DD292023A5 - Verfahren zur erhoehung der expression rekombinanter gene in escherichia coli - Google Patents
Verfahren zur erhoehung der expression rekombinanter gene in escherichia coli Download PDFInfo
- Publication number
- DD292023A5 DD292023A5 DD33800090A DD33800090A DD292023A5 DD 292023 A5 DD292023 A5 DD 292023A5 DD 33800090 A DD33800090 A DD 33800090A DD 33800090 A DD33800090 A DD 33800090A DD 292023 A5 DD292023 A5 DD 292023A5
- Authority
- DD
- German Democratic Republic
- Prior art keywords
- coli
- glucose
- cap
- expression
- host vector
- Prior art date
Links
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 title claims abstract description 70
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 27
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 21
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims abstract description 16
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims abstract description 27
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims abstract description 27
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 23
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 claims abstract description 11
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 claims abstract description 11
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 claims abstract description 7
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims abstract description 6
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 24
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 14
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 14
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 claims description 12
- 239000011707 mineral Substances 0.000 claims description 12
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 11
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 10
- 108700023157 Galactokinases Proteins 0.000 claims description 9
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 claims description 4
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 4
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 claims description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 claims description 3
- 239000008101 lactose Substances 0.000 claims description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 2
- 101150084750 1 gene Proteins 0.000 claims 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims 1
- 101150045500 galK gene Proteins 0.000 claims 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 claims 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 claims 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 abstract description 9
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 abstract description 9
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 abstract description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 4
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 abstract description 3
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 abstract description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 102000048120 Galactokinases Human genes 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 6
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 6
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 5
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 5
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 5
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 5
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 5
- HEEACTTWORLLPM-UHFFFAOYSA-N 2-(1h-imidazol-5-yl)ethanol Chemical compound OCCC1=CNC=N1 HEEACTTWORLLPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102100040019 Interferon alpha-1/13 Human genes 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IVOMOUWHDPKRLL-KQYNXXCUSA-N Cyclic adenosine monophosphate Chemical compound C([C@H]1O2)OP(O)(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H]2N1C(N=CN=C2N)=C2N=C1 IVOMOUWHDPKRLL-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229910021380 Manganese Chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L Manganese chloride Chemical compound Cl[Mn]Cl GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 2
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 108091006374 cAMP receptor proteins Proteins 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- NPFOYSMITVOQOS-UHFFFAOYSA-K iron(III) citrate Chemical compound [Fe+3].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NPFOYSMITVOQOS-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000011565 manganese chloride Substances 0.000 description 2
- 235000002867 manganese chloride Nutrition 0.000 description 2
- 229940099607 manganese chloride Drugs 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 2
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 2
- MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 2-amino-2-deoxy-D-glucopyranose Chemical compound N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 0.000 description 1
- 229910021591 Copper(I) chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 238000012366 Fed-batch cultivation Methods 0.000 description 1
- 244000290594 Ficus sycomorus Species 0.000 description 1
- 241000533867 Fordia Species 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 1
- 101100174763 Mus musculus Galk1 gene Proteins 0.000 description 1
- 229910004616 Na2MoO4.2H2 O Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- ZOIORXHNWRGPMV-UHFFFAOYSA-N acetic acid;zinc Chemical compound [Zn].CC(O)=O.CC(O)=O ZOIORXHNWRGPMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010923 batch production Methods 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactosamine Natural products NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- GVPFVAHMJGGAJG-UHFFFAOYSA-L cobalt dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Co+2] GVPFVAHMJGGAJG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- OXBLHERUFWYNTN-UHFFFAOYSA-M copper(I) chloride Chemical compound [Cu]Cl OXBLHERUFWYNTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- ORTQZVOHEJQUHG-UHFFFAOYSA-L copper(II) chloride Chemical compound Cl[Cu]Cl ORTQZVOHEJQUHG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000388 diammonium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019838 diammonium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 229960002442 glucosamine Drugs 0.000 description 1
- 229960001031 glucose Drugs 0.000 description 1
- 239000006480 glucose mineral salts medium Substances 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- FBAFATDZDUQKNH-UHFFFAOYSA-M iron chloride Chemical compound [Cl-].[Fe] FBAFATDZDUQKNH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000007483 microbial process Effects 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 101150079601 recA gene Proteins 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 239000004246 zinc acetate Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Die Erfindung betrifft ein verbessertes gentechnisch-mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung von rekombinanten DNS-Produkten in E. coli-Zellen - und zwar ein Verfahren jenes Grundtyps, in dem die Gene fuer die gewaehlten Proteine mit Hilfe von Plasmidvektoren in die Produzentenstaemme eingeschleust werden. Sie verfolgt das Ziel, in ausgewaehlten E. coli-Wirts-Vektor-Systemen die Leistung bei der Expression vorwiegend heterologer rekombinanter Gene wesentlich zu steigern. Die dieser Zielstellung zugeordnete technische Aufgabe wird geloest, indem Zellen eines herangezogenen E. coli-Stammes zunaechst jeweils mit einem neuen Expressionsplasmid transformiert werden, in welchem das gewaehlte Strukturgen (beispielsweise ein Interferon-Gen) der Kontrolle einer aus dem E. coli-Tryptophan-Promotor sowie einer vorgeschalteten sog. E. coli-cap-Sequenz aufgebauten Expressionseinheit unterworfen ist, und fuer die so transformierten E. coli-Zellen anschlieszend eine Fermentation unter Glucose-Mangelbedingungen erfolgt. Die Effizienz der vorgeschlagenen Methode wird an mehreren Beispielen demonstriert, die sich unter anderem auch hinsichtlich der Fermentationsart unterscheiden (kontinuierliche Fermentation; fed batch-Fermentation), in welchem die oben charakterisierten Mangelbedingungen realisiert werden.{Herstellung von rekombinanten DNS-Produkten in E. coli; Expression rekombinanter Gene; E. coli-Wirts-Vektor-Systeme; cap-Sequenz; cap-modifizierter Tryptophan-Promotor; Expressionseinheit; Fermentation unter Glucose-Mangelbedingungen}
Description
Hierzu 4 Seiten Zeichnungen
Anwendungsgebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein gentechnisch-mikrobiologisches Verfahren zu effektiveren Herstellung homologer und/oder heterologer DNS-Produkte (Proteine) in Escherlchia coil, wobei die Gone für die zu exprimierenden Proteine jeweils mittels Plasmidvektoren in die einbezogenen Produzentenstämme eingebracht werden.
