DD292977B5 - Verfahren und Testbesteck zur Aktivitaetsbestimmung reverser Transkriptasen (RT) - Google Patents
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren und ein Testbesteckzur Aktivitätsbestimmung reverserTranskriptasen (RT) unter Umgehung der bekannten Isotopentechniken und findet vorrangig Anwendung in der molekularbiologischen Grundlagenforschung und angewandten Medizin und Veterinärmedizin auf dem Gebiet der Virologie zur Charakterisierung und zum Nachweis von Retroviren, darüber hinaus in der Pharmakologie und pharmazeutischen Industrie zur Überprüfung der Wirksamkeit von Hemmsubstanzen der reversen Transkriptase.
Charakteristik des bekannten Standes der Technik
Der Nachweis der Aktivität reverser Transkriptasen erfolgt ausschließlich durch die Polymerisatron Tritium-markierter oder 32Phosphor-markierter Deoxynukleotid-Triphosphate an einer Einzelstrangmatritze (Template, meist PolytrA} der Kettenlänge 100) mit Startersequenzen(Primer, meist Oligo [dT) der Kettenlänge 10-20) (D. Baltimore und D.5moler: Proc. Natl. Acad. Sei. 68 [1971lrl507-1511). Der Eineatz der mit radioaktiven Isotopen markierten Nukleotide begrenzt diese Methode auf wenige Labore und ist mit allen Nachteilen, die aus dem Umgang mit radioaktivem Material herrühren; behaftet, wie z. B. der Substanzlagerung,: den erforderlichen Genehmigungen zum Umgang mit diesen Substanzen, der Versuchsdurchführung in Speziallaboratorien sowie der Abfallbeseitigung. Darüber hinaus eignet sich diese Methode nur bedingt zur Automatisierung, verursacht durch die notwendige Präzipitation des Reaktionsproduktes auf eine Matrix, in der dann die radioaktiven Zerfälle gemessen werden.
Ziel der Erfindung
Das Ziel der Erfindung besteht darin, den Einsatz von radioaktiven Isotopen bei der Bestimmung der RT zu umgehen, die RT-Bestimmung weitgehend zu automatisieren und die jeweilige RT spezifisch zu erfassen.
-2-Darlegung des Wesens der Erfindung
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Verfahren und Testbestecke zu entwickeln, die einerseits den Einsatz von Nukleotiden, die mit radioaktiven Isotopen markiert sind, umgehen und andererseits durch Umgehung der Abtrennung nicht polymerisierter Nukleotide einen hohen Automatisierungsgrad bei der RT-Bestimmung ermöglichen.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß z. B. Tritium-markiertes Thymidintriphosphat (3HTTP) gegen anders markierte Nukleotidtriphosphate, die der RT ebenfalls als Substrat dienen, ausgetauscht wird. Die an der Matritze polymerisieren markierten Nukleotide werden durch eine Bindungsreaktion nachgewiesen, wobei die gegen die Marker (Liganden) gerichteten Binder selbst markiert sind und die Signalintensität dieser Marker in Beziehung zur Aktivität der zu messenden RT steht.
