DD294276A5 - Verfahren zur verringerung der zahl an fremdkeimen bei der kultivierung von mikroorganismen - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Kultivierung von Mikroorganismen, das zur Erzeugung mikrobieller Biomasse oder speziellen Verbindungen angewandt werden kann. Erfindungsgemaesz wird zur Kultivierung ein nitratverwertender Mikroorganismus eingesetzt, als einzige Stickstoffverbindung Nitrat in den Fermentor dosiert und ein p H-Wert gleich/groeszer 3 eingestellt. Die Kultivierung kann diskontinuierlich, semikontinuierlich oder kontinuierlich durchgefuehrt werden.{Kultivierung; Fremdkeime; Nitrat; Salzgehalt; Biomasse; Umwelt}
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Kultivierung von Mikroorganismen auf der Basis verschiedener Rohstoffe. Sie kann zur Gewinnung mikrobieller Biomasse und mikrobiell erzeugter Substanzen angewandt werden.
Die Erzeugung mikrobieller Biomasse und Substanzen erfolgt im industriellen Maßstab nur dann erfolgreich, wenn definierte Prozeßbedingungen eingehalten werden können. Aus diesem Grund sind Fremdkeime bei mikrobiologischen Verfahren unerwünscht, da diese den ursprünglich eingesetzten Mikroorganismus verdrängen können bzw. Prozeßstörungen bewirken. Um dies zu verhindern, werden zahlreiche mikrobiologische Verfahren unter sterilen Bedingungen durchgeführt. Der Nachteil dieser Verfahren liegt in den hohen ökonomischen Aufwendungen für die Sterilisation der Luft, der Nährlösung, der Substrate und für die Aufrechterhaltung des sterilen Zustandes während der Kultivierung (Apparate-Aufwand).
Werden demgegenüber mikrobielle Verfahren unsteril betrieben, so treten Fremdkeime -uf, die, wenn sie eine bestimmte Zahl erreichen, die Ausbeute des Verfahrens reduzieren und die Qualität der herzustellenden F rodukte beeinträchtigen bzw. eine weitere Prozeßführung sogar verhindern.
Zur Lösung des Problems ist ein Verfahren bekannt, DT-PS 2645386, bei dem durch Zufügen von Monoperschwefelsäure Fremdkeime inaktiviert werden. Dieses Verfahren hat den Nachteil, daß die Wirksamkeit sehr begrenzt ist (auf wenige Bakterien), zu einer beträchtlichen Salzbelastung des Wassers führt und das Verfahren durch den Zusatzstoff ökonomisch stark belastet. Weiter ist bekannt, Infektionen durch kurzzeitiges Absenken des pH-Wertes zu reduzieren (W.Swyzen, Zuckerind. 11211987], 955). Diese Verfahrensweise hat den Nachteil, daß sie nicht sehr wirksam ist, indem das Wachstum der Fremdkeime in den meisten Fällen nur kurzzeitig gehemmt wird. Auch eine ständige Absenkung des pH-Wertes, wie z. B. bei der Kultivierung von Hefen auf der Basis von Schlempe (R. Braun, J. Meyroth, die Branntweinwirtschaft 121 [1981], 102) bewirkt keine Lösung d3s Problems. Aufgrund der großen Menge an Schwefelsäure zur Absenkung des pH-Wertes wird bei diesem Verfahren sowohl die Hefebiomasse als auch das Wasser so stark mit Salz belastet, daß dies zu einer erheblichen ökonomischen Belastung des Verfahrens führt.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, durch spezielle Kultivierungsbedingungen die Zahl der Fremdkeime bei der Kultivierung von Mikroorganismen zu verringern.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß zur Kultivierung nitratverwertende Mikroorganismen eingesetzt werden, Nitrat als alleinige Stickstoffverbindung in den Fermentor dosiert und ein pH-Wert gleich/größer 3 eingestellt wird. Die Vorfahrensweisu ist im einzelnen folgende:
