DD296503A5 - Chemitumineszente zusammensetzungen, chemilumineszenz-verfahren und ihre anwendung in analytischen tests - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft eine homogene hydroalkoholische chemilumineszente Zusammensetzung, die folgendes enthalten kann:

Description

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Chemilumineszente Zusammensetzungen, Chemilumineszenzverfahren und ihre Anwendung in analytischen Tests

Die vorliegende Erfindung betrifft iumineszente oder luminometrische Zusammensetzungen mit langwährender Lichtemission und hoher Quantenausbeute, Lumineszenz- bzw. luminometrische Tests, insbesondere analytische Methoden und Immuntests, sowie Diagnoseausrüstungen, die die genannten Tests erleichtern sollen.

Im Detail bezieht sich die Erfindung auf den Nachweis und die Quantifizierung von Acridinderivaten, den Nachweis und die Quantifizierung von Reduktionsverbindungen, auf pH-Messungen in kleinen Probemengen sowie auf die Quantifizierung von Immuntests und Hybridisierungsreaktionen.

Breite Anwendung in vielen wissenschaftlichen Disziplinen haben analytische Methoden gefunden, die auf dem Strahlennachweis basieren. Bei der populärsten dieser Methoden werden radioaktive Tracer verwendet. Zwar ist es damit möglich, kleinste Mengen radioaktiver Substanzen nachzuweisen und zu quantifizieren, doch dürfen zahlreiche Manipulationsrisiken sowie Einschränkungen, die aus der Halbwertszeit dieser Tracer resultieren, nicht übersehen werden. Zur Vermeidung der mit der Verwendung von Isotopen verbundenen Nachteile wurden verschiedene Versuche übernommen, den Einsatz der Radioisotope durch Methoden zu ersetzen, die auf Chemilumineszenzreaktionen beruhen.

Unter Lumineszenz versteht man die durch eine chemische Reaktion hervorgerufene Lichtemission. Im Gegensatz zur Fluoreszenz und Phosphoreszenz (verzögerte Fluoreszenz) bedarf es bei der Chemilumineszenz keiner externen Energieanregungsquelle für die Anregung der Moleküle. Chemilumineszenz wird als Lichterzeugung durch eine exergonische chemische Reaktion definiert, bei der der Moleküle in einem elektronisch angeregten Zustand verbleiben. Die Relaxation dieser SI angeregten Moleküle bis auf das Energieniveau des Grundzustandes ist kein kontinuierlicher Prozeß. Vielmehr werden kleine

-, :§ Energiepakete - die „Quanten" oder „Photone" genannt - an die Umwelt abgegeben, bis ein stabiles Niveau erreicht ist. Unter

Ie Ä| der Voraussetzung, daß die für den Übergang vom niederen Energiezustand in den angeregten Zustand benötigte Energie

ausreicht (40 kcal/Mol-70 kcal/Mol), geht die zusätzliche Relaxation auf das Energieniveau des Grundzustandes mit der Emission von Licht im sichtbaren Spektrum einher.

Bei der Chemilumineszenz werden ein Ansteigen der Energie und die nachfolgende Relaxation zumeist bei Oxidations- und Oxygenierungsreaktionen beobachtet. Verschiedene chemische Verbindungen können bei der Herausbildung eines einfachen ;n ;< angeregten Zustandeschemilumineszent werden. Der Wirkungsgrad, mit dem diese angeregten Zustände bei chemischen

Reaktionen hervorgerufen werden, wird als „Quantenausbeute" dieser Reaktionen bezeichnet. Die Quantenausbeute bezieht sich auf einen Zahlenwert, den man erhält, wenn man die Anzahl der lumineszenten Moleküle durch die Anzahl der reagierenden Moleküle dividiert. Die Lumineszenzreaktion ist optimal, wenn dieses Verhältnis gleich 1 ist (Whitehead, T. P., Kricka, L. J., Couter, T. J. M. und Thorpe, G.H.G.: Analytical luminescence: Its potential in the clinical laboratory. Clinical Chemistry 25:1531, 1979). Dies ist normalerweise bei biolumineszenten Reaktionen in lebenden Organismen der Fall, wo die chemilumineszente Reaktion durch ein Enzym katalysiert wird. Ein typisches Beispiel ist die Luciferin-Luciferase-Reaktion. Sie ist aufgrund ihrer hohen Quantenausbeute Gegenstand eingehender Untersuchungen und wird sowohl in biochemischen als auch klinischen Tests weithin genutzt (DeLuca, M., und McElroy, W.D., In: Methods of Enzymology. Colowick, S.P. und Kaplan, N.O. [Hrsg.], Academic Press, New York, Bd. 57:3,1978; Kricka, L. J., und Thorpe G. H. G.: Chemiluminescent and bioluminescent methods in analytical chemistry. Analyst: 1274,1983).

Von verschiedenen organischen Verbindungen ist bekannt, daß sie bei Oxidation oder Oxygenierung Chemilumineszenz erzeugen. Eines der bekanntesten Beispiele dafür ist Luminol (5-Amino-2,3-dihydro-1,4-prrthalazindion). Nach der Oxidation wird das Luminol über eine Serie von Zwischenstufen in ein angeregtes Alpha-Aminophthalatdianion umgewandelt, das bei der Relaxation Licht ausstrahlt. Die Emissionswellenlänge beträgt 430 nm, und die Quantenausbeute liegt bei etwa 0,01. Interessanterweise stellte sich heraus, daß Meerrettichperoxydase bei der von Luminol abhängigen Chemilumineszenz als Katalysator fungiert (Arakawa, H., Maeda, M., Tsuji, A., und Kambegawa, A.: Chemiluminescence enzyme immunoassay of dehydroepiandrosterone and its sulfate using peroxydase as the label. Steroids 28:453,1981). Dieses Enzym wird auch bei Enzymimmuntests häufig als Marker benutzt, wo es gewöhnlich anhand der kolorimetrischen Reaktion bestimmt wird (Sternberger, L. A., Hardy, P.H.Jr., Cuculis, J.J., und Meyer, H.G.: The unlabeled antibody-enzyme method of immunochemistry. Preparation and properties of soluble antigen-antibody complex [horseradish peroxydase—antihorseradish peroxydase] and its use in identification of spirochetes. J. Histochem. Cytochem. 18:315,1970). Es wurde der Versuch unternommen, Meerrettichperoxydase unter Ausnutzung ihrer katalysierenden Wirkung auf die Luminol-Wasserstoffperoxidreaktion mittels Chemilumineszenz nachzuweisen. Bedauerlicherweise ist die so erzeugte Chemilumineszenz durch geringes Licht gekennzeichnet und daher für die Anwendung in Routineanalysen nicht geeignet. Es wurde jedoch festgestellt, daß diese Art von Chemilumineszenz sich mindestens lOOfach verstärken läßt, indem man bestimmte „Verstärker"-Moleküle im Analysegemisch verwendet. Der erste entdeckte Verstärker war das Luciferin des Leuchtkäfers. Später wurden andere wirksamere Verstärker gefunden, insbesondere 6-Hydroxybenzothiazol, p-lodophenol, p-Phenylphenol und 1 -Brom-2-naphthol (Kricka, L. H., Thorpe, G. H. G., und Whitehead, T. P.: Enhanced luminescent or luminometric Assay. Europäische Patentanmeldung Nr. 116454,1983). Die Einführung dieser Verstärker führte schließlich zur Entwicklung von Immuntests auf der Grundlage der verstärkten Chemilumineszenz (unter Verwendung von Peroxydase als Marker) in Verbindung mit Luminol und Wasserstoffperoxid (Europäische Patentanmeldung Nr.87959). Dieses System wird gegenwärtig unter der Markenbezeichnung „Amerlite" durch Amersham auf den Markt gebracht.

Diese Art der Lumineszenzanalyse ist zwar leicht durchführbar und führt rasch zu Ergebnissen, jedoch weisen auf Luminol basierende Moleküle bei Konjugation mit anderen Molekülen eine wesentlich verringerte Quantenausbeute auf (Wecks, I., und Woodhead, J. S. !Chemiluminescence immunoassay. J. Clin. Immunoassay 7:82,1984; Weeks, !.,Beheshti, !.,McCapra, F. et al., Acridinium esters as high specific labels in immunoassays. CNn. Chem. 29:1474,1983). Daher ist die Anwendung des „Amerlite"-Systems auf den Nachweis von Meerrettichperoxydase beschränkt.

In jüngster Zeit hat sich das Interesse an der Verwendung von Molekülen auf Acridinbasis zur Entwicklung von Luminiszenz-Tests verstärkt. Aufgrund von Unterschieden in der Chemilumineszenz-Reaktion können von Acridin hergeleitete Moleküle im Gegensatz zu Molekülen auf Luminolbasis leicht mit Proteinen gekoppelt werden, ohne daß es zu einer Verringerung der Quantenausbeute kommt (Weeks, !.,Beheshti, !.,McCapra, F., u.a.: Acridinium esters as high specific labels in immunoassays. Clin. Chem. 29:1474,1983). Unter basischen Bedingungen wurde nachgewiesen, daß ein typisches acridinsalzähnliches bis-N-Methyl-acridindinitrat(Lucigenin) durch Wasserstoffperoxid zu zwei Molekülen N-Methylacridon oxidiert wird, von denen eines im angeregten Zustand gebildet wird. Die Relaxation dieses angeregten Zustandes geht mit der Emission vn Licht mit einer Wellenlänge von 470nm einher (Allen, R.C., in Liquid Scintillation Counting: Recent Applications and Developments, Bd. 2, Peng, CT., Horrocks, D.OL. und Alpen, E. L. (Hrsg.), Academic Press, New York: 37:1980).

Nach demselben Prinzip wurden auf Acridin basierende Ester synthetisiert, die Licht aussenden, wenn eine konzertierte Spaltung von Mehrfachbindungen über ein Dioxetanzwischenprodukt erfolgt, wobei sich vibronisch angeregte Moleküle des N-Methylacridon ergeben (McCapra, F.: Chemiluminescence of organic compounds. Prog. Org. Chem. 8:231,1977). Wichtig ist dabetdaß_das angeregte Produktmolekül vor der Emission von Photonen von den ursprünglichen Molekülen abgetrennt wird. Auf diese Weise haben jegliche strukturelle Veränderungen in bezug auf Substitutionen am alkoholischen Teil des Esters keinen Einfluß auf die endgültige Lichtausbeute (Weeks, I., Behesti, I., McCapra, F., u.a.: Acridinium esters as high specific labels in immunoassays. CMn. Chem. 29:1474,1983).

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Es wurden auch Substrate mit stabilisierten Dioxetanverbindungen synthetisiert, die durch enzymatische Einwirkung gespalten' werden, wobei sich die freie Dioxetan-Zwischenverbindung ergibt. Dabei ist die Lichtemissionsrate von der Enzymeinwirkung abhängig (Europäische Patentanmeldung Nr.254051).

Die Koppelung von Arylacridinestern an N-Succinimidylester wurde mit Erfolg für die Markierung von Antikörpern bei minimalem Verlust ihrer immunologischen Aktivität eingesetzt (Europäische Patentanmeldung Nr.263657). Die Methode als solche kommt bei verschiedenen Tests zur Anwendung, die derzeit unter der Markenbezeichnung „Magic Ute" durch Ciba Corning auf den Markt gebracht werden.

