DD147855A5 - Verfahren zur erzeugung mindestens eines hbv-antigenwirkung aufweisenden polypeptids - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von HBV-Antigenwirkung aufweisenden Polypeptiden. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dasz ein Rekombinat -DNS-Molekuel mit einem fuer mindestens ein HBV-Antigenwirkung aufweisendes Polypeptid kodierenden Strukturgen und einer operativ angefuegten Expressions-Kontroll-Sequenz geschaffen wird, ein entsprechender Wirt mit dem Rekombinant-DNS-Molekuel transformiert wird, der Wirt gezuechtet wird, und das Polypeptid gesammelt wird.

Description

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Verfahren zur Erzeugung von mindestens eines HBV-Antige mi irkung aufweisenden Polypeptide

Erfindung:

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erzeugung mindestens eines HBV-Antigenwirkung aufweisenden PoLypeptids.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen:

'Der Virus, der Hepatitis B oder. Serumhepatitis hervorruft, scheint nur den Menschen zu infizieren. Infektion durch den Hepatitis-B-Virus ("HBV") scheint bei Menschen weit verbreitet zu sein. Im Vereinigten Königsreich, den Vereinigten Staaten von Amerika sowie in Westeuropa sind annähernd 0,1 fo aller Blutspender chronische Träger von HBV. Während die Sterblichkeitsziffer infolge Virushepatitis nicht hoch ist (1975 betrug sie im Vereinigten Königsreich 3 pro Million), gibt es Anzeichen dafür, daß bis zu 5 % der Bevölkerung im Vereinigten Königsreich und 15 % der Bevölkerung in den Vereinigten Staaten von Amerika infiziert worden sind. In vielen afrikanischen und asiatischen Ländern sind bis zu 20 % der Bevölkerung chronische Träger von HBV, und. über 50 ^c/o aller Erwachsenen wurden oder sind mit HBV infiziert.

Die Hepatitisinfektion wird durch drei allgemeine Formen übertragen: (1) durch parenterale Inokulation von infiziertem Blut oder infizierten Körperflüssigkeiten, entweder in

großen Mengen bei Bluttransfusionen oder in winzigen Mengen, z.B. durch einen kleinen Hautriß; (2) durch engen familiären oder sexuellen Kontakt; und (3) durch einige Mutter, die infolge einer Infektion während der Schwangerschaft den Virus auf ihre neugeborenen Kinder übertragen. Unter natürlichen Bedingungen ist HBV nicht sehr ansteckend. Die Übertragung durch Einatmen kommt kaum, wenn überhaupt vor.

Die meisten HBV-Infektionen sind subklinisch. Die klinische Erkrankung dauert gewöhnlich drei bis sechs Wochen und kann in der Schwere zwischen leichter und akut ausbrechender Hepatitis mit folgender Zirrhose oder Tod.liegen. Die Genesung von klinischen und subklinischen HBV-Infektionen ist normalerweise vollkommen. Allerdings können in einigen Fällen ernstliche Dauerfolgen auftreten: (1) etwa 5 % der akuten Infektionen führen zur chronischen Anwesenheit von Hepatitis-B-Virusantigen mit der daraus folgenden ständigen Möglichkeit der Übertragbarkeit auf andere und des beginnenden Leberschadens; und (2) es ist möglich, daß eine frühere Infektion mit HBV allein oder teilweise die Ursache für die Auslösung eines großen Teiles von HBV-seronegativen Fällen chronischer aktiver Hepatitis, Zirrhose und primären Leberkarzinoms sein kann.

Durch neuere Erkenntnisse auf dem Gebiet der Molekularbiologie wurde es möglich, die DNS-Kodierung für spezifische nicht-bakterielle eukaryotische Proteine in Bakterienzellen einzuführen. Im allgemeinen umfaßt die Konstruktion der Rekombinant-DNS-Moleküle mit DNS, allerdings nicht mit der durch chemische Synthese hergestellten, die Schritte der Erzeugung einer einsträngigen DNS-Kopie (cDNS) einer gereinigten Messenger(mRNS)~Ternplate (Schablone) für das verlangte Protein; Umwandlung der DNS in doppelsträngige DNSj Einbau der DNS an einer passenden Stelle in ein ent-

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sprechenden Cloningvehikel und Transformieren eines entsprechenden Wirtes mit dem Rekombinant-DNS-Molekül. Durch eine derartige Transformation kann der Wirt das vorgesehene Protein erzeugen. Außerdem ist bekannt, zumindest im Falle von Ovalbumin-DNS, daß ein angemessenes Schmelzen der betreffenden DNS zu einem starken Bakterienpromoter oder einer Expressionskontrollsequenz größere Mengen des vorgesehenen Ovalbuminproteins erzeugt, d.h. etwa 0,5 bis 1 % der gesamten Proteinmasse einer E. coli-Zelle (O. Mercereau-Puijalon, u.a., "Synthesis of an Ovalbumin-like Protein by Escherichia coli K12 Harboring a Recombinant Plasmid" (Synthese eines ovalbumin-artigen Proteins durch Escherichia coli K12, das ein Rekombinant-Plasmid aufweist), Nature, 275, S. 505 - 510 (1978) und T.H. Fräser und B.D. Bruce "Chicken Ovalbumin is Synthesized and Secreted by Escherichia coli" (Hühnerovalbumin wird durch Escherichia coli synthetisiert und ausgeschieden), Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 75, S. 5936 - 5940 (1978)).

Verschiedene nicht-bakterielle Proteine und Gene sind mit Hilfe der Rekombinant-DNS-Technik synthetisiert worden. Dazu gehören ein Protein, das Rattenproinsulin-Antigen-Determinanten aufweist (L. Villa-Komaroff, u.a., "A Bacterial Clone Synthesizing Proinsulin" (ein Bakterienklon synthetisierendes Proinsulin), Proc. Natl. Acad. Sei, USA, 75, S. 3727 - 3731 (1978) Rattenwachstumshormon (P.H. Seeburg, u.a. "Synthesis of Growth Hormone by Bacteria" (Synthese von Wachstumshormon durch Bakterien), Nature, 276, S. 795 - 798 (1978), Mäuse-Dihydrofolat-Re6uktase (A.C.Y Chang, u.a., "Phenotypic Expression in E. coli of a DNA Sequence Coding for Mouse Dihydrofolate Reductase" (Phenotypische Darstellung einer DNS-Sequenz-Kodierung in E. coli für Mäuse-Dihydrofolat-Reduk^tase)* Nature, 275, S. 617 - 624 (1978), Somatostatin (K. Itakura, u.a., "Expression in Escherichia cdi of an chemically synthesized Gene for. the Hormone Somatostatin"

(Darstellung eines chemisch synthetisierten Gens für das Hormon Somatostatin in Escherichia coli), Science, 198, 1056 - 1063 (1977), GB-PS 2.007.675A, 2.007..676A und 2.008.123A und verwandte Anmeldungen in anderen Ländern), und die A- und B-Polypeptidketten des menschlichen Insulins (D.V« Goedel, u.a., "Expression in Escherichia CoIj₁ of chemically synthesized Genes for Human Insulin" (Darstellung von chemisch synthetisierten Genen für Humaninsulin in Escherichia coli), Proc» Natl. Acad« Sei. USA, 76, S. 106 110 (1979) und die obigen GB-PS und verwandte Patentschriften) *

Doch keine der obigen Literaturstellen bezieht sich, wie es die Erfindung tut, auf die Rekornbinant-DNS-Synthese von Virusproteinen wie Hepatitis-B-Virus-Antigene.

Bekanntlich führen HBV-Infektionen zur Entwicklung von Antikörpern für die Antigene des Virus. Diese Antikörper stellen den Abwehrmechanismus des Körpers gegen die HBV-Infektion dar. Durch die Entwicklung derartiger Antikörper vor der Infektion oder ihre rasche Entwicklung im Falle von potentieller Infektion müßten das Wachstum der Viren und ihre Ausbreitung im Patienten reduziert und bekämpft werden.

Ein Problem, das jedoch bei der künstlich stimulierten Entwicklung von Antikörpern für die Antigene von Hepatitis-B-Virus auftritt, ist der beschränkte Wirtsbereich des Virus. Zum Beispiel wurde trotz der starken Infektiösität des Hepatitis-B-Virus beim Menschen die experimentelle Infektion mit Hepatitis-B-Virus nur bei wenigen Primaten erreicht. Und der Virus konnte in Gewebekulturen nicht gezüchtet werden. Durch diesen begrenzten Wirtsbereich und

die Unfähigkeit, Gewebekulturzellen zu infizieren, wurden sowohl die Charakterisierung des Virus und die Pathologie seiner Infektion als auch die Entwicklung schneller Nachweismittel und wirksamer Mittel zur Infektionsbekämpfung und -verhinderung erheblich behindert«

Es hat zwar einige Versuche zur Anwendung authentischer HBV-Virusantigene, die von Personen mit HBV-Infektion isoliert worden waren, für die Entwicklung von Antikörpern und den Nachweis einer Infektion gegeben, aber diese Behandlungen können wegen der begrenzten Bereitstellung der aktiven Spezies nicht allgemein angewandt werden. Außerdem ist die Verwendung von Humanausgangsstoffen für diese Antigene ungünstig, da bei der Anwendung von Humanisolaten Probleme durch Verunreini-. gungen auftreten.

Darlegung des Wesens der Erfindung;

Durch die Erfindung können die aufgezeigten Probleme gelöst werden, da erfindungsgemäß ein Rekombinänt-DNS-Molekül zur Verfügung gestellt wird, das durch eine Strukturgenkodierung für ein HBV-Antigenwirkung aufweisendes Polypeptid gekennzeichnet ist.

Mit Hilfe der Erfindung ist es möglich, HBV-Antigene und -Gene in erheblichen und nicht-verunreinigten Mengen für Vakzinpräparate und zur Anwendung für den Nachweis von Virusinfektionen sowie zur Bestimmung ihrer Pathologie und der Molekularbiologie zu gewinnen. Bisher war eine solche Bereitstellung wegen des engen Wirtsbereichs und der Unmöglichkeit, sie in Gewebekulturen zu züchten, nicht vorhanden.

Wie aus der folgenden Offenbarung hervorgeht, ist das erfindungsgemäße Rekombinant-DNS-Molekül fähig, in einem entsprechenden Wirt zumindest ein HBV-Antigenwirkung aufweisendes Viruspolypeptid und die dafür kodierenden Strukturgene zu erzeugen. Rekombinant-DNS-Moleküle und Wirte können für die Erzeugung von HBV-Antigenwirkung aufweisenden Polypeptiden und für diese Polypeptide kodierende Strukturgene eingesetzt werden. Diese Produkte können auch identifiziert und charakterisiert werden und sind entweder in ihrer im Wirt erzeugten Form oder nach entsprechender Derivatisierung oder Modifizierung in Zusammensetzungen und bei Methoden zur Verbesserung der Erzeugung dieser Produkte selbst sowie für den Nachweis von HBV-Infektion, die Verfolgung ihrer Pathologie und Stimulierung der Erzeugung von HBV-Antikörpern bei Menschen wertvoll.

Im Rahmen der Erfindung wird auch ein Verfahren zur Erzeugung eines Rekombinant-DNS-Moleküls zur Verfügung gestellt, das dadurch gekennzeichnet ist, daß eine DNS-Sequenz, die aus der endogenen DNS einer Dane-Partikel hergestellt wurde, mit einer anderen DNS-Sequenz, die aus einer anderen Quelle als der Dane-Partikel hergestellt wurde, verknüpft wird.

Das erfindungsgemäße Verfahren unterscheidet sich von den bisherigen oben genannten Verfahren dadurch, daß bei keinem der bisherigen Verfahren ein natürliches Gen oder eine natürliche DNS für ein bestimmtes Protein zum Aufbau des Rekombinant-DNS-Moleküls und zur Erzeugung dieses Proteins oder Gens verwendet wurde. Stattdessen wurden entweder synthetische, durch chemische Synthese hergestellte Gene oder künstliche Gene verwendet, die durch enzymatisches Kopieren der mRNS, die aus der Donatorzelle zur Erzeugung von cDNS-Sequenzen isoliert wurde, erzeugt worden waren.

Ein Grund, warum natürliche DNS bisher nicht direkt für die Rekombinant-DNS-Synthese von Proteinen verwendet wurde, liegt darin, daß natürliche DNS'n der meisten höheren Organismen und zumindest einiger tierischer Viren "Introns" oder zusätzliche Nucleotidsequenzen als Teil des Gens enthalten. Diese Introns bilden keinen Teil der endgültigen Information des Gens. Stattdessen werden sie in vivo bei höheren Organismen durch spezielle Verarbeitungsenzyme entfernt, die auf das primäre Transkriptionsprodukt einwirken und die endgültige' Information (mRNS) des Gens liefern. Von den Bakterien wird angenommen, daß sie nicht in der Lage sind, solche Introns zu erzeugen, so daß nicht anzunehmen ist, daß natürliche DNS in Bakterienwirten verwirklicht wird und die vorgesehenen Proteine von diesen Wirten erzeugt werden können.