Gewöhnlicherweise handelt es sich bei dem Uganden um ein Hapten, bei dem Binder um einen Antikörper gegen dieses Hapten, wie zum Beispiel Brom oder Digoxigenin in 5-Bromo-2-deoxy-uridin-5-triphosphat (BrdUTP) oder Digoxigenin-11-dUTP und markierten anti-BrdUTP- bzw. anti-Digoxigenin-Antikörpern. Als Marker für die Antikörper werden Enzyme, wie z. B. alkalische Phosphatase oder Peroxidase bzw. Fluorochrome, verwendet. Neben der Hapten-Antikörperreaktion können bei anderen Ligand-Binder-Wechselwirkungen zum Nachweis der Nukleotidpolymerisation Biotin-markierte Nukleotide, wie z. B. Biotinmarkiertes 11-dUTP und Streptavidin-markierte Peroxidase (Biotin-Streptavidin-System), zum Nachweis der RT-Aktivität eingesetzt werden. Da die frei verbliebenen markierten, mit den durch die RT polymerisierten Nukleotiden um die Antikörperbindung konkurrieren, ist die Konzentration der markierten Nukleotide so gering wie möglich zu halten, ohne jedoch einen Substratmangel für die RT zu erzeugen. Das ist in jedem Fall erforderlich, wenn die Menge eingebauter markierter Nucleotide im Anschluß an die RT-Reaktion in einem Ein-Schritt-Zwei-Seiten-Immunoassay nachgewiesen wird. Erfolgt der Nachweis im Zwei-Schritt-Immunoassay, so besteht die Möglichkeit, nach Bindung des Stranges mit den markierten Nukleotiden die noch frei verbliebenen nicht-polymerisierten Nukleotide durch Spülen (Bound/Free[BF)-Trennung) vor der Inkubation der enzym- oder fluorochrom-markierten Antikörper zu entfernen. Die .Entfernung der markierten nicht-polymerisierten Nukleotide erfolgt dadurch, daß die Bindung entweder des Doppelstranges mit inkorporiertem Digoxigenin-11-dUTP oder des Einzelstranges nach alkalischer Hydrolyse oder thermischer Schmelzung (T. Porstmann, T.Ternynck und S.Avrameas: J. Immunol. Methods 82 [1985], 169-179), im Falle des Nachweises von inkorporiertem BrdUTP nach einem anderen Prinzip realisiert wird, z.B. immunologisch über einen Festphaseinsolubilisierten monoklonalen anti-DNA-Antikörper oder über insolubilisiertes methyliertes Rinderserumalbumin bzw. kovalent über Epoxysilan.
Um eine spezifische RT (z. B. die des die menschliche Immunschwäche AIDS verursachenden Retrovirus HIV-1) nachzuweisen, wird vor der eigentlichen RT-Reaktion die reverse Transkriptase aus dem Viruslysat durch einen insolubilisierten anti-HIV-1-RT-Antikörper isoliert. Nach einer Inkubationszeit des Viruslysats in mit monoklonalen anti-HIV-1-RT-Antikörpern beschichteten Kavitäten einer Mikrotiterplatte oder Röhrchen bzw. Kugeln zwischen 60 und 240min (vorzugsweise 90min) bei 20 bis 250C werden alle nicht gebundenen Bestandteile durch Absaugen der Flüssigkeit und mehrmaliges Spülen der Kavitäten, Röhrchen bzw. Kugeln mit Pufferlösungen bekannter Zusammensetzung entfernt. Anschließend wird die RT-Reaktion mit BrdUTP bzw. mit Digoxigenin-11-dUTP in Konzentrationen zwischen 0,005 und 0,05mmol/l (vorzugsweise 0,01 mmol/l) und PoIy(AXdT)10 in Konzentrationen zwischen 0,007 und 0,25 mmol/l (vorzugsweise 0,015mmol/l) über 60-240 min (vorzugsweise 90min) bei 37"C in Pufferlösungen bekannter Zusammensetzung (A.Hoffmann, B. Banapour und A.J. Levy: Virology 147 [1985], 326-335) durchgeführt. Der Reaktionsabbruch erfolgt im Falle des Einbaus von BrdUTP durch Zugabe von 0,4mol/l NaOH. Die Inkubationszeit zur Poly(rA)-Degradation beträgt dabei 5-30min (vorzugsweise 10 min). Nach anschließender Neutralisation durch Zugabe eines 0,5 mol/l Citrat-Phosphatpuffers pH 7,0 erfolgt der Probentransfer in die Immunoassayplatte oder -röhrchen. Hier reagiert der Poly(BrdU)-Strang entweder im sukzessiven Zwei-Schritt-Assay 60-120 min (vorzugsweise 90 min) bei 37°C mit dem insolubilisierten anti-BrdU-Antikörper, gefolgt von einer 60-120minütigen (vorzugsweise 90minütigen) Konjugatinkubation (Peroxidase-markierter anti-BrdU-Antikörper) oder aber im simultanten Ein-Schritt-Assay zusammen mit dem Konjugat und den insolubilisierten Antikörpern über 60 bis 120min (vorzugsweise 90 min) bei 37°C.