Das Anwendungsgebiet der Erfindung liegt somit in jenen Industriezweigen einer Volkswirtschaft, welche einen Biotechnologie-Sektore aufweisen, in dem auch gentechnisch modifizierte E.coll-Produzentenstämme genutzt werden.
Charakteristik des bekannten Standes der Technik
In E. coli-Wirts-Vektor-Systemen zur Expression sowohl von homologen als auch von heterologen Genen finden zahlreiche E.coli-Promotoren Verwendung, zu denen unter anderem gehören
- derTryptophanpromotor(trpPO),
- der Tryptophanpromotor mit Leader-Region (trpPOL),
- derLactosepromotorUV5(lacUV5),
- der Rekombinationspromotor recA,
- derTetracyclinpromotor (tet),
- der Arabinosepromotor für dia Gene B, A und D (araBAD),
- ein Promotor für rRNS-Synthese (rrnAP2) sowie
- der ß-Lactamasepromotor (bla) ' (s.a. M.HIRANO, K.SHIGESADAu. M.IMAI |1987],Gene, 57,89-99).
In diesen Konstruktionen erwies sich der Promotor trpPO als derjenige mit der höchsten Promotorstärke; in dieser Hinsicht übertraf trpPO sogar die aus dem E. coli-Lambda-Phagengenom isolierten Promotoren Lambda-PL und Lambda-PR. Mit dem Ziel, in E.coli-Systemen noch weiter erhöhte Expressionsleistungen zu erreichen, wurden inzwischen durch Austausch der -35-Region und der -10-Region von natürlichen E.coli-Promotoren weiterhin zahlreiche Hybridvektoren hergestellt (s.a. RUSSELL, D. R. und BENNETT, G. N. [1982], Gene, 20,231-243). Aus dem systematischen Vergleich der Promotorstärken solcher Hybridkonstrukte mit denen ausgewählter natürlicher Promotoren ergab sich folgende Relation:
trp::lac > trpPO > trp::tet > lacUV5 > tet::lac > tet > lac::tet(up) > tet::trp > lac::trp = lac::tet,
wobei zwischen den Promotoren trp: :lac und trpPO auch nur ein unwesentlicher Niveauunterschied hinsichtlich der Promotorstärke vorhanden ist.
Mit anderen Worten: Nach wie vor erweist sich in E.coli der PromotortrpPO als solcher mit starker Expressionsleistung. Somit verwundert es nicht, daß im vergangenen Jahrzehnt
- dieser Promotor in sehr vielen Fällen mit homologen bzw. heterologen Genen zur Kombination trpPO-rDNS gekoppelt,
- diese Kombination trpPO-rDNS in Plasmidvektoren eingebaut und
- nach deren Transformation in Escherichla coil die Expression zur Herstellung der rekombinanten DNS-Produkte vorgenommen
worden ist (siehe hierzu u.a. DD-WP 250335; WINNACKER, E.L. 119851: Gene und Klone, VCH Winheim; ßUELL,
G. & PANAYOTATOS, N. [1986], in: Maximizing Gene Expression [Eds: REZNIKOFF, W. & GOLD, Ll, Butterworth; OLD,
R. W. & PRIMROSE, S. B. [1986), in: Principles of Gene Manipulation, Bl-.ckwell Sei, Publ.; GASSEN, H. G. et al [19881: Gentechnik, Fischer-Stuttgart). Hierbei erfolgte die Fermentation der transformierten E. coli-Zellen üblicherweise in diskontinuierlicher Kultur (batch-Verfahren; s.a. Patentschriften DD 159435, DD 2203J5, DD 240392, DE 3445517 und EP 170204).
