskitos. Diese /erbindungen sind somit Bestandteile in wertvollen Insektiziden Mitteln zur Verringerung der Population von Insekten oder Milben.

Im Hinblick auf die einfache Herstellungsweise werden Verbindungen der vorstehenden Formel I bevorzugt, in der für die Reste R, R¹, R³, R⁴, R⁶ und R⁶ folgende Kombinationen verwirklicht sind:

R	R¹	R³	R⁴	R⁶	R^e
(a)	Me	H	Et	Me	Me
(b)	Me	H	Et	Me	Me
(O	Me	H	Et	Me	Me
(a)	Me	Me	Et	Me	Me
(a)	Me	H	Me	Me	Me
(a)	H	H	Et	Me	Me
(d)	Me	H	Et	Me	Me
(a)	Me	H	Et	H	Me
(a)	Me	H	Et	Me	H
H	Me	H	Et	Me	Me
H	Me	Me	Et	Me	Me
J	Me	H	Me	Me	Me
H	H	H	Et	Me	Me
H	Me	H	Et	H	Me
H	Me	H	Et	Me	H

sowia die Säureadditionssalze der entsprechenden Verbindungen, in dopen R nicht Wasserstoff bedeutet. Der Aminozucker in A83543 A wurde als ß-D-Forosamin und der Neutralzucker als ci-2,3,4-Tri-0-methylrhamnose identifiziert. Neun Komponenten von A-63543 wurden charakterisiert. Bei diesen Komponenten handelt es sich um Verbindungen der Formel I, wobei R kein Wasserstoffatom bedeutet. Diese Verbindungen weisen folgende Strukturen auf:

Komponente	R	R¹	R³	R⁴	R⁵	R^e
A	(a)	Me	H	Et	Me	Me
B	(b)	Ml	H	Et	Me	Me
C	(c)	Me	H	Et	Me	Me
D	(a)	Me	Me	Et	Me	Me
E	(a)	Me	H	Me	Me	Me
F	(a)	H	H	Et	Me	Me
G	(d)	Me	H	Et	Me	Me
H	(a)	Me	Il	Et	H	Me
J	(a)	Me	H	Et	Me	H

Der Aminozucker kann von den Komponenten A83543 unter Bildung von Pseudoaglyconen (Verbindungen der Formel I, in der R die Bedeutung H hat) entfernt werden. Die Komponenten A, B, C und G besitzen ein gemeinsames Pseucoaglycon, das A83543 A-Pseudoaglycon oder Pseudo-A). Später wurde festgestellt, daß das A83543 A-Pseudoaglycon als eine natürliche Komponente von A83W3 gebildet wird. Die Komponenten D, E, F, H und J weisen jeweils ein besonderes Pseudoaglycon auf. Die A83543-Pseudoaglycone besitzen folgende Strukturen:

Pseudoaglycon'	R¹	R³	R⁴	R⁵	R'
A83543A	Me	H	Et	Me	Me
A83543D	Me	Me	Et	Me	Me
A83543E	Me	H	Me	Me	Me
A83543F	H	H	Et	Me	Me
A83543H	Me	H	Et	H	Me
A83543J	Me	H	Et	Me	H

Die Pseudoaglycone eignen sich als Zwischenprodukte, beispielsweise für die A83543-Komponenten.

In den folgenden Abschnitten sind die physikalischen und spektralen Eigenschaften der A83543-Komponenten und der Pseudoaglycone zusammengestellt. Folgende Abkürzungen werden verwendet:

EI-MS: Elektronenstoß-Massenspektrometrie

FAB-MS: Fast-Atom-Bombardment-Massenspektrometrie

FD-MS: Felddesorptions-Massenspektrometrie

HPLC: Hochleistungs-Flüssig-Chromatographio

IR: Infrarot

NMR: kernmagnetische Resonanz

UV: Ultraviolett.

Eigenschaften von A83543A

Molekulargewicht: 731 Empirische Formel: C₄₁H₆₆NO₁₀ FD-MS: vgl. Fig. ν

FAB-MS (M + 1); gjf.: 732,4706; ber.: C₄₁H₆₄NO₁₀ = 732,4687 (vgl. Flg.8) EI-MS: gef. 731,4612; ber.: 731,4608 (vgl. Fig.10).

UV (EtOH) A_mlx: 243nm (ε 8920), IR (CHCI₃): ν (Lacton) 1713; (konjugiertes Keton) 1657; Mehrfachpeaks für C-H-Schwingungen um 2940 und für C-O-Schwingungen um 1060 cm"¹ (vgl. Fig. 1) [a]&^w: -121.8"(C = 1,03; CHCI₃) laß⁶⁵: +6,8° (c = 1,03; CHCI₃).

In Tabelle I sind die ¹H- und ¹³C NMR-Daten für A83543A (in Aceton-d₆) zusammengestellt.

Tabelle I

¹H- und ¹³C-NMR-Daten von A83543 A in Aceton-d_e.

Position	"C	¹H¹
1	172,02	—
2	33,83	3,07/2,45
3	48,13	2,94
4	41,65	3,48
(Jl	129,12	5,86
6	129,66	5,89
7	41,46	2,15
8	36,50	1,99/1,34
9	76,31⁺	4,31
10	37,65	2,36/1,36
11	46,42	0,93
12	49,74	2,87
13	147,78	7,01
14	144,27	—
15	202,46	—
16	47,74	3,30
17	80,41	3,53
18	30,33	1,51
19	21,85	1,78/1,17
20	34,45	1,50
21	76,24⁺	4,66
22	28,51	1,48
23	8,97	0,81
24	15,71	1,12
1'	96,34	4,81
2'	77,61	3,51
3'	81,87	3,37
4'	82,43	3,00
5'	68,03	3,48
6'	17,64	1,18
2'-OCH₃	56,66»	3,37
3'-OCH₃	'J8,39·	3,41
4'-OCH₃	60,12	3,45
Γ	103,45	4,45
2"	31,24	1,92/1,37
3"	18,14	1,84/1,52
4"	65,34	2,12
5"	73,35	3,56
6"	18,87	1,21
N(CH₃J₂	40,38	2,22

a Einige Messungen wurden aus der 'H/^l3C-Korrelation entnommen.

+,* Resonanzen mit dem gleichen hochgestellten Index können ausgetauscht werden.

Eigenschaften von A83543B Molekulargewicht: 717 Empirische Formel: FAB-NS: (vgl. Fig.9)

Eigenschaften von A83543 C Molekulargewicht: 70S Empirisch Formel: C₃₉HeINOi₀ FDMS: (vgl. Fig.5)

Eigenschaften von A83543 D

Molekulargewicht: 745 Empirische Formel: C₄₂Hg₇Nu₁O UV (EtOH) λ™»: 244nm (e 9910), IR (CHCI₃)IV(LaCtOn) 1708; (konjugiertes Keton) 1658; Mehrfachpeaks für C-H-Schwingungen um 2940 und für C-O-Schwingungen um 1070cm"¹ (vgl. Fig. 2) [aß⁸³: -142,9° (c = 1,02; CHCI₃) (a)ä^M:-29,9° (c= 1,02; CHCI₃) FD-MS: vgl. Fig.6.

In Tabelle Il sind die ¹H- und ¹³C NMR-Daten für A83543D (in Aceton-d_e) zusammengestellt.

Tabelle Il

¹H- u.id '³C-NMR-Daten von A83543D in Aceton-d_a

Position	"C	¹H'
1	172,68	—
2	34,38	3,08/2,43
3	49,01	2,90
4	42,83	3,47
5	123,27	5,54
6	137,26	—
6-CH₃	20,81	1,74
7	44,41	2,18
8	35,61	2,01/1,45
9	76,72	4,32
10	38,64	2,37/1,37
11	47,04	1,02
12	50,05	2.78
13	148,47	7,04
14	145,19	—
15	203,16
16	48,47	3,30
17	81,03	3,53
18	30,99	1,49
I9	22,51	1,78/1,19
20	35,12	1,49
21	76,84	4,65
22	29,16	1,48
23	9,55	0,81
24	16,32	1,12
V	97,11	4,85
2'	78,33	3,54
3'	82,58	3,40
4'	83,15	3,03
5'	68,71	3,50
6'	18,26	1,18
2'-OCH₃	57,31»	3,40
3'-OCH₃	53,02»	3,43
4'-OCH₃	60,71	3,47
1"	104,14	4,47
2"	31,96	1,94/1,39
3"	18,83	1,81/1,49
4"	66,06	2,12
5"	74,12	3,55
6"	19,42	1,20
N(CH₃I₂	40,99	2,21

einige Zuordnungen sind der 'H/^l3C-Korrelation entnommen. Die Resonanzen können ausgetauschtwerden.

Eigenschaften von A83543 E

Molekulargewicht: 717

Empirische Formel: C₄₀H_nNOiO

FAB-MS (M + 1): gef.: 718,4526; ber.: C₄₀He₃NO₁₀ 718,4530 UV (EtOH) X_n,.,,: 244 nm (ε 8600)

IR (KBr) (vgl. Fig. 13).

In Tabelle III sind die ¹H- und '³C NMR-Daten für A83543E (in Aceton-d_e) zusammengestellt.

Tabelle Hl

¹H-und "C-NMR-Daten von A83543E in Aceton-d_e

Position	13_C	¹H¹
1	172,46	—
2	34,95	3,06/2,40
3	48,88	2,95
4	42,11	3,43
5	129,78	5,86
6	130,39	5,90
7	42,11	2,14
8	37,18	1,96/1,39
9	77,06	4,33
10	38,31	2,36/1,36
11	47,18	0,93
12	50,40	2,86
13	148,37	7,06
14	144,84	—
15	203,09	—
16	48,05	3,34
17	81,35	3,55
18	34,98	1,62/1,48
19	22,25	1,77/1,13
20	33,73	1,50
21	72,97	4,68
22	21,61	1,12
23	—	—
24	16,52	1,13
1'	97,11	4,83
2'	78,36	3,55
3'	02,55	3,37
4'	83,13	3,02
5'	68,72	3,50
6'	18,26	\18
2'-OCH₃	59,01	3,43
3'-OCH₃	57,30	3,40
4'-OCH₃	60,69	3,46
1"	104,24	4,47
2"	32,00	Vj3/1,39
3"	18,86	1,82/1,50
4"	66,06	2,12
5"	74,13	3,57
6"	19,42	1,21
N(CH₃I₂	40,99	2,21

a Einige Messungen wurden der 'H/¹³C-Korrelation entnommen.

Eigenschaften von A83543F

Molekulargewicht: 717

Empirische Formel: C₄₀Hg₃NO₁₀

FAB-MS (M + 1): gef.: 718,4534; ber.: C₄₀He₃NO₁₀ 718,4530 UV (EtOH) X_m>x: 243nm (ε 10500) und 282nm (ε 109) IR (KBr): (vgl. Fig. 14).

In Tabelle IV sind die ¹H- und ¹³C NMR-Daten für A83543F (in Aceton-d_e) zusammengestellt.

Tabelle IV

¹H- und '³C-NMR-Daten für A83543D in Aceton-d«

Position	»c	¹H'
1	172,60	—
2	34,50	3,06/2,42
3	48,82	2,95
4	42,46	3,45
CJl	129,56	5,87
β	130,39	5,92
7	42,19	2,16
8	37,18	1,97/1,35
9	77,15	4,65
10	38,30	2,33/1,34
11	46,89	0,94
12	50,34	2,84
13	148,86	7,03
14	145,73	—
15	198,68	—
16	45,49	3,22/2,50
17	74,17	3,58
18	30,74	1,52
19	22,41	1,70/1,17
20	34,45	1,51
21	77,09	4,32
22	29,05	1,48
23	9,56	0,81
V	97,19	4,83
2'	78,38	3,53
3'	82,58	3,38
4'	83,15	3,00
5'	68,74	3,48
6'	18,25	1,18
2'-OCH₃	59,02	3,43
3'-OCH₃	57,31	3,40
4'-OCH,	60,69	3,47
1"	100,19	4,53
2"	32,41	1,80/1,38
3"	18,86	1,83/1,53
4"	66,16	2,13
5"	74,01	4,01
6"	19,46	1,22
N(CH₃I₂	41,01	2,22

a Einige Messungen wurden aus der 'H/'³C-Korrolation entnommen

Eigenschaften von A83543G Molekulargewicht: 731 Empirische Forme·: C₄₁H₆SNO₁₀ FAB-MS (M + 1): gef.: 732,4661; ber.: C₄₁H₆₅NO₁₀ = 732,4687 UV (EtOH) A_n,,,,: 243nm (ε 8970) IR (KBr): (vgl. Fig.15). In Tabelle V sind die ¹H- und '³C NMP-Daten für A83543G (in Aceton-d₆) zusammengestellt. Tabelle V

¹H- und "C-NMR-^oten für A83543D in Aceton-d₆

Position	'³C	¹H'
1	172,59	—
2	34,67	3,04/2,46
3	48,72	2,94
4	42,25	3,50
5	129,85	5,84
6	130,26	5,89
7	42,02	2,14
8	' 37,12	1,95/1,34

Fortsetzung von Tabelle V:

Position	¹³C	¹H'
9	76,99	4,32
10	38,28	2,36/1,36
11	47,23	0,91
12	50,43	2,87
13	148,28	7,04
14	144,61	—
' 15	203,20	—
16	47,94	3,30
17	81,73	3,57
18	35,20	1,55
19	21,68	1,64/1,16 ,
20	31,41	1,64/1,36
21	76,47	4,64
22	28,84	1,48
23	9,61	0,80
24	15,29	1,18
V	96,98	4,81
2'	78,23	3,52
3'	82,46	3,37
4'	83,05	2,29
5'	68,64	3,49
6'	17,18	1,12
2'-OCH₃	58,97	3,42
3'-OCH₃	57,25	3,39
4'-OCH₃	60,70	3,46
1"	99,51	4,80
2"	29,62	1,87/1,48
3"	19,31	1,73
4"	62,13	2,29
5"	69,93	4,20
6"	18,22	1,17
N(CH₃I₂	43,47	2,24

a EinigeM688ungenwurdenausder'H/'³C-Korrelatlonentnommen

Eigenschaften von A83543H Molekulargewicht: 717 Empirische Formel: CwH₆₃NOtO UV (EtCH) X_ma)<: 243nm (ε 10100)· IR (KBr): vgl. Fig.16».

* bestimmt an einem A83543H:J (58:42)-Gemisch

Eigenschaften von A83S43 J Molekulargewicht: 717 Empirische Formal: C₄₀H_nNO₁₀ UV (EtOH) K_mtx: 243 nm (ε 10100)· IR (CHCI₃): vgl. Fig. 16».

* bestimmt an einem A83543H:J (58:42)-Gemisch

A83543 H und J werden aus A83543 als ein Gemisch (H: J-Gemisch = 58:42) abgetrennt. Dieses Gemisch kann wie nachstehend beschrieben durch analytische Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) aufgetrennt werden. Die A83543 H und J zugeordneten Strukturen beruhen auf ¹H- und "C-MMR-Untersuchungen des A83543 H:J-Gemisches in Aceton-d₆. Die NMR-Spektren sind sich ähnlich und wurden /nit dem von A83543A verglichen. Die Hauptänderungen in den H- und J-Spektren sind um den Rhamnose-Zucker zentriert. Die Komponenten H und J haben nur zwei OCH₃-Gruppen in diesem Zucker. In der Komponente H ist H-V im 'H-NMR-Spektrum um etwa 0,1 δ und im "C-NMR-Spektrum um 3 δ vorschoben (4,81 bzw. 99,68). Diese Verschiebungen sind auf die Abwesenheit von Methyl am Methoxyrest in der 2'-Stellung zurückzuführen. Die Verschiebungen in der Komponente J entsprechen einer ähnlichen Abwesenheit von Methyl an der Methoxygruppe in der 3'-Stellung.

