DD292024A5 - Verfahren zur herstellung von ergosterin - Google Patents

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Ergosterin auf mikrobiologischem Wege. Ziel der Erfindung ist die Herstellung des genannten Sterols, das in der pharmazeutischen Forschung und Industrie als ein bevorzugtes Ausgangsmaterial fuer die Synthese von Vitamin-D3-Pharmaka sowie als Ausgangsmaterial fuer die Synthese pflanzenwachstumsregulatorisch wirksamer Brassinosteroide in den letzten Jahren grosze Bedeutung erlangte. Die diesem Ziel zugeordnete Aufgabe wird dadurch geloest, dasz in der biologischen Prozeszstufe der pilzliche Mikroorganismus Tolypocladium inflatum Wb 6-5, Hinterlegungsnummer IMET 43899, unter sterilen Bedingungen in aerober Submersfermentation kultiviert und das Ergosterin anschlieszend aus dem hierbei erhaltenen Mycel mit organischen Loesungsmitteln extrahiert und nachfolgend gereinigt wird.{Ergosterin; Sterol; Ausgangsmaterial fuer die Synthese pflanzenwachstumsregulatorisch wirksamer Brassinosteroide mit Vitamin D3-Pharmaka; pilzlicher Produktionsorganismus Tolypocladium inflatum Wb 6-5-Hinterlegungsnummer IMET 43899}

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Ergosterin, das als bevorzugtes Ausgangsmaterial für die Synthese von Vitamin-D₃-Pharmaka und Brassinosteroide Anwendung findet. Vitamin-D₃-Pharmaka haben in der Humanmedizin aufgrund ihrer starken Wirkung auf den Calziumstoffwechsel sowie der zeildifferenzierenden und proliferationshemmenden Wirkung zur Behandlung von Tumoren, Schuppenflechte, Skelett- und Nebenschilddrüsenerkrankungen sowie zur Therapie von Nieren- und Leberfunktionsstörungen breiten Eingang gefunden. Die Brassinosteroide haben als Pflanzenwachstumsregulatoren in den letzten Jahren große Bedeutung erlangt. Das Anwendungsgebiet der Erfindung liegt somit in der pharmazeutischen Forschung und Industrie sowie in der Landwirtschaft.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Ergosterin ist als Bestandteil der Zellen von Pilzen und Hefen bekannt. Aufgrund der großen Bedeutung des Ergostprins als Ausgangsverbindung für die Synthese von Vitamin D und als Vorstufe für die Herstellung von synthetischen Steroidrormonen führten ausgedehnte Screening-Untersuchungen zur Auffindung zahlreicher Mikroorganismen mit Ergosterin-Bildungsvermögen, so unter anderem Pilzstämme der Gattungen Aspergllli und Peniclllia (vgl. Übersicht von El-Rafai, A. H., 1964, Ph. D. Thesis, Cairo Univ.) sowie zahlreiche Hefestämme der Gattungen Endomyces, Nadsonla, Mycoderma, Saccharomyces, Zygosaccharomyces, Debaromyces, Hansonula, Pichia, Rhodotorula und Torulopsis (vgl. Übersichten von Conzales-Bibiesca, J.L. und Campillo, CC. 1961, Lationomer. Microblol.,4,83; El-Refai,A.H. und El-Kady, I.A. 1968, Zeitschr. AIIg. Mikrobiologie 8,355). Die meisten der hier genannten Mikroorganismen mit Ergosterin-Bildungsvermögen sind jedoch aufgrund der niedrigen Ausbeuten an Biomasse mit zudem auch nur geringem Ergosteringehalt für biotechnologische Nutzung nicht geeignet. Als geeignetste Mikroorganismen zur Gewinnung von Ergosterin auf fermentativem Wege erwiesen sich Hefestämme der Gattung Saccharomyces (vgl. die Patentschriften US 2059980, US 2276710, US 2817624, DRP 720007) sowie Pilzstämme der Gattungen Trlchoderma, Fusaria und Cephalosporia (Patentschrift DE 2303495 C₂). Diese biotechnologischen Verfahren, bei denen Ergosteringehalte bis zu 200 mg/l Kulturbrühe erhalten werden, benötigen jedoch komplexe organische Nährmedien mit Pepton als Stickstoffquelle, was ils ein erheblicher ökonomischer Nachteil angesehen werden muß. Die Gewinnung von Ergosterin neben Ubichinonen aus. Lipid-KW-Extrakten, die bei der mikrobiellen Gewinnung von Eiweiß auf der Basis von KW anfallen, haben die Patentschriften DD 115899, DD 151007, DD 154448 und DD 209187 zum Gegenstand. Die Lipid-KW-Extrakte mit einem Ergosteringehalt von 1 % werden aus einem KW-verwertenden Stamm der Hefe Lodderomyces elonglsporus gewonnen. Die relativ aufwendige und besonders bei hohen KW-Gehalten erschwerte Isolierung des Ergosterins aus dem Hefeextrakt erfordert zunächst eine adsorptive Anreicherung des Sterols an Kieselgel.