Weiterhin ist aus der E.coll-Physiologie bekannt (PASTAN, I. & ADHYA, S. (1976), Bacteriol. Rev., 40, 527-551; ULl.MANN,
A. & DANCHIN, A. [19831,AdV-CyCLNuCl. Res., 15,1-53), daß unter Bedingungen von Glucosemangel cyclisches Adenosinmonophosphat (cAMP) gebildet wird, welches mit dem Katabolit-Aktivator-Protein (CAP) in Wechselwirkung tritt. Der hierbei entstehende cAMP-CAP-Komplex bindet an die in der E. coli-DNS in der Umgebung von Promotoren ζ. Β. des Kohlehydrat- oder Zucker-Stoffwechsels vorhandene(n) sog. cap-Region(en) und stimuliert jeweils die Transkription (vgl.
NEIDHARDT, F.C, Editor in Chief, |1987|: Escherlchia coil and Salmonella typhlmurlum, Amer. Soc. for Microbiology, Washington D.C). Allerdings stellt sich diese Stimulationswirkung nur bei schwachen Promotoren der E.coll-DNS wie u.a. bei araBAD und lacPO, ein. Starke E. coli-Promotoren, z. B. ribosomale Promotoren oder der Promotor trpPo, weisen keine cap-Sequenzenauf.
Ziel der Erfindung v
Die Erfindung verfolgt das Ziel, in ausgewählten Escherichta coll-Wirts-Vektor-Systemen bei der Expression von vorwiegend heterologen rekombinanten Genen wesentliche Leistungssteigerungen zu erreichen.
Darlegung des Wesens der Erfindung
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein gentechnisch-mikrobielles Verfahren zu beschreiben, mit dem in ausgewählten
E. coli-Wirts-Vektor-Systemen eine wesentliche Erhöhung der Expression von vorwiegend rekombinanten Genen erzielt werden
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe in ihrem Grundzug wie folgt gelöst:
Eingebettet in ein gentechnisch-mikrobiologisches Verfahren mit seinen an sich bekannten Teilschritten wie
- Konstruktion von rekombinanten Stammaterial (einschließlich Konservierung),
- Kultivierung solchen Stammaterials (biologische Prozeßstufe),
- Produktaufarbeitung (hier aus der Biomasse) einschließlich eventueller Reindarstellung)
werden Zellen des jeweils herangezogenen E.coll-Stammes mit einem solchen neuen rekombinanten Expressionsplasmid transformiert, in welchem das Strukturgen des zu synthetisierenden Proteins der Kontrolle einer aus dem E.coli-Tryptophan-Promotor sowie einer vorgeschalteten sogenannten t.coli-cap-Sequenz aufgebauten Expressionseinheit (Kurzwort: cap-trpPO-EE) unterworfen ist (Schritt 1). Die auf diese Weise erhaltenen transformierten E. coli-Zellen werden anschließend unter Glucosamangelbedingungen fermentiert (Schritt 2).
In seiner weiteren Ausgestaltung ist das vorliegende Verfahren nun zusätzlich dadurch gekennzeichnet, daß in seinem Schritt 1 jeweils ein rekombinantes E.coli-Expressionsplasmid des oben skizzierten Grundaufbaus verwendet wird, welches in seiner captrpPO-EE stromauf vom Tryptophan-Promotor (Kurzwort: trpPO) die cap-Sequenz des E.coli-Lactosepromotors (Kurzwort: cap(lacPO), d.h. die DNS-Teilsequenz
5f-TAATGTGAGTTAGCTCACTCA-3I,
enthält. Vorzugsweise wird in diesem Teilschritt ein solches rekombinantes E.coli-Expressionsplasmid vom voranstehend skizzierten Grundaufbau verwendet, in welchem die obige cap(lacPO)-Sequenz ausschließlich in einem Abstand von 15 Nucleotiden stromauf der -35-Region ds trpPO angeordnet ist (Kurzwort für diese spezifische Anordnung: cap(lacPO)-trpPO-EE). Nach der Maßgabe dieser Vorschrift sind unter anderem mit einem gentechnologischen Handling, welches jeweils an sich bekannte Operationen wie Isolierung sowie Reinigung von DNS-Fragmenten, Ligation von DNS-Fragmenten, Plasmid-Isolierung usw. bis hin zur Sequenzierung der jeweils veränderten Vektor-Region umfaßt, die neuen Expressionsplasmide pDR72Joap, welches das E.coli-Galaktokinase-Gen (Kurzwort: galk-Gen) unter der Kontrolle der voranstehend als
Vorzugsvariante gekennzeichneten cap(lacPO)-trpPO-EE enthält, und
pHRWöOOcap, welches die Sequenz für natives humanes Interferon aipha 1 unter der Kontrolle der cap(lacPO)-trpPO-EE enthält, konstruiert worden (s. a. Abb. 1).
