DD292084A5

DD292084A5 - Verfahren zur rastermikroskopischen bestimmung von calciumionenkonzentration in zellen

Info

Publication number: DD292084A5
Application number: DD33790190A
Authority: DD
Inventors: Heidrun Wabnitz
Original assignee: Friedrich-Schiller-Iniversitaet,De
Priority date: 1990-02-16
Filing date: 1990-02-16
Publication date: 1991-07-18
Also published as: DE4104014A1

Abstract

Verfahren zur Bestimmung von Calciumkonzentrationen in Zellen. Das Verfahren ermoeglicht die absolute Bestimmung der Ca2-Konzentration in biologischen Materialien mit Hilfe solcher Indikatorfarbstoffe, die auf eine Konzentrationsaenderung mit einer Veraenderung der Fluoreszenzquantenausbeute reagieren. Die Loesung besteht darin, dasz die Zellen mit einem solchen Indikatorfarbstoff eingefaerbt und dann mit kurzen Lichtimpulsen zur Fluoreszenz angeregt werden, das Fluoreszenzlicht mit zeitlicher Aufloesung registriert wird und durch Auswertung des Abklingverhaltens das Verhaeltnis der Anteile der beiden Fluoreszenzkomponenten, die dem freien Farbstoff einerseits und dem Farbstoff-Ca2-Komplex andererseits entsprechen, und daraus die Ca2-Konzentration ermittelt werden.{Rastermikroskopie; Ca2-Konzentration, intrazellulaer; Indikatorfarbstoff; Fluoreszenz; Fluoreszenzquantenausbeute}

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft die Bestimmung intrazellulärer Ca²*-Konzentrationen. Calcium nimmt eine zentrale Stellung bei der biochemischen Signalübertragung auf zellulärer Ebene ein; es steuert die Aktivierung von Transmittern, Enzymen oder Hormonen ausgehend von Potentialänderungen oder Rezeptoren in tierischen und pflanzlichen Zellen. Die Messung von Ca²*-Konzentrationen im Zeilinneren ist deshalb von herausragender Bedeutung in der experimentellen Zellbiologie und Neurobiologie.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Es sind verschiedene Verfahren zur Bestimmung von intrazellulären Ca²⁺-Konzentrationen bekannt, die auf dem Einsatz von Ca²"-empfindlichen Mikroelektroden, Biolumineszenz von Biopolymeren "nd Fluoreszenzindikatoren beruhen. Die letztgenannte Methode wird wegen ihrer hohen Empfindlichkeit und ihres Verzichts auf mechanische Eingriffe in den letzten Jahren in wachsendem Maße breit eingesetzt. Sie bnruht auf der Verwendung von speziellen Sondenfarbstoffen, die eine hohe Affinität und Selektivität für die Bindung von Ca²^ sowie eine möglichst effiziente Fluoreszenz mit starker Änderung von Fluoreszenzparametern bei Ca²"-Anlagerung aufweisen. Die Fluoreszenzregistrierung wird mit mikroskopischen oder durchflußzytometrischen Verfahren kombiniert. Dabei ist das Verfolgen von Aktivierungsprozessen im Echtzeitbetrieb zusammen mit räumlicher Darstellung („optical recording") von besonderem Interesse. Es wurden spezielle Mikroskopphotometer entwickelt, mit denen für solche Indikatorfarbstoffe, die eine deutliche spektrale Änderung bei Ca^2r-Bindung aufweisen, aus der Fluoreszenzmessung bei zwoi verschiedenen Anregungs- bzw. Fluoreszenzwellenlängen mittels eines Quotientenverfahrens auf die Ca²*-Konzentration geschlossen wird (DE 3604815; Mature 318 [1985) 558-561). Der Einstz der Laserrastermikroskopie ist vor allem im Zusammenhang mit der Möglichkeit der 3D-Auflösung und Tiefendiskriminierung attraktiv.

Einige wenige Indikatorfarbstoffe haben sich in der breiten Anwendung durchgesetzt (J. Biol. Chem. 260 [1985] 3440-3450; Biochem. J. 248 [19871,313-328; Trans. inNeurosci. 11 [1988] 419-424). Bei den Farbstoffen „fura-2" und „indo-1" ändert sich im wesentlichen das Absorptions- bzw. Fluoreszenzspektrum bei Ca²⁺-Anlagerung, bei „quin-2" und „fluo-3" die Fluoreszenzquantenausbeute. Während die übrigen Farbstoffe im UV-Bereich angeregt werden müssen, bietet „fluo-3" den entscheidenden Vorzug, im sichtbaren Wellenlängenbereich um 500nm anregbar zu sein. Das ist einerseits hinsichtlich der Verfügbarkeit von Lichtquellen (Argonlaser) sowie optischen Bauelementen günstig. Andererseits entfällt weitestgehend die bei Anregung im nahen UV-Bereich störend in Erscheinung tretende Eigenfluoresenz von Zellen. Zudem wird der parallele Einsatz von UV-Strahlung z. B. zur photostimulierten Ca²⁺-Freisetzung möglich.

