DD295873A5 - Mikrobielles Herstellungsverfahren für Cyclosporin A - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein mikrobielles Verfahren zur Herstellung des Oligopeptids Cyclosporin A. Sie verfolgt das Ziel, diesen Wirkstoff in oekonomisch effizienter Weise herzustellen. Die diesem Ziel zugeordnete technische Aufgabe wird in ihrer biologischen Prozeszstufe in der Weise geloest, dasz in steriler aerober Fermentation in Naehrmedien mit Kohlenstoffsubstraten, darunter vorzugsweise Citrat-Ionen, mit Ammoniumsalzen als einziger Stickstoffquelle und mit ausgewaehlten Mineralsalzen fuer die Dauer von 5 Tagen bis 11 Tagen bei Temperaturen von 20C bis 30C jeweils einer der nachfolgend genannten PilzstaemmeTolypocladium inflatum Wb 6-5{Cyclosporin A; Oligopeptid; Immunsuppressivum; mikrobielles Herstellungsverfahren; biologische Prozeszstufe; Pilzstamm; Tolypocladium inflatum Wb 6-5; Sesquicilliopsis rosariensis F 605; Sesquicilliopsis rosariensis GE 440; Mineralsalze}

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein mikrobielles Verfahren zur Herstellung des Oligopeptids Cyclosporin A. Der gebildete Wirkstoff hat als Immunsuppressivum breiten Eingang in die Therapie von Organtransplantationen gefunden. ^

Das Anwendungsgebiet der Erfindung liegt somit in der mikrobiologisch-pharmazeutischen Industrie. !

\ Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Mikrobielle Verfahren zur Gewinnung von Cyclosporin A auf fermentativem Wege, nämlich durch Kultivierung ausgewählter pilzlicher Mikroorganismen, sind seit 1975 bekannt (vgl. die Patentschriften CH 589716, CH 603, DD 115695, DE 2455859 und AT 350716).

Als wichtigste Mikroorganismen werden Stämme aus den Arten Tolypocladium inflatum sowie Cylindrocarpon lucidum eingesetzt, die submers oder emers auf flüssigen, komplexen Medien bei pH-Werten im Bereich von pH 3,2 bis pH 7,5 und bei Temperaturen von 20°C bis 30⁰C kultiviert werden, wobei das gebildete Produkt aus der gewonnenen Biomasse wie auch aus dem Kulturfiltrat durch Extraktion mit Methanol gewonnen wird. Ausgedehnte Screening-Untersuchungen führten zur Auffindung zahlreicher weiterer pilzlicher Spezies mit Cyclosporin-Bildungsvermögen, die jedoch biotechnologisch bislang nicht genutzt werden, so unter anderem Tolypocladium geodes, Fusarium solani, Trichoderma viride, Neocosmospora vasinfecta, Isaria felina, Verticillium spec., Paecilomyces spec, Acremonium spec, (DREYFUSS, Sydowia Bd.39, 1986, 22-36). Es wurden auch bereits Verfahren vorgeschlagen, in denen als biologisches Material die Stämme Tolypocladium inflatum SF 136 bzw. Sesquicilliopsis rosariensis A84/195(-3) eingesetzt werden.

Dabei erbrachte die Fermentation dieser Organismen unter den beschriebenen Bedingungen in einem komplexen, kaseinpeptonhaltigen Medium Cyclosporin Α-Ausbeuten von maximal 1200 mg/l bzw. 2460 mg/l und nach 11-bis 15tägiger Kultivierung. Die Verwendung eines Peptons als organische Stickstoffquelle in der Fermentationsstufe eines industriellen Verfahrens (vgl. auch DREYFUSS et al., Europ. J. Appl. Microbiol. 3,1976,125-133; AGATHOS et al., Journal of Industrial Microbiology 1,1986,39—48) muß jedoch bei allen genannten technischen Lösungen als erheblicher ökonomischer Nachteil angesehen werden.

KOBEL und TRABER (Europ. J. Appl. Microbiol. Biotechn. 14,1982,237-240) verwendeten erstmals unter Laborbedingungen für spezielle Untersuchungen zur Biosynthese von Cyclosporin A ein chemisch definiertes, synthetisches Nährmedium. Unter Verwendung von Monohydroxybernsteinsäure und Saccharose als Hauptkomponenten konnten sie eine Ausbeute von 101 mg Cyclosporin A am 14. Kulturtag belegen. Durch zusätzliche Fütterung eines Produktbildners der Art T. inflatum mit reinen Aminosäuren in einer Konzentration von 8g/l konnte das Ausbeuteniveau zwar verbessert werden, die eingesetzten Nährlösungsbestandteile, die zudem mit Vitaminen wie Thiamin, Biotin und Pyridoxin komplettiert werden, können jedoch fyr ein technisch relevantes Verfahren keinesfalls als ökonomisch tragfähige Lösung angesehen werden.

