DD292927A5 - Verfahren zur herstellung der rekombinanten kapsidstruktur hbcag delta-pres2/adw, die das coreantigen des hepatitis b-virus mit dem an seine oberflaeche exponierten epitop hbvpres2/adw darstellt - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung der rekombinanten Kapsidstruktur HBcAgD-preS2/adw, die das Coreantigen des Hepatitis B-Virus mit dem an seiner Oberflaeche exponierten Epitop HBVpreS2/adw darstellt. Das Wesen der Erfindung besteht darin, dasz das Fragment des S-Gens des Hepatitis B-Virus, Subtyp adw, bezeichnet als preS2/adw mit einer Laenge von 180 Basenpaaren (Bp) in den Restriktionsort Cla I des Vektorplasmis pHBc 1615 unter Bildung des rekombinanten Gens HBcAgD-presS2/adw eingebaut wird. Den Produzentenstamm des HBcAgD-presS2/adw erhaelt man durch Transformation von E. coli K802-Zellen mit rekombinanten Plasmid-DNA pHBV 32-46. Dieser Produzentenstamm ermoeglicht die Herstellung der rekombinanter Kapsidstruktur HBcAgD-presS2/adw, die das Coreantigen des Hepatitis B-Virus (HBV) mit dem an seiner Oberflaeche exponierten Epitop preS2/adw darstellt.{Kapsid; Coreantigen; Hepatitis B-Virus; preS2-Region; Epitop; rekombinante DNA; Gentechnik; Escherichia coli; Virusdiagnostik; Vakzine}

Description

Hierzu 2 Seiten Zeichnungen

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft die rekombinante Kapsidstruktur HBcAg Δ-preS2/adw, die das Coreantigen des Hepatitis B-Virus mit dem an seiner Oberfläche exponierten Epitop HBVpreS 2/adw darstellt.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Die Möglichkeit der effektiven Synthese von Kapsid-ähnlichen rekombinanten Partikeln in E.coli, die das Coreantigen (HBcAg) des humanen Hepatitis B-Virus darstellen (Borisova, G. P., et al. Dokl. Akad. Nauk SSSR, 1984,279,1245-1249 Borisova, G. P., et al. Biopolimery i kletka, 1985,1,99-105) und an ihrer Oberfläche die komplette Aminosäuresequenz des preS2/Subtyp ayw exponieren, ist gezeigt worden: HBcAg-preS 2(2-54) und HBcAg Δ-preS 2 (1-55). Die Fusionsproteine enthalten die preS2-Region von der 2. bis zur 54. bzw. von der 1. bis zur 55. Aminosäure. Das Fusionsprotein HBcAg-preS 2 (2-54) enthält die vollständige Sequenz des HBcAg, während dem Fusionsprotein HBcAgA-preS2 (1-55) die 39 C-terminalen Aminosäuren des HBcAg fehlen. Diese Proteine werden gebildet im Ergebnis der Expression rekombinanter Gene, bei denen die kodierende Sequenz der preS2-Region, ausgeschnitten aus dem klonierten HBV-Genom des Subtyps ayw (Pumpen, P. P., et al. Dokl. Akad. Nauk SSSR, 1981, 260,1022-1 024), in das Kodon für die 144.Aminosäure des HBcAg inseriert ist. Solche Kapsid-ähnlichen Strukturen exponieren an ihrer Oberfläche preS2-Epitope des HBV-Subtyp ayw. Sie besitzen die immunogenen Eigenschaften von preS2-, HBc- und HBe-Antigenen und können in der Diagnostik eingesetzt werden. Außerdem kann das preS 2-Antigen HBV-neutralisierende Antikörper induzieren (Neurath, R.S., et al. Science, 1984,224,392, loth, Y. E., et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1986,83,9174). Somit können solche rekombinanten Proteine als Bestandteile von Diagnostika und/oder Vakzine dienen. Kapside auf der Grundlage des HBcAg, die an ihrer Oberfläche die preS2-Region dei· HBV-Subtyp adw exponieren, sind bisher nicht beschrieben worden.

Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung besteht darin, rekombinante K&^r.;sidstrukturen mit hoher Immunogenität und großen Ausbeuten herzustellen.

Darstellung des Wesens der Erfindung

Aufgabe der Erfindung ist es, die Gewinnung rekombinanter Kapsldstrukturen, die das Coreantigen des Hepatitis B-Virus (HBV) mit dem an seiner Oberfläche exponierten Epitop HBVpreS2/adw darstellen, und die Schaffung eines Produzentenstammes für solche Strukturen.