Ausführunqsbeispiele:

Figur 1 ist ein vereinfachtes Schema, das die Struktur der endogenen DNS einer Dane-Partikel zeigt. Es zeigt die beiden sich ergänzenden DNS-Stränge, Strang a und b, den Einschnitt im Strang a und die Lücke in Strang b und das Schließen der Lücke durch DNS-Polymerasereaktion.

Figur 2 ist eine schematische Darstellung der bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens: Fragmente der von der Dane-Partikel isolierten endogenen DNS sind an dem Plasmid pBR322 an der Stelle Pst I mit dem E. coli Penicillinasegen verschmolzen. Nach der Transformation in E ₁ . coli HB 101 dirigiert das Rekombinant-DNS-Molekül pBR322-JPs_t I dG: HBV-K£nI dC die Synthese von HBV-Antigenwirkung aufweisenden Polypeptiden.

Die Figuren 3 bis 9 zeigen die Nucleotid-Sequenz, die für einen Teil eines Hepatitis~B~Virusgenoms erfindungsgemäß bestimmt wurde. Die Sequenz ist mit den Terminator-Codens in den drei darüber angegebenen Orientierungssystemen (reading frames) wiedergegeben. Sie ist willkürlich vom Initiatorcodon für das für HBcAG kodierende Gen gemäß der erfindungsgemäßen Bestimmung numeriert. Die Nucleotide -80 bis -1 stellen die Führungssequenz, die diesem Gen vorausgeht, dar. Die Nucleotide 1 - 549 stellen die Nucleotidsequenz für das Gen dar, das für das Hepatitis-B-Virus-Kernantigen kodiert, wobei die Aminosäuresequenz (Orientierungssystem 1) dieses Antigens über dieser Sequenz angegeben ist. Die Nucleotide 1437 - 2114 stellen die Nucleotidsequenz dar, die für das Gen von Hepatitis-B-Virus-Oberflächenantigen bestimmt wurde, wobei die Aminosäuresequenz (Orientierungssystem 3) dieses Antigens über dieser Sequenz angegeben ist. Verschiedene Restriktions-Endonuclease-Erkennungsstellen in diesen Genen sind gleichfalls in den Figuren 3 bis 9 angezeigt.

Figur 10 ist eine schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen Verfahrens, bei dem ein Rekombinant-DNS-Molekül, das ein ein Hepatitis-B-Virus-Kernantigen aufweisendes Polypeptid erzeugen kann, fragmentiert ist und ein Fragment davon an eine verbesserte Expressions-Kontroll-Sequenz, das lac-System, angefügt ist.

Figur 11 ist eine schematische Darstellung eines erfin.dungsgemäßen Verfahrens, bei dem ein erfindungsgemäßes Rekombinant-DNS-Molekül fragmentiert und mit einem Fragment von Phagen-DNS zur Verwendung bei der Lysogenisierung von Wirtszellen und zur möglichen Erhöhung der .Anzahl der darin enthaltenen Genkopien verbunden ist.

Figur 12 ist eine schematische Ansicht einer anderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens: ein erfindungsgemäßes Rekombinant-DNS-Molekül, das kein Hepatitis-B-Virus-Kernantigen aufweisendes Polypeptid erzeugt, wird zur Entfernung des Strukturgens für HBsAG fragmentiert, und dieses Strukturgen wird zur Erzeugung eines Rekombinant-DNS-Moleküls verwendet, das HBsAg in einem entsprechenden Wirt erzeugt.

Zum besseren Verständnis der Erfindung wird sie anschließend ausführlich beschrieben.

In der Beschreibung werden die folgenden Begriffe verwendet: Nucleotid - Eine Monomereinheit von DNS oder RNS, bestehend aus einer Zuckerkomponente (Pentose), einem Phosphat und einer stickstoffhaltigen heterozyklischen Base« Die Base ist über den Glycosidkohlenstoff (I' Kohlenstoff der Pentose) mit der Zuckerkomponente verknüpft, und diese Kombination von Base und Zucker ist ein Nucleosid. Die Base kennzeichnet das Nucleotid. Die vier DNS-Basen sind Adenin ("A"), Guanin ("G"), Cytosin ("C") und Thymin (¹¹T"). Die vier RNS-Basen sind A, G, C und Uracil ("U"),

DNS-Sequenz - Eine lineare Reihe von Nucleotiden, die miteinander durch Phosphodiesterbindungen zwischen den 3* und 5'-Kohlenstoffen benachbarter Pentosen verbunden sind.

Codon - Eine DNS-Sequenz von drei Nucleotiden (ein Triplett), das durch mRNS eine Aminosäure, ein Translations-Initiierungssignal oder ein Translations-Terminationssignal kodiert. Beispielsweise kodieren die Nucleotid-tripletts TTA, TTG, CTT, CTC, CTA und CTG für das Aminosäureleucin ("Leu"), TAG, TAA und TGA sind*Translations-Terminationssignale und ATG ist

ein Translations-Initiierungssignal,

Orientierunqssystem (reading frame) - Die Gruppierung von Codons während der Translation von mRNS in Aminosäuresequenzen» Während der Translation muß das richtige Orientierungssystem beibehalten werden. Zum Beispiel kann die Sequenz GCTGGTTGTAAG in drei Orientierungssysteme oder Phasen übersetzt werden, von denen jedes eine andere Aminosäuresequenz ergibt:

GCT GGT TGT AAG—Ala-Gly-Cys-Lys ^G CTG GTT GTA AG—Leu-Val-Val

GC TGGTTG JAA A—Trp-Leu- (STOP)

Polypeptid - Eine lineare Reihe von Aminosäuren, die miteinander durch Peptidbindungen zwischen den oC -Amino- und Carbonsäuregruppen benachbarter Aminosäuren verbunden sind.

Genom - Die gesamte DNS einer Substanz. Sie enthält unter anderem die Strukturgene, die für die Polypeptide der Substanz kodieren sowie Operator-, Promotor- und Ribosombinde- und -Wechselwirkungssequenzen, einschließlich Sequenzen wie die Shine-Dulgano-Sequenzen.

Strukturcjen - Eine DNS-Sequenz, die durch ihre Templateoder Messenger-RNS ("mRNS") eine für ein spezifisches PoIypeptid charakteristische Aminosäuresequenz kodiert.

Transkription - Der Prozeß der Erzeugung von mRNS von einem Strukturgen. .

Translation - Der Prozeß der Erzeugung eines Polypeptids von mRNS. · .

Expression - Der Prozeß, den ein Strukturgen zur Erzeugung eines Polypeptids durchläuft. Es handelt sich um eine Kombination von Transkription und Translation.

Plasmid - Eine nicht-chromosome, doppelsträngige DNS-Sequenz, die ein intaktes "Replicon" aufweist, so daß das Plasmid sich in einer Wirtszelle repliziert. Wenn das Plasmid in einem einzelligen Organismus vorhanden ist, werden die Charakteristika dieses Organismus infolge der DNS des Rlasmids verändert oder transformiert. Zum Beispiel transformiert ein Plasmid, das das Gen für Tetracyclin-Resistenz (Tet ) trägt, eine Zelle, die vorher für Tetracyclin sensitiv war, in eine, die dagegen .·,; resistent ist. Eine durch ein Plasmid transformierte Zelle wird als "Transformant" bezeichnet.

Plhac^e oder Bakteriophaqe - Bakterienviren, von denen viele in eine Proteinhülle oder -mantel ("Capsid") eingekapselte DNS-Sequenzen enthalten. In einem einzelligen Organismus repliziert sich ein Phage mit Hilfe eines Transvektion genannten Prozesses.

Cloninq-Vehikel - Ein Plasmid, eine Phagen-DNS- oder andere DNS-Sequenzen, die sich in einer Wirtszelle replizieren können, gekennzeichnet durch eine oder eine geringe Anzahl von Endonuclease-Erkennungsstellen, an denen derartige DNS-Sequenzen in einer vorbestimmbaren Weise abgebrochen werden können, ohne daß sich daraus der Verlust einer wesentlichen biologischen Funktion der DNS ergibt, z.B. Replikation, Erzeugung von Coat-Proteinen oder Verlust an Promotor- oder Bindestellen, und die eine Markierungssubstanz enthalten, die zur Verwendung bei der Identifizierung transformierter Zellen, z.B. Tetracyclin-Resistenz oder Ampicillin-Resistenz, geeignet ist. Ein Cloning-Vehikel. wird auch oft als Vektor bezeichnet.

- Der Prozeß der asexuellen Vermehrung.

Re kj3 m bi η a η t - D N S - M ο IJgJk_-U_-I - Eine Hybrid-DNS-Sequenz, die wenigstens zwei Nucleotid-Sequenzen aufweist, wobei die erste Sequenz in der Natur normalerweise nicht zusammen mit der zweiten gefunden wird.

Expressions-Kontroll-Sequenz - Eine DNS-Sequenz von Nucleotiden, die das Erscheinen (Expression) von Strukturgenen kontrolliert und reguliert, wenn sie operativ mit diesen Genen verknüpft ist.

In Figur 1 wurde ein vereinfachtes Schema der endogenen DNS einer Dane-Partikel gezeigt. Dane-Partikel sind im Blutplasma einiger Patienten mit Hepatitis-B-Virusinfektionen nachzuweisen (D.S. Dane und CH. Cameron, "Virus-like Particles in Serum of Patients with Australia-Antigen associated Hepatitis" (Virusartige Partikel im Serunr-.von Patienten mit Hepatitis in Verbindung mit Australia-Antigen), The Lancet, 1, S» 695 - 698 - (1970)). Von dieser Partikel nimmt man an, daß sie mit dem infektiösen Virion von Hepatitis B identisch oder nahe verwandt ist. Obwohl ihre Größe bekannt ist ( Durchmesser 42 Nanometer), ist ihre Struktur noch nicht ganz geklärt. Allgemein wird angenommen, daß die Dane-Partikel aus einer äußeren Schicht und einem inneren Kern besteht. Die äußere Schicht der Partikel enthält normalerweise ein als Hepatitis-B-Oberflächenantigen ("HBsAg") bekanntes Polypeptid. Der innere Kern (Durchmesser 27 Nanometer) enthält ein zweites Polypeptid, das Hepatitis-B-Kernantigen ("HBcAg"), sowie ein endogenes, doppelst rängiges, kreisförmiges DNS-Molekül von 2,1 χ 10 Dalton, das eine einsträngige Lücke unterschiedlicher Länge enthält.

Ein drittes Polypeptid, "e"-Antigen ("HBeAg"), kann gleichfalls mit den Dane-Partikeln vorhanden sein. Außerdem glaubt man, daß die Dane-Partikel eine endogene, DNS-abhängige DNS-Polymerase enthält, die die einsträngige Lücke in der endogenen DNS durch Polymeraaereaktion unter Anwendung dieser DNS als Primer/Template teilweise schließen kann. Die Struktur und die Eigenschaften der Dane-Partikel und vor allem ihrer DNS waren das Thema verschiedener Analysen. Zum Beispiel W. S. Robinson, "The Genome of Hepatitis B Virus"(Das Genom des Hepatitis-B-Virus), Ann. Rev« Microbiol., 31, S. 357 377 (1977). Allerdings wurde die wirkliche Struktur der verschiedenen Antigene oder von deren Genen nicht bestimmt.

Die endogene DNS der Dane-Partikel wurde durch Extraktion von der Dane-Partikel isoliert. Sie besteht aus einem Nucleotid-Strang von konstanter Länge mit einem kleinen Einschnitt oder einer kleinen öffnung darin (Figur 1, Strang a, ·'-*-'3000 Nucleotide), und einem zweiten Nucleotid-Strang mit etwas variabler Länge (Figur 1, Strang b, ^2000 Nucleotide). Der zweite Strang ist komplementär zu dem ersten und überlappt seinen Einschnitt, so daß eine ringförmige Struktur durch Wasserstoffbindung zwischen komplementären Basen nach dem üblichen Watson-Crick-Modell komplettiert wird. Diese Überlappung geht aus Figur 1 hervor. Die DNS-Polymerase der Dane-Partikel scheint den zweiten Strang der endogenen DNS als Primer und den ersten Strang als Template zum Ausfüllen der variablen Lücke mit Nucleotiden zu benutzen, die komplementär zu den Nucleotiden des ersten Stranges sind und eine doppelsträngige DNS aus etwa 3000 Nucleotid-Paaren ergeben.

Methode zur Erzeugung von Hepatitis-B-Virus-DNS Humanserum von einem einzigen HBsAg-positiven, HBeAg-positiven Spender (Serotyp Adym) wurde mit einem gleichen Volumen Puffer-

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lösung (0,1 M Tri-HCl, 0,1 M Salzlösung (NaCl), 0,1 % (Masse/ Volumen, wie durchweg angewendet) 2-Mercaptoäthanol, 0,1 % Rinderserumalbumin, 0,001 M EDTA bei einem pH-Wert von 7,4 verdünnt. Diese Lösung wurde 2 Stunden lang bei 4 ⁰C mit 35 000 U/min zentrifugiert. Das dadurch gewonnene Pellet wurde erneut in 200 ul der gleichen Pufferlösung suspendiert und oben als Schicht auf ein Zentrifugenglas, das 20 % Saccharose enthielt, gegeben. Die Suspension wurde 2 Stunden lang bei 4 ⁰C mit 40 000 U/min zentrifugiert. Das dadurch gewonnene Pellet wurde abermals in 100 ul Pufferlösung (0,1 M Tri-HCl, 0,1 M Salzlösung) mit einem pH-Wert von 7,5 suspendiert.