Aufgrund der Tatsache, daß sowohl bei „Amerlite" als auch bei „Magic Lite" die Lichtemission bei Anregung zwangsläufig kurzzeitig ist, ist keines der beiden Systeme in der Routineanalyse im großen Maßstab zur Anwendung gekommen. Mit Acridinestermolekülen („Magic Lite"-System) wird lediglich ein „Lichtblitz" erzeugt, und das Signal der durch Meerrettichperoxydase katalysierten, von Luminol abhängigen Chemilumineszenz („Amerlite"-System) kann sich selbst in Gegenwart eines Verstärkers innerhalb von 30 Minuten um 30% verringern (Edwards, J.C: Development and performance of the Amerlite system. Enhanced luminescence: a practical immunoassay system. In: Proceedings of a Workshop, Minster Lovell, UK, 1985. The Medicine Publishing Foundation. Symposium Series 18).

Schließlich ist bei beiden Testmethoden aufgrund der spezifischen Ausführungsform der Einsatz von Spezialgeräten wie Luminometern zum Signalnachweis erforderlich.

Mit der vorliegenden Erfindung ist es zum einen möglich, die Probleme, welche bislang mit chemilumineszenten Systemen verbunden waren, zu überwinden. Zum anderen bietet sie breite Anwendungsmöglichkeiten bei Analyseverfahren.

Ein Aspekt der Erfindung besteht darin, daß eine chemilumineszente Zusammensetzung zur Verfugung gestellt wird, die durch

eine langandauernde Lichtsignalemission und eine hohe Quantenausbeute gekennzeichnet ist. |

Als weiteren Aspekt beinhaltet die Erfindung eine chemilumineszente Zusammensetzung, in der die wäßrige Umgebung reduziert ist, woraus sich der Vorteil der Probenverkleinerung ergibt.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung befaßt sich mit einer chemilumineszenten Zusammensetzung, in der kein Enzym erforderlich ist, wodurch Probleme in bezug auf Stabilität und Lagerung vermieden werden.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist eine chemilumineszente Zusammensetzung, die den Nachweis von pH-Schwankungen sowie die pH-Messung, insbesondere bei kleinem Probevolumen, ermöglicht Ein weiterer Aspekt der Erfindung besteht darin, daß eine quantitative und/oder qualitative Analyse verschiedener chemischer oder biochemischer Verbindungen ermöglicht wird.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung besteht in einer chemilumineszenten Zusammensetzung, mit der Acridinderivate speziell in kleinen Probemengen nachgewiesen und quantifiziert werden können.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung besteht darin, daß eine chemilumineszente Zusammensetzung zum Nachweis und zur Quantifizierung von Reduktionsmitteln speziell in kleinen Probemengen vorgestellt wird.

Ein anderer Aspekt der Erfindung besteht in einer chemilumineszenten Zusammensetzung, mit deren Hilfe Immuntests und Hybridisierungsreaktionen, insbesondere in kleinen Probemengen, quantifiziert werden können.

Ein weiterer Erfindungsaspekt beinhaltet eine chemilumineszente Zusammensetzung zur Bestimmung und Quantifizierung .

enzymatischer Aktivität, wie beispielsweise von Urease, alkalischer Phosphatase oder Peroxydase.

In einem weiteren Aspekt der Erfindung geht es um eine chemilumineszente Verbindung, mit deren Hilfe Chemilumineszenz-Tests durchgeführt werden können, bei denen für den Nachweis des Lichtsignals keine speziellen Instrumente verwendet werden müssen.

All diese Aspekte beruhen auf einer homogenen alkoholisch-wäßrigen chemilumineszenten Zusammensetzung, die folgendes beinhaltet:

- eine Lösung, die ein Acridinderivat enthält, wobei die Lösung vorzugsweise wäßrig ist;

- einen mit Wasser mischbaren Alkohol;

- ein Reduktionsmittel, das in Abhängigkeit von entsprechenden pH-Bedingungen anwesend oder abwesend sein kann, unter der Voraussetzung, daß der Alkohol nicht von einem Acridinderivat abgeleitet ist sowie kein Acridanol und kein von einem Acridanolderivat abgeleiteter Alkohol ist, der während der chemilumineszenten Reaktion hätte entstehen können.

Das Acridinderivat kann entweder wasserlöslich oder alkohollöslich sein oder in der homogenen alkoholisch-wäßrigen Zusammensetzung löslich gemacht werden.

Der Begriff „chemilumineszente Zusammensetzung" bedeutet, daß bei Mischung aller obengenannten Komponenten (d.h. des Acridinderivats, des mit Wasser mischbaren Alkohols und möglicherweise eines Reduktionsmittels) aufgrund der chemilumineszenten Reaktion zwischen diesen Komponenten Licht emittiert wird, wobei die Lichtemission wahrscheinlich von dem Acridinderivat herrührt, das ein Zwischenmolekül erzeugt, welches zur Relaxation von einem angeregten Zustand in einen Grundzustand neigt.

Der Begriff „homogene alkoholisch-wäßrige chemilumineszente Zusammensetzung" bedeutet, daß die Zusammensetzung Alkohol und eine wäßrige Lösung enthält, wobei der Alkohol in der wäßrigen Lösung mit Wasser mischbar ist, was zu einer

homogenen wäßrigen Phase führt. '

Der Begriff „mit Wasser mischbarer Alkohol" bedeutet, daß der Alkohol entweder wasserlöslich ist oder, falls nicht, eine homogene Suspension in Wasser bilden kann, deren Stabilität ausreicht, damit eine chemilumineszente Reaktion stattfinden

Im Falle eines nicht wasserlöslichen Alkohols muß die Suspension des Alkohols in Wasser ausreichend stabil sein, um die Chemilumineszenz zu ermöglichen, am besten über einen ausreichend langen Zeitraum, um die Chemilumineszenzreaktion andauern zu lassen. Die Suspension des Alkohols in Wasser sollte günstigerweise über einen Zeitraum stabil sein, der mindestens so lang ist wie die Lichtemission, damit diese nicht aufgrund der Instabilität der chemilumineszenten Zusammensetzung unterbrochen wird.

Ist der verwendete Alkohol nicht wasserlöslich, erhält man die homogene alkoholisch-wäßrige Lösung durch Schütteln - z. B.

Beschallen - der alkoholhaltigen wäßrigen Lösung.

,atteijw in einem solchen Fall kann die Stabilität der homogenen alkoholisch-wäßrigen Lösung mit Hilfe von Stabilisatoren wie

ung Wt beispielsweise Emulgatoren aufrecht erhalten werden, solange der Stabilisator die Molekularstruktur des Acridinderivats und

insbesondere die angeregte Zwischenzusammensetzung, die das Licht emittiert, nicht stört.

Bei dem Alkohol handelt es sich um einen primären, sekundären oder tertiären aliphatischen Alkohol, heterocyclischen Alkohol ils fj oder einen Polyalkohol.

Die Alkoholdefinition schließt keinen Zucker ein, jedoch Mercaptoalkohole.

In dieser Form ist die Erfindung durch folgendes charakterisiert:

- eine hohe Quantenausbeute der chemilumineszenten Reaktion und eine optimierte langanhaltende Lichtemission, aufgrund derer keine speziellen Instrumente für die Injektion von Reagenzien, die vor einem Photomultiplier positioniert sind, erforderlich sind. Der Test ist demzufolge nicht komplizierter als derzeit übliche enzymgebundene Immunosorbenstests;

- eine Empfindlichkeit des Tests, die genauso oder besser ist als die normalerweise bei Radioimmuntests erzielte.

Die erfindungsgemäße chemilumineszente Zusammensetzung erzeugt eine Lichtemission, die länger als 50 Minuten anhält und

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deren maximale Dauer etwa zehn Tage betragen kann. Das aus der erfindungsgemäßen chemilumineszenten Zusammensetzung resultierende Lichtsignal bleibt im wesentlichen bei dem Maximalwert konstant, der während der gesamten Dauer der Lichtemission erreicht wird.

Die Quantenausbeute der erfindungsgemäßen chemilumineszenten Zusammensetzung ist höher als die Quantenausbeute des in klassischen chemilumineszenten Reaktionen verwendeten Acridinderivate und liegt über 0,005, insbesondere über 0,01 und speziell über 0,05.

Die Intensität des Lichtsignals variiert zwischen etwa 100 und ungefähr 6 χ 10⁶ (ausgedrückt in Impulse pro Minute [c.p.m.]).

Die erfindungsgemäße chemilumineszente Zusammensetzung umfaßt:

- einen Alkohol in Abwesenheit eines Reduktionsmittels unter der Voraussetzung, daß die wäßrige Phase den richtigen pH-Wert hat, um die chemilumineszente Reaktion stattfinden zu lassen; oder

- einen Alkohol in Gegenwart eines Reduktionsmittels.

Ist in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung kein Reduktionsmittel vorhanden, muß die wäßrige Lösung einen solchen pH-Wert aufweisen, daß der Alkohol selbst die chemilumineszente Reaktion auslöst. Der pH-Wert der wäßrigen Lösung kann durch Addition einer Base so eingestellt werden, daß der Alkohol die chemilumineszente Reaktion auslöst.

Im Hinblick auf die Base gibt es keine Einschränkungen, solange sie die Molekularstruktur des Acridinderivats und insbesondere die angeregte Zwischenverbindung, die die Lichtemission bewirkt, nicht stört.

Die für die chemilumineszente Zusammensetzung erforderliche Alkoholmenge hängt von der Art des Alkohols sowie vom pH-Wert der wäßrigen Lösung ab und ist eine abnehmende Funktion des pH-Wertes, was bedeutet, daß die erforderliche Alkoholmenge um so geringer ist, je höher der pH-Wert liegt.

Weist die wäßrige Lösung einen pH-Wert auf, der es nicht zuläßt, daß der Alkohol eine chemilumineszente Reaktion auslöst, wird ein Reduktionsmittel benötigt.

Ist in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung ein Reduktionsmittel vorhanden, so ist dieses Teil der wäßrigen Lösung.

In diesem Fall kann die erfindungsgemäße chemilumineszente Zusammensetzung wie folgt definiert werden:

- eine vorzugsweise wäßrige Lösung aus einem Acridinderivat und einem Reduktionsmittel;

- ein mit Wasser mischbarer Alkohol.

Eine günstige Variante besteht darin, daß die erfindungsgemäße chemilumineszente Zusammensetzung zusätzlich zu dem Acridinderivat und dem Alkohol ein Reduktionsmittel umfaßt, selbst wenn der pH-Wert der wäßrigen Lösung die Auslösung einer chemilumineszenten Reaktion durch den Alkohol ermöglicht. Eine solche Zusammensetzung bietet nämlich den Vorteil erhöhter Empfindlichkeit.

Bei einer weiteren günstigen Variante enthält die erfindungsgemäße chemilumineszente Zusammensetzung zusätzlich zum Reduktionsmittel, zum Alkohol und zum Acridinderivat eine Base, mit der der pH-Wert erhöht wird. Eine solche Zusammensetzung hat den Vorteil, daß die chemilumineszente Reaktion durch höhere Empfindlichkeit gekennzeichnet ist.

In Abhängigkeit von dem Verfahren oder Test, in dem die erfindungsgemäßen chemilumineszenten Zusammensetzungen eingesetzt werden, kann es bei NichtVerwendung eines Reduktionsmittels günstiger sein, wenn der pH-Wert in einem höheren Bereich liegt; bei Verwendung eines Reduktionsmittels dagegen günstiger, wenn er sich in einem niedrigeren Bereich bewegt.

Die wäßrige Lösung des Acridinderivats kann eine biologische Probe sein, in der ein Acridinderivat aufgelöst ist. In einem solchen Fall macht es der pH-Wert der wäßrigen Lösung erforderlich, daß die erfindungsgemäße Chemilumineszenz ein Reduktionsmittel beinhaltet.