Eigenschaften von A83543 A-Pseudoaglycon Molekulargewicht: 590 Empirische Formel: C₃₃H₆₀Os UV (EtOH) X_011x: 243nm (e 10300) IR-(CHCI₃: -J (Lacton) 1724; (konjugiertes Keton 1652; Mehrfach-Peaks für C-H-Schwingungen um 3017; Mehrfach-Peaks für C-O-Schwingungen um 1140cm"¹ (vgl. Fig.3) FD-MS: vgl. Fig.7 EI-MS: vgl. Fig. 11.

Eigenschaften von A83543 D-Pseudoaglycon Molekulargewicht: 604 Empirische Formel: C₃₄H₆₂O₉

Die A83543-Komponenten lassen sich voneinander gemäß einem der folgenden analytischen HPLC-Systeme (rennen.

System I

Säule: ODS, 3μ 4,5 x 50mm (IBM) Lösungsmittel: CH₃OH:CH₃CN:H₂O (2:2:1) Strömungsgeschwindigkeit: 1,0ml/min Nachweis: UV bei 245nm Temperatur: Raumtemperatur

Komponente	Retentionszeit(min)
A	8,50
B	6,15
C	3,92
D	11,47

System Il

Säule: 4,6 χ 100mm, ODS

(AQ-301, S-5; YMC, Inc., Mt. Freedom, NJ) Lösungsmittel: CH₃OH:CH₃CN:0,05%NH₄OAc(H₂O)

(A) 35:35:30-pH-Wert 7,8

(B)45:45:10-pH-Wert6,7 Strömungsgeschwindigkeit: 2,0ml/min Laufzeit: 35min Nachweis: UV, 250nm

Gradient: 10% B auf 25% B in 20min; auf 50% Bin 30min. Komponente Retentionszeit(min)

A	System III	22,62	!,Oml/min
A-Pseudoaglycon	Säule: 4,6 χ 100mm, ODS	7,27
B	12,65
C	10,62	Retentionszeit(min)
D	25,47	4,32
E	19,22	3,42
F	16,30	3,42
G	18,92
H	16,30
J	17,50


(AQ-301, S-5; YMC, Inc., Mt. Freedom, NJ)
Lösungsmittel: CH₃OH:CH₃CN:0,05%NH₄OAc(H₂O)
35:35:30-pH-Wert 6,0
Strömungsgeschwindigkeit: 2
Laufzeit: 10min
Nachweis: UV, 250nm
Komponente
F
H
J

Die A83543-Komponenten sind in Wasser nicht löslich, jedoch löslich in Lösungsmitteln, wie Methanol, Ethanol, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, Acetonitril, Aceton und dgl.

A83543 und die einzelnen Komponenten, wie A83543A, A83543B, A83543C, A83543D, A83543E, A83543F, A83543G, A83543 H und A83543 J können unter Bildung von verschiedenen Salzen reagieren. Sämtliche Formen dieser Verbindungen sind Gegenstand der Erfindung, Die A83543-Salze sind beispielsweise wertvoll zur Abtrennung und Reinigung von A83543. Ferner besitzen einige Salze eine verbesserte Löslichkeit in Wasser.

Die Salze von A83543 werden nach üblichen Verfahren zur Salzherstellung hergestellt. Beispielsweise kann A83543 mit einer geeigneten Säure unter Bildung eines Säureadditionssalzes neutralisiert werden.

Die Säureadditionssalze sind besonders geeignet. Zu den repräsentativen geeigneten Salzen gehören Salze, die durch Standardaktionen mit organischen und anorganischen Säuren gebildet sind, z. B. mit Schwefelsäure, Salzsäure, Phosphorsäure, Essigsäure, Bernsteinsäure, Citronensäure, Milchsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Cholsäure, Pamoasäure, Mucinsäure, Glutaminsäure, Kampfersäure, Glutarsäure, Glycolsäure, Phthalsäure, Weinsäure, Ameisensäure, Laurinsäure, Stearinsäure, Salicylsäure, Methansulfonsäure, Benzolsulfonsäure, Sorbinsäure, Picrinsäure, Benzoesäure, Zimtsäure und dgl.

Bei den Erörterungen über die Anwendbarkeit bedeutet der Ausdruck „A83543-Verbindung" vorzugsweise einen Bestandteil aus der Gruppe A83543, Einzelkomponenten A83543A, A83543 B, A83543 C, A83543 D, A83543 E, A83543 F, A83543 G, A83543H und A83543 J und deren Säureadditionssalze.

Das Fermentationsprodukt A83543 wird durch Züchtung eines Stamms des neuen Mikroorganismus Saccharopolyspora spinosa, der unter NRRL18395, NRRL18537, NRRL18538 und NRRL18539 oder einer A83S43-bildenden Mutante davon ausgewählt ist, unter aeroben Submersbedingungen in einem geeigneten Kulturmedium bis zur Bildung einer gewinnbaren Menge an A83543 hergestellt. Der Fachmann auf dem Gebiet der Fermentationsverfahren erkennt, daß das Verhältnis der Komponenten in A83543 je nach den zu dessen Herstellung verwendeten Fermentationsbedingungen variiert. Im allgemeinen enthält A83543 etwa 85 bis 90%A83543A,etwa 10 bis 15% A83543D und untergeordnete Mengen an A83543B, C, E, F, G, H und J sowie A83543A-Pseudoagylcon. Die einzelnen Komponenten wie A83643A, A83543 B, A83543C, A83543D, A83543E, A83543F, A83543G, A83543H und A83543J sowie A83543A-Pseudoaglycon, lassen sich auf die nachstehend beschriebene Weise trennen und Isolieren.

Die Isolation kann nach an sich üblichen Verfahren erfolgen.

Die Erfindung betrifft auch eine biologisch gereinigte Kultur des Mikroorganismus Saccharopolyspora spinosa aus der Gruppe NRRL18395, NRRL18537, NRRL18538, NRRL18539 und A83543 bildenden Mutanten davon. Diese Mikroorganismen sind aufgrund der Bildung von A83543 wertvoll.

Zur Vereinfachung werden in den nachstehenden Erörterungen die Stämme folgendermaßen bezeichnet: A83543.1, A83543.3, A83543.4 und A83543.5. Die Kultur A83543.1 wurde durch chemische Mutation einer Kultur (A83543), die aus einer auf den Jungferninseln gewonnenen Bodenprobe isoliert worden war, erhalten. Die Kulturen A83543.3, A83543.4 und A83543.5 wurden aus Derivaten der A83543.1-Kultur durch chemische Mutationen erhalten.

Die Kulturen A83543.1, A83543.3, A83543.4 und A83543.5 wurden bei der Kulturensammlung des Midwest Area Northern Regional Research Center, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture, 1815 North University Street, Peoria, Illinois, 61604 hinterlegt. Sie sind dort der Öffentlichkeit unter den folgenden Hinterlegungs-Nummern zugänglich:

NRRL-Nr.	Stamm-Nr.
18395	A83543.1
18537	A83543.3
18538	A83E43.4
18539	A83543.5

Taxonomische Untersuchungen der Kultur A835<*3.1 wurden von Frederick P. Mertz in den Lilly Research Laboratories durchgeführt. Aufgrund dieser Untersuchungen wurden die Mikroorganismen A83543.1, A83545.4 und A83t 43.5 als Mitglieder einer neuen Spezies der Gattung Saccharopolyspora mit der Bezeichnung Saccharopolyspora spinosa sp. nov. klassifiziert. Diese Klassifikation beruht auf direkten Laboratoriumsvergleichen und der Prüfung von veröffentlichten Beschreibungen ähnlicher Spezies.

Angewandte Methoden

Die Methoden entsprechen der Empfehlung des International Streptomyces Project (ISP) für die Charakterisierung der Spezies streptomyces (E. B. Shirling und D. Gottlieb, „Methods für Characterization of Streptomyces Species," Int. J. Syst. Bacteriol., Bd. 16 [1966], Seiten 313-340) und den Empfehlungen für die Charakterisierung der Spezies Nocardia von R.E.Gordon,

D. A. Barnett, J.E. Handerhan und C.H.Pang, „Nocardia coeliaca, Nocardia autotophica, and the Nocardin Strain, Int. J. Syst.

Bacteriol., Bd. 24 (1), (1974), Seiten 54-63.

ISCC-NBS Centroid Color Charts, Standardprobe Nr.2106 (National Bureau of Standards, 1958, U.S. Department of Commerce, Washington, D. C.) wurden zur Zuordnung von Farbbezeichnungen für die Rückseite und die Lufthyphen herangezogen.

Die Morphologie wurde unter Verwendung eines optischen Lichtmikroskops und eines Rasterelektronenmikroskops (SEM) untersucht. Das Isomere von Diaminopimelinsäure (DAP) und die Kohlenhydrate in Hydrolysaten vollständiger Zellen wurden durch die chromatographischen Verfahren von Becker et al. (B. Becker, M. P. Lechevalier, R. E. Gordon und H. E. Lechevalier, „Rapid Differentiation between Nocardia and Stremtomyces by Paper Chromatography of Whole-cell hydrolysates, „Appl.

Microbiol., Bd. 12 (1964), Seite 421-423) und von Lechevalier und Lechevalier (M. P. Lechevalier und H. Lechevalier, „Chemical Composition as a Criterion in the Classification of Aerobic Actinomycetes, „Int. J. Syst. Bacteriol., Bd. 20 [1970], Seiten 435 bis

443) festgestellt.

Phospholipide wurden gemäß dem Verfahren von M. P. Lechevalier und H. Lechevalier (In „A University Laboratory Approach", Herausgeber Dietz und Thayer, Society for Industrial Microbiology Special Publication No.6, Arlington, VA, [1980], Seiten 227-233) bestimmt.

Die Menachinon-Zusammensetzung wurde gernäß den Verfahren von R. M. Kroppenstedt (in „Chemical Methods in Bacterial Systematics", Herausgeber M.Goodfellowund D.E.Minnikin [1985], Seiten 173-196) und M.D.Collins (a.a.O., Seiten 267-285) bestimmt.

Die Resistenz gegen Antibiotika wurde durch Auflegen (Padding) von Antibiotika-Empiindlichkeits-Testscheiben auf die Oberfläche von beimpften ISP Nr.2-Agarplatten gemessen.

Stärkehydrolyse wurde durch Test auf die Anwesenheit von Stärke mit Jod an ISP Nr.4 (anorganische Salze - Stärke) Agarplatten bestimmt.

Die Fettsäureanalyse wurde unter Verwendung des HP5898 A Mikroorganismen-Identifikationssystemen durchgeführt (vgl.

L.Miller undT. Berger, „Bacterial Identification by Gas Chromatography of Whole Cell Fatty Acids," Hewlett-Packard Application Note 228-241, (1985), Seite 8 ff.).

Fettsäuremethylester wurden aus lyophylisierten vollständigen Zellen, die unter identischen Bedingungen gezüchtet worden waren, hergestellt.

Die Analyse der Hauptkomponenten erfolgte zweidimensional und unter Gonerierung durch einen Computer. Die Meßeinheit beim Diagramm der Hauptkomponenten (in Fig. 2 abgebildot) ist die Standardabweichung.

Mycolsäuren wurden gemäß den von Minnikin vorgeschlagenen Verfahren (D. E. Minnikin, I. G. Hutchinson und A. B. Caldicott, „Thin-Layer Chromatography of Methanolysates of Mycolic Acid-Containing Bacteria," J.Chromatography, Bd. 188 [1980], Seiten 221-233 bestimmt.

Kultureigenschaften

Die Kultur A83543.1 zeigte ein gutes Wachstum sowohl auf komplexen als auch auf definierten Medien. Die Kultur bildete auf sämtlichen eingesetzten Medien ein Luftmyzel. Die Farbe der Luftsporenmasse war vorwiegend hell gelbstrichig-rosa, erwies sich jedoch auf einer Anzahl von Medien als weiß. Die Rückseite war gelb bis gelbbraun. Es war keine ausgesprochene Pigrpentierung vorhanden. In einigen Medien wurde ein lösliches braunes Pigment an das Medium abgegeben. Die Kultureigenschaften sind in Tabelle Vl zusammengestellt.

Tabelle Vl: Kultureigenschaften von A83543.1"

Medium	Wachstum	Rückseiten-	Luftmycel	Färbung	lösliches Pigment
		Färbung	wachstum	92 y White
ISPMedium2	reichlich	76. LyBr.	reichlich	263. White	keines
ISPMedium3	gut	264.1. Gray	gut	263. White	keines
ISP Medium 4	gut	92.yWhite	gut	31.p.yPink	keines
ISPMedium5	reichlich	73.P.OY	reichlich	31.p.yPink	1. Brown
ISPMedium7	reichlich	77. m.yBr	reichlich	31.p.yPink	1. Brown
ATAAgar^b	reichlich	89. p. Y	reichlich	31.p.yPink	Brown
ATCC No. 172	reichlich	92.yWhite	reichlich	31.p.yPink	keines
Bennetts	reichlich	92.yWhite	reichlich	9. pk. White	1. Brown
Calciummalat	gut	73.P.OY	mittelmäßig	263. White	Brown
Chitin	mittelmäßig	92.yWhite	mittelmäßig	263. White	keines
Czapek	gut	92.yWhite	gut	31.p.yPink	keines
Emerson	reichlich	76.LyBr	reichlich	31.p.yPink	Brown
Glucose-	gut	9O.gy.Y	mittelmäßig		1. Brown
Asparagin				80.gy.yBr
Glycerin-Glycin	reichlich	78,d.yBr	reichlich	3Lp.yPink	d.Brown
Nähragar	reichlich	9O.gy.Y	reichlich	31.p.yPink	1. Brown
TPO⁰	reichlich	9O.gy.Y	reichlich	263. White	keines
TWA^d	mittelmäßig	93. y Gray	schlecht	9. pk. White t	keines
YDA«	reichlich	77. m.yBr	mittelmäßig	d.Brown

a 21lägige Inkubation bet 30°C.

b Actinomyceten-lsolierungsagar, Difco.

c Tomatenpaste-Hafermehl-Agar .In The Actinomycetes, Bd. 2, S. A. Wakaman, The Williams and Wilklns Co., Baltimore, 1961).

d Leitungswasser-Agar (Gordon, Barnett, Handerhan und Pang, a.a.0.).

e Hefe-Dextrose-Agar(Gordon, Barnott, Handerhan und Pang, a.a.0.).

Morphologische Eigenschaften

Die Kultur A83543.1 bildete ein ausgedehntes Substratmycel, das bei der Flüssigfermentation fragmentierte. Keine Fragmentierung wurde bei Züchtung der Kultur auf Agar-Medien beobachtet.

Weiße kreisförmige Kolonien von 8 bis 10 mm Durchmesser mit einem erhöhten Zentrum und einer gelbbraunen Rückseitenfärbung wurden b<)im Ausstreichen der Kultur auf ISP-Medium 1 beobachtet. Auf den meisten der Medien waren gut geformte Lufthyphen vorhaiden. Die Lufthyphen waren in lange Ketten von Sporen, die als Haien und offene Schleifen angeordnet waren, segmentiert. Spiralen wurden ebenfalls beobachtet, sie waren jedoch kurz und unvollständig. Die allgemeine Struktur war Rectus-flexibilis (RA).

Die Lufthyphen wiesen ein deutliches perlenartiges Erscheinungsbild auf, wobei aber zahlreiche Leerräume in der Sporenkette auftraten. Dieses Merkmal stellte einen Hinweis auf eine die Sporenkette umhüllende Sporenscheide dar.

Diese Sporenscheide war mit sehr ausgeprägten Dornen bedeckt. Die Dornen waren etwa 1 μιη lang und am Ende abgerundet.