Mit diesen neuen Expression?plasmiden wird dann in an sich bokannter Weise jeweils eine Population des Wirtsstammes E.coli TG1 transformiert. Auf diese Weise wurden die neuen Wirts-Vektor-Systeme
E.coliTGI (pDR720cap)und E.coli TG1 (pHRW500cap)
erhalten; diese sind im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung in der Hinterlegungsstelle für Mikroorganismen der DDR, Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie der AdW, Beutenbergstraße 11, Jena, 6900 unter den Registrierzeichen
IMET 11421 für E.coli (pDR720cap) und IMET i1419fürE.coli (pHRW500cap)
deponiert worden. (Bei gleicher Gelegenheit sind der genannten Stelle auch biologisch reine Proben von E. coli TG1 Populationen, die mit den Ausgangsplasmiden pDR720 bzw. pHRW500 transformiert worden waren, hinterlegt worden; diese Stämme, die im vorliegenden Verfahren zu Vergleichszwecken benötigt werden, erhielten die Registrierzeichen
IMET 11420fürE.coliTG1[pDR720] und IMET 11418 für E, coli TG1 [pHRWüOOj.
In der weiteren Verfahrensausgestaltung werden die beiden genannten E.coli-Wirts-Vektor-Systeme in einem Glucose-Mineralsalz-Medium unter Glucose-Mangelbedingungen fermentiert. Besonders vorteilhaft wird in diesem Schritt jenes Glucose-Mineralsalz-Medium mit den Komponenten
Kaliumdihydrogenphosphat, Diammoniumhydrogenphosphat,
Zitronensäure, AntaphronNM40,
Magnesiumsulfat,
Thiamin, Ampicillin,
Glucose sowie Spurenelementelösung,
ningesetzt, welches in Verbindung mit der Patentanmeldung zu einer früheren erfinderischen Lösung aus dem Zentralinstitut offenbart worden ist, (Die Spurenelementelösung enthält Kobaldchlorid, Manganchlorid, Kupferchlorid, Borsäure, Natrlummolybdat, Eisenzitrat und Zinkacetat)
Ein anderes Glucose-Mineralsatz-Medium bestand aus den Komponenten:
Kaliumhydrogenphosphat, Dinatriumhydrogenphosphat,
Natriumchlorid, Ammoniumchlorid,
Natriumsulfat, Magnesiumchlorid,
Eisenchlorid, Manganchlorid,
Thiamin, Ampicilin, Glucose.
Die Fermentation jedes der o.g. E.coli-Wirts-Vektor-Systerne wird unter Glucose-Mangelbedingungen in einem Medium dieser Kennzeichnung hierbei sowohl in kontinuierlicher Kultur als auch in der fed-batch-Kultur durchgeführt. Erstere wird vorteilhaft in einer Chemostaten-Anordnung realisiert, in der die Verdünnungsrato D (in h"') als primärer Kontrollparameter der Relation 0 < D < Dc, vorzugsweise der Relation 0,08Cc < D < 0,5 D0, folgt (Dc-sog. kritische Verdünnungsrate einer Chemostaten-Kultur, definiert gemäß W.CRUEGER, W. & CRUEGER, A., Biotechnologie-Lehrbuch d.angew. Mikrobiologie, München-Wien, 1989). Für die verfahrensgemäß bereitgestellten Wirts-Vektor-Systeme E.coli TG ί (pDR720cap) und E.coli TG1 (pHRW500cap) ergibt sich eine solche Relation von Rate D zu Rate Dc, daß sich der voranstellend offenbarte Bereich zu
0,03h"' <D<0,16h~'
konkretisiert (Dc = 0,32 h"1). Unter Einhaltung dieser Vorschrift wird somit in einem Medium obiger Kennzeichnung mit Glucose als limitierender Kohlenstoffquelle die Chemostaten-Kultivierung durchgeführt.
Eine fed-batch-Kultivierung der genannten E.coli-Wirts-Vektor-Systeme wird in einem Nährmedium obiger Kennzeichnung nach anfänglich unlimitiertem Wachstum (d. h. bei einem Wachstum mit der spezifischen Wachstumsrate μ = μπΐχ) unter Glucose-Mangelbedingungen in solchen Regimes weitergeführt, in denen die spezifische Wachstumrate μ (in h'') als primärer Kontrollparameter der Relation 0 <μ < pmax, vorzugsweise der Relation
0,08μπιω<μ<0,5μπ,,)<,
folgt (μ™.,- sog. maximale spezifische Wachstumsrate einer fed-batch-Kultur, definiert gemäß STANBURY, P. F. & WHITAKER, A. [1984], Pergamon Press). Hierbei wird jeweils mit der anfänglich in das Nährmedium eingebrachten Glucose-Menge determiniert, wie lange der durch unlimitiertes Wachstum charakterisierte Startabschnitt in den einzelnen Fermentationsläufen beibehalten wird.