Das gewonnene, DNS enthaltende Pellet wurde dann mit H oder

P markiert, wie von P.M. Kaplan, u.a., in "DNA Polymerase

Associated with Human Hepatitis B Antigen" (DNS-Polymerase in Hepatitis-B-Antigen bei Menschen), J, Virol., 12, S* 995 1005 (1973) beschrieben, um seine Verfolgung durch die anschließenden Schritte des Prozesses zu erleichtern. Diese Markierung ergibt sich aus der 4stündigen Reaktion der kon-

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zentrierten Dane-Partikel und H- oder P-markierten Desoxynucleosidtriphosphate (dNTP'e) bei 37 °C« Nach dieser DNS-Polymerasereaktion, durch die die einstrangige Lücke in der DNS teilweise geschlossen wird (siehe Figur 1), wurde das markierte DNS-Material als Schicht oben auf ein Zentrifugenglas gegeben, das 30 % Saccharose enthielt, und 3 1/2 Stunden lang bei 4 ⁰C mit 42 000 U/min zentrifugiert.

Die DNS wurde anschließend mit Phenol von dem resultierenden Pellet mit Hilfe des Verfahrens von L. I." Lutwick und VV. S. Robinson, ¹¹DNA Synthesized in the Hepatitis B Dane Particle DNA Polymerase Reaction" (Bei der Hepatitis-B-Dane-Partikel-DNS-Polyrnerasereaktion synthetisierte DNS), J. Virol«,, 21, S_e 96 - 104 (1977) extrahiert. Die extrahierte DNS wurde

dann gegen eine Lösung von 0,01 M Tri-HCl, 0,001 M EDTA (pH-Wert 8,0) zur Beseitigung des Phenollösungsmittels dialysiert. Die isolierte DNS war dann für Restriktionsenzymdigestic nen bereit. Sie zeigte eine spezifische Strahlungsaktivität von <**·* 10 com (Schwingungen/Minute) pro jug. Der oben erläuterte Prozeß ist schematisch in Figur 2 wiedergegeben.

Cloning von Hepatitis-B-Virus-DNS

Für das Cloning der wie oben isolierten doppelsträngigen DNS können die unterschiedlichsten Wirt-Cloningvehikel-Kombinationen mit Erfolg angewandt werden. Nützliche Cloningvehikel können beispielsweise sein: chromosome, nichtchromosome und synthetische DNS-Sequenzen, z.B. verschiedene bekannte Bakterien-Plasmide wie pBR322, andere E. coli-Plasmide und ihre Derivate und ein weiterer Wirtsbereich von Plasmiden wie RP4, Phagen-DNS wie die zahlreichen Derivate von Phage Λ , z.B. NM899 und von Kombinationen von Plasmiden und Phagen-DNS'n abgeleitete Vektoren wie Plasmide, die zur Anwendung von DNS-Expressions-Kontroll-Sequenzen modifiziert wurden. Nützliche Wirte können Bakterienwirte wie E. coli ^X1776' ^E« ^coli X2282, E. coli HBlOl, und E. coli MRCl sowie Stämme von Pseudomonas, Bacillus subtilis und anderen - Bazillen, Hefearten und andere Pilze, tierische und pflanzliche Wirte wie Tier- oder Pflanzenzellen in Kulturen und anderen Wirten umfassen. Natürlich erweisen sich nicht alle Wirte als gleich wirkungsvoll. Die jeweilige Wahl der Wirt-Cloningvehikel-Kombination wird der Fachmann nach entsprechender Berücksichtigung der oben dargelegten Prinzipien treffen, ohne vom Geltungsbereich der Erfindung abzuweichen..

Des weiteren können in jedem spezifischen Vektor verschiedene Stellen für die Einfügung der isolierten doppelsträngigen DNS gewählt werden. Diese Stellen werden gewöhnlich durch das Re-Striktionsenzym oder die Endonuclease, die diese abbricht,

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bezeichnet. Beispielsweise liegt in pBR322 die Pst I-Stelle im Gen für Penicillinase zwischen den Nucleotidtripletts, die für Aminosäuren 181 und 182 des Penicillinaseproteins kodieren. Diese Stelle wurde von Villa-Komaroff, u.a., siehe oben, in ihrer Synthese von Proinsulin-Antigen-Determinanten aufweisendem Protein bei Ratten verwendet. Eine Hind II Endonuclease-Erkennungsstelle liegt zwischen den für die Aminosäuren 101 und 102 kodierenden Tripletts und eine Ta^-Stelle an dem für Aminosäure 45 kodierenden Tripletts dieses Proteins in pBR322. In ähnlicher Weise befindet sich die Eco RI Endonuclease-Erkennungsstelle für dieses Plasmid zwischen den für Resistenz gegenüber Tetracyclin bzw. Ampicillin kodierenden Genen. Diese Stelle wurde von Itakura, u.a. und Goeddel, u.a., bei ihren Synthese-Modellen von Rekombinant-DNS (siehe oben) verwendet. Die Figuren 2 und 11 zeigen zur Erläuterung einige der Restriktionsstellen in Plasmid pBR322 und Phage \nM989.

Die zur Einfügung des gewählten DNS-Fragmentes in das Cloningvehikel zur Bildung eines Rekombinant-DNS-Moleküls gewählte jeweilige Stelle wird durch eine Reihe von Faktoren bestimmt. Dazu gehören Größe und Struktur des zu verwirklichenden Polypeptids, Suszeptibilität des vorgesehenen Polypeptide . gegen endoenzymatische Degradation durch die Wirtszellenkomponenten und Verunreinigung durch deren Proteine, Expressionsmerkmale wie Lage von Initiator- und Terminator-Codons und andere, dem I» achmann einleuchtende Faktoren. Da der Expressionsprozeß nicht genau bekannt ist, bestimmt keiner dieser Faktoren alleine eindeutig die Wahl der Einfügungsstelle für ein bestimmtes Polypeptid. Die gewählte Stelle ist es, die einen ziemlichen Einfluß auf eine Ausgewogenheit dieser Faktoren hat, und nicht alle Stellen sind bei einem bestimmten Protein gleichermaßen wirksam.

Obwohl die verschiedensten Methoden im Fachgebiet für das Einfügen fremder DNS in ein Cloningvehikel zur Bildung eines Rekombinant-DNS-Moleküls bekannt sind, wird die erfindungsgemäß bevorzugte Methode in Figur 2 gezeigt. Sie ist gekennzeichnet durch Spalten der Dane-Partikel-DNS mit einer Restriktions-Endonuclease, Anheften von PolydesoxyC-Sequenzen an die 3*-Termini (benannt durch Konvention vom Desoxyribosekohlenstoff der DNS-Zucker-Hauptkette) der gespaltenen DNS und Verknüpfen der verlängerten DNS mit einem Cloningvehikel, das an einer bestimmten Stelle durch eine Restriktionsendonuclease abgebrochen und an den 3^r-Termini dieses Abbruchs mit PolydesoxyG-Sequenzen verländert wurde, die zu den Poly-dC-Sequenzen der gespaltenen DNS komplementär sind. Durch den komplementären Charakter der 3'-Schweife der DNS und des Cloningvehikels ist die Kohäsion dieser Termini möglich.

Damit das für den erfindungsgemäßen Prozeß zum Spalten der HBV-DNS gewählte Restriktionsenzym auch nützlich sein kann, darf es die HBV-DNS nicht innerhalb eines wesentlichen Teiles des Gens, das für HBV-Antigenwirkung aufweisende Polypeptide kodiert, nicht spalten und sollte am besten die DNS nur an einer begrenzten Anzahl von Stellen spalten. Zu den im Rahmen der Erfindung verwendeten Restriktionsenzymen sind Kpn I, BqI II, Bam HI, Ava I und Eco Ri zu zählen. Andere Restriktions-Endonucleasen können erfindungsgemäß gleich nützlich sein. Ihre Wahl kann von Fachleuten unter Beachtung der oben genannten Faktoren ohne Abweichung vom Geltungsbereich der Erfindung vorgenommen werden. Die Figuren 3 bis 9 zeigen einige der Restriktions-Endonuclease-Erkennungsstellen im Teil des HBV-.Genoms-.

Natürlich sind im Rahmen der Erfindung andere bekannte Methoden zur Einfügung von DNS-Sequenzen in Cloningvehikel

zur Bildung von Rekombinant-DNS-Moleküle gleichfalls nützlich. Dazu gehören beispielsweise direkte Ligation, bei der die gleiche Restriktions-Endonuclease zur Spaltung der HBV-DNS und des Cloningvehikels verwendet wird. Durch dieses Verfahren entstehen unweigerlich komplementäre Enden für die Kohäsion. .

Man sollte sich natürlich darüber im klaren sein, daß die Nucleotidsequenz oder das Genfragment, die (das) an der gewählten Restriktionsstelle des Cloningvehikels eingefügt wird, Nucleotide enthalten kann, die kein Teil des eigentlichen Strukturgens für das beabsichtigte Protein sind oder nur ein Fragment des Strukturgens enthalten können. Für die Erzeugung von Polypeptid ist es nur erforderlich, daß der transformierte Wirt unabhängig von der eingefügten DNS-Sequenz ein HBV-Antigenwirkung aufweisendes Polypeptid erzeugen wird.

Das Rekombinant-DNS-Molekül, das das Hybridgen enthält, kann zur Transformation eines Wirtes benutzt werden, so daß dieser Wirt (Transformant) das Strukturgen oder ein Fragment davon verwirklichen kann und das Polypeptid oder einen Teil davon, für das die Hybrid-DNS kodiert, erzeugen kann. Das Rekombinant-DNS-Molekül kann auch zur Transformation eines Wirtes benutzt werden, so daß dieser Wirt bei der Replikation zusätzliche Rekombinant-DNS-Moleküle als Quelle für HBV-Strukturgene und Fragmente davon erzeugen kann. Die Wahl eines geeigneten Wirtes für einen dieser Verwendungszwecke wird durch eine Reihe im Fachgebiet bekannter Faktoren bestimmt. Dazu gehören zum Beispiel die Verträglichkeit mit dem gewählten Vektor, die Toxizität der Nebenprodukte, die leichte Rückgewinnung des gewünschten Polypeptide, Expressionscharakteristika, Biosicherheit und Kosten. Da die Mechanismen der Expression nicht genau bekannt sind, kann

keine absolute Wahl eines Wirtes für ein bestimmtes Rekombinant-DNS-Molekül oder Polypeptid alleine anhand eines dieser Faktoren getroffen werden. Stattdessen muß ein Gleichgewicht dieser Faktoren unter der Annahme angestrebt werden, daß nicht alle Wirte gleichermaßen wirksam für die Expression eines bestimmten Rekombinant-DNS-Moleküls sind.

Bei der dargestellten Synthese ist das bevorzugte Cloningvehikel das Bakterienplasmid pBR322 und die bevorzugte Restriktions-Endonuclease-Stelle darin ist die Pst I Stelle (Figur 2). Dieses Plasmid ist ein kleines (Molekülmasse ca. 2,6 Megadalton) Plasmid, das Resistenzgene für die Antibiotika Ampicillin (Amp) und Tetracyclin (Tet) trägt. Das Plasmid wurde vollständig charakterisiert (F. Bolivar, u.a., "Construction and Characterisation of New Cloning Vehicles II. A Multipurpose Cloning System", Aufbau und Charakterisierung neuer Cloningvehikel II. Ein Mehrzweckcloningsystem), Gene, S. 95 - 113 (1977)). Der bevorzugte Wirt im Rahmen der Erfindung ist E. coli HBlOl.

1, Darstellung von dC-verlänqerter Dane-Partikel-DNS

Bei der praktischen Anwendung der bevorzugten erfindüngsgemäßen Ausführungsform wurde die wie oben aus den Dane-Partikeln isolierte DNS mit Restriktioris-Endonuclease Kρη Ι (etwa 20 ng DNS in 10 jul 10 mM Tri-HCl, pH-Wert 7,5, 10 mM MgCl , 10 mM 2-Mercaptoäthanol, 40 mM NaCl, 0,5 ul Enzympräparat) 90 Minuten lang bei 37 ⁰C digeriert und das Restriktionsenzym durch 5 Minuten dauerndes Erwärmen auf 70 C inaktiviert. PolydesoxyC-Sequenzen (zu Erläuterungszwecken in Fig. 2 nur als CCC angegeben) wurden mit Hilfe der Standardreaktion mit Polynucleotid-Terminaltransferase an die 3'-Termini der Digestionsprodukte nach der Entfernung des Restproteins durch Extraktion mit Phenol und Chloroform (je 20 ul) angeheftet. Phenol wurde durch Extraktion

mit Äther von der wäßrigen Phase entfernt, und die DNS wurde durch die Zugabe von 3M Natriumacetat, pH-Wert 6,5, (5 jul) und kaltem Äthanol, 0,1 ml, ausgefällt. Nach einstündiger Aufbewahrung bei - 70 ⁰C wurde die ausgefällte DNS durch Zentrifugieren mit 10 000 U/min in einem Zeitraum von 20 Minuten gewonnen, und die Pellets wurden in 10 mfi Tri-HCl mit einem pH-Wert von 7,5 (10 ul) aufgelöst. Dazu wurden

3 jul 400 mM Kaliumcacodylat, pH-Wert 7,0, 4 mM Kobaltchlorid,

4 mM Desoxycytosintriphosphat (dCTP), 200yUg/ml Rinderserumalbumin gegeben, und das Gemisch wurde 10 Minuten lang bei 27 C mit 0,5 ul Polynucleotid-Terminaltransferase (6000 u/ml) inkubiert, und die Reaktion wurde durch die Zugabe von 50 mM EDTA (1 jjI) abgebrochen.

