DD294275A5 - Verfahren zur reduzierung der zahl an fremdkeimen bei der kultivierung von mikroorganismen - Google Patents

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DD294275A5 DD34060990A DD34060990A DD294275A5 DD 294275 A5 DD294275 A5 DD 294275A5 DD 34060990 A DD34060990 A DD 34060990A DD 34060990 A DD34060990 A DD 34060990A DD 294275 A5 DD294275 A5 DD 294275A5
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DD34060990A
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Walter Teich
Horst Skrowny
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Adw Institut Fuer Biotechnologie,De
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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reduzierung der Zahl an Fremdkeimen bei der Kultivierung von Mikroorganismen, das zur Erzeugung mikrobieller Biomasse oder spezieller Substanzen angewandt werden kann. Erfindungsgemaesz wird waehrend der Kultivierung die Stickstoff- und/oder Kohlenstoffversorgung der Mikroorganismen in Abhaengigkeit von der Zahl der Fremdkeime oder vorbeugend nach einem bestimmten Rhythmus qualitativ variiert. Die Kultivierung kann diskontinuierlich, semikontinuierlich oder kontinuierlich durchgefuehrt werden.{Kultivierung; Fremdkeime; Grenzwert; Stickstoffverbindung; Kohlenstoffverbindung; Sterilisation; Biomasse; Verbindung}

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Kultivierung von Mikroorganismen auf der Basis verschiedener Rohstoffe. Sie kann zur Gewinnung mikrobieller Biomasse und mikrobiell erzeugter Substanzen angewandt werden.
Charakteristik des bekannten Standes der Technik
Die Erzeugung mikrobieller Biomasse und Substanzen erfolgt im industriellen Maßstab nur dann erfolgreich, wenn definierte Prozeßbedingungen eingehalten werden können. Aus diesem Grund sind Fremdkeime bei mikrobiologischen Verfahren unerwünscht, da diese den ursprünglich eingesetzten Mikroorganismus verdrängen können bzw. Prozeßstörungen bewirken. Um dies zu verhindern, werden zahlreiche mikrobiologische Verfahren unter sterilen Bedingungen durchgeführt. Der Nachteil dieser Verfahren liegt in den hohen ökonomischen Aufwendungen für die Sterilisation der Luft, der Nährlösung, der Substrate und für die Aufrechterhaltung des sterilen Zustandes während der Kultivierung (Apparate-Aufwand).
Werden demgegenüber mikrobielle Verfahren unsteril betrieben, so treten Fremdkeime auf, die, wenn sie eine bestimmte Zahl erreichen, die Ausbeute des Verfahrens reduzieren und die Qualität der herzustellenden Produkte beeinträchtigen bzw. eine weitere Prozeßführung sogar verhindern.
Zur Lösung des Problems ist ein Verfahren bekannt, DT-PS 2645386, bei dem durch Zufügen von Monoperschwefelsäure Fremdkeime inaktiviert werden. Dieses Verfahren hat den Nachteil, daß die Wirksamkeit sehr begrenzt ist (auf wenige Bakterien), zu einer beträchtlichen Salzbelastung des Wassers führt und das Verfahren durch den Zusatzstoff ökonomisch stark belastet. Weiter ist bekannt, Infektionen durch kurzzeitiges Absenken des pH-Wertes zu reduzieren (W.Swyzen, Zuckerind. 112 [1987), 955). Diese Verfahrensweise hat den Nachteil, daß sie nicht sehr wirksam ist, indem das Wachstum der Fremdkeime in den meisten Fällen nur kurzzeitig gehemmt wird.
Auch eine ständige Absenkung des pH-Wertes, wie z. B. bei der Kultivierung von Hefen auf der Basis von Schlempe (R. Braun, J.Meyroth, Die Branntweinwirtschaft 121 [1981), 102) bewirkt keine Lösung des Problems. Aufgrund der großen Menge an Schwefelsäure zur Absenkung des pH-Wertes wird bei diesem Verfahren sowohl die Hefebiomasse als auch das Wasser so stark mit Salz belastet, daß dies zu einer erheblichen ökonomischen Belastung des Verfahrens führt.