Die Sporenform war länglich und wies durchschnittliche Abmessungen von 1,1 χ 1,5pm auf. Die Länge der Sporenkette betrug mehr als 50 Sporen. Es wurden keine Zick-Zack-Eigenschaften, Sclerotia-, Sporangia- oder bewegliche Zellen beobachtet.

Physiologische Eigenschaften

Die Kultur A83543.1 bildete Säure aus folgenden Kohlenhydraten: Ad ο η it, D-Arabinose, Erythrit, Fructose, Glucose, Glycerin, Mannit, Mannose, Ribose und Trehalose.

Die Kultur bildete keine Säure aus folgenden Quellen: L-Arabinose, Cellobiose, Cellulose, Dextrin, Dulcit, Ethanol, Galactose, Glycogen, Inosit, Inulin, Lactose, Maltose, Melecitose, Melibiose, a-Methyl-D-glucosid, Raffinose, L-Rhamnose, Salicln, Sorbit, L-Sorbose, Saccharose, Xylit oder Xylose.

Wachstum wurde mit Galactose, Maltose und Melecitose beobachtet aus diesen Kohlenhydraten wurde aber keine Säure gebildet.

Die A83543.1-Kultur verwertete die folgenden organischen Säuren als Natriumsalze: Acetat, Butyrat, Citrat, Formiat, Lactat, Malat, Proplonat, Pyruvat und Su-cinat. Die Kultur verwertete Benzoat, Mucat, Oxalat oder Tartrat nicht.

A83543.1 zersetzte Allantoin, Caluummalat, Casein, Elastin, Hippurat, Hypoxanthin, Testosteron, L-Tyrosin und Harnstoff. Sie war nicht fähig zur Zersetzung von Adenin, Esculin, Guanin, Stärke oder Xanthin.

A83543.1 bildete Katalase, Phosphatase, Urease und H₂S. Sie verflüssigte Gelatine und reduzierte Nitrat. Sie war gegen Lysozyme nicht beständig und bildete keine melanoiden Pigmente. Magermilch wurde weder peptonisiert noch hydrolysiert.

A83543.1 tolerierte NaCI-Konzentrationen bis einschließlich 11 %. Sie überlebte nach 8 Stunden bei 50°C nicht, wuchs aber bei Temperaturen zwischen 15 und 37⁰C.

A83543.1 war resistent gegen Cephalothin (30Mg) Penicillin G (10 Einheiten) und Rifampin (5μρ). Es war empfindlich gegen Bacitracin (10 Einheiten), Gentamicin (10Mg), Lincomycin (2Mg), Neomcycin (30Mg), Oleandomycin (15Mg), Streptomycin (10Mg), Tetracyclin (30mq), Tobramycin (10Mg)^una> Vancomycin (30Mg).

Zellwandanalyse

Hydrolysierte vollständige Zellen von A83543.1 enthielten meso-Diaminopimelinsäure. Diagnostische Zucker in den Vollzellextrakten waren Galactose und Arabinose. Somit besitzt A83543.1 ein Typ IV-Zellwandmuster und ein Typ A-Zuckermuster (Lechevalier und Lechevalier, a. a. O.). Die Zellen enthalten keine Mycolsäuren.

Die Pho· pholipid-Bestimmungen an den vollständigen Zellen ergaben die Anwesenheit von Phosphatidyl-cholin und Cardiolipin. Phosphatidyl-ethanolamin wurde nicht nachgewiesen. Somit weist A83543.1 ein Typ Plll-Phospholipidmuster auf

(M. P. Lechevalier, A. E. Stern und H. A. Lechevalier, „Phospholipids in the Taxonomy of Actinomycetes," inActinomycetes, ZbI.

Bakt. Suppl. Bd. 11, Herausgeber K. P. Schaal und G. Pulverer (Gustav Fischer Verlag, New York, 198¹).

Das nachgewiesene Menachinon war MK-9(H₄). Eine untergeordnete Menge an MK-9(H_e) wurde beobachtet.

Phagenausstrlch

Eine Anzahl von Streptomycetes-, Saccharopolyspora- und Amycolatopsis-Phagen wurden auf A83543.1 ausgestrichen. Es wurden keine Plaques beobachtet.

Identität von A83543.1

Wie vorstehend erörtert, weist die Kultur A83543.1 ein Typ IV-Zellwandmuster und ein Typ A-Vollzellen-Zuckermuster auf.

Folgende 13 Gattungen weisen dieses Muster c'er Zellchemie auf:

Nocardia, Rhodococcus, Corynebacterium, Casoobacter, Mycobacterium, Faenia (Micropolyspora), Pseudonocardia, Saccharomonospora, Saccharopolyspora, Actinopolyspora, Amycolata, Amycolatopsis und Kibdelosporangium. Diese Gattungen unterscheiden sich durch die Anwesenheit oder Abwesenheit von Mycolsäuren, durch die Fettsäurezusammensetzung und die Phospholipid- und Menachinon-Typen. Faenia, Pseudonocardia und Saccharopolyspora weisen mit A83543.1 identische chemotaxonomische Eigenschaften auf, jedoch unterscheiden sich diese Gattungen von A83543.1 in ihren morphologischen und Kultureigenschaften.

Die Gattung Faenia (Micropolyspora) besitzt glatte Sporen und kurze Sporenketten, die sowohl vom Luftmycel als auch von den Substrathyphen ausgehen. Ihre Lufthyphen sind spärlich und weiß gefärbt. Es handelt sich um thermophile Organismen, die Wachstum bei 60⁰C zeigen. A83543.1 besitzt keine dieser Eigenschaften und unterscheidet sich somit von Faenia.

Die Gattung Pseudonocardia besitzt Sporen sowohl am Luftmycel als auch an den Substrathyphen. Charakteristisch für sie sind akropetale Sprossen und Blastosporen. Sie weist eine charakteristische Zick-zack-Morphologie der Hyphen auf. Die Hyphen werden als gegliedert aber nicht-septiert beschrieben (vgl. A. Henssen und D. Schafer, „Amended Description of the Genus Pseudonocardia henssen and Description of a New Species Pseudonocardia spinosa Schäfer," Int. J. Syst. Bacteriol., Bd. 21 (1971), Seiten 29-34. Sie wächst sehr langsam. Eina Fragmentierung liegt nicht vor oder wird selten beobachtet. A83543.1 weist keine dieser Eigenschaften auf. Die Gattung Saccharopolysora ist durch eine Sporenscheide und durch ein deutliches perlenähnliches Erscheinungsbild der Sporenkette charakterisiert. Dieses Merkmal ist bei A83543.1 sehr ausgeprägt. Eine Fragmentierung wurde auch bei der Gattung Saccharopolysspora beobachtet. Der Typ Spezie "> S. hirsute wurde aus Rohrzucker-Bagasse isoliert. Die Ausgangskultur, aus dor A83543.1 erhalten wurde, wurde aus einer Zuckormühle isoliert. Da A83543.1 zahlreiche Eigenschaften dieser Gattung hat, wird es als Stamm von Saccharopolyspora angesehen.

Die einzigen zuverlässig veröffentlichten Spezies der Gattung Saccharopolyspora sind S. erythraea und S. hirsute. Bekannte Subspezies sind S. hirsuta subsp. taberi und S. hirsuta subsp. kobensis. A83543.1 unterscheidet sich von diesen Stämmen in der Färbung des Luftanteils und der Färbung der Rückseite oder in der Bildung von löslichen Pigmenten.

Eine Messung der biochemischen Ähnlichkeit wurde durchgeführt, indem man eine Tabelle mit Ähnlichkeitskoeffizienten auf der Bciis möglichst vieler biochemischer Messungen aufstellte. Es wurde der Koeffizient von Jaccard Sj und der einfache Übereinstimmungskoeffizient S_1n, angewandt (vgl. W. Kurylowic, A. Paszkiewicz, W.Woznicka, W. Kurzatkowski und T.Szulga, „Numerical Taxonomy of Streptomycetes," Polish Medical Publishers, Warschau, 1975, Seite 37).

In Tabelle VII sind diese Ähnlichkeitskoeffizienten zusammengestellt.

Tabelle VII Ähnlichkeitskoeffizienten für A83543.1 und Saccharopolyspora-Spezies

Kultur	"im	Sj
A83543.1	100	100
S. hirsute subsp. taberl	68	57
S. hirsute subsp. kobensls	67	60
S.erythraea	63	54
S. hirsute	55	50

Eine Fettääureanalyse von A83543.1 und der bekannten Saccharopolyspora-Spezies, ergab, daß sie jeweils sowohl gesättigte als auch verzweigtkettige Fett?!;uren aufweist. Die Fettsäurezusammensetzung von A83543.1 ist ähnlich aber nicht identisch mit der der anderen Spezies. Tabelle VIII vergleicht die Fettsäurezusammensetzungen von A83543.1 und der bekannten Saccharopolyspora-Spezies.

Tabelle VIII Prozentuale Fettsäurezusammensetzung von A83543.1 und Saccharopolyspora-Stämmen

Fettsäure	A83543.1	S. erythraea	S. hirsute	S. hirsute
				subsp. kobensls
15:0 Iso	11,80	17,86	15,44	17,94
15:0Anteiso	0,64	1,33	' 1,38	1,25
16:0 Iso	22,47	25,70	15,61	19,05
16:1Trans9	1,15	-	4,14	2,63
17:1 IsoF	7,22	7,97	-	-
17:1 IsoG	-	-	3,75	6,82
17:0lso	17,59	13,37	26,26	19,41
17:0Anteiso	15,30	12,46	14,19	12,72
17:1 B	4,77	1,90	-	0,67
17:1C	1,65	-	2,70	1,81
17:0	2,74	1,01	1,43	0,94
16:1 2OH	1,27	2,07	4,74	4,85
18:1 IsoF	7,57	11,31	6,83	7,47
TBSA 10Me 18:0'	1,15	1,34	1,77	1,00

a TBSA = TuberculostearinsSure

Die Analyse der Hauptkomponenten der Fettsäurezusammensetzungen von Tabelle VIII zeigt eine ausreichende Streuung, was nahelegt, daß es sich bei sämtlichen Kulturen um unterschiedliche Spezies innerhalb der gleichen Gattung handelt. Das Diagramm der Hauptkomponenten der Werte der Tabelle VIII ist in Fig. 12 dargestellt.

Tabelle IX vergleicht die physiologischen Eigenschaften von A83543.1 mit denen von existierenden Saccharopolyspora-Spezies und Subspezies.

Tabelle IX Differentielle physiologische Eigenschaften von A83543.1 und Saccharopolyspora-Spezies

Eigenschaften	A83543.1	S. erythraea	S.hlrsuta	S. hirsuta	S. hirsuta
				subsp. taberi	subsp, kobensis
Zersetzung von:
Adenin	-	+	+	+	+
Esculin	—	+	+	+	+
Stärke	_	+	+	+	+
Xanthin	—	+	+	+	+
Allantoin	+	-	—	_	ND
Nitratreduktion	+	+	_	+	+
Phosphatase	+	-	+	—	ND
Verwertung von:
Benzoat	-	-	+	-	ND
Mucat	-	—	+	_	ND
Oxalat	-	—	+	_	ND
Temperaturbereich (⁰C)	15-37	20-42	25-50	20-42	20-42
NaCI Toleranz {%)	11	ND·	15	ND	12
Säurebildung aus:
Arabinose	+	+	-	+	-
Cellobiose	-	+	+	+	+
Dextrin	-	+	+	+	ND
Galactose	-	+	+	+	+
Inosit	-	+	+	+	_
Maltose	_	+	+	+	+
Melecitoso	_	+	_	+	ND

Fortsetzung der Tabelle IX

Eigenschaften A83543.1 S. erythraea S. hirsute S. hirsute S. hirsute

subsp.taberi subsp. kobensls

Säurebildung aus:

Melibiose + ND- ND

Raffinose - + + + +

Rhamnose — + + + —

Salicin- + - - ND

Saccharose - + + + +

Xylose - + + -

Lactose - - + - ND

a-Me-D-glucosid - - + + ND

Sorbitol - - + - -

Inulin - ND + ND +

• ND = nicht durchgeführt

Die durchgeführten Vergleiche zeigen, daß A83543.1 sich ausreichend von den früher beschriebenen Spezies von S-.ixharopolyspora unterscheidet, so daß von einer neuen Spezies von Saccharopolyspora gesprochen werden kann, für die die Bezeichnung Saccharopolyspora spinosa gewählt worden ist. Der Name spinosa bezieht sich auf dornige Sporenmuster dieser Spezies.

Die Stämme A83543.3, A83543.4 und A83543.5 zeigen makroskopisch ausreichendeÄhnlichkeiten mit dem Stamm A83543.1, so daß sie als Stämme von Saccharopolyspora spinöse klassifiziert werden können. Die vier Stämme unterscheiden sich in der Menge an gebildetem A83543. Der Stamm A83543.3 bildet etwa viermal mehr A83543 als der Stamm A83543.1. Die Stämme A83543.4 und A83543.5 bilden im Vergleich zum Stamm A83543.1 etwa die 8- bis 9fache Menge.

Wie es auch bei anderen Organismen der Fall ist, unterliegen die Eigenschaften der A83543 bildenden Kulturen der Erfindung, nämlich Saccharopolyspora spinosa NRRL 18395, NRRL 18537, NRRL 18538 und NRRL 18539 ständigen Variationen. Somit lassen sich Mutanten dieser Stämme durch bekannte physikalische und chemische Verfahren erhalten.

Beispielsweise lassen sich andere Stämme durch Behandlung mit Chemikalien, wie N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin, erhalten. Natürliche und induzierte Mutanten der Stämme Saccharopolyspora spinosa NRRL 18395, NRRL 18537, NRRL 18538 und NRRL 18539, bei denen die Eigenschaft der Bildung einer gewinnbaren Menge an A83543 erhalten geblieben ist, fallen unter die Erfindung.

Zur Züchtung der Saccharopolyspora-spinosa-Kulturen kann eine Vielzahl von Kulturmedien verwendet werden. Im Hinblick auf die Wirtschaftlichkeit der Herstellung, eine optimale Ausbeute und auf die einfache Produktisolierung werden jedoch bestimmte Kulturmedien bevorzugt. So sind bei der Fermentierung im großen Maßstab als Kohlenstoffc|uellen Glukose und Maltose bevorzugt, obgleich auch Ribose, Xylose, Fructose, Galactose, Mannose, Mannit, lösliche Stärke, Kartoffeldextrin, Methyloleat,

Öle, wie Sojaöl, und dgl. verwendet werden können.

Bevorzugte Stickstoffquellen nind Baumwollsamenmehl, peptonisierte Milch und verdautes Sojabohnenmehl, obgleich auch Fischmehl, Maisquellflüssigkeit, Hefeextrakt, enzymhydrolysiertes Casein, Rindfleischextrakt und dgl. verwendet werden können.

Zu den nährenden anorganischen Salzen, die den Kulturmedien einverleibt werden können, gehören die üblichen löslichen Salze, die Ionen von Zink, Natrium, Magnesium, Calcium, Ammonium, Chlorid, Carbonat, Sulfat, Nitrat und dgl. ergeben.

Dem Kulturmedium sollen auch essentielle Spurenelemente, die für das Wachstum und die Entwicklung des Organismus erforderlich sind, zugesetzt werden. Derartige Spurenelemente kommen üblicherweise als Verunreinigungen in anderen Bestandteilen des Mediums in Mengen vor, die ausreichen, die Wachstumsanforderungen des Organismus zu erfüllen.