Ähnliche Nachteile weist ein Fermentationsregime von AGATHOS et al. (Ann. N.Y. Acad. Sei. 506,1987,657-662) auf, welches Einsatz eines halbsynthetischen Mediums zwar Werte von 530 \iq CyA/ml in 8tägiger Submerskultur zuläßt, jedoch als C-Quelle die industriell schwer verfügbare Maltose verwendet.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung verfolgt das Ziel, Cyclosporin A in ökonomisch effizienter Weise herzustellen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein ökonomisch effizientes mikrobielles Verfahren zu beschreiben, welches, gestützt auf den Einsatz neuer Mikroorganismen, die Herstellung von Cyclosporin A in synthetischen Medien ohne den Einsatz komplexer Stickstoff-Rohstoffe ermöglicht.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe in der Weise gelöst, daß man den Mikroorganismus Tolypocladium inflatum WB6-5 oder Stamm GE440 bzw. Stamm F605 des Mikroorganismus Sesquicilliopsis rosariensis G. ARNOLD in einem Medium mit Ammoniumsalzen als einzig verfügbarer Stickstoffquelle sowie gegebenenfalls auch unter Zusatz von Citrat und in Gegenwart ausgewählter zweiwertiger Kationen kultiviert. Darüber hinaus erwies es sich als vorteilhaft, daß man bei Fermentation der einzelnen Stämme von rotbraun bis schwarzbraun-violett pigmentierten Emerskulturen, die auf einem Mineralsalz-Glukose-Agar mit Ammoniumsalzen angezogen wurden, ausgeht, da diese verfahrensgemäß eine stabile Cyclosporin A-Produktion garantieren. Ferner ist es für die Stämme T. inflatum WB 6-5 und S. rosariensis GE440 besonders günstig, in der Produktionskultur Ammoniumsulfat und/oder Diammoniumhydrogenphosphat als anorganische Stickstoffverbindungen zu verwenden. Die Zinkionenkonzentration bei Kultivierung des Stammes WB 6-5 sollte dabei zweckmäßigerweise im Bereich von 0,5mg/l bis 5mg/l gewählt werden. Auffällig ist, daß die Produktivität des Stammes Wb 6-5 in überraschender Weise durch die Anwesenheit von Kaliumsalzen bzw. -ionen negativ beeinflußbar ist, eine Abhängigkeit, die nicht für die Stämme GE440 und F 605 der Art Sesquicilliopsis rosariensis G. ARNOLD gilt. Für diese letztgenannten Stämme ist vielmehr die Anwesenheit bestimmter zweiwertiger Metallionen im Fermentationsmedium von Bedeutung, insbesondere die Verfügbarkeit von Magnesium-, Eisen-, Zink- und Kalziumionen, die einen unmittelbaren Einfluß, wenn auch in unterschiedlichem Maße, auf die Syntheseaktivität ausüben. So sollte die Fermentation des Stammes F605 vorzugsweise bei einer Magnesiumionenkonzentration von 250mg/l, einer Eisenionenkonzentration von 20mg/l und einer Zinkionenkonzentration von 0,7 mg/l durchgeführt werden. Insbesondere ist es wichtig, auf eine ausgewogene Menge an Kalziumionen zu achten, wobei die lonenkonzentration vorzugsweise bei Werten von 10 mg/l bis 200 mg/l liegen sollte, da bei Abwesenheit von Kalzium die Produktivität des Stammes F605 unter den übrigen gegebenen Bedingungen nicht effektiv ist.

Gleichzeitig hat es sich für diesen Stamm als ausgesprochen vorteilhaft erwiesen, die Produktionskultur in Gegenwart von Citrationen im Bereich von 5g/l bis 30g/l, vorzugsweise bei 12g/l durchzuführen.

Die Kultivierung des Stammes GE440 hingeen erfolgt ohne Citrat-Zusatz in ähnlicher Weise wie die Fermentation des Stammes Wb 6-5, jedoch hat es sich gezeigt, daß in diesem Falle die Magnesiumionenkonzentration vorzugsweise bei 250mg/l bzw. die Zinkionenkonzentration vorzugsweise bei 50 mg/l liegen sollte.