Ziel der Erfindung
Ziel der Erfindung ist eine Senkung von Produktionsverlusten sowie eine Verringerung der Umweltbelastung.
Darlegung des Wesens der Erfindung
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, durch spezielle Kultivierungsbedingungen die Zahl der Fremdkeime im Kulturmedium zu reduzieren.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß man während der Kultivierung die Stickstoff- und/oder Kohlenstoffversorgung der Mikroorganismen qualitativ variiert. Die Verfahrensweise ist im einzelnen folgende: Zur Kultivierung, die man diskontinuierlich, semikontinuierlich oder kontinuierlich durchführt, werden Mikroorganismen in on sich bekannter Art und Weise kultiviert, wobei man jedoch in Abhängigkeit von der Zahl der Fremdkeime im Kulturmedium die Stickstoff- und/oder Kohlenstoffversorgung der Mikroorganismen qualitativ variiert. Auf der Grundlage des Verwertungsspektrums der jeweils zu kultivierenden Mikroorganismen werden mindestens zwei Stickstoff- und/oder Kohlenstoffverbindungen ausgewählt und wechselseitig in Abhängigkeit von der Zahl an Fremdkeimen in den Fermentor dosiert. Die Dauer der Dosierung für die ausgewählten Verbindungen ergibt sich aus der aktuellen Zahl an Fremdkeimen, wobei diesbezüglich für das betreffende Verfahren ein Grenzwert festgelegt wird.
Beim Überschreiten des Grenzwertes erfolgt dann die qualitative Änderung der Stickstoff- und/oder Kohlenstoffversorgung dsr Mikroorganismen. Die Zahl de. 'remdkeime bestimmt man mittels bekannter Methoden, beispielsweise durch mikroskopisches Auszählen. In einer weiteren Ausgestaltung dieser Verfahrensweise hat es sich als vorteilhaft herausgestellt, die Änderungen der Dosierung der ausgewählten Stickstoff- und/oder Kohlenstoffverbindungen vorbeugend, also nicht in Abhängigkeit von dor Zahl der Fremdkeime, in einem bestimmten, für das jeweilige Verfahren empirisch zu ermittelnden Rhythmus durchzuführen.
Weiter kann es für einige Verfahren zweckmäßig sein, die Kultivierung unter den oben genannten Bedingungen so durchzuführen, daß man die Luft und/oder Kohlenstoffverbindung sterilisiert, die Kultivierung ansonsten aber unsteril betreibt.
Im Ergebnis der dargelegten Verfahrensweisen zur Reduzierung der Zahl der Fremdkeime erhält man ein Kulturmedium, das wesentlich weniger Fremdkeime enthält im Vergleich zur üblichen Kultivierung mit qualitativ konstanter Stickstoff- und/oder Kohlenstoffversorgung der Mikroorganismen unter vergleichbaren Bedingungen.
Ausführungsbolsplele
Beispiel 1
a) In einem Laborfermentor mit einem Bruttovolumen von 151 und einem Masseinhalt von 5kg wurde die Kultivierung einsr Hefe unter folgenden Bedingungen durchgeführt:
Hefe: Candida utilis 35,0 g/l CuSO4-5H2O 0,79 g/l
Temperatur: 32°C 48,3 ml/l ZnCI2 0,32 g/l
pH-Wert: 4,0 25,0 g/l AI2(SO4I3-18H2O 0,19 g/l
Verweilzeit: 4h 1,83 g/l NiSO4-7 H2O 0,11 g/l
Begasung: 4001 Luft/h 1,20 g/l Na2MoO4-2 H2O 0,04 g/l
1,29g/l CoSO4-7H2O 0,04 g/l
I
Nährsalzlösung (Konzentrat):
KH2PO4
H3PO4 80%
MgSO4-7 H2O
MnSO4-4 H2O
FeCI2-4 H2O
H3BO3
(Von diesem Konzentrat wurde eine adäquate Menge zur Versorgung der Hefen eingesetzt)
Kohlenstoffverbindung: Saccharose (konstant) Stickstoffverbindung: Ammoniak, Salpetersäure (variabel)
Die Kultivierung wurde wie folgt durchgeführt: In einer sterilen Vorkultivation mittels Schüttelkolben wurde eine ausreichende Menge Hefe erzeugt, im Batch-Verfahren weitergezüchtet und anschließend kontinuierlich kultiviert. Die pH-Regelung erfolgte über einen Regelkreis mittels NaOH- bzw. H2SO4-Lösung. Die unter diesen Bedingungen erreichte Produktivität betrug 7 g Hefetrockensubstanz/kg h. Die Dosierung der Kohlenstoffverbindung Saccharose blieb während des Versuchs konstant.