2» Darstellung von Pst I, gespaltenem, dG-verlänqertem pBR322

Das Plasmid pBR322 wurde mit Restriktions-Endonuclease Pst I (für die das Plasmid ein Target enthält) digeriert, und die Produkte wurden mit Hilfe von Phenolextraktion und Äthanolausfällung nach der oben für HBV-DNS beschriebenen Weise gereinigt. Poly-dG-Sequenzen (zu Erläuterungszwecken in Figur nur als GGG angegeben) wurden zu den 3'-Termini von linearen pBR322-flolekülen durch Terminaltransferase nach der für die Zugabe von Poly-dC-Sequenzen zu HBV erfolgten Beschreibung gegeben, nur wurde die Reaktion dabei bei 37 C ausgeführt.

3. Kohäsion von G-verlänqertem pBR322 und C-verlängerter HBV-DNS

Äquimolare Mengen von pBR322-Poly-dG und HBV-DNS-Poly-dC wurden dann zusammen vermischt, und den komplementären Sequenzen wurde die Möglichkeit gegeben, sich durch Inkubation in 100 mM NaCl, 50 mM Tri-HCl, pH-Wert. 7,5, 5mM EDTA (TNE) (50 ul) eine Stunde lang bei 65 ⁰C und anschließend

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1 Stunde bei 47 ⁰C, eine Stunde bei 37 ⁰C und eine Stunde bei 20 C zu verknüpfen, und ein gleiches Volumen von TNE und 20 ul 100 mM MgCl , 100 mM CaCl₂, 100 mM Tri-HCl, pH-Wert 7,5, wurde zugesetzt«

4. Transformation von E. coli HBlOl

Für die Transformation geeignete Kulturen von E. coli HBlOl wurden wie von E. M. Lederberg und S. H. Cohen in "Transformation of Salmonella typhimurium by Plasmid Deoxyribonucleic Acid" (Transformation von Salmonella typhimurium durch Plasmid-Desoxyribonucleinsäure), 3. Bacteriol., 119, S. 1072 1074 (1974)) beschrieben hergestellt, 0,1-ml-Portionen der Zellen wurden mit 25 ul des erhitzten DNS-Präparats vermischt und 20 Minuten lang bei 0 C inkubiert und anschließend 10 Minuten lang bei 20 ⁰C, bevor sie auf L-Agar-Platten, die Tetracylin (50 ug/ml) enthielten, zur Inkubation über Nacht bei 37 ⁰C aufgetragen wurden. Da Plasmid pBR322 das Gen für Tetracydin-Resistenz enthält, vermehren sich E. coli-Kolonien, die mit diesem Plasmid transformiert wurden, in Kulturen, die dieses Antibiotikum enthalten, mit Ausnahme derjenigen E. coli-Kolonien, die nicht in dieser Form transformiert wurden. Daher ermöglicht die Züchtung in tetracyclinhaltigen Kulturen die Selektion von gut transformierten Wirten.

5. Auswahl von E, coli-Kulturen durch Hybridisierung

Auf den inkubierten tetracyclinhaltigen L-Agar-Platten gezüchtete Bakterienkolonien wurden auf ihre Sensibilität gegenüber Ampicillin getestet. Das Plasmid pBR322 enthält das Gen für Ampicillin-Resistenz. Dieses Gen ist die vorgesehene Stelle der Hybridgen-Einfügung. Daher werden Kolonien, die mit einem Plasmid, dem an der gewählten Erkennungsstelle DNS eingefügt worden ist, transformiert worden sind,

gegenüber Ampicillin sensitiv sein, werden aber ihre Resistenz gegenüber Tetracyclin behalten. E. coli-Kolonien. die gegenüber Ampicillin sensitiv, aber gegenüber Tetracyclin resistent waren, wurden auf eine Zellulosenitrat-Ultrafilterscheibe, die sich auf tetracyclinhaltigen L-Agar-Platten befand, aufgetragen. Nach Vermehrung über Nacht bei 37 C wurde das Ultrafilter auf frische L-Agar-Platten, die Tetracyclin und Chloramphenicol (150 ug/ml) enthielten, übertragen und weiterhin mehrere Stunden bei 37 ⁰C inkubiert f um die Anzahl von Kopien des Plasmids in den Zellen zu erhöhen (Figur 2)* Die Ultrafilter wurden anschließend für die Koloniehybridisierung nach der Beschreibung von M. Grunstein und D. S. Hogness "Colony Hybridization: A Method for the Isolation of cloned DNAs that contain a specific Gene" (Koloniehybridisierung: Eine Methode zur Isolierung geclonter DNSn, die ein spezifisches Gen enthalten), Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 72, S. 3961 - 3965 (1975) mit P-markierter HBV-DNS, die zuvor als Kontrolle hergestellt worden war, verwendet. Radioautographie der Filter zeigte das Vorhandensein von Kolonien, die DNS-Sequenzen enthalten, die zu den authentischen HBV-DNS komplementär sind.

6. Nachweis von Kolonien, die Polypeptide mit HBV-Antigenwirkunq synthetisieren

Kolonien, die gegenüber Tetracyiin resistent, gegenüber Ampicillin sensitiv waren und mit authentisierter HBV-DNS hybridisiert wurden, wurden auf ihre Fähigkeit hin getestet, zumindest ein HBV-Antigen-Spezifität oder Antigenwirkung aufweisendes Polypeptid zu erzeugen. Es wurden wieder Kolonien auf Ultrafilter, die sich auf tetracyclinhaltigen L-Agar-Platten befanden, aufgebracht und bei 37 ⁰C über Nacht inkubiert. Eine zweite Platte von L-Agar wurde mit einer Kultur von E« coli C600 (0,1 ml in 2 ml Weichagar),

die mit einem virulenten Stamm des Bakteriophagen λ Virus (Multiplizität der Infektion von etwa 1) infiziert worden war/ beschichtet und ebenfalls über Nacht bei 37 C inkubiert, und in diesem Zeitraum war der Bakterienteppich zusammenlaufend durch den Bakteriophagen ( AVirus) lysiert (d.h. im wesentlichen waren alle Wände der Wirtszellen zerrissen). Das die erfindungsgemäß transformierten Zellen enthaltende Ultrafilter wurde von der Platte abgehoben und mit den Kolonien nach unten mit der Oberfläche der L-Agar-Platte von E. coli C600, die mit jVVirus lysiert worden waren, in Kontakt gebracht. Dieser Kontakt wurde etwa IO Minuten lang beibehalten, damit die auf dem Ultrafilter befindlichen Zellen durch X Virus infiziert werden konnten. Das Ultrafilter wurde dann auf eine frische Platte von L-Agar übertragen und weitere 5 Stunden lang bei 37 ⁰C inkubiert. Inzwischen wurden Polyvinylscheiben mit HBV-Antikörpern beschichtet, wie es von S. Broome and VV. Gilbert ^"Immunological Screening Method to detect specific Translation Products" (Immunologische Auswahlmethode zum Nachweis spezifischer Translationsprodukte), Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 75, S. 2746 - 2749 (1978) beschrieben wird. Das Ultrafilter, auf dem die transformierten Bakterienkolonien jetzt offensichtlich lysiert worden waren, wurden nun mit den Kolonien in Kontakt mit den beschichteten Polyvinylscheiben gebracht und 3 Stunden lang bei 4 C gehalten. Dieser Kontakt führte dazu, daß sich alle,, aus den auf dem Ultrafilter befindlichen Zellen lysierten HBV-Antigene mit den HBV-Antikörpern der Scheibe verbanden. Die beschichteten Scheiben wurden von dem Ultrafilter, abgenommen, danach mit

125 Wasser gewaschen und mit I-markierten HBV-Antikörpern inkubiert. Diese Inkubation führte zu radioaktiver Markierung derjenigen Stellen auf der Scheibe, an denen HBV-Antigene von dem Ultrafilter vorher durch die HBV-Antikörper der Scheibe gebunden worden waren. Nach dem Waschen und der Radioautographie, wie oben von Broome und Gilbert beschrieben, wurden unter Bezugnahme auf das Autoradiogramm

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die Kolonien, die Polypeptide mit HBV-Antigenspezifität erzeugt hatten, lokalisiert.

Verwendung von durch Rekombinant-DNS-Moleküle erzeugten Polypeptiden und Genen für den Nachweis der Anwesenheit von HBV-Antikörpern bei Menschen

HBV-Antigenwirkung aufweisende Polypeptide und die Struktur-, gene und Fragmente-, die dafür kodieren, können für Methoden und Ge.räte verwendet werden, die zum Nachweis der Anwesenheit von HBV-Antikörpern bei Menschen und somit zum Erkennen von Menschen und Blutproben, die durch diesen Virus infiziert wurden, dienen.

Zum Beispiel kann das durch Wirte, die durch erfindungsgemäße Rekombinant-DNS-Moleküle transformiert wurden, erzeugte HBcAg für die zur Zeit zur Verfugung stehenden immunologischen Diagnosetests zum Nachweis von Hepatitis-B-Virus eingesetzt werden, d.h. für die Radioimmunoanalyse oder ELISA (Enzym-verknüpfte Immunosorptionsmittelanalyse). Bei einer Art der Radioimmunoanalyse wird ein in einem Labortier entwickelter Anti-Kernantigen-Antikörper an einer festen Phase, zum Beispiel der Innenseite eines Teströhrchens angebracht. HBcAg wird dann in das Röhrchen gegeben, damit es sich mit dem Antikörper verbinden kann. In das Röhrchen, das mit dem Antigen-Antikörper-Komplex beschichtet ist, wird eine Probe von Patientenserum zusammen mit einer bekannten Menge von HBV-Anti-Kernantikörper, der mit einem radioaktiven Isotop wie radioaktivem Ood markiert ist, gegeben. Irgendwelcher im Patientenserum vorhandener HBV-Antikörper wird mit dem markierten Antikörper um die freien Bindestellen an dem Antigen-Antikörper-Komplex wetteifern. Sobald das Serum seine Wirkung entfalten konnte, wird die überschüssige Flüssigkeit entfernt, das Teströhrchen gewaschen und das Ausmaß der Radioaktivität gemessen. Ein positives Ergebnis,

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d.h. daß das Patientenserum HBV-Antikörper enthält, wird durch einen niedrigen Wert der Radioaktivität angezeigt. Bei einer Art ELISA-Test wird eine Mikrotiterplatte mit HBcAg beschichtet und darauf eine Probe von Patientenserum gegeben. Nach einer Inkubationszeit, in der eine Wechselwirkung zwischen etwa vorhandenem Antikörper und Antigen stattfinden konnte, wird die Platte gewaschen, und ein Präparat von in einem Labortier gezüchtetem Anti-Humanantikörpern, die mit einer Enzymmarkierung versehen sind, wird zugesetzt, zum Ablauf der Reaktion inkubiert, und die Platte wird erneut gewaschen. Anschließend wird der Mikrotiterplatte Enzymsubstrat zugesetzt, und es wird solange inkubiert, daß das Enzym auf das Substrat einwirken kann, und das Adsorptionsvermögen des fertigen Präparats wird gemessen. Eine große Veränderung des Adsorptionsvermögens gilt als positives Ergebnis.

In vivo Aktivität von durch Rekombinant-DNS-Moleküle erzeugten Polypeptiden

Zur Prüfung der biologischen Wirkung der Antigen-Polypeptide, die von den erfindungsgemäßen Rekombinant-DNS-Molekülen in den E. coli transformiert worden waren, wurden sterile Extrakte der Bakterienzellen, von denen nachgewiesen worden war, daß sie HBcAg verwirklichen, nach dem Vermischen mit einem gleichen Volumen Freund-Adjuvans, Kaninchen injiziert. Zwei Tiere erhielten rohen Bakterienextrakt, und zwei erhielten Proben des gleichen Extraktes nach der Fraktionierung auf einer Sephadex-650-Säule. Weitere Injektionen der gleichen Probe, die eingefroren und aufbewahrt worden war (zur Bewahrung der vollen Antigen-Aktivität), erfolgten zwei und fünf Wochen nach der ersten Injektion. Den Tieren wurden in regelmäßigen Abständen von mehreren Wochen nach der ersten Injektion Blutproben entnommen.