Sofern Schaumbildung ein Problem darstellt, können üblicherweise geringe Mengen, d. h. 0,2 ml/Liter eines Antischaummittels, wie Polypropylenglykol den im Großmaßstab eingesetzten Fermentationsmeo'ien zugesetzt werden. Im Fall von A83543 bildenden Kulturen hemmen jedoch herkömmliche Schaumverhinderungsmittel die Bildung von A83543. Die Schaumbildung kann durch Zusatz von Sojaöl oder Pluronic L-101 (BASF) zum Medium (1 bis 3%) kontrolliert werden. Zusätzliches Öl kann zugesetzt werden, wenn Schaumbildung eintritt.

Der prozentuale Anteil einer speziellen A83543-Komponente kann durch Veränderungen der Medien variiert werden. Setzt man beispielsweise Valin, Isobuttersäure oder Propionsäure zu, so wird der prozentuale Anteil an A83543D erhöht.

Zur Bildung wesentlicher Mengen an A83543 wird eine aerobe Submersfermentation in gerührten Bioreaktoren bevorzugt.

Geringe Mengen an A83543 lassen sich durch Schüttelkolbenkulturen erhalten. Aufgrund der zeitlichen Produktionsverzögerung, die sich üblicherweise bei der Inokulation von großen Bioreaktoren mit der Sporenform des Organismus ergibt, ist es bevorzugt, ein vegetatives Inokulum zu verwenden. Das vegetative Inokulum wird hergestellt, indem man ein geringes Volumen des Kulturmediums mit der Sporenform oder mit Mycelfragmenten des Organismus beimpft, um eine frische, aktiv wachsende Kultur des Organismus zu erhalten. Das vegetative Inokulum wird sodann auf einen größeren Bioreaktor übertragen. Beim Medium für das vegetative Inokulum kann es sich um das gleiche Medium wie bei den umfangreicheren Fermentationen handeln, jedoch sind auch andere Medien geeignet.

A83543 wird durch die A83543-bildenden Organismen durch Züchtung bei Temperaturen zwischen etwa 24⁰C und etwa 33°C gebildet. Optimale Temperaturen für die Bildung von A83543 liegen offensichtlich bei etwa 28⁰C bis 3O⁰C.

Gemäß üblicher Praxis bei Züchtungsverfahren unter aeroben Submersbedingungen wird in das Gefäß vom Boden aus sterile Luft eingeblasen, wobei das Medium mit herkömmlichen Turbinenrührern gerührt wird. Im allgemeinen soll die Belüftungsgeschwindigkeit und Bewegungsgeschwindigkeit ausreichen, um eine Konzentration an gelöstem Sauerstoff aufrechtzuerhalten, die 35% oder mehr und vorzugsweise 50% oder mehr der Luftsättigung bei einem Gefäßinnendruck von 0,34 Atmosphären entspricht.

Die Bildung der A83543-Komponente kann während der Fermentation durch Untersuchen von Extrakten der Gärbrühe verfolgt werden. Zu diesem Zweck stellt HPLC unter Verwendung des in Beispiel 1 beschriebenen Systems ein geeignetes Testverfahren dar.

Im Anschluß an die Bildung unter aeroben Submersfermentationsbedingungen können die A83543-Komponenten aus dem Fermentationsmedium durch auf diesem Gebiet übliche Verfahren gewonnen werden. Das bei der Fermentation des A83543 bildenden Organismus gebildete A83543 tritt sowohl im Myzel als auch der Gärbrühe auf. A83543 ist offensichtlich lipophil. Wird somit bei der Fermentation eine wesentliche Menge an Öl eingesetzt, so ist eine Extraktion der gesamten Brühe wirkungsvoller. Werden nur geringe Ölmengen eingesetzt, so findet sich der Hauptteil von A83543 im Myzel. In diesem Fall läPi sich eine wirkungsvollere Gewinnung von A83543 erzielen, indem man das Medium zunächst filtriert, um die Brühe ν on der Myzelmasse (Biomasse) zu trennen.

A83543 kann aus der Biomasse nach einer Reihe von Verfahren gewonnen werden. Eine bevorzugte Techni« umfaßt das Waschen der abgetrennten Biomasse mit Wasser zur Entfernung von restlicher Gärbrühe, Vermischen der Biomasse mit einem polaren Lösungsmittel, in dem A83543 löslich ist, wie Methanol oder Aceton, Abtrennen und Einengen des Lösungsmittels, Extrahieren des Konzentrats mit einem nichtpolaren Lösungsmittel und/oder Adsorbieren an einem Phasenumkehr-Kieselgel-Adsorptionsmittel, wie RP-C8 oder RP-C18 oder an einem hochporösen Polymeren, wie HP-20 und dgl. Das aktive Material wird vom Adsorptionsmittel mit einem geeigneten Lösungsmittel, wie Acetonitril :Methanol-Gemische mit einem Gehalt an geringen Mengen an THF, eluiert.

A83543 kann nach ähnlichen Verfahren in die einzelnen Komponenten A83543A, A83543B, A83543C, A83543D, A83543E, A83543F,A83543G,A83543H und A83543J sowie A83543A-Pseudoalgycon aufgetrennt werden. Ein bevorzugtes Trennverfahren umfaßt die Phasenumkehr-Kieselgel (C₁₈ oder Csl-Chromatographie. Eine andere Möglichkeit besteht darin, die Kulturfeststoffe, unter Einschluß der Bestandteile des Mediums und des Mycels, ohne Extraktion oder Trennung, jedoch vorzugsweise nach Entfernung von Wasser, als Quelle für A83543 einzusetzen. Beispielsweise kann nach Bildung von A83543 die gesamte Fermentationsbrühe durch Lyophilisation, Trommeltrocknung oder durch azeotrope Destillation und Trocknung getrocknet werden. Die getrocknet Brühe kann direkt eingesetzt werden, indem man sie beispielsweise direkt in ein Einsatzmaterial-Vorgemisch einmischt.

Insektizide und mitizide Aktivität

Die Verbindungen der Erfindung eignen sich zur Bekämpfung von Insekten und Milben. Die vorliegende Erfindung ist somit auch auf Verfahren zur Hemmung von Insekten oder Milben abgestellt, wobei an den Ort des Insekten- oder Milbenbefalls eine zur Hemmung von Insekten oder Milben ausreichende Menge an einer A83543-Verbindung aufgebracht wird.

Die A83543-Verbindungen sind gegen eine Anzahl von Insekten und Milben aktiv. Insbesondere sind die Verbindungen gegen Southern-Heerwurm (Spodoptera Eridania), ein Insekt der Ordnung Lepidoptera, aktiv. Weitere typische Mitglieder dieser Ordnung sind Apfelwickler, Eulenfalterraupen, Kleidermotten, Weißmehlmotten, Wicklerlarven, Maisohrwurm, Heliothis zea, Raupe des europäischen Maiszünslers, importierte Kohlweißling-Larven, Larven des Kohlspanners, rosafarbene Heliothis-Larven, Sackträgerlarven, Eastern-Zeltraupen, Spannerraupen (sod webworm) und Herbst-Heerwurm (fall armyworm).

Die Verbindungen sind auch aktiv gegen Baumwoll-Blattläuse (Aphisgossypii Glover, ein Insekt der Ordnung Homoptera.

Weitere Mitglieder von Homoptera sind Singzikaden, Planthoppers, Birnenblattfloh, Apfelsauger, Schildläuse, Weißfliegen (whiteflies) und Schaumzikaden (spittle bugs) sowie eine Anzahl von weiteren wirtsspezifischen Blattlaus-Spezies. Ferner besitzen die A83543-Verbindungen Aktivität gegen Stechfliegen, Schmeißfliegen und Moskitos, die Insekten der Ordnung Diptera sind. Ein weiteres typisches Mitglied dieser Ordnung ist die gemeine Hausfliege.

Die A83543-Verbindungen eignen sich zur Verringerung der Populationen von Insekten und Milben und werden bei Verfahren zur Hemmung von Insekten- oder Milben-Populationen eingesetzt, bei dem man an eine Stelle mit Insekten- oder Milbenbefall eine zur Inaktivierung von Insekten oder Milben wirksame Menge einer A83543-Verbindung aufbringt.

Unter dem „Ort" des Insek' in- oder Milbenbefalls ist die Umgebung zu vorstehen, in denen die Insekten oder Milben leben oder wo deren Eier vorhanden sind, unter Einschluß der sie umgebenden Luft, der Nahrung, die sie aufnehmen, oder der Gegenstände, mit denen sie in Kontakt kommen.

Beispielsweise können pflanzenfressende Insekten oder Milben bekämpft werden, indem man den Wirkstoff auf Pflanzenteile aufbringt, die von Insekten oder Milben gefressen oder bewohnt werden, insbesondere auf die Blätter.

Die Verbindungen der Erfindung kommen auch zum Schutz von Textilien, Papier, gelagertem Getreide oder Saatgut in Frage, indem man einen Wirkstoff auf diese Substanzen aufbringt.

Der Ausdruck „Hemmung von Insekten oder Milben" bezieht sich auf eine Verringerung der Anzahl an lebenden Insekten oder Milben oder auf eine Verringerung der Anzahl an lebensfähigen Insekten- oder Milbeneiern. Das Ausmaß der mit einer Verbindung erzielten Verringerung hängt selbstverständlich von der fv;?nge der aufgebrachten Verbindung, der speziellen eingesetzten Verbindung und der zu bekämpfenden Insekten-oder Milben-Spezies ab. Es soll eine Menge verwendet werden, die zumindest inaktivierend gegen Insekten oder Milben wirkt.

Der Ausdruck „Insekten-inaktivierende Menge" und Milben-inaktivierende Menge wird zur Beschreibung einer Menge verwendet, die ausreicht, um eine meßbare Verringerung der behandelten Insekten- oder Milbenpopulation hervorzurufen. Im allgemeinen wird eine Menge im Bereich von etwa 1 bis etwa 1000 ppm (oder 0,01 bis 1 kg/ha) des Wirkstoffs verwendet.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform richtet sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Hemmung eines empfindlichen Insekten der Ordnung Lepidoptera, bei dem man auf eine Pflanze eine zur Insekteninaktivierung ausreichende Menge einer erfindungsgemäßen A83543-Verbindung aufbringt.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist auf ein Verfahren zur Hemmung von Stechfliegen der Ordnung Diptera bei Tieren, wobei eine zur Hemmung des Schädlings ausreichende Menge einer A83543-Verbindung dem Tier oral oder parenteral verabreicht wird.

Mllban/Insekten-Test

Die A83543-Verbindungen wurden folgendem Test auf ihre mitizide und insektizide Wirkung unterzogen.

Die einzelnen Testverbindungen Wurden durch Lösen der Verbindung in einem Aceton/Alkohol (1:1 !-Gemisch mit einem Gehalt an 23g „Toximul R" (Gemisch aus Sulfonat/nicht-ionogenem Emulgator) und 13g „Toximul S" (Gemisch aus Sulfonat/nichtionogenem Emulgator) pro Liter zu einem Präparat verarbeitet. Diese Gemische wurden sodann mit Wasser auf die angegebenen Konzentrationen verdünnt.

Exemplare von Tetranychus urticae Koch und Aphis gossypii Glover wurden auf Kürbis-Keimblättern ausgesetzt, wobei man die Tiere sich auf beiden Blattoberflächen ansiedeln ließ. Weitere Pflanzen im gleichen Behandlungstopf blieben uninfiziert. Die Blätter wurden sodann mit 5 ml Testlösung unter Verwendung eines DeVilbiss-Sprühgeräts mit einem Druck von lOpsi besprüht.

Beide Blattoberflächen wurden bis zum Ablaufen bedeckt, sodann ließ man sie 1 Stunde trocknen. Zwei nicht-befallene Blätter wurden abgeschnitten und in eine Petri-Schale mit einem Gehalt an Spodoptera eridania Cramer gelegt.

Weitere Insekten wurden mit ähnlichen Präparaten und Bewertungsverfahren unter Einhaltung der angegebenen Ausnahmen

bewertet.

Nach standardisierten Behandlungszoiten wurde die prozentuale Mortalität bestimmt. Die Ergebnisse sind in den nachstehenden Tabellen wiedergegeben. Folgende Abkürzungen werden verwendet:

Abkürzung

Insekt/Milbe (engl. Bezeichnung)

wissenschaftliche Bezeichnung

BW	boll weevil	Anthonomus grandis
CA	cotton aphid	Aphis gossypii
CBW	cotton bollworm	Hellothiszea
CLH	cornleafhopper	Dalbulusmaidis
CRW	Southern corn rootworm	Diabrotlca undeclmpunctata howardl
SAW	Southern armyworm	Spodoptera eridania
SM	twospotted spider mite	Tetranychus urtluae

Tabelle X: Aktivität von A83543A gegen neugeborene CBW-Larven

Behandlung

Tage"

Menge (ppm)

%Hemmung^b

Topisch⁰ 1

Diät" 4

Eier* 6

Topisch⁰ 1

1,00	20,00
5,00	100,00
10,00	100,00
50,00	100,00
100,00	100,00
1,00	30,00
5,00	100,00
10,00	100,00
50,00	100,00
100,00	100,00
10,00	0,00
50,00	0,00
100,00	30,00
0,50	10,00
1,00	40,00
5,00	80,00
10,00	100,00
50,00	100,00
100,00	70,00
0,50	15,00
1,00	45,00
5,00	100,00
10,00	100,00
50,00	100,00

a Anzahl der Tage zwischen der Behandlung und der Beobachtung. b Mittelwert von zwei Wiederholungstests. c MK1 ml A83543A-Präparat behandelt.

d Als Nahrung dient die mit A83543A behandelte, getrocknete und befallene Oberfläche.

β Topisch mit A83543A behandelte Eier, die solange gehalten werden, bis Kontrolleier vollkommen ausgeschlüpft sind.

Tabelle Xl: Prozentuale Bekämpfung von neugeborenen CBW-Larven durch A83543-Komponenten¹

	0,5	1	PPM	5	10
Komponente²	55 (d)	100 (a)	100 (a)	100(a)
A	35 (e)	80 (c)	100 (a)	100(a)
B	5(g)	85 (bc)	93 (bc)	100 (a)
C	58 (d)	90 (ix)	100 (a)	100 (a)
D	28 (ef)	58 (ü.	100 (a)	100 (a)
E	0(g)	0(g)	0(g)	95 (ab)
F	0(g)	0(g)	20 (f)	80 (c)
G

1) Die mit dem gleichen eingeklammerten Buchstaben versehenen Behandlungen sind im 0,05-Bereich ähnlich.

2] Topisches Pipettierverfahren mit 20 Larven/Wiederholung und vier Wiederholungen; 1 Tag Zwischenraum zwischen Behandlung und Beobachtung.

Tabelle XII: Aktivität von A83543A gegen SAW-Larven

Stadium	Behandlung	Tage"	Menge (ppm)	% Hemmung¹"
neugeboren	foliar/	3	1,00	10,00
	Buschbohne⁰		5,00	40,00
			10,00	100,00
			50,00	100,00
			100,00	100,00
neugeboren	topisch^d	3	1,00	0,00
			5,00	60,00
			10,00	100,00
			50,00	100,00
			100,00	100,00
neugeboren	foliar/	4	0,50	0,00
	Buschbohne*		1,00	66,67
			5,00	100,00
			10,00	100,00
			50,00	100,00
Zweite	topisch^d	1	1,00	0,00
Erscheinungsform			5,00	0,00
			10,00	0,00
			50,00	80,00
			100,00	100,00
Zweite	foliar/	4	1,00	0,00
Erscheinungsform	Buschbohne⁰		5,00	0,00
			10,00	80,00
			50,00	80,00
			100,00	100,00
Dritte	topisch"	2	1,00	0,00
Erscheinungsform			5,00	0,00
			10,00	13,33
			50,00	73,33
Dritte	foliar/	4	0,50	0,00
Erscheinungsform	Buschbohne"		1,00	0,00
			5,00	40,00
			10,00	100,00
			50,00	100,00
Fünfte	topisch"	2	10,00	0,00
Erscheinungsform			50,00	0,00
Fünfte	foliar/	4	10,00	0,00
Erscheinungsform	Buschbohne"		50,00	0,00

a Tage zwischen Behandlung und Beobachtung.

b Mittelwert von Wiederholungstests.

c Eine Wiederholung.

d Zwei Wiederholungen.

e Drei Wiederholungen.

f Topiach mit 1 ml A83543A-Präparat behandelt.