Demgegenüber wurde in Abhängigkeit von der Fremdkeimzahl (Bakterien) die Stickstoffdosierung qualitativ variiert. Die Zahl der Fremdkeime sollte 10 (Angabe in Bakterien je 100 Hefen) nicht überschreiten (Grenzwert).
Die Zahl der Fremdkeime wurde mikroskopisch aller 4 h bestimmt. Die Stickstoffversorgung der Hefezellen erfolgte zunächst mit Ammoniak. Nach 52h Kultivierungsdauer wurde der Grenzwert für die Fremdkeime überschritten und daraufhin die Stickstoffversorgung durch Zusatz von HNO3 zur Nährsalzlösung umgestellt. Innerhalb von 12 h sank die Zahl der Fremdkeime auf 2. Die Stickstoffversorgung auf der Basis von Nitrat wurde noch weitere 24 h aufrechterhalten und danach auf Ammoniak umgestellt. Weitere Bestimmungen der Fremdkeimzahl ergaben eine Überschreitung des Grenzwertes nach 46h. Daraufhin erfolgte wieder eine Umstellung der Stickstoffversorgung auf Nitrat-Stickstoff.
b) Die Kultivierung der Hefe wurde unter den bei a) genannten Bedingungen durchgeführt, nur mit dem Unterschied, daß ein fester Rhythmus bezüglich des Wechsels der Stickstoffversorgung der Hefezellen eingehalten wurde.
Rhythmus (empirisch aus mehreren Versuchen festgelegt):
Ammoniak: 35h Kultivierungsdauer Salpetersäure: 24h Kultivierungsdauer
ProzeßkontrollPii bezüglich der Zahl an Fremdkeimen ergaben, daß mit dieser Verfahrensweise der vorgegebene Grenzwert (10) eingehalten werden konnte.
Beispiel 2
In einem Laborfermentor mit einem Bruttovolumen von 151 und einem Masseinhalt von 5kg wurde die Kultivierung einer Hefe unter folgenden Bedingungen durchgeführt:
Hefe: ßrettanomyses spez
Temperatur: 34°C pH-Wert: 4,0 Verweilzeit: 4h Begasung: 4001 Luft/h Nährsalzlösung: entsprechend Beispiel 1
Stickstoffverbindung: Ammoniak (konstant/ Kohlenstoffverbindung: Saccharose, Essigsäure (variabel)
Die Kultivierung wurde wie folgt durchgeführt: In einer sterilen Vorkultivation mittels Schüttelkolben wurde eine ausreichende Hefemenge erzeugt, im Batch-Verfahren weitergezüchtet und anschließend kontinuierlich unter unsterilen Bedingungen kultiviert. Die Produktivität lag zwischen 5,8-7,3 g Hefetrockensubstanz/kg h. Die Dosierung von Ammoniak zur Versorgung der Hefe mit Stickstoff blieb während des Versuchs konstant. Demgegenüber wurde in Abhängigkeit von der Zahl der Fremdkeir e (Bakterien) die Kohlenstoffdosierung qualitativ variiert. Die Zahl der Fremdkeime sollte 15 nicht überschreiten (festgelegter Grenzwert). Die Zahl der Fremdkeime wurde mikroskopisch aller 4 h bestimmt. Nach einer Kultivierungsdauer von 45h, begonnen wurde die Kultivierung mit der Kohlenstoffverbindung Saccharose, betrug die Zahl der Fremdkeime 15. Daraufhin erfolgte eine Umstellung der Versorgung der Hefe von Saccharose auf Essigsäure. Innerhalb von 18h sank die Zahl der Fremdkeime auf 4. Die Kultivierung der Hefe auf der Basis von Essigsäure wurde noch 15h aufrechterhalten und danach wieder auf Saccharose umgestellt.