Trotz der erkannten unterschiedlichen Bedürftigkeit der einzelnen Cyclosporin A-Produzentenstämme hinsichtlich des Gehaltes an bestimmten zweiwertigen Metallionen im Produktionsmedium besteht jedoch für alle Stämme des vorliegenden Verfahrens der entscheidende verfahrenstechnische Fortschritt einer Eliminierung der kostenintensiven, in ihrer Zusammensetzung heterogenen komplexen Stickstoffquelle.

Dieses Ergebnis war insofern unerwartet, als durch AGATHOS et al. (s. oben) weder Ammonium noch Nitrat als effektiv in bezug auf die Cyclosporin-Produktion nachgewiesen wurden, weshalb sich diese Autoren für ein semisynthetisches Medium, welches die Stickstoffquelle in Form eines Peptons enthält, entschieden. Die zur Cyclosporin Α-Herstellung verwendeten Stämme Wb 6-5, GE440 und F605 sind in der Hinterlegungsstelle für Mikroorganismen der DDR, ZIMET der AdW, Beutenbergstr. 11, Jena, DDR -6900, unter den Registriernummern 43899, IMET43909 und IMET43887 hinterlegt.

Die Fermentation erfolgt nach einer ein- bzw. zweistufigen Vorzucht in der submersen Hauptkultur unter aeroben und sterilen Bedingungen, indem die unterschiedlichen Produzentenstämme in einem flüssigen Medium bei Temperaturen von 20°C bis 30⁰C sowie einer Acidität von pH 3,2 bis 7,5 für die Dauer von 5 bis 11 Tagen kultiviert werden. Der Ablauf des gesamten Verfahrens läßt sich allgemein wie folgt charakterisieren:

Rasenstücke aus Schrägagarkulturen oben genannter Stämme bzw. auch deren Sporen werden in physiologischer NaCI-Lösung suspendiert und auf einem Nähragar ausplattiert, welcher als Kohlenstoffquelle mono- oder dimeres Kohlenhydrat sowie (NH₄I₂HPO₄ als Stickstoffquelle enthält und für die Dauer von 14 Tagen bis 21 Tagen bei 24°C bis 28°C, vorzugsweise bei 24°C, bebrütet wird.

Die Anzucht des Stammes F 605 erfolgt in gleicher Weise, jedoch ohne (NH₄)₂HPO₄ im Nähragar. Von den entstandenen Einzelkolonien werden die luftmycelarmen, rot- bis schwarzbraun pigmentierten Exemplare ausgewählt und nach Übertragung auf Mineralsalz-Kohlenhydratagar zur Herstellung von 2cm bis 4cm großen Rasenarealen verwendet. Diese werden als Agarausstich in die erste submerse Vorzuchtpassage übertragen, die aus 100-ml- bzw. 500-ml-Erlenmeyerkolben besteht, welche jeweils 20% ihres Volumens als Anzuchtmedium enthalten. Das Inokulum enthält Glukose, Maltose oder Saccharose als Kohlenstoffquelle, weiterhin organische Stickstoffsubstrate sowie Mineralsalze und wird nach der Beimpfung für die Dauer von 48 Stunden bis 72 Stunden bei 24°C bis 25°C unter Schütteln auf einem Rundschwinger bei 180 bis 240 rpm kultiviert. Nach Ausreifen der 1 .Anzucht in Flüssigkultur (= 1. Vorkultur) erfolgt gegebenenfalls die Beimpfung einer 2. Anzucht (= 2. Vorkultur) in einer Menge von 5 % bis 10% des Mediumvolumens. Diese Stufe besteht entweder aus 500-ml-Erlenmeyerkolben, die 100 ml des o.a. Mediums enthalten, oder aus gerührten und belüfteten Kleinfermentoren mit einem Nettovolumen von 5I bis 251 bei üblichen technischem Ausrüstungsgrad für Temperierung und Belüftung.

Nach 48stündiger Kultivierung wird das Hauptkulturmedium, welches als alleinige Stickstoffquelle Ammoniumsalze enthält, in einer Menge von 5% bis 10% des Volumens mit der Vorkultur beimpft und für die Dauer von 5 Tagen bis 11 Tagen unter Rühren und Belüften bzw. durch Rundschütteln kultiviert.

Unter diesen Bedingungen erreichen die Fermentationsansätze Leistungen von 700mg bis 1150mg Cyclosporin A pro Liter, welches analytisch durch HPLC in bekannter Weise erfaßt wird. Die Kulturbrühen weisen zum Erntezeitpunkt eine rot- bis schwarzbraune Färbung auf.