Zur Kultivierung, die man diskontinuierlich, semikontinuierlich oder kontinuierlich durchführt, werden Mikroorganismen, Pilze, Hefen oder Bakterien, eingesetzt, die in der Lage sind, Nitratstickstoff zu verwerten. Der Nitratstickstoff wird in Form von Salpetersäure gemeinsam mit der Nährlösung in den Fermentor dosiert. Es können aber auch die Salze der Salpetersäure, außer dom Ammoniumsalz, verwendet werden. Als Kohlenstoffverbindungen werden Kohlenhydrate (z. B. Glucose, Fructose, Saccharose, Melasse und technische Zuckerlösungen), Alkohole (z.B. Methanol und Ethanol) und organische Säuren (z.B. Essigsäure) eingesetzt. Geeignete Substrate stellen auch bei bestimmten industriellen Verfahren anfallenden Abwässer wie z. B. Schlempe, Sulfitablauge und Molke dar. Der der verwertbare Kohlenstoffgehalt dieser, Abwässer oft zu gering ist, um den Sauerstoffeintrag moderner Fermentoren auszuschöpfen, hat es sich mitunter als zwei kmäßig erwiesen, den verwertbaren Kohlenstoffgehalt durch Zusätze zu erhöhen.
Die Kultivierung führt man bei einem pH-Wert von gleich/größer 3 durch, wobei der konkrete pH-Wert vom jeweils vorliegenden mikrobiologische System und der tolerierbaren Zahl an Fremdkeimen abhängig ist. Die Nährsalzlösung wird wie üblich hergestellt und entsprechend dem Nährsalzbedarf dar Mikroorganismen dosiert. Der erforderliche Sauerstoff wird dem Fermentor mittels Luft, reinem Sauerstoff oder mit Sauerstoff angereicherter Luft zugeführt.
Bei besonders hoher Belastung der Luft mit Fremdkeimer; hat es sich als günstig herausgestellt, diese vorher zu sterilisieren. Unter den dargelegten Bedingungen erhält man bei der Kultivierung eine Mikroorganismensuspension, die wenig Fremdkeime enthält, so daß eine stabile Kultivierung möglich ist. Auch bezüglich der Salzbelastung können in einigen Fällen wesentliche Verbesserungen erreicht werden, beispielsweise bei der Kultivierung von Hefen auf der Basis von Schlempe. Nimmt die Zahl der Fremdkeime dennoch, z. B. infolge von Prozeßstörungen, zu, so hat sich folgende weitere Ausgestaltung der oben dargelegten Verfahrensweise als geeignet erwiesen. Zusätzlich xu den bereits genannten Maßnahmen wird der pH-Wert um mindestens eine Einheit gesenkt und/oder die Frementations-Temporatur um mindestens 5°C erhöht, bis eine ausreichende Inaktivierung der Fremdkeime erreicht ist. Anschließend werden die ursprünglichen Werte wieder eingestellt. Für Verfahren, die eine große Sicherheit bezüglich der Einhaltung einer möglichst niedrigen Zahl an Fremdkeimen benötigen, hat es sich als günstig herausgestellt, die genannte pH-Wert-Absenkung und/oder Temperaturerhöhung vorbeugend in einem bestimmten Rhythmus, also periodisch, durchzuführen. Die Intervalle für diese periodischen Änderungen hängen vom jeweiligen mikrobiologischen System in Verbindung mit seinem Umfeld ab und müssen daher empirisch ermittelt werden.