Im Zusammenhang mit der Erfindung eignen sich als biologische Proben unter anderem Blut, Zerebrospinalflüssigkeit, einzelne Zellen oder Sputum.

Bei einer anderen Variante beinhaltet die erfindungsgemäße chemilumineszenteZusammensetzung eine wäßrige Pufferlösung,

z. B. Phosphatpuffer, Trispuffer, Acetatpuffer, Diethanolaminpuffer, Barbitalpuffer etc.

Geeignet sind solche Puffer, die die Molekularstruktur des Acridinderivats, insbesondere die für die chemilumineszente Reaktion verantwortliche Zwischenverbindung, nicht stören.

Außerdem darf der Puffer keinen störenden Einfluß auf den Test oder das Verfahren ausüben, in denen die erfindungsgemäße chemilumineszente Zusammensetzung zur Anwendung kommt.

Wird beispielsweise die chemilumineszente Zusammensetzung zum Nachweis und zur Quantifizierung der enzymatischen Aktivität der alkalischen Phosphatase verwendet, so ist der Gebrauch eines Phosphatpuffers unangebracht.

Diese wäßrige Pufferlösung ist für die chemilumineszente Reaktion per se nicht wesentlich, sie kann jedoch bei einigen Anwendungsgebieten nützlich sein, wie beispielsweise bei analytischen Methoden, wo die durch die erfindungsgemäße chem¹ ilumineszente Zusammensetzung erzeugte chemilumineszente Reaktion eine Rolle spielt. In einem solchen Fall ermöglicht die Anwesenheit eines Puffers die Einstellung des für die Enzymaktivität optimalen pH-Wertes.

In der erfindungsgemäßen chemilumineszenten Zusammensetzung ist das Acridinderivat entweder wasser-oder alkohollöslich oder kann in einer homogenen alkoholisch-wäßrigen Zusammensetzung löslich gemacht werden. Außerdem muß es in der Lage sein, ein Zwischenmolekül zu bilden das dazu neigt, sich auf cyclische Weise aus einem angeregten Zustand in einen Grundzustand zu begeben sowie wieder in einen angeregten Zustand zurückzukehren.

Die Formel des Acridinderivats lautet beispielsweise wie folgt:

-9- 286

2X"oderX²-

2 X" oder X²~ ein negativ geladenes Gegenion (so daß die poositive Ladung des obigen Moleküls durch die negative Ladung von X ausgeglichen wird) oder ein Nitrat-, Sulfat-, Phosphat- oder Chloratgegenion darstellt, R für eine aliphatische Kette von 1-6 Kohlenstoffatomen, insbesondere 1—4 Kohlenstoffatomen und speziell CH₃ steht, wobei wenigstens einer der Phenylringe wahlweise substituiert wird, vorausgesetzt, das Acridinderivat ist entweder wasser- oder alkohollöslich oder kann in einer homogenen alkoholisch-wäßrigen Zusammensetzung löslich, vorzugsweise wasserlöslich, gemacht werden, und das besagte Acridinderivat vorzugsweise Lucigenin ist;

worin R die obengenannte Bedeutung hat, wobei mindestens einer der Phenylringe wahlweise substituiert wird, vorausgesetzt, das Acridinderivat ist entweder wasser- oder alkohollöslich oder kann in einer homogenen alkoholisch-wäßrigen Zusammensetzung löslich, vorzugsweise wasserlöslich, gemacht werden, oder

worin Y ein negativ geladenes Gegenion wie FSO₃- oder NO₃ darstellt (damit die negative Ladung von Y durch die positive Ladung des obigen Moleküls ausgeglichen wird),

steht, wobei wenigstens einer der Phenylringe dazu neigt, substituiert zu werden, vorausgesetzt, das Acridinderivat ist entweder wasser- oder alkohollöslich oder kann in der homogenen alkoholisch-wäßrigen Zusammensetzung löslich, vorzugsweise wasserlöslich, gemacht werden, oder.

in der R₁ obige Bedeutung hat,

wobei wenigstens einer der Phenylringe zur Substitution neigt, vorausgesetzt, das Acridinderivat ist entweder wasser- oder alkohollöslich oder kann in der homogenen alkoholisch-wäßrigen Zusammensetzung löslich, vorzugsweise wasserlöslich, gemacht werden.

Ein bevorzugtes Acridinderivat ist Lucigenin. Der Alkohol ist vorzugsweise kein Mercaptoalkohol.

In bevorzugten erfindungsgemäßen Zusammensetzungen handelt es sich bei dem mit Wasser mischbaren Alkohol um primären, sekundären odertertiären Alkohol mit 1-6, insbesondere 1-4 Kohlenstoffatomen, besonders Methanol, Ethanol, n-Propanol, Isopropanol oder Butanol.

Werden Methanol, Ethanol oder Propanol verwendet, so wird der Alkohol am besten als wasserlöslich charakterisiert, kommt dagegen Butanol zum Einsatz, wird er am besten als mit Wasser mischbar charakterisiert.

Günstige wasserlösliche Alkohole sind Polyvinylalkohol und der unter der Markenbezeichnung „Triton X100" vertriebene Alkohol.

In dem Verfahren, in dem die erfindungsgemäße chemilumineszente Zusammensetzung angewendet wird, kann Propanol günstig sein, wenn der pH-Wert der wäßrigen Lösung bei etwa 3 liegt. Im Ergebnis dessen ist es nicht erforderlich, ein Reduktionsmittel einzusetzen, was speziell gilt, wenn das Alkoholvolumen 90% des Gesamtvolumens der Zusammensetzung ausmacht.

Ein vorteilhafter pH-Wert-Bereich der wäßrigen Lösung in der erfindungsgemäßen chemilumineszenten Zusammensetzung ist der von 0 bis ca. 14, insbesondere von etwa 4 bis etwa 8, speziell von ca. 6 bis ca. 7,6.

Diese pH-Wert-Bereiche sind in biologischen Proben vorhanden, bei denen solche Chemilumineszenz-Tests eine Rolle spielen könnten.

Das Reduktionsmittel muß so beschaffen sein, daß es die Molekularstruktur des Acridinderivats und insbesondere die für die chemilumineszente Reaktion verantwortliche/n Zwischenverbindung/en nicht stört.

Das Reduktionsmittel hat vorzugsweise ein Redoxpotential von mindestens 0,2 V, vorzugsweise von mindestens 0,3 V.

Geeignete Reduktionsmittel sind beispielsweise Ascorbinsäure, Mannose, Glucose, NADH oder NADPH oder Hydrochinon.

Entsprechend einer anderen Variante beinhaltet die chemilumineszente Zusammensetzung zusätzlich zu der wäßrigen Lösung aus einem Acridinderivat sowie möglicherweise einem Reduktionsmittel, einer Base und einem Puffer auch ein Enzym.

Das Enzym kann Urease oder alkalische Phosphatase sein.

Bei einer weiteren Variante kann die erfindungsgemäße chemilumineszente Zusammensetzung zusätzlich zu dem Enzym ein Substrat für das Enzyment halten.

Bei einer weiteren Variante kann zu der erfindungsgemäßen chemilumineszenten Zusammensetzung eine Substanz gehören, die in der Lage ist, den pH-Wert zu erhöhen, wenn sie mit dem zu bestimmenden bzw. zu quantifizierenden Element in Kontakt gebracht wird.

Die erfindungsgemäße chemilumineszente Zusammensetzung kann beispielsweise Ninhydrin enthalten, das zu einer pH-steigernden, durch die Freisetzung von NH₃ bestimmbaren Substanz wird, wenn es mit einer Aminosäure zusammengebracht wird.

Derartige erfindungsgemäße chemilumineszente Zusammensetzungen sind für Analyseverfahren nützlich.

Die verschiedenen Elemente der erfindungsgemäßen chemilumineszenten Zusammensetzung können zu jeder beliebigen Zeit in einer bestimmten Konzentration vorhanden sein oder in ihrer aktiven Form in situ hervorgebracht werden.

Das Acridinderivat kann in situ freigesetzt werden, beispielsweise aus einer eingekapselten Form wie einer Polymereinkapselung,

z. B. Liposome, Niosome, vorausgesetzt, die Einkapselung ist der,chemilumineszenten Reaktion nicht im Wege.

Was den Alkohol anbetrifft, so kann dieser in situ durch chemische Reaktionen erzeugt werden.

Als Reduktionsmittel kann ein pH-abhängiges Mittel wie Hydrochinon verwendet werden, das zu einem Reduktionsmittel wird, wenn der pH-Wert der wäßrigen Lösung 7,8 erreicht und über diesen Wert hinaus ansteigt.

Eine vorteilhafte erfindungsgemäße chemilumineszente Zusammensetzung ist die folgende:

- Acridinderivat: von ca. 0,01 %-etwa 99,99% (Volumen), insbesondere von etwa 10%- etwa 90% bei einer Konzentration von ca. 1_0_-⁴-ca. 10"^l0M/l, besonders von etwa 10~⁴-etwa 10~⁶M/l;

- Alkohol (reiner Alkohol von einem industriellen Erzeuger) von etwa 0,5%-etwa 99,5% (Volumen), insbesondere von etwa 10%- etwa 99,5% (alle Prozentzahlen sind Volumenanteile und die Konzentrationen beziehen sich auf das Gesamtvolumen der erfindungsgemäßen chemilumineszenten Zusammensetzung).

Eine weitere bevorzugte erfindungsgemäße chemilumineszente Zusammensetzung beinhaltet folgendes:

- Acridinderivat: von etwa 0,01-99,99%, insbesondere von etwa 10-90% (Volumen), bei einem Konzentrationsbereich von etwa 10~⁴-10-¹⁰M/I;

- Alkohol (von reinem Alkohol): von etwa 10-99,5% (Volumen), insbesondere von etwa 10-90%;

- Reduktionsmittel: von etwa 0,1-99,9% (Volumen) bei einer Konzentration von ca. 100mg/ml-10 mg/ml.

Die Temperatur der chemilumineszenten Zusammensetzung ist vorzugsweise gemäßigt zu halten, in einem Bereich von etwa 10-50°C, am besten jedoch bei Zimmertemperatur. Die Temperatur der chemilumineszenten Zusammensetzung sollte am besten unter dem Siedepunkt von Alkohol liegen, um sein Verdampfen zu verhindern.

Zur Herstellung der erfindungsgemäßen chemilumineszenten Zusammensetzung werden die verschiedenen Komponenten in beliebiger Reihenfolge zusammengegeben, d. h. die wäßrige, vorzugsweise gepufferte Lösung aus Acridinderivat (und '·-,

möglicherweise einem Reduktionsmittel und/oder einer Base) und der Alkohol werden gemischt, wobei es gleichgültig ist, in % welcher Reihenfolge die verschiedenen Komponenten zugesetzt werden. ν

Wird die erfindungsgemäße chemilumineszente Zusammensetzung jedoch in einem Test verwendet, bei dem es zu einer 'j

enzymatischen Reaktion kommt, kann es sich als günstig erweisen, den Alkohol erst dann der vorzugsweise wäßrigen Lösung (aus Acridinderivat, einem Enzym und möglicherweise einem Reduktionsmittel und einem Puffer) zuzugeben, wenn die enzymatische Reaktion das entsprechende gewünschte Stadium erreicht hat oder beendet ist, da die Anwesenheit von Alkohol diese zum Stillstand bringen kann.