Nach gleichem Prinzip läuft der Nachweis des polymerisierten Digoxigenin-dUTP ab, nur daß aufgrund der Zugängigkeit des Digoxigenins für den Peroxidase-markierten anti-Digoxigeninantikörper die alkalische Hydrolyse zur Strangtrennung und Degradation des Poly/rA und anschließende Neutralisation entfällt. Nach Abtrennung der ungebundenen Komponenten erfolgt die Substratreaktion wahlweise mit den Chromogenen ABTS, oPD oder TMB und H2O2 nach bekannten Verfahren (B. Porstmann, T.Porstmann und E.Nugel: J. Clin.Chem. Clin. Biochem. 19 [1981], 435-439; T.Porstmann, B.Porstmann, R.Wietschke, R. von Baehr und E. Egger: J. CMn. Chem. Clin. Biochem. 23 [1985], 41-44). Die Extinktionsbestimmung erfolgt durch Photometric. Das erfindungsgemäße Testbesteck zur Bestimmung der RT-Aktivität ist ein Festphasenimmunoassay, der aus a) festen Phasen, z.B. Mikrotiterplatten oder Röhrchen mit immobilisierten Antikörpern zur Isolation der RT aus einem HIV-1-Lysat und b) festen Phasen (s.o.) mit insolubilisierten Antikörpern zur Bindung des Stranges mit den inkorporierten markierten Nucleosiden, c) Enzym- oder Fluorochrom-markierten Antikörpern (anti-BrdU oder anti-Digoxigenin-Antikörper) zum Nachweis der im Immunokomplex gebundenen markierten polymerisierten Nucleosiden im Ein-bzw. Zwei-Schritt-Assay, d) einem RT-Puffer (Konzentrat mit einem markierten Nukleotid),e) Natronlauge für den Abbruch der Polymerisation und für die Strangtrennung, im Falle des Einsatzes von BrdUTP f) Citrat-Phosphatpuffer (Konzentrat) für die Vorbereitung des Enzymimmunoassays, im Falle des Einsatzes von BrdUTP g) einem Substratgemisch zum Nachweis von Peroxidase, h) einem Stoppreagens für die Peroxidase-Reaktion, i) Verdünnungsmedien für Proben und Konjugate (Konzentrat), j) Waschpuffer (Konzentrat) und k) Kontrollmaterialien, besteht.
Die verwendeten monoklonalen anti-BrdU-Antikörper werden durch Immunisierung von Balb/c-Mäusen mit 5-Brom-2-uridin-Ovalbumin und Immortalisierung ihrer Milzlymphozyten mit Zellen der Mausmyelomzellinie P3X63 HG 8/653 zu den Hybridomzellinien H-CB-Bru 1 und 2, deren Selektion, Züchtung und Aufarbeitung des zellfreien Überstandes gewonnen. Die verwendeten anti-Digoxigenin-Antikörper (Boehringer, Mannheim, BRD) werden nach Angaben des Herstellers eingesetzt.
-3-Ausfuhrungsbeispiefe
1. Methodik
Ein monoklonaler Antikörper gegen RT von HIV-1 (IgG 1), gereinigt durch Ammoniumsulfatpräzipitation, lonenaustauschchromatographie an Mono Q-Sepharose und hydrophober Interaktionschromatographie an Phenyl-Superose wird mit 0,1 mol/l Karbonatpuffer, pH9,5, nach bekanntem Verfahren (K.Ca« und G.W.Traeger, Science 158 [1967], 1570-1572) über Nacht bei 20-250C an die Oberfläche von Polystyrenmikrotiterplatten (Kavitätenvolumen 400 μΙ; Flow Laboratories, Meckenheim, BRD) adsorbiert (Benetzungsvolumen 100 μΙ pro Kavität).