Zur Gewinnung von Hefe mit Ergosteringehalten von 0,8% bis 1,5% der Trockensubstanz wird bei Gärprozessen anfallende Hefe wie z. B. Melassesprithefe oder Bierhefe einer aeroben Nachfermentation in Gegenwart von Ammoniumstickstoff, Phosphationen und einer Kohlenstoffquelle unterworfen. Die durch Separation abgetrennte Biomasse (20g Trockensubstanz/l Kulturbrühe) kann zur Gt innung von Ergosterin oder nach UV-Bestrahlung als Vitamin-D₂-haltige Futtermitteikomponente benutzt werden.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung hat die ökonomisch günstige Herstellung des Sterols Ergosterin zum Ziel. Damit soll die Palette bekannter Herstellungsverfahren für das in der pharmazeutischen Forschung und Industrie zunehmend bedeutungsvoller werdende Ergosterin durch einen originellen Prozeß erweitert werden.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein technologisch einfaches Verfahren anzugeben, daß die fermentative Herstellung von Ergosterin mittels eines neuen Stammes in synthetischen Medien ohne den Einsatz komplexer organischer Stickstoffquellen in guten Ausbeuten ermöglicht.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß unter aeroben und sterilen Kulturbedingungen in einem flüssigen Nährmedium mit Kohlenstoff-, Stickstoffquellen und Mineralsalzen der Mikroorganismus Tolypocladium inflatum Wb6-5 oder eine seiner Varianten kultiviert werden.