Immunodiffusions-Experimente unter Anwendung der von On Ouchterlony, "Immunodiffusion and Immunoelectrophoresis" (Immunodiffusion und Immunoelektrophorese) in Handbook of Experimental Immunology (Handbuch der experimentellen Immunologie) (D. VV. Weir, Herausgeber) (Blackwell Scientific Publications, Oxford and Edinburgh) Kap. 19 (1967) beschriebenen Verfahrensweise wurden für den Vergleich von Kaninchenseren (Antikörper) mit Human-Hepatitis-B-Virus-Kernantikörpern ("HBcAb") unter Verwendung von Humanleber stammendem HBcAg durchgeführt. (B. D, Cohen und Y, E_e Cossart, "Application of a Screening Test for Antibody to Hepatitis B Core Antigen" (Anwendung eines Auswahltests in bezug auf Antikörper für Hepatitis-B-Kernantigen), J « Clin . Path., 30, S. 709 - 713 (1977). Alle vier Kaninchenseren ergaben Präcipitin-Linien mit HBcAg, die den zwischen HBcAg und dem von Menschen stammenden HBcAb gebildeten identisch waren. Daher ist das in E. coli mit den erfindungsgemäßen Rekombinant-DNS-Molekülen synthetisierte Kernantigen serologisch in vivo wirksam. Durch diese Aktivität wird die Eignung von Zusammensetzungen und Methoden, bei denen in mikrobiellen Zellen synthetisierte Virusantigene verwendet werden, für die Stimulierung der Antikörperbildung bei Menschen bestätigt. Solche Zusammensetzungen und Methoden sind durch die Polypeptide gekennzeichnet, die in durch erfindungsgemäß hergestellte Rekombinant-DNS-Moleküle transformierten Wirten erzeugt wurden. Diese Polypeptide könnten alleine oder mit allgemein bekannten pharmazeutisch-annehmbaren Trägermitteln wie Salzlösungen oder anderen Zusatzstoffen, die im Fachgebiet für die Verwendung in Zusammensetzungen und bei Methoden für die Behandlung und Verhütung von Vireninfektionen bei Menschen anerkannt sind, verwendet werden.

Wie bereits erwähnt, können Restriktionsenzyme, außer der oben genannten Kpn I/Pst I-Kombination, vorteilhaft für die Erzeugung von erfindungsgemäßen Rekombinant-DNS-Molekülen

herangezogen werden. Andere Restriktionsstellen in Plasmid pBR322 und einem Teil des HBV-Genoms sind in Figur 2 bzw. 3 gezeigt. Zur Erläuterung dieser Alternative werden die folgenden Beispiele gebracht, die aber weniger bevorzugte Ausführungsformen darstellen.

BAM HI₁ ECO RI, BGL II — PST I -Kombinationen

Die durch die Verwendung von Bam HI, Ecο RI und BjgjL II erzeugten HBV-DNS-Fragmente konnten im Gegensatz zu den durch Kpη I erzeugten nicht einfach direkt zur Kohäsion verlängert werden, weil kurze 5'-einsträngige Prqpktionen vorhanden waren. Sie wurden daher zur Entfernung dieser Projektionen vor der Zugabe von Poly-dC-Sequenzen an den 3'-Termini mit Λ Exonuclease behandelt. Diese Behandlung erfolgte durch Inkubation der eingeschränkten DNS (10 ul einer früher beschriebenen Lösung) mit 15 jul 100 mM Natriumglycinat, pH-Wert 9,5, 10 mM MgCl₂, 100 ug/ml Rinderserumalbumin, 5 LiI

Λ Exonuclease bei 0 C über einen Zeitraum von 1,5 Stunden. Das Gemisch wurde anschließend mit Phenol und Chloroform extrahiert und der Prozeß fortgesetzt. Bei der Herstellung, bei der Bam HI verwendet wurde, bestätigte die spätere Radioimmunoanalyse die Erzeugung von Polypeptiden mit HBV-Antigen-Spezifität.

Direkte Ligation: Eco RI-- Eco RI und Bam HI — Bam HI

Anstelle der oben beschriebenen Schweifbildung an den DNS-Fragmenten zur Kohäsion kann bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die direkte Ligation der Genfragmente angewandt werden. Beispielsweise wurde in zwei weiteren Präparaten HBV-DNS (20 ng) mit Restriktions-Endonuclease Eco RI oder Bam HI in 10 mM Tri-HCl, pH-Wert, 7,5,- 10 mM MgCl , 10 mM 2-Mercaptoäthanol, 50 mM NaCl (10 ul) bei 37 ⁰C 1,5 Stunden lang eingeengt und mit reichlich p3R322, das mit den

gleichen Enzymen unter identischen Bedingungen inkubiert worden war, vermischt. Eine konzentrierte Pufferlösung (660 mM Tri-HCl, pH-Wert 7,5, 100 mM MgCl₂, 10 rnM EDTA, 100 mM 2-Mercaptoäthanol, 400 mM NaCl₁ 1 mM ATP) (2 ul) wurde zugesetzt und das Gemisch mit T4 DNS-Ligase (0,5 ul) 3 Stunden lang bei 10 ⁰C und anschließend mindestens 24 Stunden lang bei 0 ⁰C inkubiert. Die Lösung wurde auf 0,1 ml mit 10 mM Tri-HCl, pH-Wert 7,5, verdünnt und zur Transformation von geeigneten Kulturen von E« cpli HBlOl, wie oben beschrieben, inkubiert. Im Falle der mit Hilfe von Bam HI erzeugten Rekombinant-DNS-Moleküle wurden die Kolonien vor der Auswahl zur Hybridisierung auf Sensibilität gegenüber Tetracyclin und weniger gegenüber Ampicillin hin geprüft, da das Target für Bam HI in pBR322 innerhalb des für Tetracyclinresistenz kodierenden Gens liegt, und daher die erfolgreiche Einfügung an dieser Erkennungsstelle zu einer Einbuße dieser Resistenz anstelle der Ampicillin-Resistenz führt, wie es bei der Einfügung an der Pst I-Stelle geschieht.

Im Falle von über die Eco RI-Stelle erzeugten Rekombinant-DNS-Molekülen wurden die Kolonien vor der Auswahl für die Hybridisierung auf Resistenz gegenüber Ampicillin und Tetracyclin getestet, da das Target für Eco RI in pBR322 zwischen den Tetracyclin- und Ampicillinresistenz kodierenden Genen liegt, so daß keine Inaktivierung der Gene in bezug auf Ampicillin- oder Tetracyclinresistenz bei Hybrid-DNS-Einfügung an dieser Stelle entsteht.

Nach hier beschriebenen Prozessen erzeugte Mikroorganismen werden durch Kulturen vertreten, die in der Kulturensammlung des Microbiological Research Establishment in Porton Down am 15. Dezember 1978 niedergelegt und als pBR322-HBV-A bis F identifiziert wurden.

Speziell werden diese Kulturen wie folgt gekennzeichnet :

^A: E, coli HB 101/ρBR322-Pst I dG:HBV-K£n I dC:

Tet^R Amp^S HBV⁺ VA⁺

^B: E, coli HB 10l/pBR322-_Ps_et I dG :HBV-Bam_ HI dC:

Tet^R Amp^S HBV⁺ VA⁺

^C: E. coli HB 10l/pBR322-_iPs_t_- I dG :HBV-Bc[J₁ II dC:

Tet^R Amp^S HBV⁺

^D: E. coli HB 101/pBR322-,Ps_t I dG :HBV-E£O RI dC:

Tet^R Amp^S HBV⁺

E: E. coli HB 10l/pBR322-Bam HI ;HBV-Bam HI:

Tet^S Amp^R HBV⁺

F: E. coli HB l01/pBR322-_Ec_o RI :H3V-Eco_ RI:

Tet^R Amp^R H3V⁺

Teile dieser identischen Kulturen wurden gleichfalls in der Kulturensammlung der National Collection of Industrial Bacteria, Aberdeen, Schottland, am 19. Dezember 1979 hinterlegt.

Die obige Nomenklatur für die Kulturen stellt eine Beschreibung der betreffenden Kultur wie folgt dar: VVirt/Cloningvehikel - Restriktionsstelle im Cloningvehikel mit Indikation von Verlängerungsnucleotid (wenn vorhanden): Hepatitis-B-Virus-Restriktionsstelle in Hepatitis-B-Virus mit Indikation von Verlängerung (wenn vorhanden) : Resistenz (R) oder Sensibilität (S) gegenüber Tetracyclin (Tet) und Ampicillin (Amp), positive Hybridisierung zu HBV-DNS in dem oben genannten Kolonie-Hybridisierungstest (HBV⁺) und Erzeugung von HBV-Antigenwirkung aufweisendem Polypeptid (siehe oben) (VA⁺) * Unter Anwendung dieser Nomenklatur bezeichnet die Kultur pBR322-HBV-A eine E. coli HB 101 Kultur, die als Plasmid ein Rekominant-DNS-Molekül enthält, das pBR322, an der Pst-I-

Stelle gespalten und mit einem Poly-dG~Schweif an den 3'-Terrnini verlängert, angeheftet an HBV-DNS, gespalten mit Kpη I und verlängert mit einem Poly-dC-Schweif an den 3'-Terrnini, umfaßt, wobei die Kultur Resistenz gegenüber Tetracyclin, Sensibilität gegenüber Ampicillin aufweist, einen positiven HBV-DNS-Hybridisierungstest ergibt und ein HBV-Antigenwirkung aufweisendes Polypeptid erzeugt.

Selbstverständlich sollen die erfindungsgemäßen Hybridmikroorganismen, Rekombinant-DNS-Moleküle und Polypeptide und für diese anwendbaren Methoden nicht auf das oben beschriebene bevorzugte Ausführungsbeispiel beschränkt sein. Stattdessen können die Hybridorganismen, Rekombinant-DNS-Moleküle und Polypeptide während der Erzeugung oder anschließend sehr vorteilhaft durch bekannte Methoden modifiziert werden. Beispielsweise können wirksamere Expressions-Kontroll-Sequenzen für die Transkription der HBV-Gene oder Hybridgene herangezogen werden, Mutationen zur Einschränkung der Synthese unerwünschter Genprodukte eingeführt werden, die Proteasemengen in den Wirtszellen verringert werden, durch Wärme integriert werden oder andere Modifikationen und Vorgänge zur Erhöhung der Anzahl von Genkopien in der Zelle oder zur Erhöhung der Produktivität der Zelle bei der Erzeugung der vorgesehenen Polypeptide ausgeführt werden.

Neben ihrem Nutzen bei der Erzeugung von HBV-Antigenwirkung aufweisenden Polypeptiden sind die .erfindungsgemäßen Hybrid-Mikroorganismen auch für die Herstellung großer Mengen DNS, die das Genom für Hepatitis-B-Virus vollständig oder zum Teil enthält, wertvoll. Zum Beispiel ist durch Verstärkung, z.B. durch den Zusatz von Chloramphenicol zum Nährmedium, wenn die Zelldichte einen entsprechenden Wert erreicht hat, oder die Anwendung von Mutationen zur Verhinderung der Lysis in

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Bakteriophagenhybriden, die HBV-Sequenzen enthalten, die Gewinnung von HBV-DNS in vorher nicht erreichbaren Mengen möglich. .

Auf diese Weise hergestellte HBV-DNS kann zur Bestimmung der Nucbotid-Sequenz des Genoms und daraus zu der der Gen- und Aminosäuresequenzen der HBV-Antigene und Strukturgene selbst verwendet werden. Die Kenntnis dieser Sequenzen trägt zum besseren Verständnis der Biologie des Hepatitis-B-Virus bei und ermöglicht, daß die oben beschriebenen Modifikationen zum größten Nutzen angewandt werden können.

DNS-Fraqmentdarstellunq und Nucleotidsequenzbestimmunq 1. Hepatitis-B-Kernantigen

Eine Reihe von in Übereinstimmung mit den oben beschriebenen Verfahren hergestellten Rekombinant-DNS-Molekülen, die ihren Wirtszellen die Fähigkeit verliehen, HBcAg entsprechend dem Nachweis durch Testphasen-Radioimmunoanalyse zu synthetisieren, wurden für die Sequenzanalyse gewählt. Aus diesen Rekombinant-DNS-Molekülen wurden durch Digestion mit entsprechenden Restriktionsenzymen Fragmente hergestellt, und die Fragmente wurden an ihren 5'~Termini mit /_^C - PjJ ATP und T4 Polynucleotidkinase markiert. Die Nucleotidsequenzen jedes Fragmentes wurden danach mit Hilfe allgemein bekannter chemischer Abbaumethoden bestimmt (A. M. Maxam und W. Gilbert, "A New Method for Sequencing DNA" (Eine neue Methode zur Sequenzierung von DNS), Proc. Nat. Acad. Sei. U.S.A., 74, S. 560 - 563 (1977)).