Für die vorliegenden Wirts-Vektor-Systeme TG1 (pDR720cap) und TG1 (pHRW500cap) nimmt die maximale spezifische Wachstumsrate im o.g. Glucose-Mineralsalz-Medium den Wert \imtx = 0,41 h"1 an. Damit konkretisiert sich die Vorschrift für die Auswahl der spezifischen Wachstumsrate zu
0,03h-l<M<0,21h-',
und der in den einzelnen konkreten Varianten dieser Verfahrensmodifikation jeweils einzustellende μ-Wert aus dieser Relation wird hierbei stets mit Hilfe des bei der Glucose-Zudosierung gewählte Regime realisiert.
Die vorgeschlagene Verfallronserfindung wurde am Bespiel der in der weiteren Ausgestaltung dieser technischen Lösung verfügbar gewordenen neuen E.coli-Stämme TG1 (pDR720cap) und TG1 (pHRW500cap) umfassend erprobt, wobei beide Grundmodifikationen der biologischen Prozeßstufe - hier Glucose-Iimitierte Chemostaten-Kultivierung, dort fed-batch-Kultivierung mit Glucose-Dosierung - eingezogen worden sind.
Anhand der spezifischen Galaktokinase-Aktivität des cap-modifizierten Stammes E.coli TG1 (pDR720cap) wird in Abb.2 hierbei die Steigerung in der Expressionsleistung in Relation zum Vergleichsstamm. E.coli TG1 (pDR720) für den Fall einer Glucoselimitie-ten Chemostaten-Kultur ausgewiesen.
Ein entsprechender Beleg für die gesteigerte Human-Interferonalpha 1 -Bildung von Stamm E. coll TG1 (pHRW500cap) im Vergleich zu Stamm E.coli TG1 (pHRWSOO) wurde in Abb.3 (für den FaIi der Glucose-Iimitierten Chemostaten-Kultur) sowie in Abb.4 (für den Fall einer fed-batch-Kultivierung mit Glucose-Dosierung) geführt. Wie diesen Abbildungen zu entnehmen ist, kann mit dem beschriebenen Verfahren eine Erhöhung in der Expression um mehr als 100% erreicht werden.
Vergleichende Kultivierung des Ausgangsstammes E.coli TG1 (pDR720) und des cap-modifizierten Stammes E.coli TG1 (pDR 720cap) im Glucose-Iimitierten Chemostaten
Abschwemmungen von Schrägagarkulturen von Stamm TG1 (pDR720cap) und Stamm TG1 (pDR720) dienten zur Beimpfung von 100 ml Glukose-Mineralsalz-Medium mit Zusatz von Thiamin (1pg · ml"1) und Ampicillin (100pg · ml"') in 500ml-Rundkolben, die bei 280C auf einem Schütteltisch geschüttelt werden. Derartige Vorkulturen wurden in der exponentiellen Wachstumsphase zur Hauptkultivierung in den Chemostaten übertragen. Nach Abfüllen mit gleicher Nährlösung auf das Arbeitsvolumen V (ml) der Chemostaten von 180ml und Erreichen einer Extinktion der wachsenden Kulturlösungen von E1cm470nm = 1.9 - 2,1 Skt begann die Zudosierung von gleicher Nährlösung. Diese Glucose-Iimitierte Nährlösung hatte folgende Zusammensetzung:
| KH2PO4: | 2,72 g-l"' |
| Na2HPO4 x 2H2O: | v 3,55 g · Γ1 |
| NaCI: | 4,67 g-r' |
| NH4CL: | 0,535g · I"1 |
| Na2SO4: | 1,065g-r' |
| MgCI2 x 6H2O: | 40,6 mg · Γ1 |
| FeCI3 x 6H2O: | 5,4 mg · Γ1 |
| MnCI2 x 4H2O: | 3,96 mg-r1 |
| Thiamin: | 1,0 mg · I"1 |
| Ampicillin: | 0,1 g · I"1 |
| Glucose: | 0,8 gl-'; |
Durch Einstellung der Zuflußrate F (ml h"1 konnte die Verdünnungsrate D = F-V ' (h"') determiniert werden (BERGTER, F., 1972). Wachstum von Mikroorganismen. Experimente und Modelle, VEB Gustav Fischer Verlag Jena). Nach 6 bis 10 Volumenwechsel der Kulturlösung wurden die Kulturen zur Bestimmung der Aktivität der Galaktokinaso und zur Messung der Extinktion gewonnen. Zur Ermittlung der Abhängigkeit der spezifischen Aktivität der Galaktokinase von der Verdünnungsrate D wurde für jedes „D" ein neuer Zyklus (Schrägagarkultur, Vorkultur im Rundkolben, Hauptkultur im Chemostaten für 8 bis 10 Volumenwechsel) durchlaufen.
Der Bestimmung der spezifischen Aktivität der Galaktokinase lag die von McKENNEY und Mitarbeiter beschriebene Methode zugrunde (McKENNEY, K., SHIMATAKEW, H., COURT, D., SCHMEISSNER, U., BRADY, C. und ROSENBERGER, M., 1981), In: Gene Amplification and analysis. Vol. 2. (Editors J. G. Chirikjian and T. S. Papas), Elsevier/North Holland). Aus Abb. 2 ist deutlich ersichtlich, daß im Bereich 0,03 h"1 < D < 0,32 h"' die spezifische Galaktokinaseaktivität des capmodifizierten Wirts-Vektor-Systems TG1 (pDR 720cap) größer ist als die des nicht-modifizierten Ausgangssystems TG1 (pDR720). Besonders ausgeprägt ist die höhere spezifische Galaktokinase-Aktivität von TG1 (pDR720cap) gegenüber TG1 (pDR720) bei kleinen Verdünnungsraten D < 0,15h"1.