Die Absolutbestimmung der Ca²⁺-Konzentration mittels solcher Farbstoffe, die keine wesentliche Spektrenverschiebung bei C '"-Anlagerung aufweisen, ist jedoch mit einer außerordentlich komplizierten, zeitaufwendigen und zeilschädigenden Eichprozedur verbunden

Es ist eine absolute Intensitätsmessung nötig, die durch lokale oder zeitliche Änderungen

- der Farbstoffkonzentration,

- der optischen Weglänge in der Zelle,

- der Anregungsintensität,

- der Detektorempfindlichkeit

beeinträchtigt wird. Unter Erhaltung dieser Bedingungen ist für jedes konkrete Objekt in situ die Bestimmung der Fluoreszenzintensitäten für praktisch verschwindende und sehr hohe ^r ~ Konzentration erforderlich. Die von „Mol. Probes Inc." dafür angegebene Eichprozedir beinhaltet einen z. B. durch dt sierte Zugabe von lonomycin ausgelösten Ca²⁺-Einstrom aus dsm umgebenden Medium bis in den Sättigungsbereich; anschließend wird durch Mn²*-Zugabo die Fluoreszenz gelöscht, um einen Bezug zu dem Wert ohne Ca²" zu erhalten.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist die Senkung des Aufwandes für Eichprozeduren und Herabsetzung der damit verbundenen Belastung des Zellmaterials hei der absoluten Ca²⁺-Konzentrationsbestimmung mittels Fluoreszenzindikatoren.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, oin Verfahren anzugeben, mit dem die absolute Bestimmung der Ca'⁺-Konzentration in biologischen Materialien mit Hilfe solcher Indikatorfarbstoffe, die auf eine Veränderung der Ca²*-Konzentration mit einer Veränderung der Flureszenzquantenausbeute reagieren, unter Vermeidung sonst üblicher aufwendiger Eichprozeduren gelingt. Die Lösung gelingt erfindungsgemäß dadurch, daß die Zellen mit einem solchen Indikatorfarbstoff, der auf eine Veränderung der Ca²⁺-Konzontration mit einer Voränderung dar Fluoreszonzquantonausbeute reagiert, eingefärbt und dann mit kurzen Lichtimpulsen zur Fluoreszenz angeregt werden, das Fluoreszenzlicht mit zeitlicher Auflösung registriert wird und durch Auswertung des Abklingverhaltens das Verhältnis der Anteile der beiden Fluoreszenzkomponenten, die dem freien Farbstoff einerseits und dem Farbstoff-Ca²~-Komplex andererseits entsprechen, und daraus die Ca²⁺-Konzentration ermittelt werden. In der flüssigen Lösung, deren Ca²~-Gehalt zu bestimmen ist (Cytosol der Zellen), liegen nach Zugabe des Indikatorfarbstoffes freie Farbstoffanionen (FS; Index 1) und Farbstoff-Ca²"-Komplexe (FSCa; Index 2) im chemischen Gleichgewicht vor. Ihr Konzentrationsverhältnis hängt in bekannter Weise gemäß dem Massenwirkungsgestez mit der Ca²*-Konzentration über die Dissoziationskonstante Ko zusammen.

[Ca²^l = K₀ c₂/c„ (1)

hierbei ist 1:1 -Stöchiometrie des Komplexes vorausgesetzt.

Die Messung hat die Aufgabe, das Verhältnis C₂Zc₁ zu ermitteln; erfindungsgemäß wird dazu die zeitaufgelöste Registrierung des Abklingens der Fluoreszenz herangezogen.

Ursache für eine bei Ca²⁺-Bindung eintretende Änderung der Qua 'tenausbeute bzw. Intensität der Fluoreszenz des Indikatorfarbstoffes sind Veränderungen der Raten verschiedener Relaxationsprozesse aus dem angeregten Zustand der Farbstoffmoleküle. Diese bestimmen andererseits die Lebensdauer des angeregten Zustandes, die insbesondere als Abkling eit des Fluoreszenz nach Impulsanregung der Beobachtung zugänglich ist. Deshalb sind für solche Indikatorfarbstoffe, von denen bekannt ist, daß sie auf Ca²*-Bindung mit einer erheblichen Veränderung der Fluoreszenzquantenausbeute reagieren (insbesondere quin-2 und fluo-3), auch deutliche Unterschiede der Fluoreszenzabklingzeiten für FS und FSCa zu erwarten. Die Fluoreszenzintensität bei gleichzeitigem Vorliegen von FS und FSCa hat unter der Voraussetzung, daß nur diese beiden Spezies fluoreszieren und jeweils einfach-expenentielles Abklingverhalten aufweisen, einen zeitlichen Verlauf der Form