Die Isolierung von Cyclosporin A erfolgt in der Weise, daß das Produkt aus der Biomasse mit Wasser mischbaren oder wenig mischbaren, aus dem Kulturfiltrat in organischen, mit Wasser nicht oder wenig mischbaren Lösungsmitteln extrahiert wird.

Ausführungsbeispiele

Beispiel 1

Rasenstücke von Oberflächenkulturen des Stammes Tolypocladium inflatum Wb 6-5 werden zunächst auf Glukose-Mineralsalzagar übertragen, der folgende Zusammensetzung aufweist (g/l): Glukose 20; (NH₄I₂SO₄B, KH₂PO₄ 2, MgSO₄ · 7 H₂O 0,5, CaCO₃ 3,4, Agar 20; pH 5,3 bis 5,7, Sterilisation 30 Minuten, 120^cC. Nach einer Bebrütungszeit der Petrischalen bei 24°Cfür die Dauer von 14 Tagen bis 21 Tagen werden von den entstandenen Arealen die rot- und schwarzbraun pigmentierten ausgewählt. Die Beimpfung der ersten Submersvorkultur erfolgt durch Übertragung eines ca. 1 cm² großen Rasenstückes auf 100 ml des Anzuchtmediums folgender Zusammensetzung (g/l): Glukose 50, Kaseinpepton 10, KH₂PO₄ 1, KCI 2,5 ad 11 Aqua dest.; pH 5,3 bis 5,6, Sterilisation 30 Minuten, 120⁰C. Die 500-ml-Anzuchtkolben werden 72 Stunden lang bei 24°C bis 25°C mit 180 bis 220 rpm auf Rundschüttlern kultiviert. Siezeigen als Reifekriterium eine braunschwarze Färbung. Sie dienen in einer Menge von 5% als Impfmaterial des Hauptkulturmediums, welches zu je 100 ml in 500-ml-Erlenmeyerkolben abgefüllt, folgende Zusammensetzung aufweist (g/l): Glukose 80, (NH₄J₂HPO₄ 2, (NH₄)₂SO₄ 5, MgSO₄ 7 H₂O 0,5, ZnSO₄ 7 H₂O 0,008, CaCO₃ 5,1, Aqua dest. ad 11; pH 5,3 bis 5,9, Sterilisation 30 Minuten, 120⁰C. Die Kultivierung erfolgt 11 Tage lang bei 24⁰C bis 25°C auf einem Rundschwinger mit 180rpm.

Nach Beendigung der Fermentation wird die Kulturbrühe mit Methanol im Verhältnis 5:1 (v/v) versetzt. Nach mehrmaligem gründlichem Aufrühren wird innerhalb von 30 Minuten der Extrakt zur Wertbestimmung verwendet. Diese erfolgt in an sich bekannterWeise durch Beschickung von HPLC-Säulen. Die Leistung derartiger Fermentationsansätze beträgt 1100pg Cyclosporin A/ml.

Beispiel 2

Eine Sporensuspension des Stammes Sesquicilliopsis rosariensis GE 440 wird zur Gewinnung von Einzelkolonien auf Glukose-Mineralsalzagar plattiert, der folgende Zusammensetzung aufweist (g/l): Glukose 20, (NH₄I₂SO₄ 3, (NH₄)₂HPO₄ 2, MgSO₄- 7 H₂O 0,5, CaCO₃ 6,8; entionisiertes Wasser pH 5,5; Sterilisation 60 Minuten, 110⁰C. Nach einer Bebrütungszeit von 14 bis 21 Tagen bei 24°C werden lila- bis schwarzbraun pigmentierte Einzelkolonien gewonnen, die direkt als Rasenstück oder nach Suspendieren in physiologischer NaCI-Lösung zur Beimpfung des Vorkulturmediums genutzt werden. Das Vorkulturmedium ist dabei wie folgt zusammengesetzt (g/l): Maltose oder Glukose 75, Kaseinpepton 25, KH₂PO₄ 1, KCI 2,5; entionisiertes Wasser pH 5,5; Sterilisation 30 Minuten, 120⁰CJe 100ml des beimpften Vorkulturmediums werden in 500-ml-Erlenmeyerkolbenfür 72 Stunden bei 24⁰C auf einem Rundschwinger mit einer Frequenz von 190 rpm kultiviert.

Das Hauptkulturmedium beinhaltet folgende Nährlösungsbestandteile (g/l): Glukose 80, (NH₄)₂ HPO₄ 4, (NH₄)₂SO₄ 6, MgSO₄ · 7 H₂O 2,5; ZnSO₄ · 7 H₂O 0,02; CaCO₃ 6,8; entionisiertes Wasser pH 5,7 bis pH 6,3; Sterilisation 60 Minuten bei 110°C.