Nach gleichem Verfahren wird ein monoklonaler anti-BrdU-Antikörper (IgG 1), gereinigt nach o.g. Fällungs- und Chromatographieschritten, an die Oberfläche von Polystyrenmikrotiterplatten (Typ: Maxisorb, Nunc, Dänemark) (Benetzungsvolumen ΙΟΟμΙ/Kavität) adsorbiert. Ein monoklonaler anti-DNA-Antikörper (Behri ng werke, Marburg, BRD) und ein anti-Digoxigenin-Antikörper, jeweils eingestellt auf eine IgG-Konzentration von ^^0μg/m) wird an die Oberfläche von Polystyrenmikrotiterplatten (Benetzungsvolumen ΙΟμΙ/Kavität) adsorbiert.
Nach Absaugen der jeweiligen Antikörperlösungen und einmaliger Spülung der Kavitäten mit Aqua dest. erfolgt eine Nachbenetzung der mit anti-RT-Antikörpern beschichteten Polystyrenplatte mit nukleasefreiem Rinderserümalbumin (RSA) (Boehringer, Mannheim, BRD) (Beschichtungskonzentration 10g/l) und 5% (w/v) Saccharose, gelöst in 0,01 mol/l Phosphatpuffer, pH7,2 (Nachbeschichtungslösung) über 60min bei 20-250C. Die mit anti-BrdU-Antikörpern, mit anti-DNA-Antikörpern und mit anti-Digoxigenin-Antikörpern beschichteten Platten werden mit der gleichen Lösung nachbeschichtet, wobei das nukleasefreie RSA gegen RSA reinst (Serva, Heidelberg, BRD) ausgetauscht wird.
Zusätzlich werden Mikrotiterplatten (Flow Laboratories, Meckenheim, BRD; Kavitätenvolumen 400 μΙ) nur mit nukleasefreier RSA-haltiger Nachbeschichtungslösung beschichtet (Benetzungsvolumen 20C^I/Kavität).
Anschließend wird die Flüssigkeit aus den Kavitäten abgesaugt, und die Platten werden 30 min bei 370C mit Luftumwälzung im Brutschrank nachgetrocknet. Vor Testbeginn werden die Kavitäten einer beschichteten Platte einmal mit Waschpuffer (0,01 mol/l Phosphatpuffer, pH7,2,0,3 mol/l NaCI, 0,1 % (v/v) Tween 20) gespült und anschließend trockengesaugt.
2. Beispiele
2.1. Allgemeiner RT-Aktivitätstestzur Bestimmung der HIV-1-RT aus Viruslysat 50,0 μΙ HIV-1-RT enthaltendes Viruslysat, gereinigt aus dem Kulturüberstand HIV-1 infizierten Lymphozyten durch Fällung über Nacht mit 30% (w/v) Polyethylenglycol 6000 (Serva, Heidelberg, BRD), finale Konzentration 10% (w/v), Zentrifugation bei 6000U/min über 10min bei 40C und anschließender Pelletierung des Virus bei 25000U/min über 60 min bei 4°C, welches in 50 mmol/l Tris-HCI, pH 7,8,2 mmol/l Dithiothreitol, 0,2% (v/v) Triton X-100 (Serva, Heidelberg, BRD) und 20% (v/v) bidestilliertem Glycerol aufgenommen wird, werden zusammen mit 50μΙ RT-Puffer folgender Zusammensetzung
| Substanz | finale Konzentration |
| RSA | 0,1 mg/ml |