Die erfindungsgemäße chemilumineszente Zusammensetzung kann so eingesetzt werden, daß die Lichtemission von folgenden Faktoren abhängt:

1. der Menge Acridinderivat, wenn ein Überschuß an Reduktionsmittel und Alkohol vorhanden ist,

2. der Menge Reduktionsmittel, wenn ein Überschuß an Acridinderivat und Alkohol vorhanden ist,

3. der Art und Konzentration des Alkohols, wenn ein Überschuß an Acridinderivat und Reduktionsmittel vorhanden ist, ϊ

4. dem pH-Wert der wäßrigen Pufferlösung. ^;| Die Erfindung bezieht sich außerdem auf lumineszente oder luminometrische Tests, bei denen die chemilumineszente Reaktion! auf der chemilumineszenten Zusammensetzung basiert. I Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Bestimmung der Konzentration des Acridinderivats in einer vorzugsweise f wäßrigen Lösung, in der die Konzentration des Reduktionsmittels ebenso wie die Konzentration des Alkohols und der pH-Wert i\ konstant ist, wobei die Stärke des in der chemilumineszenten Reaktion erzeugten Lichts eine Funktion der | Acridinderivatkonzentration ist. ν Für den quantitativen Nachweis des Acridinderivats muß die erfindungsgemäße chemilumineszente Zusammensetzung so h beschaffen sein, daß ein Alkoholüberschuß gegenüber dem Acridinderivat vorhanden ist, und daß bei Anwendung eines f Reduktionsmittels dieses im Überschuß gegenüber dem Acridinderivat vorhanden ist.

Der Alkoholüberschuß gegenüber dem Acridinderivat bedeutet, daß der Anteil des Alkohols am Gesamtvolumen der Zusammensetzung mindestens 90% beträgt. Der Reduktionsmittelüberschuß gegenüber dem Acridinderivat bedeutet, daß > mindestens 1 mg/ml Reduktionsmittel vorhanden ist.

Die quantitative Acridinbestimmung wird vorteilhafterweise bei einem Alkoholanteil von etwa 99% am Gesamtvolumen der chemilumineszenten Zusammensetzung und einem Anteil der wäßrigen Acridinlösung (bei einer Konzentration im Bereich von

etwa 10~³-10~⁷M) von ca. 1 % am Gesamtvolumen der chemilumineszenten Zusammensetzung vorgenommen, _;>

Ist in der erfindungsgemäßen chemilumineszenten Zusammensetzung ein Reduktionsmittel vorhanden, kann dieses einen |

Anteil von etwa 1 % am Gesamtvolumen der chemilumineszenten Zusammensetzung haben (bei einem Konzentrationsbereich ' des Reduktionsmittels von ca. 10 μg/ml-1 mg/ml).

Liegt der pH-Wert der Zusammensetzung beispielsweise höher als 9, so kann der Alkoholüberschuß gegenüber dem Acridin so aussehen, daß das volumetrische Verhältnis Alkohol/Acridin ca. 10%/90% bis ca. 99%/1 % beträgt.

Liegt der pH-Wert der Zusammensetzung im Bereich von 5-7, kann der Alkoholüberschuß gegenüber Acridin so aussehen, daß |

das volumetrische Verhältnis Alkohol/Acridin ca. 60%/40% bis ca. 99%/1 % beträgt. |

Die Quantifizierung von Acridin könnte für die bestimmung eines Antigens oder Antikörpers nützlich sein, indem man das zu bestimmende Antigen oder den Antikörper entsprechend mit einem Acridinderivat koppelt. Das zu quantifizierende Acridin kann in eingekapselter Form vorliegen, so wie in einem Polymer, beispielsweise in Liposomen oder Niosomen, unter der Bedingung, daß die eingekapselte Form die chemilumineszente Reaktion nicht stört. Dabei wird die eingekapselte Form selbst als Marker für die Quantifizierung eines Antigens oder Antikörpers oder einer Nukleinsäuresequenz verwendet.

Die Erfindung bezieht sich außerdem auf ein Verfahren zur Bestimmung der Konzentration des Reduktionsmittels in einer wäßrigen Lösung, in der die Konzentration des Acridinderivats und des Alkohols sowie der pH-Wert konstant gehalten werden, j wobei die bei der chemilumineszenten Reaktion erzeugte Lichtrate eine Funktion der Konzentration des Reduktionsmittels ist.

Für die quantitative Bestimmung eines Reduktionsmittels muß die erfindungsgemäße chemilumineszente Zusammensetzung so beschaffen sein, daß ein Überschuß sowohl an Acridinderivat als auch an Alkohol gegenüber dem Reduktionsmittel vorhanden ist.

Der Überschuß an Acridinderivat gegenüber dem Reduktionsmittel bedeutet einen Konzentrationsbereich des Acridinsvon 1O-³_M-1O"⁵M.

Der Überschuß an Alkohol gegenüber dem Reduktionsmittel bedeutet in Abhängigkeit von der Art des Alkohols einen Volumenanteil von mindestens 60%.

Eine für die Quantifizierung eines Reduktionsmittels geeignete Zusammensetzung, die einen Überschuß an Acridinderivat und Alkohol gegenüber dem Reduktionsmittel aufweist, setzt sich wie folgt zusammen:

- ein Volumenanteil von etwa 1% Acridinderivat mit einer Konzentration von etwa 10"⁴M;

— ein Volumenanteil von etwa 90% Alkohol, wobei das Volumen des Reduktionsmittels (mit einem Konzentrationsbereich von etwa 1 pg/ml-1 mg/ml) etwa 9% des Gesamtvolumens der chemilumineszenten Verbindung ausmacht.

Die Acridinderivat-abhängige verstärkte Chemilumineszenz, die auf Veränderungen in der Reduktionskapazität der chemilumineszenten Phase, vorzugsweise der wäßrigen Phase beruht, kann für den Nachweis und die Quantifizierung beliebiger Marker oder Substanzen eingesetzt werden, die an sich reduzierend wirken oder durch eine chemischen Reaktion reduzierend Wirkung erlangen können.

Die Erfindung bezieht sich außerdem auf ein Verfahren zur pH-Wert-Bestimmung oder zur Bestimmung von pH-Wert-Schwankungen in wäßrigen Lösungen - besonders bei sehr geringen Mengen von gelösten Stoffen, also beispielsweise weniger als etwa 10μΙ, insbesondere ca. 0,1 μΙ bis ca. 1 μΙ - mit einer konstanten Acridin-, Alkohol- und Reduktionsmittelkonzentration, wobei die in der chemilumineszenten Reaktion erzeugte Lichtrate eine Funktion des pH-Wertes ist.

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Bei dieser Anwendungsform der Erfindung können pH-Wert-Schwankungen entweder auf stöchiometrische oder zeitabhängige Weise in situ hervorgerufen werden. ~-

Entsprechend einer bevorzugten Anwendungsform der Erfindung können pH-Wert-Erhöhungen in wäßrigen Lösungen, wie ^ln beispielsweise in biologischen Proben, gemessen werden.

Zum Beispiel kann der pH-Wert durch Hinzufügen festgelegter Mengen an pH-erhöhenden Substanzen wie basischen Ionen wie z. B. OH- und CN-, polybasischen Ionen oder hochbasischen Molekülen wie Spermin, Spermidin und Cadaverin gesteigert werden. Auf diese Weise wird der pH-Wert stöchiometrisch erhöht.

Der pH-Wert kann auch durch eine enzymatische Reaktion gesteigert werden, wiez. B. die Reaktion, die aus der Addition eines ^g ionenerzeugenden Enzyms resultiert, beispielsweise aus der Addition von Urease, die zur Entstehung von NH₄ ⁺-lonen führt.

Der pH-Wert wird hier auf zeitabhängige Weise erhöht.

Findet die chemilumineszente Reaktion vor Beendigung der enzymatischen Reaktion statt, in deren Verlauf die Urease NH₄ ⁺-lone erzeugt, ist die pH-Wert-Erhöhung eine zeitabhängige Reaktion.

Findet die chemilumineszente Reaktion nach Beendigung der genannten enzymatischen Reaktion statt, wird der pH-Wert zeitunabhängig, d. h. stöchiometrisch erhöht. Zur Bestimmung einer durch enzymatische Reaktionen bewirkten pH-Wert-Erhöhung sollte der pH-Wert der wäßrigen Lösung vor Auftreten der Schwankungen (Anfangs-pH-Wert) günstigerweise so sein, daß das für die pH-Wert-Erhöhung verantwortliche Enzym seine maximale Aktivität aufweist.

Beispielsweise liegt bei Verwendung von Urease der Anfangs-pH-Wert in Acetatpuffer am besten bei 6,5 und in Phosphatpuffer bei 7,5.

^ion Bei der Bestimmung einer pH-Wert-Erhöhung durch eine pH-steigernde Substanz, die nicht das Ergebnis einer enzymatischen

Reaktion ist, kann der Anfangs-pH jeden beliebigen Wert haben. In diesem Fall kann es sich jedoch als notwendig erweisen, eine Kontrollbestimmung ohne die pH-steigernde Substanz durchzuführen.

Die Bestimmung der pH-Wert-Schwankung einer wäßrigen Lösung erfolgt günstigerweise unter Bedingungen, die keine chemilumineszente Reaktion vor der Addition der pH-steigernden Substanz zulassen. Erfindungsgemäß kann auch ein Absinken des pH-Wertes in wäßrigen Lösungen gemessen werden.

Die Bestimmung von pH-Wert-Schwankungen in kleinen Volumen könnte für klinische Labors und chirurgische Abteilungen von Nutzen sein, beispielsweise um pH-Wert-Schwankungen von biologischen Proben wie Blutserum im Verlaufe von Operationen bestimmen zu können.

Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren, bei dem die Konzentration der Acridinverbindungen und der wasserlöslichen Verbindungen konstant ist und bei dem eine konstante Menge Reduktionsmittel entweder stöchiometrisch oder zeitabhängig erzeugt wird, sobald ein bestimmter pH-Wert erreicht oder überschritten ist.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Quantifizierung von pH-steigernden Substanzen. Dazu gehört die Einbringung einer ^/on pH-steigernden Substanz z. B. in Form von basischen oder polybasischen Ionen oder von Enzymen, die solche Ionen erzeugen

(wie Urease, die NH⁴⁺ produziert), in einer Lösung aus Acridinderivat und Alkohol; die erzeugte Lichtrate ist eine Funktion der pH-steigernden Substanz.

Bei einer günstigen Vai iante enthält die Lösung aus Acridinderivat und Alkohol eine festgelegte Menge eines Mittels, das bei

Überschreiten eines bestimmten pH-Wertes Reduktionseigenschaften entwickelt. Ein solches Mittel ist Hydrichinon, das bei '^so i. einem pH-Wert von 7,8 zum Reduktionsmittel wird.

Der Vorteil eines solchen Systems liegt darin, daß jegliche Lichtemission ausgeschlossen ist, es sei denn, ein bestimmter

^laß' pH-Wert ist erreicht.

Die Bestimmung pH-steigernder Substanzen kann bei der Qualitätskontrolle pharmazeutischer Präparate oder beim Nachweis von Markern, die eine bestimmte pH-Wert-Veränderung herbeiführen können, sowie bei der Bestimmung eines Antigens,

^ιΠη Antikörpers oder einer Nukleinsäuresequenz Anwendung finden.

Für die Bestimmung einer Substanz unter Verwendung von Urease kann die Urease eingekapselt werden, z. B. durch polymerische Einkapselung, wie dies bei Liposomen oder Niosomen der Fall ist, vorausgesetzt, die eingekapselte Form übt keine störende Wirkung auf die chemilumineszente Reaktion aus. Dabei wird die eingekapselte Form in vielen Fällen als Marker für die zu bestimmende Substanz verwendet.