100 ml dieses Mediums in 500-ml-Erlenmeyerkolben werden mit 10% des Volumens der Vorkultur beimpft und unter den gleichen Bedingungen wie für die Vorkultur beschrieben kultiviert.

Der am 11. Tag ermittelte Gehaltan Cyclosporin A betrug biszu700mg/l Kultursuspension.

Die Bestimmung des Wirkstoffs erfolgte wie unter Beispiel 1 beschrieben.

Beispiel 3

Von einer Emerskultur des Stammes Sesquicilliopsis rosariensis F 605 auf Malzextraktagar (20g Malzextrakt/l) wird nach mindestens 14 bis 21tägiger Bebrütung bei 24°C eine Sporensuspension hergestellt, die zur Beimpfung einer Vorkultur dient.

100ml Vorkulturmedium mit einer Zusammensetzung wie im Bsp. 2 beschrieben, wurden mit 1 x 10⁷ Sporen beimpft und in 500-ml-Erlenmeyerkolben bei 24°C für 72 Stunden auf einem Rundschwinger mit einer Frequenz von 190 rpm bebrütet.

Anschließend erfolgt die Übertragung der Kultur in ein Hauptkulturmedium im Verhältnis 1:10, welches sich wie folgt zusammensetzt (g/l): Glukose 60, Diammoniumhydrogencitrat 15, KH₂PO₄ 5, KCI 2,5, MgSO₄ · 7 H₂O 2,5, FeSO₄ · 7 H₂O 0,1, ZnSO₄ · 7 H₂O 0,003; entionisiertes Wasser pH 5,5; Sterilisation 60 Minuten 110⁰C.

Alle Kulturbedingungen werden entsprechend der Vorkultur gewählt. Der am 11. Tag ermittelte Gehalt an Cyclosporin A betrug maximal 1 150mg/l Kultursuspension.

Die Bestimmung des Wirkstoffs erfolgte wie unter Beispiel 1 beschrieben.

Claims (7)

1. Patentansprüche:

   1. Mikrobielles Herstellungsverfahren für Cyclosporin A durch sterile aerobe Fermentation eines pilzlichen Mikroorganismus auf ein Medium mit Stickstoff- und Kohlenstoffsubstraten sowie Mineralsalzen für die Dauer von 5 Tagen bis 11 Tagen sowie bei Temperaturen von 20⁰C bis 30⁰C einschließlich Gewinnung des Produkts aus Biomasse und Kulturfiltrat, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kultivierung mit Stamm Tolypocladium inflatum Wb6-5_# Stamm Sesquicilliopsis rosariensis F605 bzw. Stamm Sesqicilliopsis rosariensis GE440 in einem Medium mit Ammoniumsalzen als einziger Stickstoffquelle sowie ggf. mit Citrat als Kohlenstoffquelle und in Gegenwart von ausgewählten 2wertigen Kationen durchgeführt.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man bei der Kultivierung von rot- bis schwarzbraun pigmentierten Emerskulturen ausgeht, die auf einem Mineralsalz-Glucose-Agarmit Ammoniumsalzen als einziger Stickstoffquelle angezogen wurden.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man für die Kultivierung der Stämme T. inflatum Wb 6-5 und S. rosariensis GE440 als Ammoniumsalze Ammoniumsulfat und/ oder Diammoniumhydrogenphosphat verwendet.
4. 4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kultivierung des Stammes T. inflatum Wb 6-5 bei einer Zinkionenkonzentration im Bereich von 0,5mg/l bis 5mg/l durchführt.
5. 5. Verfahren nach Anspruch 1 bis3, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kultivierung des Stammes S. rosariensis GE440 bei einer Magnesiumionenkonzentration von 250mg/l und einer Zinkionenkonzentration von 50mg/l durchführt.
6. 6. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kultivierung des Stammes S. rosariensis F605 bei einer Magnesiumionenkonzentration von 250mg/1, einer Eisenionenkonzentration von20mg/l und einer Zinkionenkonzentration von 0,7 mg/1 sowie in Gegenwart von Citrat-Ionen in Konzentrationen im Bereich von 5g/l bis30g/l durchführt.
7. 7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kultivierung des Stammes S. rosariensis F605 unter Zusatzvon Kalziumsalzen bei einer Konzentration im Bereich von 10mg/l bis 200 mg/l durchführt. i