DD293368A5

DD293368A5 - Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper gegen das Glykolyseenzymneuronenspezifische Enolase

Info

Publication number: DD293368A5
Authority: DD
Publication date: 1991-08-29

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikoerpern (mAk) gegen das Glykolyseenzym Neuronenspezifische Enolase (NSE). Die Fusion der Milzzellen von Balb/c-Maeusen auch Immunisierung mit Ferritin-gekoppelter NSE (NSE-Ferritin) mit Maus-Myelomzellen fuehrt zu dem Hybridom H-FDM-N-1D23 (ZIM-0514), aus dem die entsprechenden mAk gewonnen werden. Das Anwendungsgebiet der Erfindung ist die medizinische Diagnostik.{Antikoerper; monoklonale Antikoerper; mAk; Glykolyseenzym; Neuronenspezifische Enolase; NSE; Immunisierung mit NSE-Ferritin; Fusion; Milzzellen; Maus-Myelonzellen; Hybriden; H-FDM-N-1D23 (ZIM-0514); Medizin; Diagnostik}

Description

Erfindungsgemäß erfolgt die Immunisierung durch i.p.-lnjektion von Balb/c-Mäusen mit Pferdemilzferritin-gekoppelter NSE

über einen Zeitraum von einem Jahr. 4 Tage vor Hybridisierung wurden abermals 70μς NSE i.v. appliziert.

Das erfindungsgemäß hergestellte Hybridom H-FMD-N-1D23 wurd> ι in der ZIM-Hinterlegungsstelle - Zentralinstitut für Molekularbiologie der AdW der DDR, Berlin-Buch (ZIM) - unter der Wr. ZIM-FMD-N-1D23 (ZIM-0514) hinterlegt. Die Erfindung soll nachstehend durch Beispiele näher erläutert werden. Ausfuhrungsbelsplele

1. Herstellung der Hybridoma

BALB/c-Mäuse werden durch i.p.-lnjektion von 700 μρ an mit Pferdemilzferritin gekoppelter NSE in komplettem Freundschen Adjuvans über einen Zeitraum von 1 Jahr immunisiert. 4 Tage vor der Hybridisierung werden 70μρ reiner NSE i.v. appliziert. Die Fusion der Milzzellen einer Maus erfolgt mit Maus-Plasmozytomzellen X63/Ag 8.653 nach bekannten Verfahren (Goding, W. G.: J. Immunol. Meth. 39 [1980] 285).

2. Das Screening der Antikörper aus der Kulturflüssigkeit erfolgt durch Enzymimmunoassay (NSE an die feste Phase gebunden; zweite Immunreaktion mit peroxidasemarkiertem Antiserum gegen Maus-Immunglobulin von 10 bis 12 Tage nach der Fusion.

3. Die Eigenschaften des von dem erhaltenen Hybridklon produzierten monoklonalen Antikörpers sind in der Tabelle aufgeführt:

Monoklonaler Immunglobulin- Dissoziations- Spezifität Antikörper klasse kostante zuEnolase-UE FMD-N-1D23 IgGI 5 ±1,8 χ ΙΟ"¹⁰ Mol/l Gamma

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern (mAk) gegen das Glykolyseenzym Neuronenspezifische Enolase (NSE) durch Immunisierung von BALB/c-Mäusen mit NSE-Ferritin, Fusion ihrer Milzzellen mit Maus-Myelomzellen, Selektion der antikörperproduzierenden Hybridzellen mittels immunchemischer Testverfahren und Weitelvermehrung derHybridzellklone durch Kultivierung bzw. Transplantation auf Mäusen in der Aszitesform, dadurch gekennzeichnet, daß zur Kultivierung bzw. Transplantation der Klon H-FMD-N-1D23 (ZIM-0514) eingesetzt und aus dem zellfreien Kulturüberstand der mAK FMD-N-1D23 isoliert wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Isolierung der Milzzellen erfolgt, nachdem das Antigen Balb/c-Mäusen über einen Zeitraum von 1 Jahr in Abständen von 4-6 Wochen i. p. appliziert wird und die letzte Gabe des Antigens 4 Tage vor der Milzentnahme erfolgt.