Mt) = a (c, · k_n · exp{-t/r,} + C₂ · k_f2 · exp{-t/r₂}), (2)

wenn die Anregung mit einem im Vergleich zu den Abklingzeiten r_)i2 kurzen Lichtimpuls erfolgt. Der Faktor a hängt mit der absorbierten Anregungsenergie sowie der Effektivität des Fluoreszenznachweises zusammen. kn, ₂ sind die Raten der strahlenden Desaktivierung des angeregten Zustandes füi die beiden Farbstoffspezies. Im weiteren wird angenommen, daß k_Fι = kp2 gilt; anderenfalls sind Eichmessungen z.B. an Lösungen bekannter Ca²~-Konzentration heranzuziehen. Die lineare Abhängigkeit der Fluoreszenzintensität von der Konzentration ist an ausreichend schwache Absorption und nicht zu starke Anregung gebunden

Die zeitaufgelöste Messung der Fluoreszenzintensität liefert

Mt) = A, exp{-t/r,} + A₂ exp{-t/r₂).

Aus den Amplituden A₁,₂, die in bekannter Weise durch Kurvenanpassung aus der gemessenen Abklingkurve erhalten werden können, ist gemäß (2) und für den Fall k_n = k_F2

A₂/A, = c₂/c,, (4)

woraus sich nach (1) mit

(Ca^2T] = K_D · A₂/A, (5)

unmittelbar die Ca²*-Konzentration ergibt.

Ausführuiigsbeispiel

Das Weser, der Erfindung soll an einem Ausführungsbeispiel näher erläutert werden. Eine zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignete Anordnung ist in Fig. Ί schematisch dargestellt. Das biologische Objekt 1, dessen Ca^-Konzentrationzi' ^h"-t'mmen ist, wird gemäß üblicher Vorschrift mit dem Indikatorfarbstoff quin-2 oder fluo-3 eingefärbt. Die Anregung des Fluoreszenz erfolgt durch einen mittels des Mikroskopobjektivs 2 fokussierten Laserstrahl 3, der in einem modensynchronisierten kontinuierlichen Laser4 erzeugt wird und demzufolge aus einem £ug von Picosekundenimpulsen besteht. Das Strahlablenksystem 5 dient der Positionierung des Laserfokus auf dem Objekt 1. Die vom Objekt 1 ausgehende Fluoreszenzstrahlung wird in Rückwärtsrichtung vom Mikroskopobjektiv 2 erfaßt, am Teilerspiegel 6 reflektiert und gelangt auf den Sekundärelektronenvervielfacher 7. Dieser liefert Einzelphotonenimpulse, die in einem Meßsystem für zeitkorrelierte Einzelphotonenzählung 8 registriert werden. Die Fluoreszenzabklingkurve, die den zeitlichen Verlauf der Fluoreszenzintensität nach Impulsanregung repräsentiert und von der Ca^-Konzentration abhängt (vgl. Fig. 2), wird in dem angeschlossenen Computer 9 ausgewertet, so daß das Verhältnis der Amplituden der beiden Fluoreszenzkomponenten, die von Farbstoff-Ca²⁺-Komplexen bzw. freien Farbstoffanionen herrühren, erhalten wird. Daraus wird mit der bekannten Dissoziationskonstante unmittelbar die Ca²⁺-Konzentration berechnet. Sie kann nach Messung an vielen Punkten des Objektes 1 in Abhängigkeit von der mit der Kontrolleinrichtung 10 ermittelten Position des Laserstrahls als Rasterbild dargestellt werden.

Fig. 2 zeigt als Beispiel das Fluoreszenzabklingen für quin-2-Lösungen definierten Ca²⁺-Gehaltes(a: 10~^emol/l,b: 1(T⁷mol/l)bei festem pH-Wert 6,72 (Pufferlösung 10~²mol/l MOPS) und einer Wellenlänge 490 nm. Die Kurve c repräsentiert den Anregungsimpuls (Wellenlänge 350nm).

Claims

Verfahren zur rastermikroskopischen Bestimmung von intrazellulären Ca²⁺-Konzentrationen, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen mit einem solchen Indikatorfarbstoff, der auf eine Veränüerung der Ca²⁺-Konzentration mit einer Veränderung der Fluoreszenzquantenausbeute reagiert, eingefärbt und dann mit kurzen Lichtimpulsen zur Fluoreszenz angeregt werden, das Fluoreszenzlicht mit zeitlicher Auflösung registriert wird und durch Auswertung des Abklingverhaltens das Verhältnis der Anteile der beiden Fluoreszenzkomponenten, die dem freien Farbstoff einereits und dem Farbstoff-Ca²⁺-Komplex andererseits entsprechen, und daraus die Ca²⁺-Konzentration ermittelt werden.

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2 Seiten Zeichnungen