Ausführungsbeispiele
a) In einem Laborfermentor mit einem Bruttovolumen von 151 und einem Masseinhalt von 5kg wurde die Kultivierung einer Hefe unter folgenden Bedingungen durchgeführt:
Hefe: Candida utilis
Temperatur: 32°C
pH-Wert: 5,0
Verweilzeit: 4h
Begasung: 400l/h (Luft, nicht steril)
Stickstoffversorgung: HNO3 (wird der Nährsalzlösung zugemischt, so daß N-Versorgung der Hefezellen gewährleistet ist) Substrat: Saccharose
Nährsalzlösungskonzentrat:
| KH2PO4 | 35,0g/l | ZnCI2 | 0,322g/l |
| H3PO4 80% | 48,3 ml/l | AI2SO4-18H2O | 0,186 g/l |
| MgSO4-7H2O | 25,0 g/l | NiSO4-7H2O | 0,109g/l |
| MnSO4-4H2O | 1,833 g/l | Na2MoO4-2H2O | 0,041 g/l |
| FeCI2-4H2O | 1,201 g/l | CoSO4-7H2O | 0,036g/l |
| H3BO3 | 1,286 g/l | ||
| CuSO4-5H2O | 0,786g/l |
(von diesem Konzentrat wurde eine adäquate Menge zur Versorgung der Hefen eingesetzt)
Die Kultivierung wurde wie folgt durchgeführt: In einer sterilen Vorkultivierung wurde eine ausreichende Menge der oben genannten Hefe hergestellt, im Batch-Verfahen weiter angereichert und anschließend unter nicht sterilen Bedingungen kontinuierlich kultiviert.
Unter Einhaltung der genannten Kultivierungsbedingungon wurden dem Fermentor 215g/h einer 30-%-Saccharoselösung und 135g/h eines Gemisches, bestehend aus Nährsalzlösung mit zugemischter Salpetersäure und Wasser, zugeführt, so daß eine Verdünnugsrate von D = 0,25h"1 realisiert werden konte. Unter diesen Bedingungen wurde eine Produktivität von 7g Hefentrockenmasse/kg erreicht.
Zur Kontrolle der Fremdkeime wurden täglich 3 Untersuchungen mittels Plattentests durchgeführt.
Ergebnis:
(Angabe = Anzahl Bakterienkolonien je 100 Hefekolonien) nach 5 Tagen Kultivierung: 3 nach 7 Tagen Kultivierung: 3
b) Parallelversuch zur Demonstration dos Effektes
Es wurde ein Parallelversuch mit veränderter Stickstoffversorgung, aber sonst gleichen Bedingungen durchgeführt. Anstelle von Salpetetsäure wurde Ammoniak eingesetzt.
Ergebnis:
nach 1 Tag Kultivierung: 28
nach 2 Tagen Kultivierung: 510
nach 3 Tagen Kultivierung: Die Kultivierung mußte wegen einer Bakterien-Infektion abgebrochen werden.
a) In einem Laborfermentor mit einem Bruttovolumen von 151 und einem Masseinhalt von 4kg wurde die Kultivierung einer Hefe unter folgenden Bedingungen durchgeführt:
Hefe: Candida utilis Temperatur: 320C pH-Wert: 4,5 Verweilzeit: 4h Begasung: 2501 Luft/h (nicht sterilisiert) Stick§toffversorgung: HNO3 Substrat: Schlempe aus einer Ethanol-Gärung Nährsalzlösung entsprechend Beispiel 1
Die Kultivierung wurde wie folgt durchgeführt: In einer sterilen Vorkultivierung mittels Schüttelkolben wurde eine ausreichende Hefemenge erzeugt, im Batch-Verfahren weitergozüchtet und anschließend kontinuierlich unter unsterilen Bedingungen kultiviert. Unter Einhaltung der genannten Parameter wurde dem Fermentor ein Gemisch, bestehend aus Schlempe und Nährsalzlösung, in einer Menge von 10OCg/h zugeführt, so daß die Verdünnungsrate D = 0,25 h~' betrug. Die Schlempe wurde unverdünnt eingesetzt. Unter diesen Bedingungen erhielt man eine Konzentration von 15,8g Hefetrockensubstanz/kg Fermentorablauf, was einer Produktivität von 3,95g Hefetrockenmasse/kg h entspricht. Die Kontrolle der Fremdkeime erfolgt wieder mittels Plattentest. Als Maß für den Salzgehalt wurde die Sulfatkonzentration verwendet (Angabe in g SO4 2~/kg separierter Fermentorablauf) Ergebnisse:
1. Fremdkeime
nach 5Tagen Kultivierung: nach 7 Tagen Kultivierung:
2. Salzkonzentration: 1,6g/kg
b) Parallelversuch zur Demonstration des Effektes
Es wurde ein Parallelversuch mit veränderter Stickstoffversorgung und pH-Wert, aber sonst gleichen Bedingungen durchgeführt. Anstelle der Salpetersäure wurde Ammoniak eingesetzt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefaßt.
