DD291447A7

DD291447A7 - Verfahren zur trennung eines steroidgemisches

Info

Publication number: DD291447A7
Application number: DD28427485A
Authority: DD
Inventors: Juergen Rapus; Gerhard Teichmueller; Gudrun Knaak
Original assignee: Jenapharm Gmbh,De
Priority date: 1985-12-13
Filing date: 1985-12-13
Publication date: 1991-07-04

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Trennung eines Steroidgemisches, das als Produkt des mikrobiologischen Sterolabbaus erhalten wurde und im wesentlichen aus 4-Androsten-3,17-dion sowie 1,4-Androstadien-3,17-dion besteht, durch Anwendung der Methode der Enaminbildung. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dasz das Ausgangsgemisch in Methanol und/oder Benzol und/oder Aceton mit 1 bis 10 Mol des sekundaeren Amins Pyrrolidin pro Mol 4-Androsten-3,17-dion bezogen auf das Gemisch im Temperaturbereich von 0C bis zur Siedetemperatur des jeweils eingesetzten Loesungsmittels umgesetzt, anschlieszend das Reaktionsgemisch abgekuehlt und das auskristallisierte Enamin des 4-Androsten-3,17-dions vom in Loesung gebliebenen, unumgesetzten 1,4-Androstadien-3,17-dion abfiltriert wird.{Verfahren; Trennung; Steroidgemisch; 4-Androsten-3,17-dion; 1,4-Androstadien-3,17-dion; Enaminbildung; Pyrrolidin; Molverhaeltnis; 1 bis 10 Mol Pyrrolidin; Temperaturbereich 0C bis Siedetemperatur; Loesungsmittel; Methanol; Benzol; Aceton; Kristallisation}

Description

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Mit der technischen Anwendung des mikrobiologischen Sterol-Seitenkettenabbaus sind 3-Keto-4-en-Steroide und 3-Keto-1,4-dien-Steroide wie AD und ADD leicht zugängliche Produkte für die Steroidsynthese geworden, die als Ausgangsmaterialien für die Synthese von Androstan- und Pregnan-Derivaten sowie Estrogenen verwendet werden.

Für die Synthese pharmacopoegerechter Steroidprodukte ist die Trennung der durch mikrobiologischen Abbau anfallenden 3-Keto-4-en- und 3-Keto-1,4-dien-Steroide erforderlich.

Für die Trennung derartiger Gemische sind in der Literatur verschiedene Verfahren bekannt geworden, die vorzugsweise für das System ADD/AD beschrieben sind. Das bekannte Verfahren zur Reinigung von Steroiden mittels Säulenchromatographie ist auch zur Trennung von AD und ADD eingesetzt worden (Marshek, W. u. a., Appl. Microbiology 1072,23 [1 ], 72 bis 77). Weiterhin können allgemein übliche Verfahren der Kristallisation und der extraktiven Verteilung zur Trennung eingesetzt werden.

Diesen Verfahren ist der hohe technologische Aufwand sowie die hinsichtlich Qualität und Ausbeute ungenügende Trennleistung gemeinsam.

Ein weiteres Verfahren zur Trennung von ADD und AD beruht auf der Derivatisierung der Steroide in 17-Stellung und nachfolgender fraktionierter Kristallisation.

Somit werden gemäß DD-WP 211452 ADD und AD durch Bildung ihrer Cyanhydrine in Form der 17beta-Cyano-17alpha-hydroxy-Verbindungen und anschließende Abtrennung des schwerlöslichen AD-Oerivates getrennt.

Mit diesem Verfahren können nur 3-Keto-4-en- und 3-Keto-1,4-dien-Steroide mit einer Ketofunktion in 17-Stellung getrennt werden.

In einem weiteren Verfahren (J. L.Johnson et al. J. Am. Chem. Soc. 78 [1956], 436) wird die Trennung eines Steroidgemisches (Progesteron, Pregnenolon) beschrieben, in dem das Progesteron mittels Enaminbildung in Benzol und anschließende Aminhydrochloridbildung ausgefällt wird. Die Enaminbildung erfolgt mit Pyrrolidin in bekannter Weise (Heyl, Herr et al, J. Am.