Die Erfindung bezieht sich außerdem auf ein Verfahren zur Quantifizierung von Antigenen oder Antikörpern unter Verwendung der erfindungsgemäßen chemilumineszenten Zusammensetzung.

Ein solches Verfahren kann die Erbringung einer Lösung, die das zu bestimmende Antigen oder den Antikörper in einer Bindung an eine pH-steigernde Substanz enthält, in eine Lösung aus Acridinderivat und Alkohol beinhalten, wobei günstigerweise ein Reduktionsmittel vorhanden sein sollte. Die erzeugte Lichtrate ist dabei eine Funktion der pH-steigernden Substanz. Von ihr läßt sich die Quantifizierung des Antigens oder Antikörpers durch Vergleich mit Eichkurven ableiten.

Bei einer vorteilhaften Variante enthält die Lösung aus Acridinderivat und Alkohol eine bestimmte Menge eines Mittels, das ab einem gewissen pH-Wert dazu neigt, Reduktionseigenschaften anzunehmen.

Der Vorteil der Verwendung eines solchen Systems liegt darin; daß jegliche Lichtemission ausgeschlossen ist, es sei denn, ein bestimmter pH-Wert ist erreicht.

Gemäß einem weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Verfahren wirkt das zu bestimmende Antigen oder der Antikörper als ein pH-abhängiges Reduktionssystem, und die für den Test verwendete chemilumineszente Zusammensetzung enthält eine pH-steigernde Substanz.

Wirken Antigene oder Antikörper als pH-abhängige Reduktionssysteme, so kann dies so aussehen, daß ein immobilisierter

Antikörper (z. B. auf einem festen Träger fixiert) ein Antigen wie beispielsweise eine Bakterie oder andere eukariotische Zellen '"J. oder TeileTia von einfängt, die selbst zur Produktion eines Reduktionsmittels angeregt werden, wodurch es ztFeiner Veränderung

in der Reduktionskapazität der sie enthaltenden wäßrigen Phase kommt.

Bei einem anderen bevorzugten erfindungsgemäßen Verfahren ist das zu bestimmende Antigen oder der Antikörper an ein pH-abhängiges Reduktionssystem gebunden, und die für den Test verwendete erfindungsgemäße chemilumineszente Zusammensetzung enthält ein pH-steigendes System.

' Entsprechend einer weiteren günstigen Anwendungsform der Erfindung kann das zu quantifizierende Antigen oder der

Antikörper an ein Reduktionsmittel gebunden sein, und die Quantifizierung des Antigens oder des Antikörpers ergibt sich aus der Quantifizierung des Reduktionsmittels.

L·

Gemäß einem weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Verfahren kann das zu quantifizierende Antigen oder der Antikörper an ein Acridinderivat gebunden sein, und die Quantifizierung des Antigens oder Antikörpers ergibt sich aus der Quantifizierung des Acridinderivats.

Die Erfindung betrifft auch die Quantifizierung einer Hybridisierungsreaktion einer Probe mit einer nachzuweisenden Nukleinsäuresequenz, wobei die hybridisierbare Probe mit einer pH-steigernden Substanz markiert sein muß, am günstigsten in Gegenwart eines Reduktionsmittels, insbesondere eines pH-abhängigen Reduktionsmittels wie oben beschrieben, oder mit einer Komponente, die erkennbar ist durch einen mit einer pH-steigernden Substanz markierten Antikörper, günstigerweise in Gegenwart eines Reduktionsmittels, insbesondere eines pH-abhängigen Reduktionsmittels.

Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf eine Methode zum Nachweis und zur Quantifizierung von Aminosäuren unter Einbeziehung der erfindungsgemäßen chemilumineszenten Zusammensetzung, ausgehend von der Bestimmung einer pH-steigernden Substanz wie Ninhydrin.

Ninhydrin wird aufgrund der Freisetzung von NH₃ zu einer pH-steigernden Substanz, wenn man es mit einer Aminosäure in Kontakt bringt.

Dieses mit der Erfindung in Zusammenhang stehende Verfahren zum Nachweis und zur Quantifizierung von Aminosäuren beinhaltet die Zugabe von Ninhydrin zu einer erfindungsgemäßen chemilumineszenten Zusammensetzung, die die nachzuweisende und zu quantifizierende Aminosäure enthält. Diejenige Menge Ninhydrin, die mit der nachzuweisenden und zu quantifizierenden Aminosäure reagiert hat, kann bestimmt werden; demzufolge läßt sich die vorhandene Menge Aminosäure durch Vergleich mit Eichkurven nachweisen und quantifizieren.

Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Messung der Aktivität alkalischer Phosphatase auf einem Substrat, das eine oder mehrere Phosphatgruppen enthält, wobei die chemilumineszente Zusammensetzung eine Lösung aus einer auf Acridin basierenden Komponente, vorzugsweise in gepufferter Lösung, und Mannose enthält sowie ein Alkohol zugegen ist. Die durch die chemilumineszente Reaktion erzeugte Lichtrate ist eine Funktion der Phosphatgruppen, die aus dem Substrat durch das Wirken der alkalischen Phosphatase freigesetzt wurden.

Wird die erfindungsgemäße chemilumineszente Zusammensetzung für die Bestimmung der Aktivität von alkalischer Phosphatase eingesetzt, sollte als Puffer günstigerweise Diethanolaminpuffer und kein Phosphatpuffer verwendet werden.

Das phosphatgruppenhaltige Substrat kann jede beliebige Komponente sein, die eine oder mehrere Phosphatgruppen enthält, solange sie nicht störende Auswirkungen auf die Molekularstruktur des Acridinderivats hat, z.B. ATP, 1,2-Glycerolphosphat, p-Nitrophenylphosphat, ß-Glycerolphosphat, Phosphokreatin oder Indolylphosphat.

Erfindungsgemäß ist bei der Messung der alkalischen Phosphatase derjenige pH-Wert am günstigsten, bei dem die alkalische Phosphatase ihre maximale enzymatische Aktivität zeigt, also ca. 9,8.

Die Bestimmung der Aktivität alkalischer Phosphatase unter Verwendung der erfmdungsgemäßen chemilumineszenten Zusammensetzung kann für die quantitative Bestimmung eines Antigens oder Antikörpers eingesetzt werden. In diesem Fall kann das zu bestimmende Antigen oder der Antikörper an das Enzym gebunden sein, welches mit einem Substrat zur Reaktion gebracht wird. Die in der chemilumineszenten Reaktion erzeugte Lichtrate ist eine Funktion des Stoff Umsatzes.

Für die Quantifizierung eines Antigens oder eines Antikörpers kann die alkalische Phosphatase eingekapselt sein, wie es bei einer polymerischen Einkapselung der Fall ist, beispielsweise in Liposomen oder Niosomen. Die eingekapselte Form darf dabei die chemilumineszente Reaktion nicht stören und wird selbst als Marker für die Quantifizierung eines Antigens, Antikörpers oder einer Nukleinsäuresequenz verwendet.

Bei einer anderen Variante kann das zu quantifizierende Antigen oder der Antikörper an ein Substrat gebunden sein, das eine f

oder mehrere Phosphatgruppen enthält und mit alkalischer Phosphatase zur Reaktion gebracht wird. Die in der |

chemilumineszenten Reaktion erzeugte Lichtrate ist eine Funktion der Phosphatgruppen des Substrats, die durch die Einwirkung f, von alkalischer Phosphatase freigesetzt werden.

Die Bestimmung der Aktivität der alkalischen Phosphatase unter Verwendung der erfindungsgemäßen chemilumineszenten Zusammensetzung kann für den quantitativen und qualitativen Nachweis einer Hybridisierungsreaktion bei einer Probe mit einer nachzuweisenden Nukleinsäuresequenz eingesetzt werden.

Bei einer Variante wird die Probe mit einem Marker vormarkiert, und es wird ein mit alkalischer Phosphatase markierter Antikörper (mono- oder polyklonal) gegen den genannten Marker eingesetzt, um eine enzymatische Reaktion zwischen der alkalischen Phosphatase und einem Substrat, das eine oder mehrere Phosphatgruppen enthält, stattfinden zu lassen. Die in der chemilumineszenten Reaktion erzeugte Lichtrate ist eine Funktion der Phosphatgruppen, die durch die alkalische Phosphatase freigesetzt werden.

Die Erfindung bezieht sich außerdem auf Testausrüstungen, die alles umfassen, was für die Ausführung eines Tests unter Einbeziehung der erfindungsgemäßen chemilumineszenten Zusammensetzung erforderlich ist.

Für die Quantifizierung von Acridinderivaten umfaßt der erfindungsgemäße Testsatz folgendes:

- einen Alkohol .

- eventuell einen Puffer

- ein Reduktionsmittel

- eventuell eine Base, um den pH-Wert der Zusammensetzung konstant einzustellen.

Für die Quantifizierung des Reduktionsmittels umfaßt der erfindungsgemäße Testsatz folgendes:

- ein Acridinderivat

- eventuell einen Puffer

- eventuell eine Base, um den pH-Wert der Zusammensetzung konstant einzustellen

- einen Alkohol.

Für die Quantifizierung von pH-Schwankungen umfaßt der erfindungsgemäße Testsatz folgendes:

- ein Acridinderivat

- eventuell einen Puffer

- eventuell ein Reduktionsmittel

- einen Alkohol.

Für die Quantifizierung von pH-steigernden Substanzen umfaßt der erfindungsgemäße Testsatz folgendes:

- ein Acridinderivat

- eventuell einen Puffer

- eventuell ein Reduktionsmittel

- einen Alkohol.

Für die Quantifizierung eines Antigens oder Antikörpers umfaßt ein erfindungsgemäßer Testsatz folgendes:

- ein Acridinderivat

- einen Alkohol

- eventuell einen Puffer

- ein Reduktionsmittel, vorzugsweise ein pH-abhängiges Reduktionssystem, das mit hoher Wahrscheinlichkeit mit dem zu bestimmenden Antigen oder Antikörper gekoppelt wird Enzymein pH-steigendes System wie beispielsweise ein

- eventuell ein Substrat für das Enzym.

Ein weiterer erfindungsgemäßer Testsatz für die Quantifizierung eines Antigens oder Antikörpers umfaßt folgendes:

- ein Acridinderivat

- einen Alkohol

- eventuell einen Puffer

- ein pH-steigerndes System, beispielsweise ein Enzym wie Urease, das mit hoher Wahrscheinlichkeit mit dem zu bestimmenden Antigen oder Antikörper gekoppelt wird

- eventuell ein Substrat für das Enzym

- eventuell ein Reduktionsmittel, vorzugsweise ein pH-abhängiges Reduktionssystem wie Hydrochinon.

Für die Quantifizierung von Nukleinsäuresequenzen umfaßt ein erfindungsgemäßer Testsatz folgendes:

- ein Acridinderivat

- einen Alkohol

- eventuell einen Puffer

- ein Reduktionsmittel, vorzugsweise ein pH-abhängiges Reduktionssystem, das mit hoher Wahrscheinlichkeit mit derzu bestimmenden Nukleinsäuresequenz gekoppelt wird

- ein pH-steigerndes System, beispielsweise ein Enzym

- eventuell ein Substrat für das Enzym.