Kultivierung des Ausgangsstarr.nes E.coli TG1 (pHRW500) und des cap-modifizierten Stammes E.coli TG1 (pHRWöOOcap) im Glucose-Iimitierten Chemostaten
Die Anzucht und Kultivierung der Stämme wurde vorgenommen wie in Beispiel 1. Die Bestimmung von Interferon erfolgte nach einem Ultraschallaufschluß der Zellen entsprechend einem üblichen ELISA-Test.
Die Ergebnisse sind in Abb. 3 dargestellt. Im gesamten Bereich der untersuchten Verdünnungsraten 0 < D < 0,32 h"' ist die spezifische Interferonkonzentration in E. coll TG1 (pHRW500cap) größer als die in E. coll TG1 (pHRW500), wobei wie in Beispiel 1 mit abnehmender Verdünnungsrate die spezifische IFN-Konzentration ansteigt. Der Anstieg ist besonders drastisch im Bereich kleiner Verdünnungsraten für D <0,12h~'.
Fed-batch-Kultivierung des Ausgangsstammes E. coll TG1 (pHRW500) und des cap-modifizierten Stammes E. coll TG1 (pHRW500cap)
Die Fermentation erfolgte in einem Rührkesselfermentor mit Belüftung unter Verwendung von 151 eines definierten Mediums mit Glucose als Kohlenstoffquelle zu Kultivierungsbeginn. Das zu beimpfende Medium hatte folgende Zusammensetzung:
KH2PO4 (7,61 g/l), (NH4I2HPO4(2,33g/l), MgSO4 · H2O (2,2g/l), Zitronensäure (1,61 g/l), Eisenzitrat (36,5mg/l), CoCI2 · 6H2O (2,67mg/l), MnCI2 · 4H2O (16mg/l), CuCI2 · 2H2O (1,51 mg/l), H3BO3 (3,33mg/l), Na2MoO4 · 2H2O (2,67mg/l), Zn(CH3COO)2 · 2H2O (8,4mg/l), Thiamin (2,67mg/l), EDTA (4,96mg/l), Antaphron NM40 (0,33ml/l), Ampicillin (100mg/l) und Glucose (25g/l).
Nach Beimpfung wurden die Zellen bei 280C, einem pH-Wert von 6,9, einer Belüftungsrate von 1 vvm und einem Druck von 70KPa kultiviert. Zur Konstanthaltung des pH diente die automatisch kontrollierte Dosierung von 25%v/v- NH3. Der pO2-Wert wurde nach dem Absinken von 100% des Sättigungswertes auf den Regelwert von 20% konstant gehalten. Die Kulturen wachsen nach einer sehr kurzen lag-Phase exponentiell mit in dem vorgelegten Medium maximal möglicher spezifischer Wachstumsrate von pmax = 0,415h"1 im Falle von TG1 (pHRW500) und 0,411 h"1 im Falle von TG1 (pHRW500cap) (s. Abb.4) bis zum Verbrauch der zu Anfang eingebrachten Glucose. Nach vollständigem Glucoseverbrauch wurde die Zufütterung von Glucose in der Weise vorgenommen, daß die Kulturen nur noch mit verringerter spezifischer Wachstumsrate wachsen konnte. Die durchschnittlichen spezifischen Wachstumsraten in der Glucose-Feedingphase betrugen für TG1 (pHRW500)0,114h"'undfürTG1 (pHRW500cap) 0,119 h"1. Beide Kulturen waren somit aufgrund des nicht signifikant verschiedenen μ vergleichbar.
Aus Abb.4 ist trotz Schwankungen der Meßdaten deutlich ersichtlich, daß die spezifischen Interferonmengen von beiden Stämmen bei Wachstum mit \xmix einander entsprechen. Dagegen konnte bei Glucose-Iimitiertem Wachstum in der Dosierungsphase eine wesentlich höhere spezifische Interferonmenge in dem cap-modiiizierten Stamm TG1 (pHRW 500cap) als in dem Ausgangsstamm TG1 (pHRW500) festgestellt werden.
Legenden 2u den Abbildungen
Abb. 1: Darstellung der Plasmidpaare pDR720 und pDR720cap bzw. pHRWSOO und pHRW500cap.
Abb. 2: Abhängigkeit der spezifischen Aktivität der Galaktokinase von der Verdünnungsrate 0 bei E. coli TG1 (pDR720) und E. coli TG1 (pDR720cap) in Glucose-Iimitierten Chemostaten-Kulturen.
Abb.3: Abhängigkeit der spezifischen Humaninterferon-alpha 1-Aktivität von der Verdünnungsrate D bei E. coli TG1 (pHRW500) und E. coli TG1 (pHRW500cap) in Gluiose-Iimltierten Chemostaten-Kulturen.