Tabelle XIII: Aktivität von A83543A gegen erwachsene BW

Behandlung	Menge (ppm)	% Hemmung"
topisch"	1,00	0,00
	5,00	20,00
	10,00	20,00
	50,00	100,00
	100,00	100,00

a Eine Wiederholung; Beobachtung 3 Tage nach der Behandlung.

b A83543A-Präparat (1 ml! wurde über ausgewachsene Insekten in einer Petrischale gegossen.

Tabelle XIV: Aktivität von A83543A in Gewächshaustests gegen verschiedene Pnanzenschädlinge

Pflanze	Schädling	Menge (ppm)	Hemmung'
Mais	CRW	30	100
		15	50
		7,5	10
		3,75	0
Kürbis	SAW	250	100
		125	100
		62,5	100
		31,25	55
		15,63	40
		7,8	20
		3,9	20
		1,9	0
Kürbis	SM	250	70
		125	40
		62,5	20
		31,25	0
Kürbis	CA	100	0'
		50	0
Mais	CLH	200	90
		100	30
		50	0
Buschbohne	SAW	100	100
		50	80
		25	40
		12,5	0
Buschbohne	SM	100	100
		50	80
		25	30
		12,5	10
		6,25	0
Kürbis	CA	100	80
		50	40
		25	0
Mais	CRW	6	30
		3	0

a Ergebnisse in % Mortalität.

Tabelle XIV vergleicht die Wirksamkeit und die Dauerhaftigkeit der A83543A-Behandlung mit uer von Methomethyl bei Freiland-Topftests gegen SAW.

Tabelle XV: Wirksamkeit von A83543 gegen Spodoptera eridania in Freiland-Topftests

	Menge(ppm)	1	Tage nach der Behandlung	88	7	90	14	Ol
Behandlung	63	100	5	88	95	90
A83543A	125	100	95	100	100
A83543A	250	100	100	100	100
A83543A	500	100	20	15	0
A83543A	63	iOO	35	40	20
Methomyl	125	100	85	45	40
Methomyl	250	100	90	85	60
Methomyl	500	100	0	0	0
Methomyl	0	0	0	0	0
Keine	0	0
Keine

Tabelle XVI stellt die Ldg-Werte, d. h. dio letalen Konzentrationen, bei der die Testverbindungen 50% der Testinsekten oder Milben hemmen, von A83543A im Vergleich mit dem bekannten Insektizid Methomyl zusammen.

-20- 290 351 Tabelle XVI: LC_E0-Werte für A83543"

LC 50 (ppm) zu bekämpfender Organismus A83543 Methomyl

CRW

Kornblattlaus SM

SAW/foliar . CBW/Kontakt a Bei CRW Gewichtsmenge Im Boden; sämtliche übrigen Werte als Konzentration im Sprühmittel.

Die A83543-Komponenten waren gegen Larven von aedes aegypti bei Standard-in-vitro-Moskito-Larvenabtötungstests wirksam. In den Tabellen XVII und XVIII ist die Aktivität der Komponenten bei diesen Tests zusammengestellt.

Tabelle XVII: In vitro-Aktivität von A83543B und A83543C gegen Moskito-Larven der ersten Erscheinungsform

15	6
>250	5,4
150	71,4
1,3	11,4
0,6	14,5

A83543- Minimale Hemmkonzentration

Komponente ^g/ml)"

A 0,016,0,031"

B 0,016

C 0,031

a Niedrigste Konzentration, die eine 100%-Hernmung nach 24h ergibt (auf Mikrotiterplatten) b Tests an zwei Gruppen.

Tabelle XVIII: Aktivität von A83543-Komponenten gegen die vierte Erscheinungsform von Moskito-Larven"

Komponente prozentuale Bekämpfung'

A	60,70"
B	60
C	60
D	30
E	80
F	0
G	0

a Nach 24h bei Behandlung mit 0,312 ppm b Ergebnisse von zwei Teste.

Feldversuche

A83543A wurde in Feldversuchen bewertet. Bei diesen Versuchen war A83543A aktiv gegen die importierte Kohlraupe und Kohlspannerlarven an aufgehenden Brokkoli-Pflanzen und gegen ein Gemisch aus Sojabohnen-Spannerlarven (75%) und Herbst-Heerwurm (25%) an Sojabohnen.

Insektizide Zusammensetzungen

Die Verbindungen der Erfindungen werden in Form von Zusammensetzungen, die ebenfalls Gegenstand dieser Erfindung sind, angewandt. Diese Zusammensetzungen enthalten eine Insekten oder Milben inaktivierende Menge einer A83543-Verbindung und einen phytologisch verträglichen inerten Träger. Die aktive Komponente, d. h. die A83543-Verbindung kann als 1) einzelne A83543-Komponente, 2) ein Gemisch von zwei oder mehr Komponenten, 3) dem abgetrennten A83543-Gemisch oder A83543 zusammen mit dem getrockneten Anteil des Fermentationsmediums, in de . ι es hergestellt worden ist, d.h. als rohe, getrocknete Fermentationsbrühe, vorhanden sein.

Bei den Zusammensetzungen handelt es sich entweder um konzentrierte Präparate, die zur Anwendung in Wasser dispergiert werden, oder um staubförmige oder granulierte Präparate, die ohne weitere Behandlung angewandt werden.

Die Zusammensetzungen werden gemäß Verfahren und Formulierungen hergestellt, die auf dem Gebiet der landwirtschaftlichchomischen Technik üblich sind, die aber insofern neu und von Bedeutung sind, als eine oder mehrere der Verbindungen der Erfindung vorhanden sind.

Die Dispersionen, in denen die Verbindungen oder das rohe getrocknete Material angewandt werden, stellen häufig wäßrige Suspensionen oder Emulsionen dar, die aus konzentrierten Präparaten der Verbindungen oder des Rohmaterials hergestellt werden. Derartige wasserlösliche, in Wasser suspendierbare oder emulgierbare Präparate sind entweder Feststoffe (üblicherweise als benetzbare Pulver bekannt) oder Flüssigkeiten !üblicherweise als emulgierbare Konzentrate oder wäßrige Suspensionen bekannt).

Benetzbare Pulver, die zur Bildung von in Wasser dispergierbaren Granulaten verarbeitet werden können, enthalten ein inniges Gemisch dts Wirkstoffs, einen inerten Träger und oberflächenaktive Mittel. Die Konzentration des Wirkstoffs beträgt im allgemeinen von etwa 1 Gew.-%, vorzugsweise 10Gew.-%, bis etwa 90Gew.-%. Der inerte Träger wird im allgemeinen unter Attapulgit-Tonnen, Montmorillonit-Tonen, Diatomeenerden oder gereinigten Silikaten ausgewählt.

Wirksame oberflächenaktive Mittel, die etwa 0,5 bis etwa 10% des benetzbaren Pulvers ausmachen, finden sich unter sulfonierten Leinen, kondensierten Naphthalinsulfonaten, Naphthalinsulfonaten, Alkylbenzolsulfonaten.Alkylsulfaten und nicht-ionoger oberflächenaktiven Mitteln, wie Ethylenoxid-Addukten von Alkylphenolen.

Emulgierbare Konzentrate der Verbindungen enthalten eine zweckmäßige Konzentration einer Verbindung, z. B. etwa 50 bis etwa 500g/Liter Flüssigkeit, entsprechend etwa 10 bis etwa 50%, gelöst in einem inerten Träger, bei dom es sich entweder um ein mit Wasser mischbares Lösungsmittel oder um ein Gemisch aus einem mit Wasser nicht-mischbaren organischen Lösungsmittel und Emulgatoren handelt.

Zu den geeigneten organischen Lösungsmitteln gehören aromatische Lösungsmittel, insbesondere Xylole und Petroleumfraktionen, insbesondere hochsiedende naphthalinische und olefinische Anteile von Petroleum, wie schweres, aromatisches Naphtha. Es können auch andere organische Lösungsmittel verwendet werden, wie Terpenlösungsmittel, einschließlich Kolophoniumderivate, aliphatische Ketone, wie Cyclohexanon, und komplexe Alkohole, wie 2-Ethoxyethanol.

Geeignete Emulgatoren für emulgierbare Konzentrate werden unter herkömmlichen nicht-ionogenen oberflächenaktiven Mitteln, wie sie vorstehend erwähnt sind, ausgewählt.

Wäßrige Suspensionen umfassen Suspensionen von Wasserunlöslichen Verbindungen der Erfindung, dispergiert in einem wäßrigen Träger in einer Konzentration im Bereich von etwa 5 bis etwa 50Gew.-%. Suspensionen werden he'oestellt, indem man die Verbindung fein mahlt und heftig in einen Träger aus Walser und oberflächenaktiven Mitteln, die unter den vorstehend erörterten Typen ausgewählt werden, einmischt.

Inerte Bestandteile, wie anorganische Salze und synthetische oder natürliche Gummen, können ebenfalls zugesetzt werden, um die Dichte und Viskosität des wäßrigen Trägers zu erhöhen. Häufig ist es besonders wirksam, das Mahlen und Mischen der Verbindung gleichzeitig mit der Herstellung des wäßrigen Gemisches und dessen Homogenisierung in einem Gerät, wie einer Sandmühle, Kugelmühle oder einem Homogenisator vom Kolbentyp, durchzuführen.

Die Verbindungen können auch als granulierte Zusammensetzungen angewandt werden, die sich insbesonderezum Aufbringen auf den Boden eignen. Granulierte Zusammensetzungen enthalten im allgemeinen etwa 0,5 bis etwa 10 Gew.-% der Verbindung, dispergiert in einem inerten Träger, der vollständig oder großenteils aus Ton oder einer ähnlichen billigen Substanz besteht.

Derartige Zusammensetzungen werden üblicherweise hergestellt, indem man die Verbindung in einem geeigneten

Lösungsmittel löst und sie auf einen granulierten Träger aufbringt, der zu der geeigneten Teilchengröße im Bereich von etwa 0,5

bis 3mm vorgeformt worden ist. Derartige Zusammensetzungen können auch hergestellt werden, indem man einen Teig oder eine Paste aus dem Träger und der Verbindung herstellt und dann eine Zerkleinerung und Trocknung zur Erzielung der gewünschten Granulat-Teilchengröße durchführt.

Stäubemittel mii einem Gehalt an den Verbindungen werden hergestellt, indem man einfach die Verbindung in pulverisierter Form innig mit einem geeigneten staubförmigen, für die Landwirtschaft geeigneten Träger, wie Kaolin-Ton, gemahlenes vulkanisches Gestein und dgl. vermischt. Stäubemittel können zweckmäßigerweise etwa 1 bis etwa 10% der Verbindung enthalten. Sofern es aus irgendwelchen Gründen wünschenswert ist, ist es besonders praktisch, die Verbindung in Form einer Lösung in einem geeigneten organischen Lösungsmittel, üblicherweise einem milden Petroleumöl, wie Sprühöle, die in der landwirtschaftlich-chemischen Technik weit verbreitet sind, anzuwenden.

Insektizide und Mitizide werden im allgemeinen in Form einer Dispersion des Wirkstoffs in einem flüssigen Träger angewandt.

Es ist zweckmäßig, auf die Anwcnd'ingsmengen als Konzentration des Wirkstoffs im Träger Bezugzu nehmen. Der am weitesten verbreitete Träger ist Wasser.

Die Verbindungen der Erfindung können auch in Form einer Aerosol-Zusammensetzung angewandt werden. Bei diesen Zusammensatzungen wird der Wirkstoff in einem inerten Träger, bei dem es sich um ein druckerzeugendes Treibmittelgemisch handelt, gelöst oder dispergiert. Die Aerosol-Zusammensetzung wird in einen Behälter gegeben, aus dem Gemisch über ein Zerstäubungs ventil abgegeben wird. Treibmittelgemische enthalten entweder niedrigsiedende Kohlenwasserstoffe, die mit organischen Lösungsmitteln vermischt werden können, oder wäßrige Suspensionen, die mit inerten Gasen oder gasförmigen Kohlenwasserstoffen unter Druck gesetzt werden.

Die tatsächliche Menge des auf die von Insekten oder Milben befallenen Stellen aufzubringenden Verbindung ist nicht kritisch und läßt sich vom Fachmann leicht unter Berücksichtigung der vorgelegten Beispiele festlegen. Im allgemeinen ist zu erwarten, daß Konzentrationen von 10 bis 5000 ppm der Verbindung eine gute Bekämpfung ermöglichen. Bei zahlreichen Verbindungen reichen Konzentrationen von 100 bis 1000 ppm aus. Bei Feldfrüchten, wie Sojabohnen und Baumwolle, beträgt eine geeignete Anwendungsmenge für die Verbindungen etwa 0,01 bis 1 kg/ha, die typischerweise in Mengen von 5 bis 50 Gallonen A Spritzpräparat angewandt werden.

Bei der Stelle, auf die die Verbindung aufgebracht wird, kann es sich um beliebige von Insekten oder Milben befallene Stellen handeln, beispielsweise Gemüseplantagen, Obst- und Nußbäume, Weinstöcke und Zierpflanzen.

Aufgrund der besonderen Resistenz von Milbeneiern gegen toxische Einwirkungen kann eine wiederholte Anwendung zur Bekämpfung von neu ausgeschlüpften Larven wünschenswert sein, wie es auch bei anderen bekannten Akariziden der Fall ist.

Ektoparasitizide Aktivität

Die A83543-Verbindungen sind auch gegen Insekten der Ordnung Diptera aktiv.

In den Tabellen XIX bis XXI sind die Ergebnisse von in-vitro-Untersuchungen mit A83543A und A83543D zusammengestellt.

Tabelle XIX In-vitro-Wirkung von A83543A gegen Lan'6n der schwarzen Schmeißfliege

Dosis (ppm)	Aktivität¹
100	100
50	100
25	100
10	100
5	100
2	100
1	95
0,5	60
0,25	25^s

1 Aktivität = % Mortalität.

Tabelle XX: In vitro-Wirkung von A83543A gegen ausgewachsene Stubenfliegen

Dosis 24 Stunden 48 Stunden

(ppm) Aktivität' Aktivität¹

100	100	100
50	100	100
25	100	100
10	100	90
5	80	100
2	70	90
1	10	60
0,5	0	10

1 Aktivität = % Mortalität

Tabelle XXI:	In vitro-Wirkung von A83543A und A83543D¹²	48 hr	24 hr	ASF	48 hr	A83543D	LBF	48 hr
	A83543A
	ASF LBF				24 hr
ppm	24 hr 48 hr 24 hr

10	80	100	100	100	50	100	100	100
CJI	50	100	100	100	20	90	90	100
2,5	30	100	100	100	20 .	100	90	100
1,25	20	100	100	100	10	90	80	90
0,625	0	70	60	90	0	60	50	75
0,312	0	50	25	50	O	0	25	25

1 Prozentuale Insektenmortalität nach 24 bis 48 Stunden bei In vitro-Behandlung mit Serumproben, die mit der Chemikalie versetzt waren

2 ASF-ausgewachseneStubenfliege LBF =LarvederSchmeißfllege ppm = Teile pro Million

In vivo-Tests der A83543-Verbindungen ergaben eine systemische insektizide Wirkung bei Meerschweinchen und Schafen gegen Larven der Schmeißfliege und ausgewachsene Stubenfliegen ohne offensichtliche Anzeichen von Toxizität. Die repräsentativen Verbindungen A83543A und A83543D wurden an Laboratoriumstiereh getestet, um den Aktivitätsumfang zu bestimmen. Die folgenden Tests dienen zur Erläuterung.