Der Mikroorganismus, der in diesem Verfahren Anwendung findet, ist in der Hinterlegungsstelle für Mikroorganismen der DDR, ZIMET der AdW, Beutenbergstr. 11, Jena, DDR, unter der Registriernummer IMET 43699 hinterlegt. Die Fermentation erfolgt nach einer ein- bzw. zweistufigen Vorzucht in der submersen Hauptkultur unter aeroben, sterilen Bedingungen, indem der oben genannte Mikroorganismus in einem flüssigen Medium bei Temperaturen von 2O⁰C bis 37°C sowie einer Acidität von pH 3,2 bis pH 7,5 für die Dauer von 5 Tagen bis 11 Tagen kultiviert werden. Rasenstücke aus Schrägkulturen des Stammes Tolypocladium Inflatum Wb6-5 werden in physiologischer NaCI-Lösung suspendiert und auf einen Nähragar ausplattiert, welcher als Kohlenstoffquelle Glucose, Maltose oder Saccharose, sowie (NH₄I₂SO₄ als Stickstoffquelle enthält und für die Dauer von 14 Tagen bis 21 Tagen bei 24⁰C bis 28°C bebrütet wird. Von den entstandenen Einzelkolonian werden die luftmycelarmen, rot- bis schwarzbraun pigmentierten Exemplare ausgewählt und nach Übertragung auf Mineralsalz-Glukoseagar zur Herstellung von 2cm bis 4cm großen Rasenarealen verwendet. Diese werden als Agarausstich in die erste submerse Vorzuchtpassage übertragen, die aus 100-ml- bis 500-ml-Erlenmeyerkolben besteht, welche jeweils 20% ihres Volumens als Anzuchtmedium enthalten. Das Inokulum enthält Glukose, Maltose oder Saccharose als Kohlenstoffquelle, weiterhin organische Stickstoffsubstrate sowie Mineralsalze und wird nach Beimpfung für die Dauer von 48 Stunden bis 72 Stunden bei 24⁰C bis 25⁰C unter Schütteln auf einen Rundschwinger bei lOOrpm bis 24Orpm kultiviert. Nach Ausreifen der I.Anzucht in Flüssigkultur erfolgt gegebenenfalls die Beimpfung einer 2 Anzucht in einer Menge von 5% bis 10% des Medienvolumens. Diese Stufe besteht entweder aus 500-ml-Erlenmeyerkolben, die 100ml des o.a. Mediums enthalten, oder aus gerührten und belüfteten Kleinfermentoren mit einem Nettovolumen von 51 bis 251 bei üblichem technischen Ausrüstungsgrad für Temperierung und Belüftung. Nach 48stündiger Kultivierung wird das Hauptkulturmedium, welches als alleinige Stickstoffquelle Ammoniumsalze enthält, in einer Menge von 5% bis 10% des Volumens mit der Vorkultur beimpft und für die Dauer von 5 Tagen bis 11 Tagen unter Rühren und Belüften bzw. durch Rundschütteln kultiviert. Die Isolierung des Ergosterins wird in der Weise durchgeführt, daß das Sterol aus der Biomasse mit Wasser mischbaren oder wenig mischbaren organischen Lösungsmitteln extrahiert, im Vakuum das Lösungsmittel abdestilliert, anschließend in einem organischen unpolaren Lösungsmittel wieder aufgenommen und einer säulenchromatographischen Trennung unterworfen wird. Die Ergosterin enthaltenden Eluate werden im Vakuum eingeengt, der Rückstand in wäßrigem Methanol aufgenommen, das abgeschiedene Ergosterin abfiltriert und durch Umkristallisieren als reine kristalline Verbindung erhalten.

Eigenschaften des Ergosterins

Die Identität des Ergosterins wurde durch den Vergleich der physikochemischen und spektralen Eigenschaften mit einer authentischen Probe gesichert.

Farblose, mikrokristalline Substanz aus Äthanol Fp.: 165⁰C

Optische Drehung [a)_D 25°C-129°C (Chloroform, C = 1,0)

Chromatographische Eigenschaften:

DC: RF-Wert 0,59 (DC-Alufolie Kieselgel 60 [Merck),

Laufmittel: Essigester/Isopropanol = 95/5, Anfärbung mit Joddampf) GC: Gaschromatograph GCHF-18.3, VEB Chromatron, Berlin, mit FID, Glassäule (1,8m x 3mm) gefüllt mit 3,5% OV-17 auf Gaschrom Q (80-100 mesh) bei Temperaturen (Thermostat 260°C, Injektor 300°C, Detektor 300°C, Trägerfluß 75 ml/min N₂.

Retentionszeit für Ergosterin 9,05 min

IR-Spektrum: X_n,.,, (KBr cm"'): 800,835,965,975,1030,1055,1365,1375,1455,2860,2945,3425

Die Vorteile des hier beschriebenen Herstellungsverfahrens für das Sterol Ergosterin werden zusammenfassend gesehen

- in der Bereitstellung eines Mikroorganismus, der neben Ergosterin keine von dem Sterol schwer abtrennbaren Substanzen im Mycel anreichert,

- in der Möglichkeit, in guten Ausbeuten und bei Rückgriff auf billige Einsatzstoffe ein für die pharmazeutische Forschung und Industrie bedeutsames Ausgangsmaterial verfügbar machen zu können, das für die Synthese von Vitamin-D₃-Pharmaka und Pflanzenwachstumsregulatoren vom Typ der Brassinosteroide von potentiellem Nutzen ist,

- in der einfachen Isolierung des Ergosterins aus der Biomasse und der einfachen Abtrennung des Sterols von anderen mikrowellen Metaboliten ohne wesentlichen zusätzlichen Aufwand an Chemikalien, Arbeitszeit und Energie.