Chem. Soc. 75,1918,5927 [1953]). Allerdings wird hier die Trennung von einem 4-En-3-on- und 5-En-3-ol-Steroidgemisch durchgeführt.

Nach R.Bucourt u.a. (Bull. Soc. Chim. Fr. II-33 [1978]) können auch 3-Keto-1,4-dien-Steroide mit Pyrrolidin zum 1,3-BiS-(N-pyrrolidinyl)-3,5-androstadien-Derivat bzw. 3-(N-Pyrrolidinyl)-1,3,5-androstatrien-Derivat umgesetzt werden.

Zur Darstellung der Enaminderivate von 3-Keto-1,4-dien-Steroiden mit anderen sekundären Aminen wurden auch Zusätze von Katalysatoren wie Lewis-Säuren beschrieben. Hierdurch wird auch der Zugang von acyclischen Dialkylenaminderivaten ermöglicht, wie von Van Rheenen in US-PS 3629298 dargestellt wurde.

Für keine der bisher in der Literatur beschriebenen Enamine bzw. deren Enamin-Darstellungsmethoden konnte der Nachweis für die Nutzung zur Trennung von 3-Keto-4-en-Steroiden von 3-Keto-1,4-dien-Steroiden erbracht werden.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist es, die Trennung der3-Keto-4-en-/3-Keto-1,4-dien-Steroidgemische mit unterschiedlicher Zusammensetzung ohne größeren Aufwand in der geforderten Qualität und Quantität durchzuführen. Diese Steroidgemische fallen bei mikrobiologischen Umsetzungen von Steroiden, wie z. B. beim Sterol-Seitenkettenabbau an und werden als

Ausgangsmaterialien für die Synthese von Androstan- und Pregnan-Derivaten sowie von Estrogenen eingesetzt. Das abgetrennte Enaminderivat läßt sich leicht in bekannter Verfahrensweise in das 3-Keto-4-en-Steroid zurückverwandeln, wurde aber auch ökonomisch günstig als in 3-Stellung geschütztes Steroid eine Weiterverarbeitung erlauben.

Darlegung des Wesens der Erfindung Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Steroidgemisch, das als Produkt des mikrobiologischen Sterolabbaus erhalten

wurde und im wesentlichen aus 4-Androsten-3,17-dion sowie 1,4-Androstadien-3,17-dion besteht, über eine Enaminverbindungzu trennen.

Ein vorliegendes 3-Keto-4-en-/3-Keto-1,4-dien-Steroidgemisch, z. B. AD/ADD, das aus einer mikrobiologischen Kulturlösung,

z. B. vom Sterol-Seitenkettenabbau, erhalten wurde, soll abgetrennt werden, um bei nachfolgenden Steroidsynthesen einpharmacopoegerechtes Endprodukt herzustellen.

Erfindungsgemäß wird das Steroidgemisch des mikrobiologischen Sterolabbaus, das die vorgenannten Produkte enthält, in Methanol und/oder Benzol und/oder Aceton mit 1 bis 10 Mol des sekundären Amins Pyrrolidin pro Mol 4-Androsten-3,17-dion

bezogen auf das Gemisch im Temperaturbereich von O⁰C bis zur Siedetemperatur des jeweils eingesetzten Lösungsmittelsumgesetzt, anschließend das Reaktionsgemisch abgekühlt und das auskristallisierte Enamin des 4-Androsten-3,17-dions vom in

Lösung gebliebenen, unumgesetzten 1,4-Androstadien-3,17-dion abfiltriert. Beim Umsatz in einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel wird nach der Enaminbildung das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur, falls erforderlich auf 10°C, abgekühlt und das Pyrrolidinyl-3,5-dien-Steroid sofort zur Kristallisation gebracht. Beim Umsatz in einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel wird nach der Enaminbildung und Entfernung des gebildeten Wassers nicht umgesetztes 3-Keto-1,4-dien-Steroid und gebildetes Pyrrolidinyl-3,6-dien-Steroid durch Überführung des Reaktionsgemisches in ein Enamin-unlösliches Lösungsmittel getrennt. Erfindungsgemäß wird als mit Wasser mischbares Lösungsmittel und als Enamin-unlösliches Lösungsmittel vorzugsweise Methanol oder Aceton und als mit Wasser nicht

mischbares Lösungsmittel Benzen oder Toluen eingesetzt. Als sekundäres Amin wird vorzugsweise Pyrrolidin verwendet unddie Umsetzung mit 1 bis 10 Mol Pyrrolidin durchgeführt.