| BrdUTPIbzw. Digoxigenin-11-dUTP) | 0,015 mmol/l |
| Poly(rA)(dT),e | 0,02 mmol/l |
| Tris/HCI pH 8,1 (Serva) | 50 mmol/l |
| DTT | 5 mmol/l |
| MgCI2 | 5mmöf/l |
| KCI | 150mmol/l |
| EGTA | 0,5 mmol/l |
| Gluthation | 0,3 mmol/l |
| Glycerol | 0,1 % |
| Triton X-100 | 0,05% |
in den nur mit nukleasefreien RSA-beschichteten Platten 90min bei 37°C inkubiert. Im Parallelansatz wird im RT-Puffer das BrdUTP durch Digoxigenin-11-dUTP ausgetauscht (Konzentration 0,015 mmol/l). Anschließend werden für den Nachweis des inkorporierten BrdU δΟμΙ/Kavität 0,4 mol/l NaOH zugegeben, und nach einer Hydrolysezeit von 15 min bei 37 0C wird die Lösung durch Zugabe von 100 μΙ/Kavität 0,5 mol/l Citrat-Phosphat-Puffer, pH 7,0 neutralisiert. 50 μΙ dieser Lösung werden in die mit monoklonalem anti-BrdU-Antikörper beschichteten Mikrotiterplatten dosiert, in deren Kavitäten unmittelbar zuvor 50μΙ Peroxidasemarkierte monoklonale Antikörper, eingestellt auf eine Konzentration von 5g IgG/l, dosiert wurden. Für den Nachweis des inkorporierten Digoxigenin-dUTP werden 50μΙ aus dem Parallelansatz entnommen und in die mit anti-Digoxigenin-Antikörpern beschichteten Kavitäten der Enzymimmunoassayplatte dosiert, in die unmittelbar zuvor 50 μΙ der 1:2000verdünnten Stammlösung peroxidasemarkierter anti-Digoxigenin-Antikörper pipettiert wurden. Nach kurzem Schütteln werden die jeweiligen Reaktionsgemische 120min bei 37°C inkubiert. Anschließend werden die Gemische abgesaugt, und die Kavitäten werden dreimal mit Waschpuffer (0,01 mol/l Phosphatpuffer, pH 7,2; 0,3 mol/l NaCI, 0,1 % (v/v) Tween 20) gewaschen. Nach Abtrennung der ungebundenen Reaktanten erfolgt die Substratreaktion mit o-Phenylendiamin und Wasserstoffperoxid (100 μΙ je Kavität) nach bekanntem Verfahren (T. Porstmann, B. Porstmann, R.Wietschke, R. von Baehr und E. Egger: J. CMn. Chem. Clin. Biochem. 23 [1985], 41-44) durch Zugabe von ΙΟΟμΙ/Kavität. Nach einer Reaktionszeit von 30 min wird die Enzym-Substratreaktion durch Zugabe von ΙΟΟμΙ/Kavität 2,0 mol/l Schwefelsäure gestoppt. Anschließend werden die Kavitäten bichromatisch bei 492 und 690nm vermessen.
2.2. Allgemeiner RT-Aktivitätstest zur Bestimmung von hochgradig gereinigter AMV-RT Hochgradig gereinigte AMV-RT (Boehringer, Mannheim, BRD) wurde mit dem BrdUTP- bzw. Digoxigenin-11-dUTP- und Template-Primer-freien RT-Reaktionspuffer (siehe Beispiel 1) auf eine Volumenaktivität von 0,20 U/ml eingestellt und von hier bis zu einer Aktivität von 0,02 U/ml linear verdünnt.