Diese Aufgabenstellung wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß im Ergebnis der Konstruktion des rekombinanten Gens HBcAgA-preS2/adw, welches die Synthese des entsprechenden Proteins kodiert, und des Expressionsplasmas pHBV 32-46 ein Produzentenstamm E. coli (pHBV 32-46) erhalten wird, der die Produktion der rekombinanten Kapsidstruktur HBcAg A-preS2/ adw mit einem Anteil von 13,2% am Gesamtprotein von E.coli sichert.

Das rekombinante Plasmid pHBV 32-46, dessen Konstruktionssrhema in Fig. 1 dargestellt ist, besteht aus folgenden Elementen:

- DNA des Plasmids pHBc1615, einer Variante des Plasmids pHBc3, welche das Gen des HBcAg mit einem optimierten Initiationsbereich für die Translation enthält, und ein mutiertes Gen des HBcAg, das einen Polylinker-Einschub im Kodon für die 144.Aminosäure hat, der für den Einbau von Fremdabschnitten in diesem Bereich vorgesehen ist, besitzt; Länge 6900Bp

- Fragment des HBV-Genoms, Subtyp adw, welches dem Abschnitt zwischen den Restriktionsorten Eco Rl₀ und Eco 130I₁₈₀ entspricht und den Bereich des preS2 (4. bis 55.Aminosäure) und 9 Aminosäuren des S-Antigens kodiert (Länge 180Bp). Die Größe des Plasmids beträgt 7080Bp.

Die DNA des rekombinanten Plasmids pHBV 32-46 enthält die Gene:

- Gen HBcAgA-preS2/adw, das die Synthese des Endprodukts gewährleistet,

- Gen bla, welches eine Ampizillin-Resistenz verleiht.

Das Gen HBcAgA-preS2/adw steht unter Kontrolle eines Tandempromotors P,_rp. Das Plasmid pHBV 32-46 wird nach Zugabe von Chloramphenikol ins Medium nicht-konjugativ amplifiziert. Das Wesen der Konstruktion des Plasmids pHBV 32-46 besteht darin, daß das Fragment des S-Gens vom HBV, Subtyp adw,

bezeichnet als preS2/adw, mit einer Länge von 180Bp in den Restriktionsort CIaI des Vektorplasmids pHBc1615 unter Bildungdes rekombinanten Gens HBcAg A-preS2/adw eingebaut wird.

Den Produzentenstamm des HBcAgA-preS2/adw erhält man durch Transformation von E.coli K802-Zellen mit rekombinanter Plasmid-DNA pHBV 32-46. Morphologische Merkmale: gram-negative stäbchenförmige Zellen, Kulturmerkmale: Zellen wachsen auf üblichen Nährmedien,

bilden Kolonien mittlerer Größe,

Physiko-biochemische Merkmale: optische Kultivierungstemperatur 37⁰C, pH-Optimum 7,0-7,4. Als Kohlenstoffquelle werden Kohlenwasserstoffe, als Stickstoffquelle sowohl Mineralsalze als auch organische Verbindungen in Form von Pepton, Trypton

und Aminosäuren eingesetzt.

Antibiotika-Resistenz: resistent gegen Ampizillin, bedingt durch das Vorhandensein des Plasmids. Die Anwesenheit von Plasmid-DNA im Zellstamm wird durch Kontrolle der Ampizillin-Resistenz bestätigt, außerdem durch die Gewinnung und Analyse von Plasmid-DNA. Der Zellstamm ist in der Kollektion des Zentralmuseums industrieller Mikroorganismen der UdSSR unter der Nummer WKPM W 5240 deponiert. Ausführungsbeispiel

Die Erfindung soll nachstehend an einem Ausführungsbeispiel näher dargestellt werden. Die dazugehörigen Abbildungen zeigen >

Fig. 1: Konstruktionsschema der erfindungsgemäßen rekombinanten Plasmid-DNA pHBV 32-46 Fig.2: Bestimmung der preS2-Aktivität mittols Immunoblotting.

Die Realisierung des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt in 2 Verfahrensschritten:

1. Konstruktion rekombinanter Plasmid-DNA pHBV 32-46

2μρ des Plasmids pHBc1615, nach Standardmethoden gewonnen, spaltet man mit 2 Einheiten der Restriktase CIaI in 25μΙ der Lösung A (1 OmM Tris-HCI, pH 7,5; 50 mM NaCI; 1OmM MgCI₂) 2 Stunden bei 37⁰C. Die Restriktase inaktiviert man 15 Minuten bei 65°C. Die linearisierte Plasmid-DNA, Länge 6900Bp, isoliert man aus einem 0,8%igen Agarosegel und resuspendiert sie in 20μΙ H₂O(DNAI).