SystemischnrTest am Meerschweinchen

Ausgewachsene Meerschweinchen werden in diesem Testsystem verwendet. Die zu testenden Verbindungen werden in wäßr iiem Polyvinylpyrrolidon oder in Polyethylenglykol 200 gelöst, und eine geeignete Menge der Lösung wird entweder oral oder durch intraperitioneale Injektion verabreicht. Es werden verschiedene Dosen der Verbindung eingesetzt, wie in den nachstehenden Tabellen dargelegt ist.

Nach 30 Minuten (sofern nichts anderes angegeben ist) wird den Meerschweinchen Blut entnommen, und die Blutproben werden zentrifugiert. Zahntampons werden mit dem Blutserum gesättigt und sodann in Petri-Schalen ausgewachsenen Stufenfliegen ausgesetzt. Larven der Schmeißfliege werden in Teströhrchen behandelt. Nach 24 und 48 Stunden werden die Insekten geprüft. Die Anzahl der toten Tiere wird festgestellt. Die Testergfibnisse sind als prozentualer Anteil der getöteten Insekten wiedergegeben.

Systemischer Test am Schaf

Unter Anwendung des vr rstehend für das Meerschweinchen beschriebenen Testverfahrens wird ein Test am Schaf durchgeführt. Die Testverbindung wird intraperitoneal, durch intravenöse Injektion oder intraruminal verabreicht.

Blutproben werden bei diesen Tests nach 24 Stunden entnommen.

Die Ergebnisse der systemischen Tests am Meerschweinchen und am Schaf unter Verwendung von A83543A und A83543D sind in den Tabellen XXII bis XXV zusammengestellt.

A83543A zeigte bei mit einer einzelnen intraperitonealen oder intraruminalen Dosis von 50mg/kg Körpergewicht behandelten Schafen oder bei experimentell mit der Darmnematode Nematospiroidesdubius infizierten Mäusen bei einer einzigen oralen Verabreichung von 500 mg/kg keine anthelminthische Wirkung.

Tabelle XXII: In vivo-insektizide Aktivität von A83543A*

Meerschweinchen	,systOTiisch	ASF	Tox	Schaf, systemisch	mg/kg	LBF	ASF	Tox
mg/kg	LBF	0	N	10 (IP)	0	0	N
10 (IP)	0	0	N	10 (IR)	0	0	N
20 (IP)	0	50	N	30 (IP)	80	0	N
30 (IP)	90	100	N	30 (IR)	100	30	N
50 (IP) .	100	60»	N	50 (IP)	20	30	N
50 (OR)	100			50 (IR)	100	70	N
				2 x 25 (IR)	100	90	N
				1,0 (IV)	25	10	N

* 5 h-BI"'probe; keine 30-Min.-Probe entnommen a Al.tivität gemessen als % Mortalität

ASF = ausgewachsene Stubenfliege LBF = Schmeißfliegenlarve Tox =Toxizität für das Wirtstier

(N = keine)

IP = intraperitoneal IR = intran:minal IV = intravenous

OR =oral

Tabelle XXIII: Systemische insektizide Wirkung von A83543A und A83543O bei Meerschweinchen'

Dosis	Verabrei	(mg/kg)	IP	Zeitpunkt	LBF	A83543A	ASF	LBF	A83543D	ASF
	chungsweg	10		der Blut	0	% Aktivität	0	0	% Aktivität	0
		entnahme	0	0	0	0
	IP	30 min	0	0	0	10
20		5h	0	0	0
		24 h	0	0
	IP	30 min	0	0
30		5h	90	50	0	0
		24 h	50	0	0	0
	IP	30 min	30	0	0	0
50		5h	100	100	75	0
		24 h	95	40	0	0
	Oral	30 min	25	30	25	0
50		5h	100	60
	= Larven der Schmeißfliege	24 h	0	0
a LBF	- ausgewachsene Stubenfliege	5h
	= intraperitoneal	24 h
IP

Tabelle XXIV: Test der Insektiziden Wirkung von A83543A in Schafblut gegen Haemonchus contortus - 24stündige in vitro-Behandlung der Insekten mit von Schafen gewonnenen Serumproben'

	anfängt.	TagO	A	35 min	0	A	5h	A	% Insektenmortalität⁰	10	A	Tag 2	A	Tag 3	A	Tag 4	A	Tag 5	A
Behandlung¹¹	Gewicht	L	0	L	0	0	L	0		90	0	L	10	L	0	L	10	L	0
	(kg)	0	0	0	10	10	10	Tag1	100	0	20	20	20	0	10	0	10	0
	38,6	0	0	25	20	40	10	L	0	10	90	20	80	0	40	0	20	0
5OxKIP)	31,8	0	0		10	25	0		0	90	0	90	0	60	0	50	0
5OxKIR)	34,1	0		0		10		0		0		0		0		0
25 x 2 (IR)	25,9		0	0	0		0	0	0		0		0		0		0
1 x 1 (IV)		0	0	0	0	0		0	0	10	0	0	0	0	0	0
Träger	44,5	0			0			0		0		0		0
kontrolle	30,9
unbehandelt

a_L =Larven der Schmeißfliege

A = ausgewachsene Stubenfliege

|R = intraperitoneal

IR = intraruminal IV = intravenous

b Menge (mg/kg) mal Anzahl der verarbeiteten Dosen c Zeitpunkt nach der Verabreichung bei der Blutentnahme

Tabelle XXV: Test der Insektiziden Wirkung von A83543A in Schafblut gegen Haemonchus contortus - 48stündige in vitro-Behandlung der Insekten mit von Schafen gewonnenen Serumprobon'

	anfängl.	TagO	A	35 min	A	5h	A	% lnsektenmort&lität^c	A	Tag 2	20	A	Tag 3	20	A	Tag 4	A	Tag 5	A
Behandlung*¹	Gewicht	L	20	L	0	L	10		0	L	100	30	L	100	10	L	20	L	0
	(kg)	0	0	10	10	10	30	Tag1	60	100	70	100	20	20	20	25	0
	38,6	0	10	0	30	75	10	L	90	0	90	0	70	40	30	25	30
5OxI(IP) .	31,8	0	0	0	10	50	20	10	0		0		0	90	0	75	0
5OxKIR)	34,1	0		25		10		100		0		0		0		0
25 x 2 (IR)	25,9		10		0		20	100	10	0	0	0	20		0		0
1 χ 1 (IV)		0	40	0	0	0	0	0	0		10		0	0	0	0	0
Träger	44,5	0		0		0							0		0
kontrolle	30,9					0
unbehandelt					0

a_L =La<ven der Schmeißfliege

A = ausgewachsene Stubenfliege

IR = intraperitoneal

IR =intraruminal

IV = intravenous

b Menge (mg/kg) mal Anzahl der verarbeiteten Dosen c Zeitpunkt nach dor Verabreichung bei der Blutentnahme

Bei in vitro-Tests gegen die intestinale Schaf-Nematode Haemonchus contortus tötete A83543A in einer Konzentration von 100ppm 30% der Larven.

Ektoparasitizlde Verfahren

Die Erfindung betrifft daher auch ein Verfahren zur Bekämpfung einer Population von Insekten-Ektoparasiten, die das Blut eines Wirtstieres aufnehmsn. Dieses Verfahren umfaßt die Verabreichung einer wirksamen Menge einer A83543-Verbindung an das Wirtstier. Zu Insekten-Ektoparasiten gehören Insekten- und Milbenparasiten. Die Verabreichung an die Tiere kann auf dermalem, oralem oder parenteralem Weg erfolgen.

Parasitische Insekten und Milben umfassen blutsaugende und fleischfressende Spezies, die während ihres gesamten Lebenszyklus oder nur während eines Teils ihres Lebenszyklus, beispielsweise nur im Larvenstadium oder nur im ausgewachsenen Stadium, parasitär sind. Nachstehend sind repräsentative Spezies aufgeführt:

englische Bezeichnung

horse fly

stable fly

black fly

horse sucking louse

mange mite

scab mite

horn fly

cattle biting louse

shortnosed cattle louse

longnosed cattle louse

tsetse fly

cattle follicle mite

cattle tick

GulfCoasttick

Lone Star tick

eartick

Rocky Mountain wood tick

screwworm fly

assassin bug

mosquito

brown eartick

African red tick

bonttick

bontleggedtick

hog louse

chigoe

body louse

foot louse

sheepked

sheep scab mite

greenbottlefly

black blowfly

secondary screw-worm

sheep blowfly

bedbug

lateinische Bezeichnung

Tabanusspp. Stomoxys calcUrans Simuliumspp. Haematoplnus aslni Sarcoptes scablel Psoroptesequi Haematobia irritans Bovlcola bovls Haematopinus eurysternus Llnognathusvltuli

Glossina spp.

Dmodex bovls

Boophilus mlcroplus and B. decoloratus

Amblyomma maculatum Amblyomma americanum Otobius megnlni Dermacentor andersonl Cochliomyia homlnivorax Reduviusspp. Cullseta inornate Rhlpicephalus appendlculatus Rhiplcephalus evertsl

Amblyomma sp.

Hyalomnosp. Haematoplnus suls Tungapenetrans Haematoplnus ovillus Linognathus pedalis Melophagus ovlnus Psoroptes ovis Phaenlciasericata Phormiareglna Cochliomyia macellarla Phaenlciacuprlna Clmexlectularius

Southern chicken flea Echidnophaga galllnacea

fowl tick Argasperslcus

chicken mite Dermanyssusgallinae

scalylegmite Knemldokoptes mutans

depluming mite Knemldokoptes gallinae

dog follicle mite Demodexcanls

dog flea Ctenocephallscanis

American dog tick Dermacentorvarlabilis

brown dog tick Rhlpicephalussanguineus

Das erfindungsgemäße Verfahren kann zum Schutz von aus wirtschaftlichen oder privaten Gründen gehaltenen Tieren gegen Ektoparasiten eingesetzt werden. Beispielsweise können die Verbindungen mit Erfolg an Pferde, Rinder, Schafe, Schweine, Ziegen, Hunde, Katzen und dgl. sowie an exotische Tiere, wie Kamole, Lamas, Rehe, Hirsche und andere Spezies, die üblicherweise als wilde Tiere bezeichnut werden verabreicht werden. Die Verbindungen lassen sich mit Erfolg auch an Geflügel und andere Vögel, wie Truthähne, Hühner, Enten und dgl., verabreichen. Vorzugsweise wird das Verfahren bei aus wirtschaftlichen Gründen gehaltenen Tieren und insbesondere bei Rindern und Schafen angewandt. Die Menge, derZeitpunkt unctdie Art und Weise einer wirksamen Anwendung hängt weitgehend von der Art des Parasiten, dem Grad des Parasitenbefalls und anderen Faktoren ab. Anwendungen können periodisch während der gesamten Lebensdauer des Wirtstieres oder nur während der Jahreszeit mit dem Maximum an Parasitenbefall durchgeführt werden. Im allgemeinen wird eine Ektoparasitenbekämpfung mit einer topischen Anwendung von Flüssigpräparaten mit einem Gehalt von etwa 0,00005 bis 95,0% der Verbindung und vorzugsweise bis zu 5% und insbesondere bis zu etwa 1 % der Verbindung erreicht. Eine wirksame Parasitenbekämpfung wird bei Verabreichungsmengen von etwa 5 bis etwa 100mg/kg erzielt.

Die Verbindungen werden den Wirtstieren gnmäß herkömmlicher tierärztlicher Praxis verabreicht. Im allgemeinen werden die Verbindungen zu ektoparasitiziden Zusammensetzungen vera.beitet, die eine Verbindung und einen physiologisch verträglichen Träger enthalten. Beispielsweise können flüssige Zusammensetzungen einfach auf die Tiere, bei denen eine Ektoparasitenbekämpfung erfolgt ist, gesprüht werden. Die Tiere können sich auch selbst mittels Vorrichtungen, wie Rückenkratzvorrichtungen, in denen der Wirkstoff beispielsweise in einem textlien Behälter enthalten ist, behandeln, wobei die Tiere sich an dem Behälter vorbeibewegen und damit in Kontakt kommen. Tauchbehälter können ebenfalls verwendet werden, um den Wirkstoff an Wirtstiere zu verabreichen.

Die vorliegenden Verbindungen entfalten eine systemische ektoparasitizide Wirkung. Die Verbindungen besitzen die Fähigkeit, in das Gewebe der Wirtstiere, denen eine der Verbindungen verabreicht worden ist, einzudringen. Insektenparasiten, die dann das Blut oder lebendes Gewebe des Wirtstieres aufnehmen, werden dadurch abgetötet. Die Verbindungen werden auf dermalem, oralem oder perkutanem Wege verabreicht.

Die Erfindung betrifft auch ektoparasitizide Zusammensetzungen mit einem Gehalt an einem physiologisch verträglichen inerten Träger und einer A83543-Verbindung. Diese Zusammensetzungen lassen sich nach bekannten Verfahren herstellen, beispielsweise indem man die Verbindung in einem von zahlreichen physiologisch verträglichen Adjuvantien oder Verdünnungsmitteln löst. Eine orale Verabreichung kann durchgeführt werden, indem man die Verbindung in das Futter oder Trinkwasser für die Tiere einmischt, oder indem man Dosierungsformen, wie Tabletten, Kapseln, Boluspräparate oder Implantate verabreicht. Eine perkutane Verabreichung wird zweckmäßigerweise durch subkutane, intraperitoneale oder intravenöse Injektion eines injizierbaren Präparats durchgeführt.

Die Verbindungen können zur oralen Verabreichung zu üblichen Formen, wie Tränkflüssigkeiten, Tabletten oder Kapseln formuliert werden. Derartige Zusammensetzungen erfordern selbstverständlich oral verträgliche, inerte Träger. Die Verbindungen lassen sich auch zu einer injizierbaren Lösung oder Suspension für die subkutane, dermale, intraruminale, intraperitoneale, intramuskuläre oder intravenöse Injektion verarbeiten. Auf einigen Anwendungsgebieten werden die Verbindungen zweckmäßigerweise als eine Komponente eines Standardtierfutters formuliert. Bei dieser Ausführungsform ist es üblich, die vorliegende Verbindung zuerst als ein Vorgemisch zu formulieren, indem die Verbindung in einem flüssigen oder teilchenförmigen festen Träger dispergiert ist. Das Vorgemisch kann etwa 2g bis 250g der Verbindung pro Ib (450g) enthalten. Das Vorgemisch wird wiederum durch herkömmliches Missen zum fertigen Futter verarbeitet.

Da ein Ektoparasitenbefall im allgemeinen während eines e eblichen Teils der Lebensdauer des Wirtstieres erfolgt, ist es bevorzugt, die Verbindungen der Erfindung in Form von Präparaten mit über eine lange Zeitspanne hinweg verzögerter Wirkstoffabgabe bereitzustellen. Zu den herkömmlichen Verfahren gehören die Verwendung einer Matrix, die physikalisch die Auflösung hemmt, wobei es sich bei der Matrix um eine wachsartige, halbfeste Matrix handelt, wie pflanzliche Wachse oder hochmolekulares Polyäthylenglykol. Ein günstiger Weg zur Verabreichung der Verbindungen besteht in der Verwendung von Boluspräparaten mit verzögerter Wirkstoffabgabe, ζ. B. Präparate gemäß Laby, US-PS 4251506 und Simpson GB-2059767. Für ein derartiges Boluspräparat wird die Verbindung in einer polymeren Matrix, z. B. in dem Produkt gemäß Nevin. US-PS 4 273920, eingekapselt. Eine verzögerte Freisetzung der Verbindungen der Erfindung kann auch erreicht werden, indem man ein Implantat, beispielsweise aus silikonhaltigem Kautschuk, verwendet.