Die resultierende Nucleotidsequenz ist in den Figuren 3 bis 9 dargestellt. Zur Bezugnahme ist die Sequenz von dem A des ATG-Translations-Initiator-Codons des Kerngens an numeriert

Die Nucleotidsequenz des Gens für HBcAg und die Aminosäuresequenz für das von diesem Gen abgeleitete Polypeptid (Orientierungssystem 1) ist in den Figuren 3 bis 9 zwischen den Nucleotiden 1 - 549 angegeben. Die Größe des durch dieses Gen kodierten Polypeptide entspricht etwa dem Molekulargewicht von 19 000, das bei den Kernantigenen von Dane-Partikeln ermittelt wurde. Jedoch wird durch die vorgelegte Strukturbesti.mmung nicht die Möglichkeit ausgeschlossen, daß einige Aminosäuren von dem Aminoterminus dieses PoIypeptids in vivo während der Bildung des authentischen Antigens abgeschnitten werden können. Bei dieser Struktur werden auch keine anderen oder weiteren Modifikationen des Polypeptids, wie sie durch die Wechselwirkung mit anderen Hurnanenzymen auftreten können, z.B. derjenigen Enzyme, die Proteine glycosolieren, berücksichtigt. Daher braucht die hier bestimmte Polypeptidstruktur nicht mit der in vivo ermittelten von HBcAg identisch zu sein, aber sie wird jedenfalls eine sehr ähnliche, wenn nicht identische, Immunreaktion ergeben.

Bei allen untersuchten Rekombinant-DNS-Molekülen war die HBV-DNS so eingefügt, daß das Kernantigen-Gen in der gleichen Translationsphase wie das Gen für die Penicillinresistenz von pBR322 gehalten wurde. Darüberhinaus begann der HBV-DNS-Insert innerhalb eines oder zweier Nucleotide mit der gleichen Position in der HBV-Sequenz. Da diese Rekombinant-DNS-Moleküle von der mit verschiedenen Restriktionsenzymen digerierten, z.B. Bam HI und Kpn I, HDV-DNS stammten, ist diese einmalige Anheftung überraschend und kann sich aus dem unbeabsichtigten Bruch oder Polynucleotid-Schweifbildung der HBV-DNS an dem Einschnitt in der endogenen DNS der Dane-Partikel ergeben haben (Fig. 1). Rekombinant-DNS-Moleküle, die den HBV-DNS-Insert in einer anderen Translationsphase aufweisen, verwirklichten das HBcAg-Gen nicht, und es konnte kein HBV-Antigenwirkung

aufweisendes Polypeptid in Wirten, die mit derartigen Rekombinant-DNS-Molekülen transformiert wurden, nachgewiesen werden. Es ist natürlich klar, daß solche Nicht-Gene verwirklichenden Wirte und Rekombinant-DNS-Moleküle trotzdem für die erfindungsgemäße Erzeugung von HBV-DNS wertvoll sind. .

Obwohl man angenommen hatte, daß HBcAg oder Fragmente davon,, die durch Expression der HBV-DNS-Inserts erzeugt wurden, mit dem Produkt (β-Lactamase) des Gens für Penicillinase-Resistenz über eine kleine Anzahl von Glycocollresten verschmolzen würden, war das nicht der Fall. Stattdessen war die (o-Lactamase in jedem Fall durch 5-8 GIycocolle mit einer identischen Peptid-Sequenz verschmolzen, aber diese Sequenz endete nach 25 Aminosäuren. Bei diesem Orientierungssystem (System 1, Figur 3) folgt auf ein Terminator-Codon (TAG) nach drei Nucleotiden ein Initiator-Codon, von dem aus die Translation ungehindert weitergeht und ein Polypeptid mit der Länge von 183 Aminosäuren ergibt (Figuren 3 - 8). Daher ist Kernantigen-Aktivität in einem Polypeptid von etwa 21 000 Dalton, das de novo von der HBV-Sequenz innerhalb der von dem Rekombinant-DNS-Molekül transkripierten mRNS umgewandelt wurde, vorhanden. Dieses Polypeptid bleibt in der Wirtszelle, da es infolge der Anordnung der Terminator- und Initiator-Codons des HBV-DNS-Inserts nicht an das ausgeschiedene Penicillinase-Trägerprotein angeheftet wird.

2. Hepatitis-B-Oberflächenantiqen

Die Nucleotid-Sequenz des Gens für HBsAg und die Aminosäuresequenz für das von diesem Gen abgeleitete Polypeptid (Orientierungssystem 3) sind gleichfalls in den Figuren 6 bis 8 zwischen den Nucleotiden 1437 - 2114 dargestellt.

Die AminosäuresG N-Terminus rait d Anfangs-Amirsosatn ;: "Partial Amino Ac peptides of Hepat säuresequenz von Hepatitis-B-Ober; U.S.A., 74, S· i: HBsAg bestimmt« ": setzt sich in den entfernten Jermi,·/ Sequenz entsprich

ϊπζ dieses Polypeptids beginnt an dem Sequenz met-glu-asn-ile-thr-ser. Diese : sequenz wurde von D. L. Peterson, u.a., j Sequence of two Major Component PoIy- ;.:is B Surface Antigen" (Partielle Aminoei Hauptkomponenten-Polypeptiden von ichenantigen), Proc. Natl. Acad. Sei. J - 1534 (1977) aus authentischem Humanise Aminosäuresequenz dieses Proteins riguren 6-8 bis zu einem 226 Aminosäure ror-Codon fort. Diese 226-Polypeptideinem Protein von 25 400 Dalton.

ix

Die HBsAg-Afiinot-;' resequenz und die Länge wurden unabhängig durch Sequenzler geeigneter Rekombinant-DNS-Moleküle durch

., "Nucleotide Sequence of the Gene Coding ν ν ν?in of Hepatitis B Virus Surface Antigen" τ:: des für das Hauptprotein von Hepatitis-B-

Virus-Oberflächo; . ntigen kodierenden Gens), Nature, 280,

S. 815 - 819 (13?:) bestätigt.

P. Valenzuela,, for the Major

Die für die erfl stimmte Nucleoti Weise unters'JcST·: das Gen für HBsA annehmen könnte,. zelle zu verwirk/, in den Extrakten Plasmiden, von Cv HBcAg verwi rklic erläutert wurde. Gene bekannt sin·" besserung seiner

ungsgemäßen Rekombinant-DNS-Moleküle beiequenz zeigt, daß keine der auf diese , die das Gen für HBcAg verwirklichten, in einer Position haben kann, von der man aß es auch in einer entsprechenden Wirtsohen sei. Tatsächlich wurde kein HBsAg on den Zellen gefunden, die mit diesen an gefunden wurde, daß sie das Gen für n, transformiert wurden. Wie jedoch oben st es, wenn die Nucleotidsequenzen dieser

möglich, den Expressionsprozeß zur Verusbeute und Wirkung und zur besseren

Expression von Genen sowie zur Erzeugung von Polypeptiden, die vorher nicht verwirklicht oder nachgewiesen wurden, zu modifizieren.

Herstellung von verbesserten Rekombinant-DNS-Molekülen zur Erzeugung von HBV-Antiqenen

Gen und Aminosäuresequenzen dieser Antigene sind für die Entwicklung von Methoden zur Erhöhung der Erzeugungsmenge von Antigen oder Gen pro Bakterienzelle wertvoll.

Die Erzeugungsmenge eines Proteins wird durch zwei Hauptfaktoren gesteuert : Die Anzahl von Kopien seines Gens innerhalb der Zelle und den Wirkungsgrad, mit dem diese Genkopien transkribiert und umgewandelt werden. Der Wirkungsgrad der Transkription und Translation (die zusammen die Expression bilden) ist seinerseits von den Nucleotidsequenzen abhängig, die normalerweise vor der gewünschten Kodierungssequenz sitzen. Diese Nucleotidsequenzen oder Expressions-Kontroll-Sequenzen bestimmen unter anderem die Stelle, an der DNS-Polymerase zur Initiierung der Transkription (der Promotorsequenz) wirksam wird und an der Ribosomen gebunden werden und mit der mRNS (dem Produkt der Transkription) zur Initiierung der Translation wirken. Nicht alle derartigen Expressions-Kontroll-Sequenzen funktionieren mit gleicher Wirksamkeit. Es ist daher vorteilhaft, die spezifischen Codierungssequenzen für das gewünschte Protein von ihren benachbarten Nucleotidsequenzen zu trennen und sie lieber mit bekannten Expressions-Kontroll-Sequenzen zur Förderung höherer Expressionsgrade zu verschmelzen. Wenn dies erfolgt ist, kann das neu geschaffene DNS-Fragment in ein Multikopie-Plasmid oder ein Bakteriophagenderivat zur Erhöhung der Anzahl von Genkopien innerhalb der Zelle und dadurch zur weiteren Verbesserung der Ausbeute an Expressions-Protein eingefügt werden..

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Zu Erklärungszwecken wurde die für das Gen von HBcAg bestimmte Sequenz in dieser Weise zur Verbesserung der Erzeugung von HBcAg in E. coli verwendet. Ein derartiger Prozeß ist in Fig. IO wiedergegeben.

Eine Betrachtung der DNS-Sequenz für HBcAg in Figur 3 ergibt, daß diesem Gen ein Target für Alu I an Nucleotid-26 (AGCT) vorausgeht und daß es Targets für Eco RI⁺ an den Nucleotiden 22 und 1590, für Eco RII an 209 (CCTGG), für Hae III an 280 (GGCC) und für Ava II an 246 und 461 (GGACC, GGTCC) enthält. Aufgrund dieser Komplexität ist es zweckmäßig, eine Kernantigen-Codiersequenz in wirksamere Expressions-Kontroll-Sequenzen in zwei Stufen umzuwandeln. Zum Beispiel ergibt die Digestion eines erfindungsgemäß erzeugten Rekombinant~DNS-Moleküles, das einen HBV-DNS-Insert von etwa 2350 Basenpaaren (Nucleotiden) aufweist, d.h. von den Nucleotiden -80 bis etwa 2270 von Figur 3, mit Alu I und auch Eco Rl unter anderem das Fragment zwischen den Nucleotiden -26 und 22 (Fragment A), während die Eco RI ⁺ Digestion alleine das Fragment von den Nucleotiden 23 bis 1589 (Fragment B) und geringe Ausbeuten an einem Fragment von den Nucleotiden 23 bis 576 (Fragment B') ergibt. Diese Fragmente lassen sich leicht anhand der Figuren 3 und 4 identifizieren und sind schematisch in Figur 10 gezeigt. Die Fragmente A und B werden durch Gelelektrophorese zu ihrer Reinigung fraktioniert und werden über ihre Eco RI ⁺ Kohäsionsenden zur Gewinnung eines kombinierten Fragments (Fragment C) angefügt. Fragment C ist nun an eine neue Expressions-Kontroll-Sequenz angeheftet, wie es über direkte Ligation zur Aufrechterhaltung der richtigen Translationsphase, über die früher beschriebene 3'-Schweifbildungsmethode oder über synthetische Oligo-Nucleotid-Glieder möglich ist. Durch dieses Anheften wird nicht nur eine bessere Expressions-Kontroll-Sequenz zur Verbesserung

der Proteinerzeugung eingesetzt, sondern es ermöglicht auch, daß das für HBcAg kodierende Genfragment enger an die Expressions-Kontroll-Sequenz selbst angeheftet wird, um dadurch die Kontrolle der Expression dieses Genfragments zu verstärken. In der gleichen Weise können die Fragmente A und B' verbunden oder zahlreiche andere Fragmente erzeugt werden und das resultierende Fragment wie oben verwendet werden. Dieser Prozeß demonstriert, daß nur ein Teil des für ein bestimmtes Polypeptid kodierenden Strukturgens für erfindungsgemäße Rekombinant-DNS-Moleküle verwendet werden muß.

Um den Abstand zwischen der betreffenden Expressions-Kontroll-Sequenz und dem Initiator-Codon des gewählten Gen-' fragments noch mehr zu verkürzen, kann das betreffende Fragment leicht mit einer Kombination von Nucleasen, die speziell an oder nahe ihrem Terminus wirken, behandelt werden, oder in Exonuclease und Polymerase-verknüpften Reparaturreaktionen verwendet werden, um einige oder alle derjenigen Nucleotide des Fragments, die dem Initiator-Codon des Fragments vorausgehen, zu entfernen. Alternativ kann ein Fragment, z.B. ein aus der Spaltung an den Nucleotiden -26 und 30 herrührendes Alu-I-Fraqment in ähnlicher Weise durch Exonucleasebehandlung oder Polymerase-verknüpfte Reparaturreaktionen verkürzt werden und anschließend mit Eco RI gespalten werden, um ein Fragment aus dem Stück zwischen den Nucleotiden -26 und 1 und Nucleotid 22 zu erzeugen, damit die Verschmelzung mit Fragment B für das Anheften an die Expressions-Kontroll-Sequenz erfolgen kann. Ein anderer Weg könnte in der Hybridisierung von Fragment B oder eines äquivalenten Fragments zu einer entsprechenden einsträngigen Template (Schablone) von dem Eltern-Rekombinant-DNS-Molekül zur Verlängerung in einer Reihe von Reaktionen mit DNS-Polymerase und einer begrenzten Anzahl von Nucleosid-Triphosphaten bestehen, so daß der Fragmentstrang zu

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Beginn der Codierungssequenz rekonstruiert werden könnte. Der Template-Strang würde dann an der Stelle seiner Vereinigung mit dem verlängerten Fragmentstrang mit Endonuclease Sl gespalten werden, und das dabei gewonnene Fragment könnte an die Expressions-Kontroll-Sequenz angeheftet werden.