Ein weiterer erfindungsgemäßer Testsatz für die Quantifizierung von Nukleinsäuresequenzen umfaßt folgendes:

- ein Acridinderivat

- einen Alkohol

- eventuell einen Puffer

- ein pH-steigerndes System, beispielsweise ein Enzym wie Urease, das mit hoher Wahrscheinlichkeit mit derzu bestimmenden Nukleinsäuresequenz gekoppelt wird

- eventuell ein Substrat für das Enzym

- eventuell ein Reduktionsmittel, vorzugsweise ein pH-abhängiges Reduktionssystem wie Hydrochinon.

Für die Quantifizierung von Aminosäuren enthält ein erfindungsgemäßer Testsatz folgendes:

- ein Acridinderivat

- einen Alkohol

- eventuell einen Puffer

- eine Substanz wie Ninhydrin, die den pH-Wert steigert, wenn sie mit der zu bestimmenden Aminosäure zur Reaktion gebracht

- evefttuelf ein Reduktionsmittel, vornehmlich ein pH-abhängiges wie Hydrochinon. Für die Quantifizierung eines Antigens umfaßt der erfindungsgemäße Testsatz folgendes:

- ein Acridinderivat

- einen Alkohol

- eventuell einen Puffer

- einen polyklonalen oder vorzugsweise monoklonalen Antikörper gegen das zu bestimmende Antigen

- Mittel zum Nachweis des auf das zu bestimmende Antigen gerichteten Antikörpers, das mit hoher Wahrscheinlichkeit mit 11 Urease gekoppelt wird; das Mittel kann beispielsweise ein Antikörper gegen den Antikörper sein, der gegen das zu bestimmende Antigen gerichtet ist, gekoppelt mit Urease

- ein Substrat für die Urease.

Ein erfindungsgemäßer Testsatz für die Quantifizierung eines Antigens oder Antikörpers umfaßt folgendes:

- ein Acridinderivat

- einen Alkohol

- ein Reduktionsmittel, vorzugsweise Mannose

- eventuell einen Puffer

- alkalisches Phosphataseenzym, das mit hoher Wahrscheinlichkeit an den zu bestimmenden Antigen oder Antikörper gebunden wird

- ein Substrat für die alkalische Phosphatase.

Ein günstiger erfindungsgemäßer Testsatz zur Quantifizierung eines Antigens beinhaltet folgendes:

- ein Acridinderivat

- einen Alkohol

- ein Reduktionsmittel, vorzugsweise Mannose

- eventuell einen Puffer

- einen Antikörper zu dem zu bestimmenden Antigen, der mit alkalischer Phosphatase gekoppelt ist

- ein Substrat für die alkalische Phosphatase wie p-Nitrophenylphosphat.

Ein günstiger erfindungsgemäßer Testsatz für die Quantifizierung einer Nukleinsäuresequenz umfaßt folgendes:

- ein Acridinderivat

- einen Alkohol

- eventuell einen Puffer

- ein Reduktionsmittel, vorzugsweise Mannose

- eine vormarkierte Probe, z.B. eine mit Digoxigenin vormarkierte Probe

- einen gegen den Marker der Probe gerichteten Antikörper, der sich mit hoher Wahrscheinlichkeit an alkalische Phosphatase bindet, wobei der Antikörper beispielsweise ein mit alkalischer Phosphatase markierter Antikörper gegen Digoxigenin sein kann ·

- ein Substrat für die alkalische Phosphatase wie z. B. p-Nitrophenylphosphat. f

Die Erfindung betrifft insbesondere eine Testausrüstung für den Nachweis und die Quantifizierung eines beliebigen Antigens | (oder Antikörpers) in einem Testmedium wie Körperflüssigkeit oder Zellüberstand. Dieser Testsatz umfaßt folgendes: f

- Mittel zur Fixierung eines Antikörpers (oder Antigens), der mit hoher Wahrscheinlichkeit mit dem zu bestimmenden Antigen "< (oder Antikörper) einen immunologischen Komplex bildet %

- einen monoklonalen oder polyklonalen Antikörper, der mit einer pH-steigernden Substanz oder einem pH-steigernden Enzym j wie z. B. Urease oder einem phosphaterzeugenden Enzym wie z. B. alkalische Phosphatase einen Komplex bildet, wobei der \ Antikörper dazu neigt, eine spezifische Bindung mit dem zu bestimmenden Antigen (oder Antikörper) einzugehen ;

- eine erfindungsgemäße chemiluminiszente Zusammensetzung. \

Die Erfindung betrifft eine vorteilhafte Ausrüstung für den Nachweis und die Quantifizierung eines beliebigen Antigens (oder , Antikörpers) in einem Testmedium wie z. B. Körperflüssigkeit oder Zeilüberstand. Dieser Testsatz umfaßt folgendes:

- einen festen Träger, vorzugsweise Mikrotestplatten, Luminometergefäße aus Plast oder proteinbindende Membranen, an die kovalent oder nichtkovalent Proteine (d. h. ein Antikörper, wenn die zu bestimmende Substanz ein Antigen ist, oder ein Antigen, wenn die zu bestimmende Substanz ein Antikörper ist) gebunden sind, wobei die Proteine in der Lage sind, mit dem zu bestimmenden Antigen (oder Antikörper) in dem Testmedium einen immunologischen Komplex zu bilden

- einen monoklonalen oder polyklonalen Antikörper, der mit einer pH-steigernden Substanz oder einem pH-steigernden Enzym wie Urease oder einem phosphaterzeugenden Enzym wie alkalischer Phosphatase einen Komplex bildet und dazu neigt, eine spezifische Bindung mit dem zu bestimmenden Antigen (oder Antikörper) einzugehen

- eine erfindungsgemäße chemiluminenszente Zusammensetzung.

Die Erfindung bezieht sich noch konkreter auf einen Testsatz für den Nachweis und die Quanitfizierung einer bestimmten Target-Nukleinsäuresequenz in einem Testmedium, der in einem oder mehreren Behältern folgendes umfaßt:

- eine erste einsträngige Nucleotidprobe, die in der Lage ist, mit einer in der nachzuweisenden Target-Nucleinsäuresequenz vorhandenen Nucleotidsequenz zu hybridisieren, wobei die genannte erste Probe auf einem Fixierungsmittel fixiert ist

- eine zweite chemisch oder enzymatisch markierte Nucleotidprobe, die in der Lage ist, mit einer in der Target-Nucleinsäuresequenz vorhandenen Nucleotidsequenz zu hybridisieren, wobei die genannte zweite Probe nicht mit der auf Fixierungsmitteln fixierten ersten Probe hybridisieren kann

- Mittel zum Nachweis der Markierung der zweiten Probe, wobei dieses Mittel mit Urease, alkalischer Phosphatase oder acridinbeladenen Liposomen konjugiert ist

- eine erfindungsgemäße chemilumineszente Zusammensetzung.

Die Erfindung bezieht sich noch konkreter auf einen Testsatz zum Nachweis und zur Quantifizierung einer bestimmten Target-Nucleinsäuresequenz in einem Testmedium, der in einem oder mehreren Behältern folgendes umfaßt:

- eine erste Polynucleotidprobe, die aus einer einsträngigen Nucleotidsequenz besteht, welche mit der nachzuweisenden Target-Nucleinsäuresequenz hybridisieren kann, wobei die erste Probe auf einem festen Träger—vorzugsweise in Form von Streifen, Mikrotiterplatten oder Luminometergefäßen aus Plast-fixiert ist

- eine zweite chemisch oder enzymatische markierte Nucleotidprobe (z. B. mit Biotin oder Digoxigenin markiert), die in der Lage ist, mit einer in der Target-Nucleinsäuresequenz vorhandenen Nucleotidsequenz zu hybridisieren, wobei die zweite Probe nicht mit der auf dem festen Träger fixierten ersten Probe hybridisieren kann

- ein Protein oder irgendeine andere Substanz, die an dem genannten Marker angebracht werden kann; dies können beispielsweise Avidin oder Antikörper gegen Digoxigenin, konjugiert mit Urease oder alkalischer Phosphatase oder acridinbeladenen Trägerstoffen sein

- eine geeignete erfindungsgemäße chemilumineszente Zusammensetzung.

Die verschiedenen Aspekte der Erfindung werden durch folgende Beispiele verdeutlicht, die nicht als Einschränkung der Erfindung zu verstehen sind.

Beispiel I: Langzeitchemiluminseszenzemission:

Langwährende Chemilumineszenz kann erfindungsgemäß entsprechend der Darstellung in Figur 1 erzeugt werden, in der die Intensität des ausgesandten Lichtsignals (in Impulsen pro Minute [c. p.m.] im Koinzidenzmodus) als Funktion der Zeit (in Minuten) gezeigt wird.

Aus einem Gemisch aus

- 10μΙ phosphatgepuffeterKochsalzlösung

- ΙΟΟμΙ Reduktionsmittel (Konz.: 10mg/ml)

- 10μΙ Diethanolaminlösung und

- 10plAcridinsalz (Konz.MO"⁴M/l)

wurde eine wäßrige Lösung hergestellt.

Dieser wäßrigen Lösung wurden 800 μΙ Alkohol hinzugefügt, woraufhin eine mehr als 50 Minuten anhaltende Chemilumineszenz verzeichnet wurde.

Beispiel II: Nachweis von Acridinzusammensetzungen in Kleinstmengen:

Sehr kleine Mengen Acridinester lassen sich unter alkalischen Bedingungen und in Anwesenheit eines Alkoholüberschusses nachweisen. Das wird in Figur 2 verdeutlicht, wo die Intensität der Lichtsignalemission, ausgedrückt als Logarithmus der relativen Lichtintensitätseinheiten, als Funktion des negativen Logarithmus der Lucigeninkonzentration dargestellt ist. Reihenverdünnungen von Lucigenin wurden in destilliertem Wasser hergestellt. Aus jeder Verdünnung wurden 10 μΙ mit einer Pipette in geeignete Fläschchen gegeben. Danach wurden 10μΙ einer Lösung aus 0,01 M NaCN in destilliertem Wasser hinzugefügt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 980μΙ Alkohol ausgelöst. Entsprechend der Darstellung resultieren Lucigeninkonzentrationen von 10"¹⁷M in Chemilumineszenzimpulsen, die bei der Messung nach dem „Koinzidenz"-Modus (d.h. ein Nachweiszeitraum von 12 Nanosekunden mit zwei Photomultipliern) wesentlich über dem Untergrundpegel liegen.

Beispiel III: Sensitive pH-Wert-Messungen in kleinen Reaktionsvolumen:

Erfindungsgemäß können hochsensitive pH-Wert-Messungen relativ leicht unter Verwendung kleiner Probenvolumen durchgeführt werden.

In einer Pufferlösung mit einem pH-Wert im Bereich von 3,01—4,19 des indizierten pH-Wertes wurden Lösungen von 10"³M Lucigenin hergestellt. 100μΙ jeder Lucigeninlösung wurden jeweils 900 μΙ n-Propylalkohol hinzugefügt; anschließend wurde die Chemilumineszenzreaktion gemessen und im „Koinzidenz"-Modus in c. p. m. ausgedrückt. Aus den Ergebnissen in Figur 3, in der die Intensität der Lichtemission als Funktion des pH-Wertes dargestellt ist, wird deutlich, daß unter diesen Bedingungen ein pH-Intervall von 1 pH-Einheit eine Spanne von fast 4 χ 10⁶C. p.m. hervorrufen kann. Figur 4 zeigt analoge Ergebnisse im höheren pH-Bereich von 8,39-9,29.