Die Erfindung wird durch das nachfolgende Ausführungsbeispiel näher erläutert, jedoch nicht eingeschränkt.

Rasenstücke von Oberflächenkuituren des Stammes Tolypocladium Inflatum Wb6-5 werden zunächst auf Glucose-Mineralsalzagar übertragen, der folgende Zusammensetzung aufweist (g/l):

Glucose 20, (NH₄I₂SO₄ 5, KH₂PO₄ 2, MgSO₄ χ 7 H₂O 0,5;

CaCO₃ 3.4, Agar 20; pH 5,3 bis pH 5,7;

Sterilisation 30min bei 120°C.

Nach einer Bebrütungszeit der Petrischalen bei 24°C für die Dauer von 14 Tagen bis 21 Tagen werden von den entstandenen Arealen die rot- bis schwarzbraun pigmentierten ausgewählt. Die Beimpfung der ersten Submersvorkultur erfolgt durch Übertragung eines ca. 1 cm² großen Rasenstückes auf 100 ml des Anzuchtmediums folgender Zusammensetzung (g/l).

Glucose 50, Kaseinpepton 10, KH₂PO₄1, KCI 2,5 zu 11 Aqua dest.; pH 5,5 bis pi H 5,6; Sterilisation 30min bei 120°C.

Die 500-ml-Anzuchtkolben werden 72 Stunden lang bei 24°C bis 25⁰C mit 180 rpm bis 220 rpm auf Rundschüttlern kultiviert. Sie zeigen als Reifekriterien eine braunschwarze Färbung. Sie dienen in einer Menge von 5% als Impfanteil des Hauptkulturmediums, welches zu je 100ml in 500-mt-Erlenmeyerkolben abgefüllt folgende Zusammensetzung aufweist (g/l):

Glucose 50, (NH₄I₂SO₄ 5, (NH₄J₂HPO₄ 2, MgSO₄ x 7 H₂O 0,5, ZnSO₄ x 7 H₂O 0,008, CaCO₃ 5,1 zu 11 Aqua dest., pH 5,3 bis pH 5,9; Sterilisation 30min bei 12O⁰C.

Die Kultivierung erfolgt 11 Tagelang bei 24°C bis 25⁰C auf einem Rundschwinger mit 180 rpm.

101 Kulturbrühe, die man auf diese Weise erhält, werden separiert und die erhaltene feuchte Biomasse (ca. 400g) wird 2mal mit je 1,21 Methanol je 5 Stunden bei Raumtemperatur extrahiert. Die Extrakte werden vereinigt und im Vakuumrotationsverdampfer weitgehend eingeengt. Der ölige Rückstand wird in wenig Chloroform aufgenommen und an Aluminiumoxyd neutral mit Chloroform/Äthanol = 98,5/1,5 chromatographiert. Die Ergosterin enthaltenden Fraktionen (Kontrolle mittels DC) werden vereinigt und im Vakuumrotationsverdampfer eingeengt. Der ölige Rückstand wird in wenig Methanol/Wasser = 95/5 aufgenommen und nacch lOstündigem Stehen bei 10⁰C das ausgefallene Rohergosterin abgesaugt. Man erhält 800mg kristallines Ergostarin-Rohprodukt (ca. 90%ig), das zur Feinstreinigung aus Äthanol umkristallisiert werden kann.

Verfahren zur Herstellung von Ergosterin

Bericht über das Ergebnis der Prüfung auf Schutzfähigkeit und Bewertung der technisch-ökonomischen Effektivität

zu 1.) Es wurden Patente folgender Länder und Regionalfonds im Zeitraum 1970-1989 recherchiert (im AfEP, Berlin, Lesesaal Mohrenstraße)

Land Patentklasse Schriften

DD C12P33/00 140478-254025

DE C12P33/00 2303495-3031334

SU C12P33/00 1411336 (!.Schrift)

US C12 P 33/00 4232122-4783402

CH C12P33/00 634105-656462

EP C12P33/00 15308-227588

Andere Informationsquellen:

Über die Herstellung von Ergosterin wurde recherchiert in

a.) Beilstein: Handbuch der Organischen Chemie, 4. Ergänzungswerk (Literatur bis 1959)

b.) Chemical Abstracts (Columbus/Ohio- USA) published by the American Chem. Soc. 1960-1989, Subject Index, Formel Index

c.) Steroid Kartei (Dokumentation) des ZIMET

zu 2.) Ergosterin ist als Bestandteil der Zellen von Pilzen und Hefen bekannt. Aufgrund der großen Bedeutung des Ergosterins als Ausgangsverbindung für die Synthese von Vitamin D und als Vorstufe für die Herstellung von synthetischen Steroidhormonen führten ausgedehnte Screening-Untersuchungen zur Auffindung zahlreicher Mikroorganismen mit Ergosterin-Bildungsvermögen, so unter anderem Pilzstämme der Gattungen Aspergilll und Penicillin (vgl. Übersicht von El-Refai, A. H., 1964, Ph. D. Thesis, Cairo Univ.) sowie zahlreiche Hefestämme der Gattungen Endomyces, Nadsonla, Mycoderma, Saccharomyces, Zygosaccharomycs, Debaromyces, Hansenula. Plchla, Rhodorula und Torulopsls (vgl. Übersichten von Conzales-Bibiesca, J. L. und Campillo, C. C. 1961, Latinomer. Microbiol., 4,83; El-Refai, A. H. und El-Kady, I.A. 1968, Zeitschr. AIIg. Mikrobiologie 8,355). Die meisten der hier genannten Mikroorganismen mit Ergosterin-Bildungsvermögen sind jedoch aufgrund der niedrigen Ausbeuten an Biomasse mit zudem auch nur geringen Ergosteringehalt für biotechnoiogische Nutzung nicht geeignet. Als geeignetste Mikroorganismen zur Gewinnung von Ergosterin auf fermentativem Wege erwiesen sich Hefestämme der Gattung Saccharomyces (vgl. die Patentschriften US 2059980, US 2276710, US 2817624, DRP 720007) sowie Pilzstämme der Gattungen Trichoderma, Fusaria und Cephalosporia (Patentschrift DE 2303495 C₂). Diese biotechnologischen Verfahren, bei denen Ergosteringehalte bis zu 200mg/l Kulturbrühe erhalten werden, benötigen jedoch komplexe organische Nährmedien mit Pepton als Stickstoffquelle, was als ein erheblicher ökonomischer Nachteil angesehen werden muß. Die Gewinnung von Ergosterin neben Ubichinonen aus Lipid-KW-Extrakten, die bei der mikrobiellen Gewinnung von Eiweiß auf der Basis von KW anfallen, haben die Patentschriften DD 115899,DD 151007, DD 154448 und DD 209187 zum Gegenstand. Die Lipid-KW-Extrakte mit einem Ergosteringehalt von 1 % werden aus einem KW-verwertenden Stamm der Hefe Lodderomyces elongisporus gewonnen. Die relativ aufwendige und besonders bei hohen KW-Gehalten erschwerte Isolierung des Ergosterins aus dem Hefeextrakt erfordert zunächst eine adsorptive Anreicherung des Sterols an Kieselgel. Zur Gewinnung von Hefe mit Ergosteringehalten von 0,8% bis 1,5% der Trockensubstanz wird bei Gärprozessen anfallende Hefe wie z. B. Melassesprithefe oder Bierhefe einer aeroben Nachfermentation in Gegenwart von

Ammoniumstickstoff, Phosphationen und einer Kohlenstoffquelle unterworfen. Die durch Separation abgetrennte Biomasse (20g Trockensubstanz/l Kulturbrühe) kann zur Gewinnung von Ergosterin oder nach UV-Bestrahlung als Vitamin-Dj-haltige Futtermittelkomponente benutzt werden (vgl. Patentschrift DD 202892).

Wie aus der Patent- und Literaturrecherche hervorgeht, existieren keine Schutzrechte für die gleichzeitige Gewinnung von Ergosterin neben leicht abtrennbarem Cyclosporin, die das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Ergosterin mit Hilfe des Mikroorganismus Tolypocladlum Inflatum Wb6-5 mit der Hinterlegungsnummer IMET 43899 tangieren.