Ausführungsbeispiele Beispiel 1 A83543-HPLC-Bestlmmungsverfahren

Das folgende analytische HPLC-Verfahren eignet sich zur Überwachung der Fermentation zur Bildung von A83543:

Eine Probe der gesamten Gärbrühe wird zentrifugiert und zur Entfernung des Überstands dekantiert. Die Biomasse wird mit einer ausreichenden Menge an Methanol versetzt, um die Probe auf das ursprüngliche Volumen zu bringen. Nach dem Mischen läßt man das Gemisch mindestens 15 Minuten stehen. Der Überstand wird zentrifugiert und durch ein O,45pm-Filter filtriert.

Eine andere Möglichkeit besteht darin, die gesamte Gärbrühe mit Acetonitril (1:4 GärbrüheiLösungsmittel) oder Aceton zu extrahieren.

HPLC-System

Säulenträger: 8 - χ 100-mm-Säule, Kiesrlgel-4μπΊ sphärisch C₁₈ (Nova C18, Waters) Mobile Phase: CH₃CH/MeOH/H₂O (45/45/10) mit einem Gehalt an 0,05% Amm iniumacetat Strömungsgeschwindigkeit: 4ml/min Nachweis: UV bei 250nm Retentionszeiten: A83543A - 3,6-3,7 min A83543D - 4,4-4,5 min

Beispiel 2 Herstellung von A83543 durch Züchtung von A83543.1 A. Schüttelkolbenfermentation

Die Kultur Saccharopolyspora spinosa NRRL18395 wird entweder als lyophilisiertes Pellet oder als in flüssigem Stickstoff gehaltene Suspension zur Beimpfung eines vegetativen Mediums der Zusammensetzung A oder B verwendet (das Medium B wird für die Herstellung im Großmaßstab bevorzugt):

Vegetatives Medium A	Menge(%)
Bestandteil	3,0
Trypticase-Sojabrühe*	0,3
Hefeextrakt	0,2
MgSO₄-7 H₂O	0,5
Glukose	0,4
Maltose	ad 1 Liter
entionisiertes Wasser
Keine Einstellung des pH-Werts
* Baltimore Biological Laboratories
Vegetatives Medium B	Menge(%)
Bestandteil	3,0
Enzymhydrolysiertes Casein*	0,3
Hefeextrakt	0,2
MgSO₄-7 H₂O	1,0
Glucose	ad 1 Liter
Entionisiertes Wasser
pH-Wert 6,2, Einstellung mit NaOH auf 6,5

• NZ Amine A, Sheffield Products, P.O. Box 638, Norwich, NY13815

Schräg gestellte Kulturen oder Platter, lassen sich herstellen, indem man 2,5% Agar zu den vegetativen Anzuchtmedien A oder B gibt. Die beimpfte Schrägkultur wird bei 3O⁰C etwa 10 bis 14 Tage inkubiert. An der reifen Schrägkultur wird mit einem sterilen Gerät gekratzt, um die Sporen zu iockern und zu entfernen und die Myzelmatte zu zerkleinern. Etwa Ά der auf diese Weise erhaltenen gelösten Sporen und des Kulturwachstums werden zur Überimpfung auf 50μΙ eines vegetativen Anzuchtmediums für das erste Stadium verwendet. Eine andere Möglichkeit besteht darin, das Medium für das erste Stadium mit einer in flüssigem Stickstoff gehaltenen Ampulle zu beimpfen.

Wird die Kultur in flüssigem Stickstoff gehalten, so werden die Ampullen unter Verwendung gleicher Volumina an vegetativer Kultur (48-72stündige Inkubation, 30°C) und an Suspendiermedium hergestellt. Das Suspendiermedium enthält Lactose (100g), Glycerin (200ml) und entionisiertes Wasser (ad 1 Liter).

Eine in flüssigem Stickstoff gehaltene Ampulle wird zur Beimpfung von 100ml vegetativem Medium in 500ml Erlenmeyer-Kolben (oder 50ml Medium mit 250ml-Kolben) verwendet. Die Kulturen werden 48 Stunden bei 3O⁰C an einem Schüttler, der sich mit 250U/min auf einer 5,08cm-Kreisbahn bewegt, inkubiert.

Die inkubierte Kultur (5% Vol./Vol. Inokulum) wird zur Beimpfung von 100 ml eines Produktionsmediums der folgenden Zusammensetzung verwendet.

Produktionsmedium I	Menge(%)
Bestandteil	4
Glucose
pflanzliches Protein, ρδΊϊβΙΙ enzymatisch	1,5-3
hydrolysiert*	1,0
Baumwollsamenmehl**
CaCO₃ (Reagentienqualität oder technische	0,3
Qualität)	1,0
Sojaöl	ad 1 Liter
Leitungswasser

(Einsteilung des pH-Werts vor der Sterilisation mit NaOH auf 7,0).

" Sheftone H, Sheffield Products ·· Proflo,Traders Protein, P. O. Box 8407, Memphis,TN 38108

Das beimpfte Produktionsmedium wird in 500 ml-Erlenmeyerkolben 6 bis 8 Tage bei 28⁰C bis 30°C auf einem Schüttler, der sich in einer ö,08cm-Kreisbahn mit 250cm-Kreisbahn mit 250U/min bewegt, inkubiert.

B. Fermentation In gerührten Bioreaktor

Um ein größeres Volumen an Inoculum herzustellen, werden 10ml des inkubierten Mediums des ersten Stadiums, das gemäß Abschnitt A hergestellt worden ist, zur Beimpf ung von 400 ml eines vegetativen Mediums des zweiten Stadiums mit der gleichen Zusammensetzung wie das vegetative Medium des ersten Stadiums verwendet. Dieses Medium des zweiten Stadiums wird etwa 48 Stunden bei 3O⁰C in einem 2 Liter fassenden Erlenmeyer-W^ithalskolben auf einem Schüttler, der sich mit 250 U/min auf einer 5,08cm-Kreisbahn bewegt, inkubiert.

Das auf diese Weise hergestellte vegetative Medium (2 Liter) des zweiten Stadiums wird zur Beimpfung von 80 bis 115 Liter an sterilem Produktionsmedium, das gemäß Abschnitt A hergestollt worden ist, verwendet. Weiteres Sojaöl wird nach Bedarf zur Bekämpfung der Schaumbildung zugesetzt.

Das beimpfte Produktionsmedium wird 5 bis 8 Tage bei einer Temperatur von 28⁰C in einem 165 Liter fassenden gerührten Bioreaktor fermentiert. Der Luftstrom und die Rührgeschwindigkeit im gerührten Gefäß werden durch einen Computer so gesteuert, daß sich ein Gehalt an gelöstem Sauerstoff entsprechend einer Luftsättigung von 50% oder darüber ergibt.

Beispiel 3 Isolierung von A83543 A, B, C und D

Die gemäß Beispiel 2 hergestellte Fermentationsbrühe (225 Liter) wurde unter Verwendung einer Filtrierhilfe (1 % Hyflo) filtriert.

Die abgetrennte Biomasse wurde mit Wasser (- 50 Liter) gewaschen. Anschließend wurde die Biomasse mit Niethanoi (-100 Liter) etwa 1 Stunde gerührt und filtriert.

Das Methanolfiltrat wurde auf ein Volumen von etwa 1 Liter eingeengt. Das Konzentrat wurde dreimal mit Diethylether (jeweils 1 Liter) extrahiert. Die vereinigten Etherextrakte wurden auf ein Volumen von etwa 200 ml eingeengt.

F.in Teil des Konzentrats (8ml) wurde an einer Kieselgelsäure RP-8 Lobar, Größe B, E. M. Science, Abteilung der E.M. Industries, Inc.) chromatographiert.

Dieses Verfahren wurde für insgesamt 12 Ansätze (Zyklen) wiederholt. Die Instrumenteneinstellung und die Durchführung des Verfahrens für die präparative Chromatographie in einem „Autoprep"-Modus wird nachstehend beschrieben:

Ein vollständiges „Autoprep"-HPLC-System umfaßt drei Rainin Rabbit HPX-Pumpen, ein Druckmc 'IuI, einen Gilson-Modell 201B HPLC-Fraktionssammler, einen ISCO-V*-Absorptionsdetektor und einen Apple Macintosh Plus-Compute -. Das vollständige System ist gemäß den Anweisungen in Dynamax HPLC Method Manager-Handbuch der Rainin Instrument Company, Inc., angeordnet. Die „Autoprep"-HPLC-Konfiguration nutzt die Systemautomation aus, um präparative Abtrennungi η unter praktisch identischen Bedingungen mit praktisch identischen Ergebnissen wiederholt durchzuführen. Das Sammeln und Vereinigen von entsprechenden Fraktionen aus mehreren Ansätzen gewährleistet die chromatographische Kapazität ohne das Erfordernis einer großen Säule.

Zwei Lösungsmittelgemische (A) und (B) werden im isokratischen Modus bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 8,0ml/min verwendet.

Lösungsmittelsysteme

Menge (ml) Lösungsmittel A

CH₃CH 95 100

H2O II) -

Das verwendete isokratische Gemisch enthält 60% Lösungsmittel B.

Die Laufzeit für die einzelnen Zyklen beträgt 28,0 Minuten. Die Eluate der ersten 16 Minuten der einzelnen Ansätze werden verworfen. Die folgenden Eluate werden in 6fach-Fraktionen von jeweils 2 Minuten (16ml) gesammelt.

Die automatisch vereinigten Fraktionen aus den einzelnen 12 Zyklen ergab sechs endgültige Fraktionen (chromatographische Fraktionen).

Die Anwesenheit der aktiven A83543-Verbindungen wird ermittelt, indem man die jeweilige Endfraktion auf ihre Aktivität gegen Moskitolarven und analytisch durch HPLC analysiert.

Die aktiven Fraktionen werden sodann entsprechend ihrer Aktivität und ihren HPLC-Profilen vereinigt und weiter gereinigt, wobei man das gleiche „Autoprep"-HPLC-System und Lösungsmittelsystem verwendet, sich jedoch einer hochauflösenden 21,4mm x 25cm-präparativen Säule (Rainin Dynamax), die mit 8μ C-18, Fliasenumkehr-Kieselgel gepackt ist, bedient. Man erhält die A83543-Komponenten A, B, C und D. Die Faktoren A und D kristallisieren aus CH₃OH/H₂O.

Das FD-MS von A83543C ist in Fig.5 gezeigt. Das FAB-MS von A83543B ist in Fig.9 gezeigt.

Beispiel 4 Reinigung von A83543 A und D

Eine Fermentationsbrühd (10 Liter) wurde gemäß Beispiel 2, Abschnitt A mit der Abänderung hergestellt, daß 1) 200ml Produktionsmedium in 1 Liter-Kolben verwendet wurden; 2) Sojaöl aus dem Produktionsmedium weggelassen wurde; und 3) die Inkubation 4 bis 6Tage bei 30°C durchgeführt wurde. Die Gärbrühe wurde filtriert. Das Filtrat, das 4 Mg A 83543 A/ml und keine nachweisbaren Mengen an A83543 B, C oder D/ml enthielt, wurde verworfen.

Die Biomasse wurde mit Wasser gewaschen und 1 Stunde mit Methanol extrahiert. Der Extrakt (7 Liter) enthielt 72 pg A83543 A/mlund7MgA83543D/ml.

Der Methanolextrakt wurde auf ein Volumen von 5 Liter eingeengt und zu HP-20-Harzen (150ml) Mitsubishi Chemical Industries, Ltd., Japan) in Wasser (2 Liter) gegeben. Dieses Gemisch wurde 1 Stunde gerührt.

Das HP-20-Harzgemisch wurde sodann in eine Glassäule gegeben. Das anfänglich ausströmende Pndukt und das Eluat unter Verwendung von MethanohWasser (1:1,1 Liter' waren nicht aktiv. Das zweite Eluat unter Verwendung von MethanohWasser (7:3,1 Liter) enthielt Spurenmengen an Α8οΓ/43Α. Das folgende Eluat unter Verwendung von Methanol (1 Liter) enthielt die A83543A- und A83543 D-Aktivität. Das Methanoleiuat wurde eiiiGsen&t und mit zwei ähnlichen Fraktionen aus anderen

Au fart ditungen vereinigt und zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde in 75ml MethanoiiTHF (4:1) gelöst und durch Eingießen indie IOfache Volumenmenge Acetonitril ausgefällt. Das Gemisch wurde filtriert. Das Filtrat wurde zur Trockene

eingedampft.

Df Rückstand wurde in Methanol (25ml) gelöst und auf eine 5,5-x 90-cm-Säule von LH-20-Sephadex (Pharmacia LKB

Biotechnology Inc., V. St. A.), die in Methanol vorbereitet worden war, aufgesetzt, in 125 Fraktionen von jeweils 25ml

aufgefangen und unter Anwendung des in Beispiel 1 beschriebenen H P LC-Ve rf ahrens analysiert.

Fraktionen mit einam Gehalt an den gewünschten Verbindungen wurden vereinigt und eingeengt. Der Rückstand wurde in

Methanol (10ml) gelöst und auf eine 41,1 mm x 25cm-präparative Säule, die mit 8μ C-18 Phasenumkehr-Kieselgel gepackt war (Rainin Dynamax), aufgesetzt.

Die Säule wurde in Methanol:Ac9tonitril:Wasser (37,5:37,5:25) konditioniert. Nach dem Aufsetzen der Probe wurde unter

Verwendung eines linearen Gradienten der filgpnden Lösungsmittel 180min entwickelt:

Lösungsmittelsystem	Menge (ml) A	B
Lösungsmittel	37,5 37,5 25	45 45 10
CH₃OH CH₃CN H₂O

Der Gradient wurde von 100% A bis 100% B unter Auffangen von 25ml-Fraktionen angesetzt.

Die Fraktionen mit einem Gehalt an A83543 A wurden vereinigt, zur Trockene eingedampft, in tert.-BuOH (5 ml) gelöst und

lyophilisiert. Man erhielt 778mg reines A83543A.

Das IR-Spektrum von A83543A in CHCI₃ ist in Fig. 1 gezeigt. Das FD-MS-Spektrum von A83543 Aist in Fig.4 gezeigt. Das FAB-MS-Spektrum von A83543A ist in Fig.8 gezeigt (FAB-Dispergiermittel-Dithiothreit:Dithioerythrit (5:1). Das EI-MS-Spektrum von

A83543 A ist in Fig. 10 gezeigt.

Die Fraktionen mit einem Gehalt an A83543 D wurden mit den D-enthaltenden Fraktionen aus 6 ähnlichen Trennvorgängen

vereinigt und auf die vorstehend beschriebene Weise eingeengt und chromatographiert, wobei die gleiche Säule mit

unterschiedlichen Lösungsmitteln verwendet wurde. Die Säule wurde mit Methanol: Acetonitril: Wasser (40:40:20) konditioniert.

Die zur Entwicklung der Säule verwendeten Lösungsmittelsysteme in einem linearen Gradientenbetrieb von 180 Minuten waren:

Lösungsmittelsysteme

Menge (ml) Lösungsmittel A

CH₃OH 40 95

CH₃CN 40 95

HjO 20 10

Fraktionen mit einem Gehalt an A83543 D wurden vereinigt und eingeengt. Der Rückstand wurde in tert.-BuOH (5 ml) gelöst und lyophilisiert. Man erhielt 212mg A83543D.

Das IR-Spektrum von A83543D in CHCI₃ ist in Fig.2 gezeigt. Das FD-MS-Spektrum von A83543D ist in Fig.6 gezeigt.