Beispiel 3
In einem Laborfermentor mit einom Bruttovolumen von 151 und einem Masseinhalt von 4 kg wurde die Kultivierung eines Pilzes unter folgenden Bedingungen durchgeführt:
Pilz: Aspergillus niger
Temperatur: 3O0C
pH-Wert: 4,0
Begasung: 3001 Luft/h (sterilisiert)
Nährsalzlösung: wie in Beispiel 1
Ergänzung: Zugabe von Maisquellwasser
Kohlenstoffverbindung: Glucose (konstant) Stickstoffverbindung: Ammoniak, Salpetersäure (variabel)
Die Anzucht des Myzels (Inoculum) erfolgte in einer Vorfer.nentation unter sterilen Bedingungen. Mit dem gezüchteten Pilzmyzel wurde anschließend eine Fed-Patch-Kultivierung unter unsterilen Bedingungen (außer der Luft) über einen Zeitraum von 60h durchgeführt, wobei während dieses Zeitraums die Stickstoffversorgung, beginnend mit Ammoniak, stündlich entsprechend der oben genannten Verbindungen gewechselt wurde.
Unter diesen Bedingungen konnte die Kultivierung über den gesamten Zeitraum problemlos durchgeführt und der vorgegebene Grenzwert bezüglich der Zahl an Fremdkeimen (Hefen, Bakterien) von 5 χ 10β Keimen/ml stets unterschritten werden.
Demgegenüber mußte eine unter denselben Bedingungen durchgeführte Kultivierung unter alleiniger Verwendung von Ammoniak als Stickstoffquelle wegen Infektion nach 19h abgebrochen werden.
Bei Verwendung von Ammoniumnitrat als alleinige Stickstoffquelle mußte die Kultivierung nach 28h abgebrochen werden.
Beispiel 4
In einem Laborfermentor mit einem Bruttovolumen von 151 und einem Masseinhalt von 4kg wurde die Kultivierung einer Hefe unter folgenden Bedingungen durchgeführt:
Temperatur: 340C Verweilzeit: 3,5h Begasung: 4001 Luft/h Nährsalzlösung: entsprechend Beispiel 1
Kohlenstoffverbindung: Schlempe, Saccharose (variabel) Stickstoffverbindung: Ammoniak, Salpetersäure (variabel)
Die Kultivierung wurde wie folgt durchgeführt: In einer sterilen Vorkultivation mittels Schüttelkolben wurde eine ausreichende Menge Hefe erzeugt, im Batch-Verfahren weitergezüchtet und anschließend auf der Basis von Schlempe (aus Ethanolverfahren) und Ammoniak kontinuierlich unter unsterilen Bedingungen kultiviert. Die Bestimmung der Zahl an Fremdkeimen (Bakterien) erfolgte all π 4 h. In Abhängigkeit vom Überschreiten des festgelegten Grenzwertes von 12 ergab sich folgender Wechsel der Dosierungen:
Kohlenstoff- bzw. Stickstoffverbindung Kultiviarungsdauer
Schlempe Ammoniak 42 h
Schlempe Salpetersäure 40 h
Saccharose Ammoniak 28 h
Saccharose Salpetersäure Oh
Danach wurde wieder mit Schlempe/Ammoniak die Kultivierung fortgesetzt.

Claims (4)

1. Verfahren zur Reduzierung der Zahl an Fremdkeimen bei der Kultivierung von Mikroorganismen, dadurch gekennzeichnet, daß während der "(ultivierung die Stickstoff- und/oder Kohlenstoffversorgung der Mikroorganismen qualitativ variiert wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die qualitative Änderung der Stickstoff- und/oder Kohlenstoffversorgung dann erfolgt, wenn ein vorgegebener Grenzwert bezüglich der Zahl an Fremdkeimen überschritten wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die qualitative Änderung der Stickstoff- und/oder Kohlenstoffversorgung vorbeugend nach einem empirisch ermittelten Rhythmus erfolgt.
4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Luft und/oder die Kohlenstoffverbindung sterilisiert wird.
DD34060990A 1990-05-14 1990-05-14 Verfahren zur reduzierung der zahl an fremdkeimen bei der kultivierung von mikroorganismen DD294275A5 (de)

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