DD293368B5 - Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikoerper gegen das Glykolyseenzym Neuronenspezifische Enolase - Google Patents
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Description
Anwendungsgebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper (mAk) gegen das Glykolyseenzym Neuronenspezifische Enolase (NSE). Diese mAk eignen sich für Testsysteme zum Nachweis der NSE, wie sie zur Diagnose und Monitoring von Patienten mit !(!einzeiligem Lunyenkarzinom, pädiatrischem Neuroblastom und neuroendokrinen Tumoren eingesetzt werden. Das Anwendungsgebiet der Erfindung ist die medizinische Diagnostik.
Charakteristik des bekannten Standes der Technik
immunologisch verschiedenen Untereinheiten (alpha, beta, gamma) besteht. Neuronenspezifische Enolase, die gamma-Untereinheit, kommt in hoher Konzentration nur in Neuronen (Schmechel, D., PJ. Marangos, A. P. Zis, M.W. Brightman, F.K. Goodwin: Science 19911978] 313) und neuroendokrinen Zellen (Schmechel, D., P. J. Marangos, M.W. Brightman: Hybridoma 4 [1978113) vor und wird von neuroendokrinen Tumoren produziert (Tapia, F. J., J. M. Marangos, C. Dermody, A. G. E. Pearse: Lanceti [1981 ] 808). Die Herstellung monoklonaler Antikörper ist ein durch Köhler und Mil.stein beschriebenes Verfahren (Nature 256 [1975] 495). Den genannten Autoren gelang es durch somatische Fusion von murinen antikörperproduzierenden Zellen und Zellen einer permanent wachsenden Plasmozytomzellinie Hybridoma zu erzeugen, die nach verschiedenen Klonierungsschritten monoklonal Antikörper murinen Ursprungs gegen eine gewünschte Antigenspezifität produzieren. Mit dieser prinzipiellen biotechnologischen Lösung sind bereits auch monoklonal Antikörper gegen Neuronenspezifische Enolase erzeugt worden (Haan, E.A., B.D. Boss, M.W. Cowan: Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 79 [1982] 7585: Kimura, S.T., K. Hayano, K. Kato: Biochem. Biophys. Acta, 799 [1984] 252; Seshi, B., C.B. Bell jr.: Hybridome,4 [1985] 13; Soler Federsspiel, B.S., P. Crass, J. Gheuens, D. Andries, A. Lowenthal, J. Neurochem. 48 [1987] 22), um sie als Zellmarker bzw. für Immunoassays zur Quantifizierung der NSE in biologischem Material einzusetzen.
Ziel der Erfindung
Das Ziel der Erfindung besteht darin, für die medizinische Diagnostik monoklonal Antikörper zur Verfügung zu stellen, die für den Aufbau von Testsystemen zum Nachweis Neuronenspezifischer Enolase geeignet sind.
Darlegung des Wesens der Erfindung
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zu entwickeln, mit dem zunächst eine Hybridomzellinie erzeugt werden kann, von der in anschließenden Verfahrensschritten murine mAk gewonnen werden können, die gegen die NSE gerichtet sind. Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß Balb/c-Mäuse mit NSE-Ferritin immunisiert werden, ihre Milzzellen mit Maus-Myelomzellen fusioniert, antikörperproduzierende Hybridzellen mittels immunchemischer Testverfahren selektiert, geeignete Hybridzellklone weitervermehrt, das Hybridom H-FMD-N-1 D23 (ZIM-0514) etabliert, zur Kultivierung eingesetzt und aus dem zellfreien Kulturüberstand der mAk FMD-N-1D23 isoliert wird.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden die zunächst erhaltenen Hybridome in Mikrotitorplatten kultiviert. Der Nachweis antikörperproduzierender Hybridome erfolgt mit einem Immunoassay. Die spezifischen antikörperproduzierenden Hybridome werden kloniert, weitervermehrt und gegebenenfalls nach Lagerung in flüssigem Stickstoff erfindungsgemäß zur Produktion der monoklonalen Antikörper eingesetzt. Die Produktion der monoklonalen Antikörper erfolgt entweder in vitro in Zellkultur als Monolayer- und Rollerkultur oder in vivo in Aszitesflüssigkeit nach Transplantation der spezifischen Hybridomzellen in BALB/c-Mäusen und/oder deren Hybride. Der monoklonale Antikörper FMD-N-1D23 gehört der Immunglobulinklasse IgG 1 an. Die spezifische Bindung an NSE erfolgt mit einer Dissoziationskonstante von 5 +/-1,8 x 1(T10MoI/!.