Wie oben beschrieben, können verschiedene Expressions-Kontroll-Sequenzen verwendet werden. Dazu gehören die Operator-, Promotor-, und Ribosombinde- und -Wechselwirkungssequenzen (einschließlich Sequenzen wie die Shine-Dulgano-Sequenzen) des Lactose-Operon von E. coli ("das lag-System"), die entsprechenden Sequenzen des Tryptophan-Synthetase-Systems von E. coli ("das trp-System"), die Hauptoperator- und Promotorregionen von Phage X (0.P₁- und 0_RP_R) und die Kontrollregion des Phagen-fd-Coat-Proteins. Diese Sequenzen enthaltende DNS-Fragmente werden durch Spaltung mit Restriktionsenzymen von der DNS, die von übertragenden Phagen, die die Iac oder trρ Operons tragen, isoliert wurde, oder von der DNS von Phage Λ. oder fd entfernt. Diese Fragmente werden dann in der für die HBV-Antigensequenzen aufgezeigten Weise manipuliert, um eine begrenzte Population von Molekülen zu gewinnen, so daß die wesentlichen Kontrollsequenzen sehr nahe mit dem oder nebeneinanderliegend mit dem Initiator-Codon der Kodierungssequenz für das gesuchte Antigen, wie oben für das Fragment C beschrieben, vereinigt werden können.

Das Fusionsprodukt wird dann wie vorher in ein Cloningvehikel zur Transformation der entsprechenden Wirte eingefügt, und die Höhe der Antigenproduktion wird nach Lysis der Zellen mit Hilfe der Radioimmunoanalyse gemessen. Zellen, die die wirksamste Expression ergeben, können auf diese Weise ausgewählt werden. Alternativ können Cloningvehikel, die das an ein Initiator-Codon angeheftete

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lac-, trp- oder Λ P,-Kontrollsystem tragen, verwendet und mit einem Fragment verschmolzen werden, das eine, für ein HBV-Antigenwirkung aufweisendes Polypeptid kodierende Sequenz enthält, so daß das Strukturgenfragment einwandfrei von dem Initiierungscodon auf das Cloningvehikel übertragen wird.

Wenn sich auch diese Experimente speziell auf die Erzeugung von HBV-Kernantigen konzentriert haben, sind sie doch auch für die Verbesserung der Expression anderer Gene wie HBsAg- und HBcAg-Gene und Fragmente davon anwendbar.

Eine weitere Steigerung der Zellenausbeute dieser bestimmten Antigene hängt von einer Erhöhung der Anzahl von Genen ab, die in der Zelle verwendet werden können. Dies konnte zu Illustrationszwecken erzielt werden durch die Einfügung von in der beschriebenen Weise entwickelten Rekombinant-DNS-Molekülen in den temperenten Bakteriophagen A(NM 989), am einfachsten durch Digestion des Plasmids mit einem Restriktionsenzym, z.B. Eco RI oder Hind III, zur Gewinnung eines linearen Moleküls, das dann mit einem eingeschränkten Phagen A-Cloningvehikel vermischt wurde (z.B. des Typs, der von N. E. Murray, u.a., "Lambdoid Phages that simplify the Recovery of in vitro Recombinants" (Lambda-Phagen, die die Gewinnung von in vitro Rekombinanten vereinfachen), Molec. gen. Genet., 150, S. 53 - 61 (1977), und N. E. Murray, u.a., "Molecular Cloning of the DNA Ligase Gene from Bacteriophage T4" (Molekülcloning des DNS-Ligasegens des Bakteriophagen T4), ö. Mol. Biol.. 132, S. 493 - 505 (1979) beschrieben wurde), und des durch Inkubation mit DNS-Ligase erzeugten Rekombinant-DNS-Moleküls. Ein solcher Vorgang ist in Figur 11 dargestellt. Der vorgesehene Rekombinant-Phage wurde dann durch Radioimmunoanalyse für das betreffende

Antigen oder durch Hybridisierung mit radioaktiv markierten HBV-DNS-Sequenzen ausgewählt und zum Lysogenisieren eines Wirtsstammes von E. coli verwendet.

Besonders nützliche A-Cloningvehikel enthalten eine temperatur-empfindliche Mutation in dem Repressionsgen el und unterdrückbare Mutationen im Gen S, dessen Produkt zur Lysis der Wirtszelle erforderlich ist, und Gen E₁ das Produkt, das das Hauptcapsidprotein des Virus ist. Mit Hilfe dieses Systems wurden die lysogenen Zellen bei 32 C gezüchtet und anschließend auf 45 C zum Einleiten der Excision des Prophagen erhitzt. Längere Züchtung bei 37 C führt zu hohen Produktionswerten des Antigens, das innerhalb der Zellen zurückgehalten wird, da diese nicht in der üblichen Weise durch Phagengenprodukte lysiert werden, und da der Phagengeninsert nicht eingekapselt ist, bleibt er für die Transkription zur Verfugung. Durch künstliche Lysis der Zellen wird dann das Antigen in großen Mengen freigesetzt (Figur 11).

Außer den E. coli-Systemen, mit denen sich die Beispiele vor allem befaßten, kann die gleiche Art von Manipulationen zur Steigerung des Grades der Antigenproduktion in anderen Mikrobenzellen durchgeführt werden, z.B. in B. subtilis, thermophilen Bakterien oder Hefearten und Pilzen oder in Tier- und Pflanzenzellen in Kultur. Im Falle von B. subtilis bietet ein Plasmid, das die Determinanten für von B« licheniformis isolierte Penicillinase trägt, eine nützliche Expressions-Kontroll-Sequenz für diesen Zweck.

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Herstellung von verbesserten Rekombinant-DNS-Molekülen für die Expression des für HBsAq codierenden Gens

Das Gen und die Aminosäuresequenzen, die für HBsAg bestimmt wurden, sind wertvoll für die Entwicklung von Methoden, die die Expression des Gens für HBsAg mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens ermöglichen. Eine derartige Expression konnte bisher in Wirten nicht beobachtet werden, die mit Rekombinant-DNS-Molekülen, die HBV-Antigenwirkung aufweisende Polypeptide erzeugten, transformiert worden waren.

Die Nucleotid-Sequenz der Figuren 6 bis 8 zeigt die Genkodierung für HBsAg zwischen den Nucleotiden 1437 und 2114. Dieses Gen befindet sich in einer anderen Translationsphase (Orientierungssystem 3) als das für HBcAg codierende Gen (Orientierungssystem 1) in dem HBV-Genom der Figuren 3-9. Daher wurde ein Rekombinant-DNS-Molekül, das kein HBcAg bei der Verwendung zur Transformation eines entsprechenden Wirtes erzeugte, sondern einen HBV-DNS-Insert von etwa 2350 Nucleotiden (etwa den Nucleotiden -80 bis 2270 der Sequenz der Figuren 3 bis 8 entsprechend) enthielt, für den Einsatz bei der HBsAg-Erzeugung ausgewählt.

Das gewählte Rekombinant-DNS-Molekül enthielt unter anderem die gesamte Genkodierung für HBsAg. Die Untersuchung der Nucleotid-Sequenz des HBV-DNS-Inserts dieses Rekombinant-DNS-Moleküls ergibt verschiedene Restriktions-Endonuclease-Targets, die die Excision von Fragmenten ermöglichen, die die Genkodierung für HBsAg enthalten; zum Beispiel Nucleotid 1409 (Xho), Nucleotid 1410 (Tag), Nucleotid 1409 (Ava I) und Nucleotid 1428 (Hh_a I) (Figur 6). Von den genannten ist letzteres (jlha I) besonders wertvoll, da die Spaltung des HBV-DNS-Inserts zwischen den Nucleotiden

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1430 und 1431 erfolgt, ein nur sechs Nucleotide vor dem Translations-Initiator-Codon (ATG) des Gens für HBsAg selbst liegender Schnitt. In allen vier Fällen wird sich das abgeschnittene Fragment über den gewählten HBV-DNS-Insert hinaus bis zu einem Target für die betreffende Restriktions-Endonuclease ausdehnen, die innerhalb der Nucleotidsequenz des pBR322-Teiles des Rekombinant-DNS-Moleküls liegt. Daher ermöglicht die Verwendung dieserRestriktions-Endonucleasen und anderer gleich nützlicher, alleine oder in Kombination, die Excision des für HBsAg kodierenden Gens nahe seinem Initiator-Codon, jedoch vor diesem, und hinter seinem Translations-Terminator-Codon. Selbstverständlich brauchen, wie es für den Fall des Gens für HBcAg gezeigt wird, nur Fragmente des ganzen Gens tatsächlich in Rekombinant-DNS-Molekülen zur Erzeugung von HBsAg-Antigenwirkung in entsprechenden Wirten aufweisenden Polypeptiden eingesetzt zu werden.

Von derartigen Digestionsprodukten abgeleitete Fragmente von HBV-DNS wurden in einer Reihe von Reaktionen behandelt, die denen analog sind, die für das Gen und die Genfragmente, die für Kernantigen kodieren, beschrieben wurden. Das Genfragment kann z.B. in das für Penicillin-Resistenz kodierende Gen von pBR322 (z.B. P_nSt_- I Erkennungsstelle, Figur 2) eingefügt werden, wodurch bei Verschmelzung mit P -Lactamase (dem Produkt des Penicillinasegens) HBsAg-Antigenwirkung aufweisendes Polypeptid erzeugt wird; zwischen den für Penicillin-Resistenz und Tetracyclin-Resistenz.in pBR322 kodierenden Genen (Eco RI oder Hind III-Erkennungsstellen, Figur 2) eingefügt und dort oder vor der Einfügung mit der lac-System-Expressions-Kontroll-Sequenz verknüpft werden, um das HBsAg-Antigenwirkung aufweisende, mit dem β -Galactosidaseprotein des lac-Systems verschmolzene Polypeptid zu erzeugen; in ein Cloningvehikel so dicht wie möglich an der gewählten Ex-

pressions-Kontroll-Sequenz selbst eingefügt werden, wie zuvor für das für HBcAg kodierende Gen beschrieben wurde; oder anderweitig, wie erfindungsgemäß beschrieben, geclont werden. Zu Erläuterungszwecken ist ein derartiges Schema in Figur gezeigt. In diesem wurde das gewählte Rekombinant-DNS-Molekül mit einem sich etwa zwischen den Nucleotiden -30 und 2270 erstreckenden HBV-DNS-Insert (Figuren 3 bis 8) durch Digestion mit Hha I fragmentiert. Das entstandene Fragment wurde mit Hilfe der oben beschriebenen 3'-Schweifbildungsmethode an der Pst'-I-Stelle von pBR322 eingefügt. Mit diesem Rekomb'inant-DNS-Molekül transformierte Wirte erzeugten HBsAg-Antigenwirkung aufweisende Polypeptide.

Andere Fragmente (z.B. Aνa I, Tag, Xho oder Pst I) (Partialdigest) wurden ebenfalls an der Pst—I-Erkennungsstelle oder anderen Stellen in pBR322 eingefügt, um Rekombinant-DNS-Moleküle zu erzeugen, die für die Erzeugung von HBsAg-Antigenwirkung aufweisenden Polypeptiden oder von für HBsAg kodierenden Genfragmenten wertvoll sind.

Außerdem wurden solche Genfragmente in pBR322 eingefügt, das durch Pst I gespalten worden war, und das resultierende Fragment des für Penicillinase kodierenden Gens entfernte sich dann in einem Fall von dem für Aminosäure 182 von Penicillinase oder ß> -Lactamase kodierenden Codon zu dem für Aminosäure 32 kodierenden Codon und in einem anderen Fall zu dem für Aminosäure 13 des Polypeptids kodierenden Codon. Diese Derivat-Plasmide von pBR322-Pst I' sind gleichfalls mit HBsAg-Genfragmenten, die von den Nucleotiden 1447 bis 1796 reichten (figuren 6 und 7), verwendet worden, um HBsAg-Antigenwirkung aufweisende Polypeptide zu erzeugen.

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Die Nucleotid-Sequenz zwischen den Nucleotiden 948 und 1437, die dem für HBsAg kodierenden Strukturgen unmittelbar vorausgeht, kann auch in die Fragmente einbezogen werden, die zur Gewinnung nützlicher Rekombinant-DNS-Moleküle für die Erzeugung von HBsAg-Antigenwirkung aufweisenden Polypeptiden und Genfragmenten des Strukturgens für HBsAg verwendet werden. Diese Nucleotid-Sequenz wird als die Vorläufersequenz des Gens bezeichnet. Genfragmente, die sowohl diese Vorläufersequenz als auch das Strukturgen für HBsAg enthalten, können mit Alu I (Nucleotid 939), Hhä I (Nucleotid 900) oder Hae II (Nucleotid 899) abgebrochen werden. Im Falle von A_-Iu I und Hha I₁ ist Partialdigestion und Trennung der resultierenden Fragmente, z.B. durch Gelelektrophorese, erforderlich, weil die Erkennungsstellen für diese Enzyme ebenfalls in der Vorläufersequenz am Nucleotid 1091 für Alu I und am Nucleotid 1428 für Hha II vorkommen.