Beispiel 5 Isolierung der A83543-Komponenten E, F, G, H und J und des Pseudoaglycons von A

Fermentationsbrühe (8 Liter), die auf ähnliche Weise wie in Beispiel 2 hergestelltworden war, wurde gemäß Beispiel 4 behandelt Die Fraktionen der LH-20-Sephadex-Säule mit einem Gehalt an den gewünschten Verbindungen wurden mit den

entsprechenden Fraktionen von ähnlichen Fermentationen vereinigt. Da die Komponenten E, F, G, H, J und das Pseudoaglycon von A in sehr geringen Mengen entstehen, sind zahlreiche Fermentationsvorgänge orforderlich, um für die weitere Reinigung ausreichende Mengen bereitzustellen.

Ein auf diese Weise hergestellter Pool der untergeordneten Faktoren mit einem Gehalt an etwa 1,6g festem Material wurde auf eine HPLC-Säule (Rainin Dynamax), die mit 8 pm C-18 Phasenumkehr-Kieselgel gepackt war (ODS entsprechend den Angaben in Beispiel 4), aufgesetzt. Die Säule wurde in CH₃OHiCH₃CNiH₂O (75:75:50) konditioniert. Der Gradient wurde von 100%

Lösungsmittel (A) bis 50% (B) mit folgenden Lösungsmittelsystemen betrieben:

Lösungsmittelsysteme	Menge(%) A	B
Lösungsmittel	75 75 50	95 95 10
CH₃OH CH₃CN H₂O

-29- 290 351 Dabei wurden Fraktionen von 25ml gewonnen. Die folgenden Fraktionen wurden vereinigt:

Pool	Fraktionen
1	31- 44
2	45- 63
3	64- 69
4	70- 80
5	81-130
6	131-160

Ein Teil des Pools 5 (100ml) wurde eingeengt. Der Rückstand wurde in Methanol (1 ml) gelöst und auf eine 21,4mm x 250mm HPLC-Säule (Rainin Dynamax) gemäß den Angaben in Beispiel 3 aufgesetzt. Die Säule wurde unter Verwendung des Lösungsmittelsystems (A) (vgl. die folgenden Lösungsmittelsysteme) konditioniert.

Lösungsmittelsysteme	Menge(%) A	B
Lösungsmittel	:)0 :io 40	95 95 10
CH₃OH CH₃CN H₂Od N NH₄OAC, pH-Wert 5,0 H₂O

Nach Entwicklung unter Verwendung eines linearen 120 Minuten-Gradienten von 100% Lösungsmittel (A) bis 50% Lösungsmittel (B) wurden bei einer Geschwindigkeit von 7,5 ml/min Fraktionen von 15ml gewonnen. Die Elution wurde bei 50% (B) weitere 60 Minuten fortgesetzt. Folgende Fraktionen wurden vereinigt:

Pool Fraktion Komponente

1 37 F

2 38-48 E

3 52-63 B,G

4 65-70 HJ

Diese Pools wurden mit den Pools von anderen chromatographischen Ansätzen, die unter Verwendung ähnlicher Auogangsmaterialien durchgeführt worden waren, vereinigt. Die vereinigten Pools wurden auf die vorstehend beschriebene Weise unter Anwendung von Säulenchromatographie weiter gereinigt, unter Anwendung üblicher Techniken an HP-20-Harz entsalzt und unter Bildung der folgenden Komponenten eingeengt und lyophilisiert:

Komponente	Menge (mg)	Molgewicht*	IR"
E	249	717	Fig. 13
F	4	717	Fig. 14
G	104	731	Fig. 15
H,J	87	717	Fig. 16
PseudoA	288	590	Fig. 3

* durch Massenspektrometrie " KBr-Preßling

Die FD-MS- und EI-MS-Spektren von A83543A-Pseudoaglycon sind in den Figuren 7 bis 11 gezeigt.

Beispiele Herstellung von A83543 durch Züchtung von A 83543.3 A. Schuttelkolbonfermentation

Unter Anwendung ähnlicher Verfahren wie in Beispiel 2, Abschnitt A, wird die Kultur Saccharopolyspora spinosa NRRL18537 in Schüttelkolben unter Verwendung des nachstehend angegebenen vegetativen Mediums C gezüchtet.

Vegetatives Medium C	Menge
Bestandteil	30,0 g
enzymhydrolysiertes Casein·	3,0 g
Hefeextrakt	0,2 g
MgSO₄-7H₂O	10,0 g
Glucose	20 ml
Glycerin	ad 1 Liter
entionisiertes Wasser	pH-Wert 6,6, mit NaOH auf 7,0 eingestellt
	• NZ Amine A

B. Fermentation im gerührten Bioreaktor

In flüssigem Stickstoff gehaltene Ampullen der Kultur werden gemäß Beispiel 2 unter Anwendung der allgemeinen Verfahren von Abschnitt B hergestellt. Eine Ampulle wird zur Beimpfung einer vegetativen Kultur des ersten Stadiums (50ml Medium C in 250-ml-Kolben) verwendet, die etwa 48 bis 72 Stunden inkubiert wird. Die inkubierte Kultur des ersten Stadiums wird zur Beimpfung (10ml Inokulum) einer Kultur des zweiten Stadiums (400 ml Medium C in 2-Liter-Kolben) verwendet, die etwa 48 Stunden inkubiert wird, nie inkubierte Kultur des zweiten Stadiums (5 Liter) wird zur Beimpfung eines Produktionsmediums (115 Liter) der nachstehend angegebenen Zusammensetzung verwendet:

Produktionsmedium Il	Menge (g/L)
Bestandteil	80
Glucose	20
peptonisierte Milch*	20
Baumwollsamenmehl··	5
CaCO₃	30 ml/L
Methyloleat	ad 1 Liter
Leitungswasser

(pH-Wert vor der Sterilisation mit NaOH auf 7,0 eingestellt

•Peptonislertes Milch-N'.hrmedium, Sheffield Products; es kann eine zusätzliche kontinuierliche Zufuhr, beginnend am 4. Tag In einer Geschwindigkeit von 5 mg/ml/Tag angewandt werden. "Prof Io

Das beimpfte Produktionsmedium wird etwa 8 bis 10 Tage oder mehr bei einer Temperatur von 3O⁰C in einem 165 Liter fassenden, gerührten Bioreaktor fermentiert. Die Konzentration an gelöstem Sauerstoff (DO) wird durch computergesteuerte Systeme so eingestellt, daß sich eine DO-Konzentration entsprechend einer Luftsättigung über 50% ergibt; vgl. Beispiel 2, Abschnitt B.

Beispiel 7 Herstellung von A83543 mit der Kultur A83543.5 A. Schüttelkolbenfermentatlon

Unter Anwendung der Verfahren von Beispiel 2, Abschnitt A wird die Kultur Saccharopolyspora spinosa NRRL18539 in Schüttelkolben unter Verwendung des vegetativen Mediums B gezüchtet.

B. Fermentation im gerührten Bioreaktor

In flüssigem Stickstoff gehaltene Ampullen der Kultur werden gemäß Beispiel 2 unter Anwendung der allgemeinen Verfahrun von Abschnitt B hergestellt. Eine Ampulle wird ur Beimpfung der vegetativen Kultur des ersten Stadiums (50ml Medium B in 250-ml-Kolben) verwondet, die 48 bis 72 Stunden inkubiert wird. Die inkubierte Kultur des ersten Stadiums wird zur Beimpfung (10ml) Inokulum) einer Kultur des zweiten Stadiums (400ml Medium B in 2-Liter-Kolben) verwendet, die etwa 48 Stunden inkubiert wird. Die inkubierte Kultur des zweiten Stadiums (2 Liter) wird zur Beimpfung eines Produktionsmediums (115 Liter) mit einer der folgenden Zusammensetzungen verwendet:

Produktionsmedium III	Menge (g/L)	Menge(%)
Bestandteil	80	8
Glucose		3
pflanzliches Protein, partiell enzymatisch	20	2
hydrolysiert·	10	1
Baumwollsamenmehl*·	5	0,5
CaCO₃	30 ml/L	3,0
Methyloleat	ad 1 Liter	ad 1 Liter
Leitungswasser	(Einstellung des pH-Werts vor der Sterilisation mit NH₄OH auf 7,0)	(p-Wert vor der Sterilisation mit NAOH auf 7,0 eingestellt
	^# SheftoneH	* Proflo
·· Proflo	** Peptonislertes Milch-Nährmedium
Produktionsmedium IV
Bestandteil
Glucose
Baumwollsamenmehl*
peptonisierte Milch**
Maisquellflüssigkeit
CaCO₃ (technische Qualität)
Methyloleat
Leitungswasser

Das beimpfte Produktionsmedium wird etwa 8 bis 10 Tage oder länger bei einer Temperatur von 30°C in einem 165 Liter fassenden, gerührten Bioreaktor fermentiert. Die DO-Konzentrationen werden gemäß Beispiel 6 eingestellt.

Beispiel 8 Herstellung von A83543 unter Verwendung der Kultur A 83543.4

Unter Anwendung ähnlicher Verfahren wie in den Beispielen 2 und 7 wird die Kultur Saccharopolyspora spinosa NRRL18538 unter Verwendung des vegetativen Mediums Bund des Produktionsmediums III gezüchtet.

Beispiel 9

Gemäß Beispiel 8 wird eine Fermentationsbrühe hergestellt. A83543 wird auf folgende Weise von der Gärbrühe abgetrennt:

1. Zugabe eines gleichen Volumens an Aceton zu der Gärbrühe und Filtration unter Verwendung eines keramischen Filters oder einer Filterhilfe mit einer Filterpresse.

2. Einstellen des Brühefiltrats auf pH-Wert 10.

3. Zugabe von Ethylacetat V< bis 72 des Volumens der Brühe.

4. Gewinnen von Ethylacetat-Extrakt durch Dekantieren des nicht-mischbaren wäßrigen Antr ils; und Einengen des Ethylacetat-Extrakts auf V2 Volumen durch Evakuieren.

5. Extrahieren der konzentrierten Ethylacetatlösung mit wäßriger 0,1 m Weinsäure (V2 Volumen; und Trennen der Phasen.

6. Entfernen des löslichen Ethylacetats aus der wäßrigen Phase durch Vakuumverdampfung (etwa 5%). Einengen der wäßrigen Lösung unter Anwendung von umgekehrter Osmose.

7. Einstellen des pH-Werts der konzentrierten wäßrigen Lösung mit Natriumhydroxid auf 10 bis

8. Abtrennen des Niederschlags durch Filtration; Waschen mit Wasser; und Trocknen unter Vakuum unter Bildung von A83543.

Beispiel 10 A83543A-Pseudoaglycon

Eine Probe von A83543, die vorwiegend die Komponente A (etwa 100 mg) enthält, wurde in Methanol (50ml), Wasser (2ml) und konzentrierter HCI (3ml) gelöst. Diese Lösung wurde bei 5O⁰C zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde zweimal mit Diethylether (jeweils 200ml) behandelt. Das unlösliche Material wurde verworfen. Die vereinigten Etherlösungen mit einem Gehalt an dem rohen Pseudoaglycon wurden zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde in Methanol (20ml) gelöst und gereinigt, wobei man das in Beispiel 3 beschriebene Autoprep-HPLC-System einsetzte. Man erhielt 20mg reines A83543A-Pseudoaglycon.

Beispiel 11

Unter Anwendung eines ähnlichen Verfahrens wie in Beispiel 10 wird aus A83543 D das A83543D-Pseudoaglycon hergestellt.

Beispiel 12

Nachstehend finden sich typische Rezepturen für insektizide Zusammensetzungen der Erfindung.

A. Wäßrige Suspension

A-83543A 12,5%

„TergitolTMN-6"(nicht-ionogenes oberflächenaktives Mittel) 1,0%

„Zeosyl 200" (Siliciumdioxid) 1,0%

„AF-100" (Antischaummittel auf Silikonbasis) 0,2%

Xanthan-Lösung(2%) 10,0% „Makon 10" (lOMolEthylenoxid-N'jnylphenol, oberflächenaktives Mittel) 9,0%

Leitungswasser 66,3%

B. Emulgierbares Konzentrat

A83543D 12,4%

„Exxon 200" (Naphthalin-Lösungsmittel) 83,6%

„Toximul H" (nicht-ionogenes/anionaktives oberflächenaktives Gemisch) 2,0%

„Toximul D" (nicht-ionogenes/anionaktives oberflächenaktives Gemisch) 2,0%

Beispiel 13

Die folgenden Zusammensetzungsbeispiele erläutern die Art von Rezepturen, wie sie in der erfindungsgemäßen Praxis eingesetzt werden.

A. Futtermittelvorgemisch

A83543A 10%

Reishüllen 85

Leichtes Mineralöl 5

B. Futtermittelvorgemisch

A83543E 25%

Luzernenmehl 60 pulverisierter Ton 5

Melassen 10

C. Suspension

A83543A 30

Naphthalinsulfonatsaiz 5

Nicht-ionogenes oberflächenaktives Mittel 5

kolloidales Siliciumdioxid 1

Wasser 59

D. Lösung zum Auftropfen A83543A

nicht-ionogenes oberflächenaktives Mittel

Propylenglykol

Wasser

E. Suspension zum Auftropfen A83543B

nicht-ionogenes oberflächenaktives leichtes Mineralöl

F. Injizierbar Lösung A83543A Propylenglykol

Q. Injizierbare Suspension A83543C Propylenglykol Wasser

H. Injizierbare Suspension A83543D

Polyvinylpyrrolidon Wasser

20% 0,8 15 64,2

10

89

15% 85

25%

15

60

30%

2 68

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von Makrolid-Verbindungen A83543 der Formel I

-.»OR²"

(I)

in der RH oder eine Gruppe der Formeln

(C)

bedeutet;

R² eine Gruppe der Formel

(d)

R⁵O

O-

.M/W

OCH₃

bedeutet,

R¹, R³, R⁵ und R⁶ Wasserstoff oder Methyl bedeuten; und R⁴ Methyl oder Ethyl bedeutet; oder von phytologisch verträglichen Salzen davon, sofern R nicht Wasserstoff bedeutet; dadurch gekennzeichnet, daß man einen Stamm von Saccharopolyspora spinosa aus der Gruppe NRRL18395, NRRL18537, NRRL18538 oder NRRL18539 bzw. eine A83543-bildende Mutante davon in einem Kulturmedium, das assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthält, unter aeroben Submersbedingungen züchtet, bis eine gewinnbare Menge an A83543 gebildet worden ist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurui gekennzeichnet, daß man Verbindungen, bei denen für R, R¹, R³, R⁴, R⁵ und R⁶ eine der folgenden Kombinationen gilt

oder ein Säureadditionssalz davon, sofern R nicht Wasserstoff bedeutet, herstellt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung herstellt, in der R eine (a)-Gruppe bedeutet; R\ R⁵ und R⁶die Bedeutung CH₃ haben, R³ die Bedeutung H hat; und R⁴ die Bedeutung Ethyl hat.
4. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung, in der R eine (a)-Gruppe bedeutet; R¹, R³, R⁶ und R⁶ die Bedeutung CH₃ haben; und R⁴ die Bedeutung Ethyl hat; oder ein Säureadditionssalz davon herstellt.
5. Insektizide oder mitizide Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß sie 1 bis 90Gew.-% einer gemäß den Ansprüchen 1 bis 4 hergestellten A83543-Verbindung der Formel I zusammen mit einem oder mehreren phytologisch verträglichen Trägern oder Verdünnungsmitteln,
6. Verfahren zum Bekämpfen von Insekten oder Milben, dadurch gekennzeichnet, daß man auf den von Insekten oder Milben befallenen Ort eine wirksame Menge der A83543-Verbindung oder ein phytologisch verträgliches Salz davon, die gemäß den Ansprüchen 1 bis 4 hergestellt sind, aufbringt.