Abb.4: Kinetiken von Wachstum und Interferonbildung von E. coli TG1 (pHRW500) (4 A) und von E. coli TG1 (pHRW400cap) (4 B) bei fed-batch-Kultivierung.mit Glucose-Dosierung.
Es bedeuten: X = Biotrockenmassekonzentration ing I"1 IFN = spezifische Konzentration von Human-
Interferon-alphai in IE · g"1 μ = spezifische Wachstumsrate in h~'
Claims (14)
1. Verfahren zur Erhöhung der Expression rekombinanter Gene in Escherichia coli auf gentechnischmikrobiologischem Wege unter Rückgriff auf rekombinanta Plasmide als Expressionsvektoren, gekennzeichnet dadurch, daß man
- Zellen eines E.coli-Stammes jeweils mit einem Expressionsplasmid transformiert, in welchem das gewählte Strukturgen der Kontrolle einer aus dem E.coli-Tryptophan-Promotor sowie einer vorgeschalteten sog. E.coli-cap-Sequenz aufgebauten Expressionseinheit (Kurzwort: captrpPO-EE) unterworfen ist, (Schritt 1) und
- die erhaltenen transformierten E.coli-Zellen unter Glucosemangelbedingungen fermentiert (Schritt 2).
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß man in Schritt 1 jeweils ein E.coli-Expressionsplasmid verwendet, welches in seiner cap-troPO-EE die cap-Sequenz des E. coli-Lactosepromotors (Kurzwort: cap[lacPO])
5'-TAATGTAGTTAGCTCACTCa-S'
enthält.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß man in Schritt 1 jeweils ein Expressionsplasmid verwendet, in welchem die cap(lacPO)-Sequenz in einem Abstand von 18 Nucleotiden stromauf der -35-Region des trpPO angeordnet ist.
4. Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 3, gekennzeichnet dadurch, daß man Zellen des Stammes E. coli TG1 mit dem Expressionsplasmid pDR720cap, in dem da& E.coli-Galactokinase-Gen (Kurzwort: galK-Gen) der Kontrolle dercap-trpPO-EE obiger Kennzeichnung unterworfen ist, transformiert.
5. Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 3, gekennzeichnet dadurch, daß man in Schritt 1 Zellen des Stammes E.coli TG1 mit dem Expressionsplasmid PHRW500cap, in dem das humane Interferonalpha 1-Gen (Kurzwort: hlFN 1-Gen) der Kontrolle der cap-trpPO-EE obiger Kennzeichnung unterworfen ist, transformiert.
6. Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 5, gekennzeichnet dadurch, daß man das jeweils erhaltene E.coli-Wirts-Vektor-System in einem Glucose-Minerdsalz-Medium unter Glucosemangelbedingungen fermentiert.
7. Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 6, gekonnzeichnet dadurch, daß man das jeweils erhaltene E.coli-Wirts-Vektor-System in Schritt 2 in einem Glucose-Mineralsalz-Medium unter Mangelbedingungen obiger Kennzeichnung in kontinuierlicher Kultur mit einer Verdünnungsrate D (in h~1) im Bereich 0 < D < Du fermentiert (Dc — kritische Verdünnungsrate).
8. Verfahren gemäß Anspruch 7, gekennzeichnet dadurch, daß man das jeweils erhaltene E. coli-Wirts-Vektor-System in einem Glucose-Mineralsalz-Medium unter Mangelbedingungen obiger Kennzeichnung mit einer Verdünnungsrate im Bereich 0,08 Dc < D < 0,5 Dc fermentiert.
9. Verfahren gemäß 4,6 und 8, gekennzeichnet dadurch, daß man das Wirts-Vektor-System E.coli TG1 (pDR720cap) in einem Glucose-Mineralsalz-Medium unter Mangelbedingungen obiger Kennzeichnung mit einer Verdünnungsrate im Bereich 0,03h~1 < D < 0,16h"1 fermentiert.
10. Verfahren gemäß Anspruch 5, 6 und 8, gekennzeichnet dadurch, daß man das Wirts-Vektor-System E.cüii TG1 (pHRW500cap) in einem Glucose-Mineralsalz-Medium unter Mangelbedingungen obiger Kennzeichnung mit einer Verdünnungsrate im Bereich 0,03h~1 < D < 0,16h~1 fermentiert.
11. Verfahren pemäß Anspruch 1 bis 6, gekennzeichnet dadurch, daß man das jeweils erhaltene E.coli-Wirts-Vektor-System in SchriU 2 in einem Glucose-Minoralsalz-Medium in fed batch-Kultur nach anfänglich unlimitiertem Wachstum mit der spezifischen Wachstumsrate μ = \imm sodann unter Mangelbedingungun obiger Kennzeichnung mit einer spezifischen Wachstumsrate (in h"1) im Bereich 0 y μ < pmax fermentiert.