Während oben eine Anzahl Ausführungsformen der Erfindung vorgestellt wurden, ist es klar, daß die Grundkonstruktion verändert werden kann, um andere Ausführungsformen unter Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zu schaffen. Daher wird man einsehen, daß der Geltungsbereich der Erfindung durch die angefügten Ansprüche und weniger durch die oben als Beispiele angeführten spezifischen Ausführungsformen festgelegt wird.

Mikroorganismen,^ die mit Hilfe der oben beschriebenen Verfahren erzeugt wurden, werden durch in der Kulturensammlung der National Collection of Industrial Bacteria, Aberdeen, Schottland, am 19. Dezember 1979, als pBR322-HBV-G-L- hinterlegte Kulturen vertreten und wie folgt charakterisiert:

^G: B, coli HB101/pBR322-Pst I d'g: HBV-RDn I dG

(anschließend ^(IpHBV114"): Tet^R Amp^S HBV⁺

^{H: E}» ^coli IiB101/pBR322-Pst I'dG:pHBV114-Pst I: Tet^R Amp^S HBV⁺VA⁺

^I: Ξ. coli HBlOl/((pBR322-Sco RI, Bam HI: IadPromoter-Seqzenz)-Hind III Bindeglieder, HBV114-Hha 1 Bam HI:Tet^S Amp^R .HBV⁺VA⁺

^J: E. coli HB10l/pUR2-Eco RI:HBV114-Hha I Ec_o RI Bindeglieder: Tet^S ijnp^R HBV⁺VA⁺

^K: E.coli HB10l/pBR322-P8t I dG:pPIBV114-Ava I dC Tet^R /unp^S HBV⁺VA⁺

^{L: B}« ^coli HB10l/pBR322-Pst I dG:pHBV114- Ta& dG Tet^R Arap^S HBV⁺ VA⁺

⁺ Ein Derivat von pBR322 mit einer DITS-Sequenz. einschließlich der Genkodierung für das Polypeptid für Tetracyclin-Resistenz, ersetzt durch eine kleinere DNS-Sequenz, die das des Ξ. coli lac-Sy st ein aufweist.

Claims (11)

1. -46- 21 7945

   Erfindungsanspruch

   1. Verfahren zur Erzeugung mindestens eines HBV-Antigenwirkung . aufgleisenden Polypeptids, gekennzeichnet dadurch, daß ein Rekdmbinant-DNS-Molekül mit einem für mindestens ein HBV-Antigenwirkung aufweisendes Polypeptid kodierenden Strukturgen und einer operativ angefügten Expressions-Kontroll-Sequenz geschaffen wird, ein entsprechender Wirt mit dem Rekombinant-DITS-Molekül transformiert wird, der Wirt gezüchtet wird, und das Polypeptid gesammelt wird.
2. 2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß das Strukturgen zwischen einer ersten und einer zweiten Restriktions-Endonuclease-Stelle eines Cloningvehikels zur Bildung des Rekombinant-DIJS-Moleküls eingefügt wird.
3. 3. Verfahren nach Punkt 1 oder 2, gekennzeichnet dadurch, daß das Struktirgen die endogene DlTS einer Dane Partikel oder Fragmenten davon ist.
4. 4. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 3, gekennzeichnet dadurch, daß der Wirt Stämme von Ξ. coli, Pseudomonas, bacillussubtilis, Bazillen, Hefearten, Pilzen oder tierische oder pflanzliche Zellen in Kultur umfaßt.
5. 5. Verfahren nach einem der Punkte 2- bis 4, gekennzeichnet dadurch, daß die Espressions-Kontroll-Sequenz zwischen weiteren Endonuclease-Erkennungsstellen in dem Cloningvehikel eingefügt ' ist.
6. 6. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 5, gekennzeichnet dadurch, daß die Eypressions-Kontroll-Sequenz aus der das lac_~S;y3tem, das trjD-Svatem, die Hauptoperator- oder pro-

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   motorregionen des Phagen JL oder die Kontrollregion von Phagen-fd-Coat-Protein umfassenden Gruppe ausgewählt ist.

   7, Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 6, gekennzeichnet dadurch, daß die Anzahl von Kopien des Rekombinant-DHS-Moleküls in dem V/irt erhöht wird.

   8, Verfahren nach einem der Punkte·1 bis 7, gekennzeichnet dadurch, daß das Strukturgen durch Osilieren des Rekombinant-DHS-Moleküls aus dem dadurch transformierten V/irt und durch Entfernen des Strukturgens oder von Fragmenten davon von dem Molekül erzeugt wird.

   9, Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 8, gekennzeichnet dadurch, daß ein Polypeptid mit der Formel MetBluAsnlle ThrSerGlyPheLeuGlyProLeuLeuValLeuGlnAlaGlyPhePheLeuLeu Thr ArglleLeuThrlleProGlySerLeuAspSerTrpThrSerLeuAsnPhe LeuGlyGlyThrThrValCysLeuGlyGlnAsnSerGlnSerProIleSerAsn HisSerProThrSerCyGProProThrCysProGlyTyrArgTrpMetCysleu . ArgArgPhellellePheLeuPhelleLeuLeuCysLeuIlePheLeuLeuVal LeuLeuAspTyrGlnGlyUetLeuProValCysLeuIleProGlySerSerThr ThrSerThrGlySerCysArgThrCysThrThrProAlaGlnGlylleSerMet TyrProSerCysCysCysThrlysProSerAspGlyAsnCysIleProIlePro SerSerTrpAlaPheGlyLysPheLeuTrpGluTrpAlaSerAlsArgPheSer TrpLeuSerLeuLeuValProPheValGlnTrpPheValGlyLeuSerProIle ValTrpLeuSerVallleTrpIJetLietTrpTyrTrpGlyProSje^LeuTyrSer IleLeuSerProPheLeuProLeuLeuProIlePhePheCysLeuTrpillaTyr He or MetAspIleAspProTyrLysGluPheGlyAlaThrValGluLeu leuSerPheLeuProSerAspPhePheProSerValArgAspLeuLeuAspThr AlaAlaAlaLeu TyrArgAspAlaLeuGluSerProGluHisCysSerProHis HisThrAlaLeaArgGlnAlalleLeuGysTrpTrpGlyAspLeuMetThrLeu AlaThrTrpValGlyThrAsnLeuGluAspProAlaSerArgAspLeuValVal SerTyrValAsnThrAsnValGlyLeuLysPheArgGlnLeuLeuTrpPheHis IleSerCysLeuThrPheGlyArgGluThrValGluTyrLeuValSerPheGly

   -48- 217945

   ValTrplleArgThrProProAlaTyrArgProProAsnAlaProIleLeuSer ThrLeuProGluThrThrValValArgArgGlyArgSerProArgArgThrPro SerProArgArgArgArgSerGlnSerProArgArgArgArgSerGlnSerArg GluSerGlnCys oder Fragmenten davon hergestellt wird.
7. 10. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 9, gekennzeichnet dadurch, daß das für wenigstens ein HBV-Antigenwirkung aufweisendes Polypeptid kodierende Strukturgen das Strukturgen für Hepatitis-B-Virus-Oberflächenantigen oder Fragmente davon, das Strukturgen für Hepatitis-B-Virus-Kernanigen pder Fragmente davon oder Gene mit Strukturgenen oder Fragmenten als Teil derselben aufweist.
8. 11. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 10, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei dem für wenigstens ein HB¥-Antigenwirkung aufweisendes Polypeptid kodierendes Strukturgen um folgendes:ATGGACATTGACCCTTATAAAGAATTTGG agctactgtggagttactctcgtttttgccttctgacttctttccttccgtacg agatcttctagataccgccgcagctctgtatcgggatgccttagagtctcctga gcattgttcacctcaccatactgcactcaepgcaagcaattctttgctggggaga cttaatgactctagctacctgggtgggtactaatttagaagatccagcatcaggg' acctagtagtcagttatgtcaacactaatgtgggcctiuagttcagacaattattgtgg ttscacatttcttgtctcacttttggaagaaacggttctagagtatttggtgtcttttg gactgtggattcggactccagcttatagaccaccaaatgcccctatcctatciucgctt ccggagactactgttgttagacgacgaggcaggtcccctagaagaagaactccctcgcc tcgcagacgiugatctciutcgccgcgtcgcagaagatctciutctcggiutctcaatg TTAG oder Fragmante davon handelt.
9. 12. Verfahren nach Punkt 1 bis 10, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei dem für wenigstens ein PIBV-Anigenwirkung aufweisendes Polypeptid kodierenden Strukturgen um ATGGAGAiICA TCAGATCAGGATTCCTAGGACCCGTGCTCGTGTTACAGGCGGGTTTTCTTGTTGACAA GAiLTCCTCACAATAC C GCAGAGTC TAGAC TC GTGGTGGACTTC TCTCAATTTTCTAGGGG GAACTACCGTGTGTCTTGG^CiUAiLTTCGCAGTCCCCiUTCTCCAATCACTCACCMCCT CCTGTCCTCCXUCTTGTCCTGGTTATGGCTGGATGTGTCTGCGGCGTTTTATCATCTTCC

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   TCTTGATCCTGCTGCTATGCCTGATCTTCTTGTTGGTTCTTCTGGACTÄTCAAGGTATG TTGCCCGTTTGTCCTCTAATTCGAGGATCATGAACCACCAGCACGGGATCCTGCAGAAG CTGCACGACTCCTGGTCAAGGiulTCTGTATGTATCCCTCCTGTTGCTGTAC/iAAACCTT ' CGATGGAAACTGCACCTGTATTCCCATCCGATCATGCTGGGCTTTCGGAz₁AATTCCTAT GGGAGTGGGCCTCACCCGGTTTGTCTTGGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGG TTCGTAGGGCTTTCCCCCATTGTTTGGCTTTCAGTTATATGGATGATGTGGTATTGGGG GCAAGTCTGTACAGCATCTTGAGTCCCTTTTTACCGCTGTTACCAATTTTCTTTTGTCT TTGGGCATACATTTAA als Tragmente davon handelt.
10. 13. Verfahren nach, einem der Punkte 1 bis 12, kennzeichnet dadurch, daß das Rekombinant-DITS-Molekül folgendes aufweist:

    pBR322-Pst I dG:HBV-K^n I dC; pBR322~Pst I dC: HBV-Bam IiI

    dC; pBR322-Pst I dG:PIBV~Bgl II dC; ρ BR322-Pst I dG; HBY-Bcο

    RI dC;

    pBR322-Bam HI: HBV-Bam HI; pBR322-Eco RI; HBV-Eco Rl; pBR322-Ps_fc I dGiHBV-KDn I dC; pBR322-Pst I'dG: pHBV114-PSt I (pBR-322-Eco RI, Bam HI: lac promoter sequence) Hind III linkers: PHBY114-Hha I, Bam HI and pUR2-Sco RI:HBV114-Hha I Ecο RI linkers.
11. 14. Verfahren nach Punkt 1 bis 13, gekennzeichnet dadurch, daß der Wirt folgendes aufweist:

    E.coli HB 10l/pBR322-Pst I dG/l-IBV-Kün I dC: Tet^RAmp^SHBV^{+ YA+}> E.coli HB 10l/p3R322-Pst I dG/HBV-Bam HI dC: Tet^RArnp^S HBY⁺VA⁺; S.coli HB 10l/pBR322-Ps£ I dG/HBY-B^ II dC: Tet^RArnp^SHBV⁺: E.coli HB 101/pBR322-Ps_t I dG/HBV-Eco RI dC: ³¹^

    Te1³AmP¹^I-IBV⁺; E.coli HB 10l/_PBR322-Bain HlAlBV-BaEi HI: Tet^R Amp^RKBV⁺; E.coli HB 10l/p3R322-Ec_o RI/IIBY-Eco RI: Tet^RAmp^R HBV⁺; E.coli HB101/p322-Pst I dG:HBV-Kgn I dG: Tet^RAm_p ^S HBV⁺; E.coli HB101/pBR322-Pst I» dG: pHBV114-Pst I Tet^R Amp⁵HBV'¹ YA⁺, Ξ. coIi HBlDl/((pBr322-Eco RI Bam HI: lac promoter sequence)-Hind III linkers: pHBV114-Hha I, Bam HI:

    50 - 21

    ^νΔ+» Ξ.Coli HB10l/pUr2-Sco RI: HB114-Hha I Eco RI linkers: Te-Ii⁰Ai]Ip³HBV⁺VA⁺, E.coli HB101/pBr322-,P at I dG: pHBV114-Ava I dG: Tet^Rilmp^SHBV⁺VA⁺, and B.ooli HB10l/pBR322-Pst IdG: ρΡΙΒνΐ14-Τει^ dG: Tet^RAmp^SHBV⁺VA⁺.

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