Beispiel IV: Nachweis von Antigenen in Kleinstmengen unter Verwendung von Urease-gebundenen Antikörpern: Urease ist ein Enzym, das Ammoniak aus Harnstofflösung freisetzt. Die daraus resultierende pH-Wert-Erhöhung der Pufferlösung kann mit Hilfe der Chemilumineszenzreaktion der vorliegenden Erfindung nachgewiesen werden. Zur Verdeutlichung wurden verschiedene Verdünnungen von 0,5 Einheiten Urease (5E/mg) in 10ml phosphatgepufferter Lösung mit einem pH-Wert von 7,4 aufgelöst, in der 10"³M Lucigenin und 0,1 % (V/M) Hydrochinon enthalten waren. 600μΙ jeder Verdijnngjng wurden jeweils 10μΙ Harnstoff (0,5mg/ml in destilliertem Wasser) hinzugefügt und das Gemisch 30 Minuten lang bei 37°C inkubiert. Die Chemilumineszenz wurde durch Hinzufügen von 400 μΙ Ethylalkohol ausgelöst. Wie aus Figur 5 (in der die Intensität des Lichtsignals, ausgedrückt in c.p.m. im Koinzidenzmodus, als Funktion der Ureaseverdünnung, ausgedrückt in Einheiten /3, dargestellt ist) ersichtlich wird, lassen sich weniger als 0,1 μΕ Urease problemlos in einer 30minütigen Reaktionszeit nachweisen.

Diese Reaktion kann zum Nachweis jedes beliebigen Antigens eingesetzt werden, vorausgesetzt, daß geeignete monoklonale oder polygonale Antikörper, die dieses Antigen erkennen, vorhanden sind. Diese das Antigen nachweisenden Antikörper können entweder unter Verwendung der üblichen Kopplungsverfahren mit Urease konjugiert werden, oder man kann diese

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Antikörper durch sekundäre artspezifische Antikörper, die unter Anwendung von üblichen Verfahren mit Urease konjugiert sindjf nachweisen. Die markierten Antikörper sind im Handel erhältlich. Die Quantifizierung eines Antigens wird mittels Verwendung«! des Humantumor-Nekrosefaktors (HuTNF) als Antigen in einem enzymgebundenen Immunosorbens-Test dargestellt. Mikrotestplatten, die mit anti-HuTNF von Kaninchen überzogen waren, wurden 200μΙ von HuTNF-Reihenverdünnungen hinzugefügt (im Bereich von 2,5 μΙ/ml — 250 Femtogramm/ml), die in einer Lösung aus phosphatgepufferter Kochsalzlösung, 0,1% Rinderserumalbumin (BSA) und 0,05% 20 hergestellt wurden. Nach zweistündiger Inkubation bei 37°C wurden die ä

Mikrotestplatten gespült, und in jede Vertiefung wurden 200 μΙ einer Lösung gegeben, die aus einem monoklonalen anti-HuTNF,S von Mäusen bestand und auf optimale Bindung getestet war. Nach zweistündiger Inkubation bei 37°C wurden die Platten erneut ? gespült und anschließend mit 200μΙ ureasekonjugiertem anti-Maus-lgG von Ziegen (40ng) inkubiert. Die Inkubation wurde eine weitere Stunde bei 37°C fortgesetzt. Nach abschließendem Spülen wurde jede Mikrotestplatte mit 200 μΙ Ureasesubstratlösung (Sera Labs) gefüllt. Nach einstündiger Inkubation bei 37°C wurden 100μΙ des Reaktionsgemischs in Lumineszenzgefäße (LKB) pipettiert. Jedem Gefäß wurden 50μ110~³ M-Lucigenin mit einem pH-Wert von 5,2 hinzugefügt, und die Lumineszenz wurde i durch Hinzufügen von 850 μΙ Ethylalkohol ausgelöst. Aus Figur 6 (in der die Intensität des Lichtsignals, ausgedrückt ine. p.m. im Koinzidenzmodus, als Funktion der Konzentration des TNF, ausgedrückt in Femtogramm/ml, pg/ml und ng/ml, dargestellt ist) wird ersichtlich, daß es möglich ist, 50 Femtogramm/ml TNF zu messen. ^r;

Beispiel V: Messung der Aktivität von alkalischer Phosphatase: <

Bei einem optimalen pH-Wert von alkalischer Phosphatase (d.h. 9,8) ist es möglich, die enzymatische Aktivität unter Verwendung f von gepufferten Lösungen aus Lucigenin und Mannose in Gegenwart von Alkohol aufgrund der Freisetzung von Phosphat zu 8 messen. Wenn das alkalische Phosphataseenzym mit artspezifischen Antikörpern gekoppelt ist, kann die Reaktion für den |^!

Nachweis und die Quantifizierung beliebiger Antigene eingesetzt werden, vorausgesetzt, es sind antigenspezifische :j

monoklonale oder polyklonale Antikörper vorhanden, die mit dem Enzym gekoppelt werden oder mit den enzym-gekoppelten % artspezifischen Antikörpern reagieren können. §

Dies wird veranschaulicht durch Reihenverdünnungen von äquimolaren Mengen p-Nitrophenol und p-Nitrophenolphosphat in ^K Diethanolaminpuffer mit einem pH-Wert von 9,8, von denen 10 μΙ einem Gemisch aus 100μΙ Mannoselösung (10mg/ml in destilliertem Wasser) und 10μΙ in destilliertem Wasser aufgelöstem 10~⁴ M-Lucigenin hinzugefügt werden können. Die Chemilumineszenz wird durch Hinzufügen von 880 μΙ Ethanol ausgelöst. Wie aus Figur 7 (in der die Absorbanz bei 405 nm als Funktion der Verdünnung von p-Nitrophenol in Diethanolaminpuffer dargestellt ist) ersichtlich, läßt sich der Umfang der enzymatischen Reaktion aufgrund der Freisetzung von p-Nitrophenol (kolorimetrische Reaktion) auch unter Verwendung optischer Dichtemessungen bei 405nm verfolgen; die Messung der.Lumineszenz in c. p.m. erhöht jedoch die Empfindlichkeit des Nachweises erheblich (Figur 8, in der die Intensität des Lichtsignals —ausgedrückt als Logarithmus der c. p.m. im Koinzidenzmodus- als Funktion des negativen Logarithmus der Konzentration von p-Nitrophenol dargestellt ist).

Beispiel Vl: Nachweis und Quantifizierung von Aminosäuren:

Entsprechend der vorliegenden Erfindung kann die Chemilumineszenz zum Nachweis von pH-Wert-Veränderungen eingesetzt werden. Wird im Ergebnis einer stöchiometrischen Reaktion eine pH-steigernde Verbindung erzeugt, läßt sich eine solche ; Reaktion unter der Voraussetzung, daß sie die Chemilumineszenz nicht dämpft, quantifizieren. Ein typisches Beispiel für dieses i Prinzip findet man in der Quantifizierung von Aminosäuren unter Verwendung der Ninhydrinreaktion, bei der das Reagieren von j Ninhydrin mit einer Aminosäure zur Freisetzung von NH₃ führt. j

In Figur 9 (in der die Intensität des Lichtsignals, ausgedrückt als Logarithmus der c.p.m. im Koinzidenzmodus, als Funktion des negativen Logarithmus der Konzentration [in M/l] von Glycin dargestellt ist) werden die Ergebnisse der Chemilumineszenz ί aufgeführt, die durch Mischen von 100μΙ Reihenverdünnungen von Glycin in Kochsalzlösung mit 100μ110~³ M-Lucigenin, 10μΙ ' 0,1%iger Hydrochinonlösung (V/M),780μΙ Ethanol und 10μΙ einer 1%igen Ninhydrinlösung (V/M) entstehen. Entsprechend der Darstellung erzeugt eine Konzentration von 10"¹⁷M Glycin noch immer ein Signal, das beträchtlich über dem Untergrundpegel liegt.

Beispiel VII: DNA-Hybridisierungs-Test:

Entsprechend der vorliegenden Erfindung kann die Chemilumineszenz auch als Mittel zum quantitativen und qualitativen Hybridisierungsnachweis unter Verwendung der zuvor genannten Methoden zum Erhalt chemilumineszenter Signale eingesetzt werden. Das geht aus Figur 10 hervor. Hierbei wurden unterschiedliche Mengen von Neisseria gonorrhoeae-DNA auf Nitratcellulosepapierstreifen aufgebracht wurden. Die Streifen wurden getrocknet, in einem Vakuum bei 80°C zwei Stunden lang gebacken und mit einer hochspezifischen DNA-Probe hybridisiert, die laut Protokoll des Herstellers (Boehringer, Mannheim) mit Digoxigeninvormarkiertwar.Nach16stündigerHybridisierungbei65⁰Cin3 x SSC(SSC = 0,15MNaCI,0,015MNatriumeitrat), 0,1%igem N-Laurylsarkosin (M/V), 0,02%igem Natriumdodecylsulfat (M/V) und 0,5%igem Blocking-Reagens wurden die Filter wiederholt laut Vorschrift des Lieferanten mit 1,5 x SSCoder3₍ χ SSC gewaschen und mitAnti-Digoxigenin-Antikörpern, die mit alkalischer Phosphatase markiert waren, inkubiert. Nach der Bindung und dem Waschen wurden die enzymatische Reaktion in Anwesenheit von 1 mg/ml p-Nitrophenylphosphat in Diethanolaminpuffer mit einem pH-Wert von 9,8 12 Stunden bei Zimmertemperatur fortgesetzt. Ein aliquoter Teil des Inkubationsgemischs von den verschiedenen Filtern wurde in eine Lösung aus 100μΙ Mannose (Konz.: 10mg/ml) und 10μ110~⁴ M-Lucigenin pipettiert. Nach Hinzufügen von 880μΙ Ethylalkohol wurde in verschiedenen Zeitabständen die Chemilumineszenz gemessen. Die Ergebnisse aus Figur 10 (in der die Intensität des Lichtsignals-ausgedrückt als Logarithmus der c. p. m. im Koinzidenzmodus-als Funktion der Zeit nach Hinzufügen des Alkohols für verschiedene DNA-Konzentrationen dargestellt ist) machen deutlich, daß ein stabiles Signal erzeugt wird und daß Mengen von 10 Femtogramm DNA pro Filter unter diesen Umständen noch nachweisbar sind.

Beispiel VIII: Nachweis von in Liposomen enthaltenen Acridinverbindungen:

Lucigeninhaltige Liposome wurden hergestellt, indem 4 mg Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC) in Chloroform (CHCI₃) s

aufgelöst wurden. Nach Verdampfen des CHCI3 (1 Stunde in einer ^-Atmosphäre) wurden 600μΙ einer Lucigeninlösung (13mg/ ;. ml in phosphatgepufferter Kochsalzlösung, pH-Wert: 7,4) hinzugefügt. Die Lösung wurde anschließend 4x7 Minuten bei 32W,;

(Branson-Beschallungsgerät mit stufenförmigem Microtip) und einerTemperatur, die über der Übergangstemperatur von DPPC

liegt, beschallt. -»

Als nächstes wurde eine ausreichende Menge der beschallten Lösung, die 0,8mg DPPC enthielt, auf einem Sepharose 6B unter Verwendung einer 25x1 cm-Säule separiert. Während des Laufs konnten zwei Fraktionen separiert werden, von denen eine das in den Liposomen eingekapselte Lucigenin enthielt. Es konnte außerdem festgestellt werden, daß diese Fraktion kein freies Lucigenin enthielt.

Danach wurde eine Reihenverdünnung (1/10-1/10⁷) der liposomhaltigen Fraktion in physiologischer Kochsalzlösung mit einem pH-Wert von 9 durchgeführt.

Nach dem Einbringen von 10μΙ Triton X-100 (0,01%ig) in 100μΙ Liposomsuspension wurden 900μΙ Ethanol hinzugefügt und die Chemilumineszenz (c.p.m. im Koinzidenzmodus) aufgezeichnet.