12. Verfahren gemäß Anspruch 11, gekennzeichnet dadurch, daß man das jeweils erhaltene E. coli-Wirts-Vektor-System in einem Glucose-Mineralsalz-Medium nach anfänglich unlimitiertem Wachstum unter Mangelbedingungen obiger Kennzeichnung mit einer spezifischen Wachstumsrate im Bereich 0,08μ^χ < μ < 0,5 μ^χ fermentiert.
13. Verfahren gemäß Anspruch 4,6 und 12, gekennzeichnet dadurch, daß man das Wirts-Vektor-System E.coli TG1 (pDR72Dcap) in einem Glucose-Mineralsalz-Medium nach anfänglich unlimitiertem Wachstum mit Mmax = 0,41 h~1 unter Zudosierung von Glucosemiteinerspezifischen Wachstumsrate im Bereich 0,03 h~1 < μ < 0,21 h~^ fermentiert.
14. Verfahren gemäß Anspruch 5,6 und 12, gekennzeichnet dadurch, daß man das Wirts-Vektor-System E.coli TG1 (pHRW500cap) in einem Glucose-Mineralsalz-Medium nach anfänglich unlimitiertem Wachstum mit Pmax = 0,41 h~1 unter Zudosierung von Glucose mit einer spezifischen Wachstumsrate im Bereich 0,03h~1 < μ < 0,21 h~1 fermentiert.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD33800090A DD292023A5 (de) | 1990-02-21 | 1990-02-21 | Verfahren zur erhoehung der expression rekombinanter gene in escherichia coli |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD33800090A DD292023A5 (de) | 1990-02-21 | 1990-02-21 | Verfahren zur erhoehung der expression rekombinanter gene in escherichia coli |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DD292023A5 true DD292023A5 (de) | 1991-07-18 |
Family
ID=5616562
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DD33800090A DD292023A5 (de) | 1990-02-21 | 1990-02-21 | Verfahren zur erhoehung der expression rekombinanter gene in escherichia coli |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DD (1) | DD292023A5 (de) |
-
1990
- 1990-02-21 DD DD33800090A patent/DD292023A5/de not_active IP Right Cessation
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DE69219775T2 (de) | Neuartiges L-threoninproduzierendes Mikrobakterium und eine Herstellungsmethode für L-Threonin | |
| DE3891417C5 (de) | Verfahren zur Veränderung eines L-Threonin produzierenden Mikroorganismus und Verwendung eines so erhaltenen Mikroorganismus zur Herstellung von L-Threonin | |
| EP0866876B1 (de) | Verfahren zur herstellung von rekombinanten proteinen in e. coli mittels hochzelldichte-fermentation | |
| EP0759997B1 (de) | Verwendung des tetracyclinpromotors zur stringent regulierten produktion von rekombinanten proteinen in prokaryontischen zellen | |
| DE3688534T2 (de) | Verfahren und Gerät zur Kultivierungssteuerung. | |
| DE69133066T2 (de) | Verfahren zur Expression heterologischer Gene in der Hefe Pichia Pastoris, Expressionsverfahren und transformierte Mikroorganismen | |
| DE69318909T2 (de) | Verfahren zur Herstellung von menschlichem Wachstumshormon | |
| DE69311873T2 (de) | Fed-batch-Verfahren für Proteine sekretierende Zellen | |
| DE60014640T2 (de) | Genetische kaskaderegulierte expression von klonierten genen | |
| CH640268A5 (en) | Process for the preparation of filamentous hybrid phages, novel hybrid phages and their use | |
| DE69530176T3 (de) | Verfahren zur Herstellung von Protein | |
| DE69310373T2 (de) | Expressionssystem für proteine | |
| DE3686102T2 (de) | Mikrobiologische herstellung eines schweinewachstumshormons mit hoher ausbeute. | |
| US7118884B1 (en) | Method for controlling metallophosphate precipitation in high cell density fermentations | |
| EP0511226B1 (de) | Verfahren zur hochzelldichte-fermentation von escherichia coli in einem rührkesselfermentor | |
| EP0504798B1 (de) | Verfahren zur Herstellung von Glutarylacylase in grossen Mengen | |
| DE3925550C2 (de) | ||
| EP0776975A2 (de) | Verfahren zur Nutzung des Hefe-ADH-II-Promotorsystems zur biotechnologischen Produktion heterologer Proteine in hohen Ausbeuten | |
| DE69233447T2 (de) | Biotin-Operon | |
| DE69231306T2 (de) | Fermentationsverfahren zur Herstellung von Peptiden durch einen Wirt | |
| DE19943919A1 (de) | Verfahren zur Steigerung der Ausbeute von rekombinanten Proteinen in mikrobiellen Fermentationsprozessen | |
| DE3687796T2 (de) | Verkuerzter phosphoglycerat-kinase-promotor. | |
| DE60223406T2 (de) | Expressionsvektoren und promotoren für heterologe genexpression | |
| EP0393684A1 (de) | Rekombinante DNA und Expressionsvektor | |
| DD239222A1 (de) | Verfahren zur herstellung von plasmid-dna vom cole1-typ |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| ENJ | Ceased due to non-payment of renewal fee |