Es wurde weiterhin gefunden, daß das gebildete Enamin in Form des Iminiumsalzes durch Einwirken einer verdünnten Halogenwasserstoff säure, beispielsweise Salzsäure, oder auch einer organischen Säure, beispielsweise Essigsäure, abgetrennt Das Steroidgemisch kann in kristalliner Form oder auch als Lösung, die aus Extraktionsprozessen von Kulturlösungen

fermentativer Umsetzungen erhalten wurde, eingesetzt werden.

Die Erfindung soll durch die nachfolgend angeführten Ausführungsbeispiele näher erläutert werden, ohne daß damit die Erfindung eingeschränkt werden soll. Ausführungsbeispiele Beispiel 1

30g Steroidgemisch (AD = 24,6%, ADD - 75,4%) werden in Methanol gelöst, unter Stickstoff auf 60'C erhitzt und mit 6,75 ml

Pyrrolidin versetzt. Die Heizungsquelle wird entfernt und das Reaktionsgemisch einer spontanen Abkühlung überlassen. Nach

einer Stunde wird auf 10°C abgekühlt und nach einer weiteren halben Stunde werden 8,5g 3-(N-Pyrrolidinyl)-3,5-androstadien-17-on (I) (gelb, kristallin) abfiltriert.

Aufarbeitung des Filtrats: Vom Filtrat wird das Methanol unter Vakuum abdestilliert und der Rückstand auf Butylacetat aufgezogen. Die Lösung wird 2mal mit verdünnter Salzsäure gewaschen und 1mal mit Natriumbicarbonatlösung, 2mal mit Wasser

neutralisiert. Nach Trocknung mit Natriumsulfat wird Butylacetat unter Vakuum bis zur vollständigen Kristallisation eingeengt.

Die Kristalle werden mit wenig Diisopropylether auf der Fritte gewaschen und trockengezogen. Es werden 19,15g ADD mit einem Gehalt von 99,5% (GC) erhalten. Beispiel 2

22g Steroidgemisch (AD 9%, ADD 90,9%) werden in 40ml Methanol gelöst, auf 60°C erhitzt und mit 2ml Pyrrolidin versetzt. Die Heizung wird entfernt und das Reaktionsgemisch einer spontanten Ankühlung auf Raumtemperatur überlassen. Nach einer Stunde wird auf 10X gekühlt und nach einer weiteren halben Stunde werden 2,4g (I) abfiltriert. Die Aufarbeitung des Filtrats wird, wie unter Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt. Es werden 19,1 g ADD isoliert.

Beispiel 3

76g Steroidgemisch (AD 76,3%, ADD 20%) werden in 1160ml Methanol gelöst, auf 60°C erhitzt und nach Zugabe von 55ml

Pyrrolidin wird die Heizquelle entfernt. Nach eineinhalb Stunden Kühlung bei 10⁹C werden 71,5g (I) abgesaugt und mit Methanol

gewaschen. Das Filtrat wird wie unter Beispiel 1 aufgearbeitet. Es werden 9,2g ADD isoliert.

Das erhaltene (I) wird in 80ml Eisessig gelöst und mit 730ml Wasser versetzt. Nach einer Stunde Stehen bei Raumtemperatur

werden die Rückstände abfiltriert und die Lösung mit 2 Π η Natronlauge zur Fällung gebracht. Erhalten werden 57 g AD m it 97,1 %(GC) Gehalt, ADD konnte nicht festgestellt werden.

Beispiel 4

9,51 g Steroidgemisch (AD 22%, ADD 74,9%) werden in 120ml Benzol gelöst, mit 2 ml Pyrrolidin und einer Spatelspit2ep-Toluensulfonsäure versetzt. Das Gemisch wird aufgeheizt und 2 Stunden am Wasserabscheider unter Rückfluß gekocht. Das

Benzol wird unter Vakuum abdestilliert und der Rückstand mit Methanol versetzt. Nach einer halben Stunde Stehen im Kühlschrank wird das (I) abfiltriert und mit wenig kaltem Methanol nachgewaschen. Das Filtrat wird wie unter Beispiel 1 aufgearbeitet.