| Kultivierungsdauer | pH-Wert | Fremdkeime | Salzkonzentration |
| 2Tago | 4,5 | 148 | 2,8 |
| 5Tage | 4,5 | 950 | 2,8 |
| 2 Tage | 4,0 | 87 | 12,6 |
| 5 Tage | 4,0 | 680 | 12,6 |
| 2 Tage | 3,5 | 19 | 15,1 |
| 5 Tage | 3,5 | 80 | 15,1 |
Die Werte in der Tabelle zeigen deutlich die Unvereinbarkeit zwischen fremdkeimarmer Kultivierung und Reduzierung der Umweltbelastung mit Salz bei Anwendung der üblichen Kultivierung von Mikroorganismen am Beispiel des Substrates Schlempe.
In einem Laborfermentor mit einem Bruttovolumen von 151 und einem Masseinhalt von 5kg wurde die Kultivierung einer Hefe unter folgenden Bedingungen durchgeführt:
Hefe: Candida utilis Temperatur: 32°C pH-Wert: 4,0 Verweilzeit: 4 h Begasung: 4501 Luft/h (nicht sterilisiert) Stickstoffversorgung: HNO3 Substrat: Schlempe mit Zusatz von Melasse
Die Anzucht der Hefe erfolgte gemäß Beispiel 1. Unter Einhaltung der obengenannten Parameter wurde dem Fermentor ein Gemisch, bestehend aus Schlempe (80 Ma.-%), Melasse (4 Ma.-%) und Nährsalzlösung, in einer Menge von 1250g/h zugeführt. Der unter diesen Bedingungen erhaltene Fermentorablauf enthielt 24g Hefetrockensubstanz/kg, was einer Produktivität von 6 g Hefet.ockensubstanz/kg h entspricht. Die Zahl der Fremdkeime betrug:
nach 2 Tagen 4 nach 5 Tagen 7 nach 7 Tagen 8
Die Kultivierung wurde gemäß Beispiel 2 durchgeführt, wobei jedoch aufgrund eines Pumpenausfalls die Kultivierung für 6h unterbrochen werden mußte. Danach ergab eine mikroskoische Untersuchung, daß eine Infektion erfolgt war. Diese wurde folgendermaßen beseitigt:
Der pH-Wert wurde sofort nach der mikroskopischen Feststellung der Infektion um eine Einheit auf 3,5 mittels Schwefelsäure abgesenkt (für 8h).
Ergebnis:
Zahl der Fremdkeime 4
Durch periodisches Absenken des pH-Wertes alle 48h um eine Einheit konnte die Zahl der Fremdkeime über einen Zeitraum von 2 Wochen kleiner als 10 gehalten werden.
Beisplel5
In einem Laborfermentor mit einem Bruttovolumen von 151 und einem Masseinhalt von 4 kg wurde die Kultivierung eines Pilzes folgendermaßen durchgeführt:
Pilz: Aspergillus niger Temperatur: 30°C pH-Wert: 4,0
Begasung: 300I Luft/h (nicht sterilisiert) Substrat: Glucose Stickstoffversorgung: HNO3 Nährsalzlösung: entsprechend Beispiel 1 Ergänzung: Zugabe von Maisquell-Wasser
Die Anzucht des Myzels erfolgte in einer Vorfermentation unter sterilen Bedingungen. Die weitere Kultivierung wurde als Fed-Batch unter unsterilen Bedingungen über einen Zeitraum von 55h durchgeführt, wobei eine Konzentration von 19,8g Trockensubstanz/kg am Ende der Kultivierung vorlag.