50 μΙ von den AMV-RT-Lösungen der unterschiedlichen Aktivität wurden zusammen mit 50 μΙ doppelt konzentriertem RT-Reaktionspuffer mit BrdUTP bzw. mit Digoxigenin-11-dUTP- und Template-Primer in den mit nukleasefreiem RSA beschichteten Kavitäten der Mikrotiterplatte inkubiert. Alle übrigen Reaktionsbedingungen gleichen denen von Beispiel 2.1. Von dem AMV-RT-freien RT-Reaktionspuffer wurden 21 Bestimmungen als Leerwertkontrolle durchgeführt. Die Summe aus dem Extinktionsmittelwert dieser Bestimmungen und dessen dreifachen Standardabweichung wurden als untere Nachweisgrenze definiert. Zur Einschätzung der analytischen Empfindlichkeit wurden verschiedene AMV-RT-Konzentrationen 10fach bestimmt und der Extinktionsbereich vom Extinktionsmittelwert x E482Hm ± 3SD ermittelt.
2.3. HIV-1 -spezifischer RT-Aktivitätstest
100 μΙ des geometrisch mit BrdUTP- und Template-Primer-freien RT-Puffer verdünnten Viruslysats werden in die mit dem anti-HIV-1-RT-Antikörper beschichteten Kavitäten der Mikrotiterplatte dosiert und 30-90min bei 37"C inkubiert. Anschließend wird die Lösung abgesaugt, und nicht gebundene Bestandteile werden durch dreimaliges Spülen der Kavitäten mit Waschpuffer entfernt. Für die nachfolgende enzymatische RT-Reaktion werden 100μΙ RT-Puffer (siehe Allgemeiner RT-Aktivitätstest, Beispiel 1) in die Kavitäten dosiert und 90min bei 370C inkubiert. Von diesem Schritt an verläuft der Test weiter wie unter Allgemeiner RT-Aktivitätstest, Beispiel 2.1., beschrieben.
Zur Spezifitätskontrolle des Tests gegenüber HIV-1 assoziierter RT wurde AMV-RT, eingestellt auf eine Volumenaktivität von 50 Einheiten (U)/ml, geometrisch bis zu einer Aktivität von 0,09 U/ml verdünnt. Jeweils 100μΙ dieser Verdünnungen wurden in die mit Anti-HIV-1-RT-Antikörpern beschichteten Kavitäten der Mikrotiterplatten dosiert und 90min bei 37"C inkubiert. Nach Absaugen der Lösung und dreimaligem Spülen der Kavitäten mit Waschpuffer wird der Test wie unter Beispiel 2.1. beschrieben weitergeführt.
3. Ergebnisse
Zu Beispiel 2.1.: HIV-RT läßt sich unter der im Beispiel 2.1. beschriebenen Methode mit BrdUTP bis zu einer Aktivität von 0,20U/ml nachweisen. Mit Digoxigenin-11-dUTP liegt die Nachweisgrenze zwischen 0,05 und 0,10U/ml. Die höhere Empfindlichkeit ist wahrscheinlich durch die Vermeidung der Probenverdünnung durch Hydrolyse und Neutralisation bedingt, wie sie im Falle des BrdUTP-Nachweises im Einzelstrang durch den Zwei-Seiten-Bindungsassay nicht zu umgehen ist (Abb. 2). Zu Beispiel 2.2.: Die untere Nachweisgrenze für AMV-RT liegt bei 0,03 U/ml. Auch hier wird mit dem Nachweis des inkorporierten Digoxigenin-11-dUTP eine doppelt so hohe Empfindlichkeit (0,015 U/ml) erzielt. Die Extinktionen im Immunoassay zum Nachweis von Poly-BrdUTP verhalten sich über den Bereich von 0,02 bis 0,2 U/ml RT linear zur eingesetzten RT-Aktivität (Abb. 1). Die analytische Empfindlichkeit bei der Erfassung der geringsten Differenz zweier unterschiedlicher RT-Konzentrationen beträgt für beide Systeme 0,01 U/ml (Abb. 1).