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper (mAk) gegen das Glykolyseenzym Neuronensiezifische Enolase (NSE). Diese mAk eignen sich für Testsysteme zum Nachweis der NSE, wie sie zur Diagnose und Monitoring von Patienten mit ((!einzeiligem Lungenkarzinom, pädiatrischem Neuroblastom und nsuroendokrinen Tumoren eingesetzt werden. Das Anwendungsgebiet der Erfindung ist die medizinische Diagnostik.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Das Glykolyseenzym Enolase (2-Phospho-D-Glycerathydratase, E. C. 4.2.1.11) ist ein dimeres Protein, das aus drei immunologisch verschiedenen Untereinheiten (alpha, beta, gamma) besteht. Neuronenspezifische Enolase, die gamma· Untereinheit, kommt in hoher Konzentration nur in Neuronen (Schmechel, D., P. J. Marangos, A. P. Zis, M. W. Brightman, F. K. Goodwin: Science 199 (1978) 313) und neuroendokrinen Zellen (Schmechel, D., PJ. Marangos, M.W. Brightman: Hybridoma 4 [1978] 13) vor und wird von neuroendokrinon Tumoren produziert (Tapia, F. J., J. M. Marangos, C. Dermody, A. G. E. Pearse: Lanceti [1981J 808). Die Herstellung monoklonaler Antikörper ist ein durch Köhler und Milstein beschriebenes Verfahren (Nature 256 (1975) 495). Den genannten Autoren gelang es durch somatischo Fusion von murinen antikörperproduzierenden Zellen und Zellen einer permanent wachsenden Plasmozytomzellinis Hybridoma zu erzeugen, die nach verschiedenen Klonierungsschritten monoklonale Antikörper murinen Ursprungs gegen eine gewünschte Antigenspezifität produzieren. Mit dieser prinzipiellen biotechnologischen Lösung sind bereits auch monoklonale Antikörper gegen Neuronenspezifische Enolase erzeugt worden (Haan, E.A., B.D. Boss, M.W. Cowan: Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 79 [1982) 7585: Kimura, S.T., K. Hayano, K. Kato: Biochem. Biophys. Acta, 799 [1984] 252; Seshi, B., CB. Bell jr.: Hybridoma, 4 [1985] 13; Soler Federsspiel, B.S., P. Crass, J. Gheuens, D. Andries, A. Lowenthal, J. Neurochem. 48 [1987] 22), um sie als Zellmarker bzw. für Immunoassays zur Quantifizierung der NSE in biologischem Material einzusetzen.

Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung besteht darin, für die medizinische Diagnostik monoklonale Antikörper zur Verfugung zu stellen, die für den Aufbau von Testsystemen zum Nachweis Neuronenspezifischer Enolase geeignet sind.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zu entwickeln, mit dem zunächst eine Hybridomzellinie erzeugt werden kann, von der in anschließenden Verfahrensschritten murine mAk gewonnen werden können, die gegen die NSE gerichtet sind. Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß Balb/c-Mäuse mit NSE-Ferritin immunisiert werden, ihre Milzzellen mit Maus-Myelomzellen fusioniert, antikörperproduzierende Hybridzellen mittels immunchemischer Testverfahren selektiert, geeignete Hybridzellklor.e weitervermehrt, das Hybridom H-FMD-N-1D23 (ZIM-0514) etabliert, zur Kultivierung eingesetzt und aus dem zellfreien Kultu· überstand der mAk FMD-N-1D23 isoliert wird.

Bei dem erf indungsgemauen Verfahren werden die zunächst erhaltenen Hybridome in Mikrotiterplatten kultiviert. Der Nachweis antikörperproduzierender Hybridome erfolgt mit einem Immunoassay. Die spezifischen antikörperproduzierenden Hybridome werden kloniert, weitervermehrt und gegebenenfalls nach Lagerung in flüssigem Stickstoff erfindungsgemäß zur Produktion der monoklonalen Antikörper eingesetzt. Die Produktion der monoklonalen Antikörper erfolgt entweder in vitro in Zellkultur als Monolayer- und Rollerkultur oder in vivo in Aszitesflüssigkeit nach Transplantation der spezifischen Hybridomzellen in BALB/c-Mäusen und/oder deren Hybride. Der monoklonale Antikörper FMD-N-1D23 gehört der Immunglobulinklasse IgG 1 an. Die spezifische Bindung an NSE erfolgt mit einer Dissoziationskonstante von 5+/-1,8 χ 1 CT¹⁰MoI/!. Immunhistochemisch reagiert der Antikörper in ZNS Schnitten ausschließlich mit Neuronen, nicht mit Glia- oder Ependymzellen. Die Testung von FMr N-1D23 im Enzymimmunoassay gegen die verschiedenen Untereinheiten der Enolase erbrachte keine Reaktionen mit alpha- bzw. beta-Enolase, womit eine absolute Spezifität des FMD-N-1D23 auf gamma-Enolaso gesichert ist. Der Antikörper reagiert mit einem identischen Epitop der NSE von Ratte und Mensch, er reagiert wesentlich schwächer mit NSE vom Schwein. FMD-N-1 D23 eignet sich zur Bestimmung von NSE im Serum. FMD-N-1 D23 ist in 2-Seiten-Enzymimmunoassay prinzipiell entweder nur als Festphase-Ak oder nur als Konjugat-Ak einsetzbar.