Das Pilzmyzel wurde durch Filtration von der wäßrigen Phase abgetrennt und anschließend im Filtrat mittels Plattentests die Zahl der Fremdkeime bestimmt.
Ergebnis:
2 x 108 Keime je g TS (Fremdkeime: Hefen)
In einem Parallelversuch wurde anstelle von Nitrat-Stickstoff Ammoniak zur Stickstoff-Versorgung der Zellen eingesetzt und unter sonst gleichen Bedingungen kultiviert. Nach 18h mußte die Kultivierung infolge einer Bakterieninfektion abgebrochen werden.
In einem Laborfermentor mit einem Bruttovolumen von 151 und einem Masseinhalt von 4 kg wurde die Kultivierung eines Pilzes folgendermaßen durchgeführt:
Pilz: Aspergillus niger
Temperatur: 30°C
pH-Wert: 3,8
Begasung: 300I Luft/h (sterilisiert)
Substrat: Schlempe
Stickstoffversorgung: HNO3
Nährsalzlösung: entsprechend Beispiel 1
Die Anzucht des Myzels erfolgte in einer Vorfermentation unter sterilen Bedingungen. Die Kultivierung wurde danach unter unsterilen Bedingungen (außer Luft) als Batch über einen Zeitraum von 30h durchgeführt, wobei eine Konzentration von 10,8g Trockensubstanz/kg am Ende der Kultivierung vorlag.
Das Pilzmyzel wurde durch Filtration von der wäßrigen Phase abgetrennt und anschließend im Filtrat mittels Plattentest die Zahl der Fremdkeime bestimmt.
Ergebnis:
0,5 x 108 Keime je g TS (Fremdkeime: Hefen)
In einem Parallelversuch wurde anstelle von Nitrat-Stickstoff Ammoniak zur Stickstoff-Versorgung der Zellen eingesetzt und unter sonst gleichen Bedingungen kultiviert. Nach 14h mußte die Kultivierung infolge einer Bakterieninfektion abgebrochen werden.
Claims (4)
1. Verfahren zur Verringerung der Zahl an Fremdkeimen bei der Kultivierung von Mikroorganismen, dadurch gekennzeichnet, daß
a) nichtverwertende Mikroorganismen zur Kultivierung eingesetzt werden,
b) Nitrat als alleinige Stickstoffquelle zur Kultivierung eingesetzt und
c) ein pH-Wert größer/gleich 3,0 eingestellt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert beim Anwachsen von Fremdkeimen bis zu deren Inaktivierung um mindestens eine Einheit abgesenkt und/oder die Kultivierungs-Temperatur um mindestens 5°C erhöht wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Absenkung des pH-Wertes um mindestens eine Einheit und/oder die Erhöhung der Kultivierungs-Temperatur um mindestens 5°C periodisch durchgeführt werden.
4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung mit sterilisierter Luft durchgeführt wird.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD34063290A DD294276A5 (de) | 1990-05-14 | 1990-05-14 | Verfahren zur verringerung der zahl an fremdkeimen bei der kultivierung von mikroorganismen |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD34063290A DD294276A5 (de) | 1990-05-14 | 1990-05-14 | Verfahren zur verringerung der zahl an fremdkeimen bei der kultivierung von mikroorganismen |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DD294276A5 true DD294276A5 (de) | 1991-09-26 |
Family
ID=5618472
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DD34063290A DD294276A5 (de) | 1990-05-14 | 1990-05-14 | Verfahren zur verringerung der zahl an fremdkeimen bei der kultivierung von mikroorganismen |
Country Status (1)
| Country | Link |
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| DD (1) | DD294276A5 (de) |
-
1990
- 1990-05-14 DD DD34063290A patent/DD294276A5/de not_active IP Right Cessation
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