5,98g ADD mit 97% Gehalt kristallisieren aus.

Beispiels

10g Steroidgemisch (20% Methyltestosteron, 80% 1-Dehydromethy I testosteron) werden in 40 ml Methanol gelöst, auf 60°C erhitzt und mit 1,64ml Pyrrolidin versetzt. Anschließend wird die Heizquelle entfernt und nach eineinhalb Stunden Nachreaktion werden 1,7g Enamin des Methyltestosterons filtriert (hellgelbe Kristalle). Das FiItrat wird nach Beispiel 1 aufgearbeitet. Es werden 7,8g 1-Dehydro-methyltestosteron kristallisiert.

Beispiel 6

Eine methanolische Steroidlösung mit einer Zusammensetzung von 127,0Sg AD und 312,23g ADO, gewonnen aus einem Fermentationsansatz mittels Extraktion, wird unter Inertgas aufgeheizt, bei Rückschluß erhitzt, 130 ml Pyrrolidin werden zugesetzt und die Heizquelle wird entfernt.

Die Reaktionslösung kühlt langsam ab und wird nach 2 Stunden abgesaugt. Das gebildete Enamin des AD wird mit kaltem Methanol gewaschen und getrocknet (151 g). Das Firtrat enthält laut GC 291,2g ADD (kein Ab) und kann wie unter Beispiel 1 aufgearbeitet werden.

Betspiel 7

10g Steroidgemisch (AD 22%, ADD 74,9%) werden in 120ml Benzol gelöst, mit 3 ml Pyrrolidin und einer Spatelspitze P'Toluensulfonsäure versetzt. Das Gemisch wird aufgeheizt und 2 Stunden am Wasserabscheider unter Rückfluß gekocht. Nach Abkühlung auf ca. 20⁰C wird die Lösung mit Essigsäure 2mal extrahiert, Imal mit Natriumbicarbonatlösung und 2mal mit Wasser gewaschen. Nach Trocknung mit Natriumsulfat wird Benzen bis zur voltständigen Kristallisation abdestilliert. Die Kristalle werden mit wenig Ether gewaschen und trockengezogen. 6,12g ADD werden erhalten mit 98,5% Gehalt (GC). Die Essigsäureextrakte werden vereinigt und das vorliegende Salz vom AD wird mit Natronlauge zersetzt und in ein mit Wasser nicht mischbares Lösungsmittel überführt, z.B. Benzol oder Butylacetat. Die Lösung wird wie unter Beispiel 1 aufgearbeitet, dabei erhält man 1,8 g AD.

Claims

Verfahren zur Trennung eines Steroidgemisches, das als Produkt des mikrobiologischen Sterolabbaus erhalten wurde und im wesentlichen aus4-Androsten-3,17-dion sowie 1,4-Androstadien-3,17-dion besteht, durch Anwendung der Methode der Enaminbildung, gekennzeichnet dadurch, daß das Ausgangsgemisch in Methanol und/oder Benzol und/oder Aceton mit 1 bis 10 Mol des sekundären Amins Pyrrolidin pro Mol 4-Androsten-3,17-dion des Gemisches im Temperaturbereich von OX bis zur Siedetemperatur des jeweils eingesetzten Lösungsmittels umgesetzt wird, anschließend das Reaktionsgemisch abgekühlt und das auskristallisierte Enamin des 4-Androsten-3,17-dions vom in Lösung gebliebenen, unumgesetzten 1,4-Androstadien-3,17-dion abfiltriert wird.

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Trennung eines Steroidgemisches, das als Produkt des mikrobiologischen Sterolabbaus erhalten wurde und im wesentlichen aus 4-Androsten-3,17-dion (AD) und 1,4 Androstadien-3,17-dion (ADD) besteht. Derartige Gemische sind als Ausgangsmaterialien für die Synthese von Androstan- und Pregnan-Derivaten sowie Estrogenen von Bedeutung.