Störpatente sind nicht bekannt, eine Kollision fremder Patentansprüche mit der eigenen erfinderischen Lösung ist nicht zu erwarten und eine Umgehung entgegenstehender Schutzrechte Dritter ist daher nicht erforderlich. Da es sich um einen nicht bekannten Ergosterinproduzierenden Mikroorganismus handelt, gibt es keine naheliegenden Lösungen.

zu 3.) Mikrobiologie - Fermentationsbetriebe - pharmazeutische Industrie

zu 4.) Pie Vorteile des vorliegenden Verfahrens zur Herstellung von Ergosterin liegen darin,

- in der Bereitstellung eines Mikroorganismus der neben Ergosterin, außer dem leicht abtrennbaren Cyclosporin, keine weiteren, von dem Sterol schwer abtrennbaren Substanzen im Mycel anreichert.

- in der Möglichkeit, in guten Ausbeuten und bei Rückgriff auf billige Einsatzstoffe ein für die pharmazeutische Forschung und Industrie bedeutsames Ausgangsmaterial verfügbar machen zu können, das für die Synthese von Vitamin-D₃-Pharmaka und Pflanzenwachstumsregulatoren vom Typ der Brasinosteroide von potentiellem Nutzen ist.

- in der einfachen Isolierung des Ergosterins aus der Biomasse und der einfachen Abtrennung des Sterols vom Cyclosporin ohne wesentlichen zusätzlichen Aufwand an Chemikalien, Arbeitszeit und Energie.

zu 5.) Die Erprobung fand bisher im Labor- und im Technikumsmaßstab (2000-Liter-Fermentor) statt. Die Nutzung des Verfahrens soll unmittelbar nach Anmeldung beim AfEP beginnen.

Die aufzunehmende Produktion soll den Eigenbedarf im ZIMET abdecken und darüber hinaus den anderer Institutionen der DDR

Eine Exportmöglichkeit im SW ist zu prüfen.

Claims (5)

1. Verfahren zur Herstellung von Ergosterin durch Fermentation unter aeroben und sterilen Bedingungen in flüssigen Nährmedien, die eine Kohlenstoff-, Stickstoffquelle sowie Mineralsalze enthalten, bei einerTemperatur zwischen 20⁰C und 37°C, gekennzeichnet dadurch, daß der pilzliche Mikroorganismus Tolypocladium inflatum Wb 6-5 eingesetzt, während eines Zeitraumes von 5 Tagen bis 11 Tagen in einem Medium mit Ammoniumsalzen als einziger Stickstoffquelle kultiviert und das gebildete Ergosterin aus dem Mycel oder gegebenenfalls auch aus dem Kulturfiltrat auf extraktivem Wege gewonnen und nachfolgend gereinigt wird.

2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß man bei der Kultivierung von rot- bis schwarzbraun pigmentierten Emerskulturen ausgeht, die auf einen Mineralsalz-Glukose Agar mit Ammoniumsalzen als einziger Stickstoffquelle angezogen werden.

3. Verfahren nach Punkt 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß man für die Kultivierung des Stammes Tolypocladium inflatum Wb 6-5 als Ammoniumsalze Ammoniumsulfat und/oder Diammoniumhydrogenphosphat verwendet.

4. Verfahren nach Punkt 1 bis 3, gekennzeichnet dadurch, daß das Mycel von der Kulturlösung abgetrennt, mit einem organischen Lösungsmittel extrahiert, die Lösung anschließend eingeengt und das Ergosterin durch säulenchromatographische Fraktionierung an Aluminiumoxyd isoliert wird.

5. Verfahren nach Punkt 1 bis 4, gekennzeichnet dadurch, daß zur Reinigung des Ergosterins die säulenchromatographischen Fraktionen eingeengt, die Eluatrückstände in wäßrigem Methanol aufgenommen, abgeschiedenes Ergosterin abfiltriert und durch Umkristallisation aus einem organischen Lösungsmittel in reiner Form erhalten wird.