20Mg des Plasmids pAE 10, das das vollständige Genom des HBV-Genoms, Subtyp adw, enthält, spaltet man mit 50 Einheiten der Restriktase Eco Rl und 50 Einheiten der Restriktase Eco 1301 in 100 μΙ der Lösung A16 Stunden bei 37⁰C. Nach der Inkubation wird das Fragmentgemisch auf ein 2%iges Agaiosegel aufgetragen und das Fragment mit einer Länge von 180 Bp, welches das Epitop preS2/adw trägt, nach bekannten Methoden aus dem Gel eluiert. Das Fragment wird in 10μΙ H₂O resuspendiert (DNA2). 0,05Mg DNA2 und 0,1 Mg DNAI werden gemischt und die überhängenden Enden in 20μΙ der Lösung B (5OmM Tris-HCI, pH 7,5; 1OmM MgCI₂; 1OmM DTT; 25mM NaCI) durch Zugabe von je 100μΜ dATP, dCTP, dTTP und dGTP sowie 5 Einheiten DNA-Polymerase aus E.coli (Klenow-Fragment) im Laufe einer Stunde bei Raumtemperatur aufgefüllt. Die DNAs verbindet man mit Hilfe von 10 Einheiten T4-DNA-Ligase in 10μΙ der Lösung B bei Zugabe von 1 mM ATP im Laufe von 12 Stunden bei 4⁰C. Zum Reaktionsgemisch werden ΙΟΟμΙ E.coli RR1-Zellen, die vorher mit 10OmM CaCI₂ behandelt worden waren (Endkonzentration 5 χ 1Q⁹ Zellen/ml), zugegeben, um die rekombinanten Plasmid-DNAs zu transformieren. Die Auswahl der Klone erfolgt mit Hilfe der Restriktionsanalyse der Plasmid-DNA, die im Schnellverfahren isoliert worden war. Das Plasmid mit dem erwarteten Restriktionsspaltmuster erhält die Bezeichnung pHBV 32-46. Figur 1 zeigt das Konstruktionsschema dieses Plasmids.

2. Transformation des erfindungsgemäßen Plasmids in einen Produzentenstamm

Den Produzentenstamm erhält man durch Transformation von E.coli K802 mit dem rekombirianten Plasmid pHBV 32-46. Die Zellen werden in M 9-Medium mit Zusatz von 10g/l Kasaminsäuren, 2g/l Glukose und 0,02 g/l Ampizillin bis zu einer optischen Dichte von OD₆Gd 4-5 kultiviert. Die Zellen werden durch Zentrifugation gesammelt und im dreifachen Volumen eines Puffers lysiert, der 0,05 M Tris-HCI, pH 8,0; 0,15 M NaCI; 0,1 % Triton X100; 0,005 M EDTA und 3 mg/ml Lysozym enthält. Nach 30minütiger Inkubation bei 4⁰C werden die Zellen einem dreimaligen Frieren/Tauen ausgesetzt. Anschließend werden Desoxyribonuklease und MgCI₂ bis zu Endkonzentrationen von 20μg/ml bzw. 1OmM zugegeben und bei 4⁰C nochmals 30 Minuten inkubiert. Das Lysat wird 30 Sekunden mit Ultraschall behandelt und dann zentrifugiert (1000Ox g, 4⁰C).

Das rekombinierte Protein HBcAgA-preS2/adw wird wie folgt gereinigt: Das Lysat wird mit Ammoniumsulfat fraktioniert. HBcAg A-preS2/adw wird durch 30% Sättigung mit Ammoniumsulfat gefällt. Das Pellet wird gesammelt und in 0,04 M Natriumphosphat, pH 8,0; 0,15 M NaCI; 0,1 % Triton X100 gelöst, bis zu einer Endkonzentration des Proteins von 25-50 mg/ml. 2-4ml dieser Lösung trägt man auf eine Sepharose CL4 B-Säule

(2,1 cm x 75cm) auf, die mit dem gleichen Puffer (nur ohne Triton X100) ausgeglichen wurde. Die Fraktionen mit HBcAg-Aktivität(siehe unten) sammelt man und verwendet sie sofort oder nach Konzentrierung durch nochmalige Fällung mit 50%

Ammoniumsulfat. Die Charakterisierung der erfindungsgemäßen rekombinanten Kapsidstruktur wird wie folgt vorgenommen: Bestimmung der HBcAg-Aktivität mittels radialer Immundiffusion (RID) Den HBcAg-Titer bestimmt man mit Hilfe der radialen Immundiffusion nach Ouchterlony. Dafür bereitet man eine Verdünnungsreihe (1:2", η is 1) des Zellysats und titriert gegen anti-HBc-Antikörper des Menschen. Als Standard verwendet man gereinigtes HBcAg aus rekombinanten Bakterien (1 mg/ml). Die Ergebnisse der Titration sind in der Tabelle 1 aufgeführt. Tabelle 1 Synthese von HBcAg A-preS2/adw in E.coli K802-Zellen, die rekombinante Plasmid-DNA pHBV 32-46 tragen Stamm OD₆₆₀ TiterimRID Protein HBcAg Ertrag des

mg/ml mg/ml Produkts (%)