Immunhistochemisch reagiert der Antikörper in ZNS Schnitten ausschließlich mit Neuronen, nicht mit Glia- oder Ependymzellen. Die Testung von FMD-N-1 D23 im Enzymimmunoassay gegen die verschiedenen Untereinheiten der Enolase erbrachte keine Reaktionen mit alpha- bzw. beta-Enolase, womit eine absolute Spezifität des FMD-N-1 D23 auf gamma-Enolase gesichert ist. Der Antikörper reagiert mit einem identischen Epitop der NSE von Ratte und Mensch, er reagiert wesentlich schwächer mit NSE vom Schwein. FMD-N-1 D23 eignet sich zur Bestimmung von NSE im Serum. FMD-N-1 D23 ist in 2-Seiten-En7ymimmunoassay prinzipiell entweder nur als Festphase-Ak oder nur als Konjugat-Ak einsetzbar.
Erfindungsgemäß orfolgt dis Immunisierung durch i.p.-Injektion von Balb/c-Mäusen mit Pferdemilzferritin-gekoppelter NSE über einen Zeitraum von einem Jahr. 4 Tage vor Hybridisierung wurden abermals 70μρ NSE i.v. appliziert, Das erfindungsgemäß hergestellte Hybridom H-FMD-N-1D23 wurde in der ZIM-Hinterlegungsstelle - Zentralinstitut für Molekularbiologie der AdW der DDR, Berlin-Buch (ZIM) - unter der Nr. ZIM-FMD-N-1D23 (ZIM-0514) hinterlegt. Die Erfindung soll nachstehend durch Beispiele näher erläutert werden.
Ausführungsbelspiele
1. Herstellung der Hybridoma
BALB/c-Mäuse werden durch i.p.-lnjektion von 700 μ9 an mit Pferdemilzferritin gekoppelter NSE in komplettem Freundschen Adjuvans über einen Zeitraum von 1 Jahr immunisiert. 4 Tage vor der Hybridisierung werden 70\ig reiner NSE i.v. appliziert. Die Fusion der Milzzellen einor Maus erfolgt mit Maus-Plasmozytomzellen X 63/Ag 8.653 nach bekannten Verfahren (Goding, W.G.: J. Immunol. Meth. 39 (1980) 285).
2. Das Screening der Antikörper aus der Kulturflüssigkeit orfolgt durch Enzymimmunoassay (NSE an die feste Phase gebunden; zweite Immunreaktion mit peroxidasemarkiertem Antiserum gegen Maus-Immunglobulin von 10 bis 12 Tage nach der Fusion.
3. Die Eigenschaften des von dem erhaltenen Hybridklon produzierten monoklonalen Antikörpers sind in der Tabelle aufgeführt:
Monoklonaler Immunglobulin- Dissoziations- Spezifität
Antikörper klasse kostante zuEnolase-UE
FMD-N-1D23 IgGI 5 ±1,8 χ ΙΟ"10Mol/l Gamma
Claims (2)
1. Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern (mAk;) gegen das Glykolyseenzym
Neuronenspezifische Enolase (NSE) durch Immunisierung von BALB/c-Mäusen mit NSE-Ferritin, Fusion ihrer Milzzellen mit Maus-Myelomzellen, Selektion der antikörperproduzierenden Hybridzellen mittels immunchemischer Testverfahren und Weitervermehrung der Hybridzellklone durch Kultivierung bzw. Transplantation auf Mäusen in der Aszitesform, dadurch gekennzeichnet, daß zur Kultivierung bzw. Transplantation der Klon H-FMD-N-1D23 (ZIM-0514) eingesetzt und aus dem zellfreien Kulturüberstand der mAK FMD-N-1D23 isoliert wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Isolierung der Milzzellen erfolgt, nachdem das Antigen Balb/c-Mäusen über einen Zeitraum von 1 Jahr in Abständen von 4-6 Wochen i. p. appliziert wird und die letzte Gabe des Antigens 4 Tage vor der Milzentnahme erfolgt.
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