Zu Beispiel 2.3.: Der HIV-RT-Aktivitätsnachweis ist um den Faktor 5-10 (BrdUTP) und 10-20 (Digoxigenin-11-dUTP) empfindlicher als der Nachweis der RT-Aktivität des gleichen Präparates im Allgemeinen RT-Aktivitätstest, bedingt durch Entfernung von hemmenden Substanzen (PEG) vor der RT-Reaktion (Abb. 2). AMV-RT-Aktivität läßt sich in diesem Test nicht nachweisen, da sie über den anti-HIV-1 RT Antikörper nicht gebunden und demzufolge durch die nachfolgende BF-Trennung vor der RT-Enzymreaktion aus dem Reaktionsgefäß entfernt wurde (Abb. 2).
Claims (6)
- Patentansprüche:1. Verfahren zur Aktivitätsbestimmung reverser Transkriptasen (RT), dadurch gekennzeichnet, daß Hapten-markierte oder substituierte Nukleotidtriphosphate, gegen die sich entweder spezifisch Antikörper herstellen lassen oder die durch andere Binder spezifisch gebunden werden, zur Strangpolymerisation eingesetzt werden und ihr Einbau in einem Bindungstest quantifiziert wird.
- 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die polymerisierten Nukleotide in einem Zwei-Seiten-Assay nachgewiesen werden, in dem bei Verwendung identischer Antikörper als Festphaseantikörper und als markierter Antikörper der gebildete Strang über einen Teil der markierten Nukleotide an den Festphaseantikörper gebunden--wird und der verbleibende Teil durch die markierten Antikörper im jeweiligen Immunoassay nachgewiesen wird.
- 3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß eine Abtrennung der nicht eingebauten тагкіеПѳл Nukleotide durch Substratoptimierung bei der Reaktion derfiT überflüssig wird oder aber im Verlauf eines Zwei-Seiten Zwei-Schritt-Assays realisiert werden kann, wobei die Strangbindung an die feste Phase nicht über eine Interaktion mit den markierten Nukleotiden realisiert wird und letztere nachdem Waschprozeß zur Entfernung der nicht eingebauten markierten Nukleotide voll dem Nachweissystem zur Verfügung steht.
- 4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß ein RT-Puffer Verwendung findet, derjieben RSA, Poly(rA)dTi8,TrisHGI, DTT, MgGI2, KCbEGTA/ Glutathion, Glycerorund Triton Χ-10Ό zusätzlich ein haptenisiertes Nukleotid enthält, wogegen spezifische Antikörper oder andere Binder verfügbar sind.
- 5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die RT-Aktivität des HIV-1 gemessen wird, indem die RT aus einem HIV-1-Lysat vor der RT-Reaktion durch einen insolubilisierten anti- ^IVrirRT-AntikörpeciisoMeitvvirdund andere, die RT-Reaktion störende Substanzen vor derRT-Reaktion eliminiert werden können.
- 6. TestbesteckzurAktivitätsbestimmung reverser Transkriptasen (RT), dadurch gekennzeichnet, daß es aus a) festen Phasen, wie Mikrotiterplatten oder Röhrchen bzw. Kugeln mit immobilisierten anti-HIV-1-RT-Antikörpern,b) festen Phasen gern; a) mit insolubilisierten Antikörpern zur Bindung des Einzel· bzw. PoppeJstranges,c) markierten Antikörpern gegen die haptenisierten Nukleotide, d) einem RT-Pufferkonzentrat mit dem entsprechenden haptenisierten Nukleotid, e) einem ,Substratgemisch für die Enzymreaktion, f) einem Stoppreagens zum Abbruch der Enzymreaktion, g) Verdünnungsmedien für Proben und Konjugate, h) Waschpuffer, i) Kontrollmaterialien—und im Falle der Einzelstrangherstellung j) Natronlauge Und k) Citrat-Phosphatpuffer-besteht.
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EP | Request for examination under paragraph 12(1) filed | ||
| RPI | Change in the person, name or address of the patentee (searches according to art. 11 and 12 extension act) | ||
| AUF | Maintained (sect. 12/3 extension act | ||
| B5 | Patent specification, 2nd publ. accord. to extension act | ||
| RPV | Change in the person, the name or the address of the representative (searches according to art. 11 and 12 extension act) |