E.coli

(pHBV 32-46) 4,0 1:128 15,0 2,0 13,2

Bestimmung der preS2-Aktivität mittels Immunoblotting Für das Immunoblotting resuspendiert man die Zellen (6mg) in 100μΙ Probenpuffer nach Laemmli, der 2% SDS und 2% Mercaptoäthanol enthält, und lysiert durch 2minütiges Erhitzen im kochenden Wasserbad. Die erhaltenen Lysate (2-4mg/ml Protein)trägtmanaufeinGradientenpolyacrylamidgel(12-23%)auf(Größe150mm χ 150mm χ 0,75mm). Die Elektrophorese

wird 15 Stunden bei einer Stromstärke von 7 mA durchgeführt.

Nach der Elektrophorese überträgt man die Proteine auf Nitrozellulose HAWP. Die Filter werden mit dem murinon monoklonalen Antikörper MAb E in einer Verdünnung von 1:500 in TBS-Puffer (5OmM Tris-HCI, jH7,5; 15OmM NaCI; 0,1 % Triton X100 + 1% BSA) 15 Stunden bei 2O⁰C inkubiert. Nach dreimaligem Waschen in TBS-Puffer inkubiert man die Filter 2 Stunden bei 20⁰C mit

dem Peroxidase-markierten Konjugat der Antikörper gegen Maus-Immunglobulin (Verdünnung 1:200). Die Filter spült man mit

TBS-Puffer (3-5x) und entwickelt mit Diaminobenzidin. Die Zellysate des Produzentenstammes weisen dabei das Auftreten spezifischer Färbungszonen auf, welche einem Protein mit

einem Molekulargewicht von 21,3kD (Länge 205 Aminosäuren) entsprechen, was in Übereinstimmung mit dem

Konstruktionsschema in Figur 1 steht. Die Kontrollysate von E. coli K802-Zellen (pHBc3) weisen solche Zonen nicht auf. Elektronenmikroskopische Charakterisierung rekombinanterKapsidstrukturen HBcAg A-preS2/adw Die elektronenmikroskopische Charakterisierung rekombinanter Kapsidstrukturen HBcAgA-preS2/adw wird wie folgt

vorgenommen:

Die Präparate des gereinigten Proteins HBcAg A-preS2/adw (siehe oben) werden mittels Negativ-Kontrastierung unter Verwendung von 1% Uranilacetat gewonnen und im Elektronenmikroskop bei einer Beschleunigungsspannung von 8OkV und

einer lOOOOOfachen Vergrößerung untersucht. Das Protein HBcAg A-preS2/adw bildet Kapside mit einem Durchmesser von

Claims (3)

1. Verfahren zur Herstellung der rekombinanten Kapsidstruktur HBcAg Δ-preS 2/adw, die das

Coreantigen des Hepatitis B-Virus mit dem an seiner Oberfläche exponierten Epitop HBVpreS 2/adw darstellt, dadurch gekennzeichnet, daß die 39C-terminalen Aminosäuren des HBcAg durch die Sequenz des Epitops preS2/adw (4.-55. Aminosäure) und 9N-terminale Aminosäuren des HBsAg ersetzt sind.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die rekombinante Plasmid-DNA pHBV

32-46 mit einer Größe von 7 080 Bp, bestehend aus

- der DNA des Plasmids pHBc 1615 mit einer Länge von 6900 Bp, die das Gen bla, das die Ampizillin-Resistenz vermittelt, und das HBc-Gen, unter Kontrolle eines Tandempromotors P_trp, enthält, und

- dem Fragment des HBV-Genoms, Subtyp adw, das der Sequenz zwischen, den Restriktionsorten Eco Rl₀ und Eco 1301₁₈₀ mit einer Länge von 180 Bp entspricht und den Bereich der preS2-Region von der 4. bis zur 55. Aminosäure und die 9 N-terminalen Aminosäuren des HBsAg kodiert und im Restriktionsort Cia I der DNA des Plasmids pHBc 1615 eingebaut ist, die Synthese der rekombinanten Kapsidsruktur HBcAg Δ-preS 2/adw ermöglicht.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadu.^h gekennzeichnet, daß man den Produzentenstamm des HBcAg Δ-preS 2/adw durch Transformation von E. coli K802-Zellen mit rekombinanter Plasmid-DNA PHBV36-46 erhalt.