Die maximalen Peakhöhen (ausgedrückt als log c.p.m. im Koinzidenzmodus) sind in der folgenden Tabelle 1 dargestellt:

Tabelle 1

Liposomfraktionsverdünnung log c.p.m.

im Koinzidenzmodus

0 2,40

1/10 6,46

1/10² 6,25

1/10³ 5,44

1/10⁴ 3,94

1/10^s 3,31

1/10⁶ 3,24

1/10⁷ 2,90

Beispiel IX: Nachweis und Quantifizierung von Reduktionsverbindungen:

Entsprechend der vorliegenden Erfindung kann man die Chemilumineszenz zum Nachweis von Reduktionsverbindungen einsetzen. In Figur 11 wird die Ascorbatkonzentration als Funktion der Intensität des Lichtsignals, ausgedrückt in c. p. m., dargestellt, die man erhält, wenn man 150μΙ 0,1 mM-Lucigenin, aufgelöst in destilliertem Wasser, mit 100μΙ Ascorbat, das entsprechend den spezifischen Konzentrationen in Phosphatpufferkochsalzlösung aufgelöst wurde, und 750μΙ Ethanol mischt.

Wieder Darstellung zu entnehmen ist, können lOFemtogramm Ascorbat problemlos im Reaktionsgemisch nachgewiesen werden.

Beispiel X: Nachweis von alkalischer Phosphatase mit Lucigenin-BCIP-Chemilumineszenz: ^s Alkalische Phosphatase von Kalbsdärmen (CIP) (Boehringer) wurde in 2%igem Diethanolaminpuffer (DEA) mit einem Gehalt von

^; 0,01 % Albumin und einem p-Wert von 9,41 verdünnt (1/5000). Ausgehend von dieser Enzympräparation wurden in demselben

Puffer in Schritten von 1/10 weitere Verdünnungen vorgenommen (1/5000—1/5 χ 10¹⁴).

Zunächst wurde Lucigenin bei einer Konzentration von 10"³M in 2%igem Diethanolaminpuffer mit einem pH-Wert von 9,41 aufgelöst und dann bis auf 10"⁴M im selben Puffer weiterverdünnt.

50mg Brom-Chlor-Indolylphosphat (Natriumsalz) (Boehringer), im folgenden als BCIP bezeichnet, wurden in 1 ml 2%igem ^r DEA-Puffer mit einem pH-Wert von 9,41 aufgelöst. 350 μΙ dieser Lösung wurden dem Lucigenin (10"⁴M) enthaltenden DEA-Puffer

hinzugefügt.

Eine zweite Verdünnungsreihe des CIP wurde in 2%igem DEA-Puffer mit einem pH-Wert von 9,41, der 7% Polyvinylalkohol (PVA) (Molekülmasse 80000) (Aldrich) enthielt, hergestellt und durch Hinzufügen von NaOH auf einen pH-Wert von 9,41 korrigiert. Zum Schluß wurde Albumin bei einer Endkonzentration von 0,01 % hinzugefügt.

Von jeder der Enzymverdünnungen wurden 250μΙ in Lumineszenzgefäße pipettiert (mit einem Gesamtarbeitsvolumen von 1 ml ^:t [LKB 1 251] und in einen Szintillationszähler gegeben [Beckman LS7500)].

Die Chemilumineszenz wurde ausgelöst, indem den Proben in Zeitintervallen von 12 Sekunden 250 μΙ Lucigenin-BCIP-Lösung in DEA zugesetzt wurden. Danach wurde die Lumineszenz 30 Minuten lang im „Koinzidenzmodus" aufgezeichnet.

Die Messungsergebnisse sind in Tabelle 2 aufgeführt.

Hier wird die Endkonzentration des Enzyms in den Lumineszenzproben zusammen mit dem in DEA und in DEA + PVA erhaltenen log c. p. m. aufgeführt. Diese c. p. m. werden verglichen mit der optischen Dichte (OD) der BCIP-Reaktion in DEA-Puffer nach 30 Minuten, deren Ablesung auf einem Spektrophotometer (Pye Unicam) mit automatischer Backgroundsubstraktion erfolgte. Die Endkonzentration des Enzyms war dieselbe wie bei den Chemilumineszenz-Tests.

Wie aus Tabelle 2 ersichtlich, erhöht sich die Nachweisbarkeit von alkalischer Phosphatase in den mit PVA ergänzten Chemilumineszenzsystemen um das 1000-IOOOOfache.

-19- 296 50Ϊ

Tabelle 2

-CIP	Attom öl	log cpm	log cpm	OD620nm
	Attomol	ohnePVA	mit PVA	BCIP
_	Attom ο I	1,83	1,60	0,000
0,0003	Attomol	1,80	1,80	0,000
0,003	Attomol	1,50	1,85	0,000
0,03	Attomol	1,71	2,38	0,000
0,35	Attomol	1,64	3,20	0,000
3,5	Attomol	1,55	4,55	0,000
35	Attomol	1,68	5,48	0,000
350	Attomol	2,35	6	0,003
3500	Attomol	3,75	6	0,008
35000	6	6	0,080
350000	6	6	0,380
3500000	6	6	0,675

Beispiel Xl: Vergleichende Beispiele:

Es wurde ein Vergleich zwischen der Chemilumineszenz, die mit den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen erzielt wurde, und der, die mit bisher verwendeten, nicht alkoholhaltigen Zusammensetzungen erzielt wurde, angestellt.

1) Chemilumineszenz auf der Grundlage von Zusammensetzungen, welche von Zusammensetzungen abgeleitet sind, die in J. R.Totter, „Photochemistry and Photobiology", 1975, Bd.22, S.203-211, beschrieben wurden.

Es wurden die folgenden Zusammensetzungen a) und b) verwendet:

a) 200 μΙ destilliertes Wasser

100 μΙ NaOH (Molarität wie unten in Tabelle 3 angegeben) 100μΙ Lucigenin (2 χ 10"⁴M)

b) 100 μΙ destilliertes Wasser 100μΙ Fructose (10"²M)

100μ! NaOH (Molarität wie unten in Tabelle 3 angegeben) 100μΙ Lucigenin (2 x 10-"M).

Die Ergebnisse in bezug auf die Chemilumineszenz (ausgedrückt in log cpm) sind in Tabelle 3 aufgeführt, in der

- die erste Spalte Angaben zur Molarität von NaOH enthält,

- die zweite Spalte den log cpm angibt, der mit den oben definierten Zusammensetzungen a) erzielt wurde,

- die dritte Spalte den log cpm angibt, der mit den oben definierten Zusammensetzungen b) erzielt wurde.

Tabelle 3

Nr.	Hinzugefügtes	log cpm	log cpm
	NaOH(M)	(ohne Fructose)	(mit Fructose)
1	5 x 10~5	1,30	1,60
2	1 x 10'"	1,54	1,69
3	5 x 10""	1,65	2,24
4	1 x 10"3	2,04	3,29
5	5 x 10~3	2,85	5,39
6	1 x 10"2	4,10	6,77
7	5 X 10"2	5,25	6,77
8	1 X 10~1	6,09	6,77

2) Chemilumineszenz, die mit den beiden folgenden erfindungsgemäßen Zusammensetzungen c) und d) erzielt wurde:

c) 100 μΙ destilliertes Wasser

100μΙ NaOH (Molarität wie unten in Tabelle 4 angegeben) 100μΙ Ethanol (EtOH)

100μ] Lucigenin (2 x 10""M)

d) 100μΙ Fructose (10"²M)

100μΙ NaOH (Molarität wie unten in Tabelle 4 abgegeben) 100μΙ Ethanol (EtOH)

100μΙ Lucigenin (2 x 10""M).

Die Chemilumineszenzergebnisse (ausgedrückt als log cpm) sind in Tabelle 4 zusammengefaßt, in der

- in derersten Spalte die Molarität von NaOH angegeben ist,

- in der zweiten Spalte der log cpm aufgeführt wird, der mit den oben definierten Zusammensetzungen c) erzielt wurde, und

- die dritte Spalte den log cpm angibt, der mit den oben definierten Zusammensetzungen d) erzielt wurde.

Tabelle 4

Nr.	Zugegebenes	logcpm	logcpm
	NaOH(M)	(ohne Fructose)	(mit Fructose)
1	5 x ΙΟ"5	1,30	1,84
2	1 x 10~"	1,30	3,01
3	5 χ 10""	3,26	5,05
4	1 χ 10"3	4,66	6,77
5	5 χ 10~3	6,77	6,77
6	1 χ 10"2	6,77	6,77
7	5 χ ΙΟ"2	6,77	6,77
8	1 X 10"'	6,77	6,77

Schlußfolgerung 1: Wie aus Tabelle 3 und 4 hervorgeht, demonstriert das System deutlich, daß bei Verwendung von Fructose eine wesentlich höhere Quantenausbeute der Chemilumineszenz erzielt wird als bei NichtVerwendung. Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen sind praktisch durch eine wesentlich höhere Quantenausbeute charakterisiert als die von J. R.Totter (Photochemistry and Photobiology, 1975, Bd.22, S. 203-211) beschriebenen Zusammensetzungen.

3) Chemilumineszenz, die mit den im folgenden definierten, bisher verwendeten Zusammensetzungen 1,2,3,4, 5,6,7,8,9 und

mit den folgenden definierten erfindungsgemäßen Zusammensetzungen 1', 2', 3', 4', 5', 6', T. 8', 9' und 10' erzielt wurde

Bisher verwendete Zusammensetzungen:

1: 100μΙ NaOH 10"¹M + 100μΙ Fructose 10"²M + 100μΙ destilliertes Wasser + 100μΙ Lucigenin 10'³M; 2: sowie 1,mit Ausnahme von 200 anstelle von 100μΙ destilliertem Wasser; 3: sowie 1, mit Ausnahme von 300 anstelle von 100μΙ destilliertem Wasser; 4: sowie 1, mit Ausnahme von 400 anstelle von 100μΙ destilliertem Wasser; 5: so wie 1, mit Ausnahme von 500 anstelle von 100μΙ destilliertem Wasser; 6: sowie 1, mit Ausnahme von 600 anstelle von 100μΙ destilliertem Wasser; 7: sowie 1, mit Ausnahme von 700 anstelle von ΙΟΟμΙ destilliertem Wasser; 8: sowie 1, mit Ausnahme von 800 anstelle von 100 μΙ destilliertem Wasser; 9: sowie 1, mit Ausnahme von 900 anstelle von 100 μΙ destilliertem Wasser; 10: sowie 1, mit Ausnahme von 1000 anstelle von 100μΙ destilliertem Wasser.

Erfindungsgemäße Zusammensetzungen:

100μΙ NaOH 10"¹ M + 100μΙ Fructose 10"²M + 100μΙ EtOH + 100μΙ Lucigenin 10"³M; so wie 1', mit Ausnahme von 200 anstelle von 100 μΙ destilliertem Wasser; sowie 1', mit Ausnahme von 300 anstelle von 100μΙ destilliertem Wasser; so wie 1', mit Ausnahme von 400 anstelle von 100μΙ destilliertem Wasser; sowie Y, mit Ausnahme von 500 anstelle von 100μΙ destilliertem Wasser; so wie Y, mit Ausnahme von 600 anstelle von 100μΙ destilliertem Wasser; sowie 1', mit Ausnahme von 700 anstelle von 100 μΙ destilliertem Wasser; so wie 1', mit Ausnahme von 800 anstelle von 100μΙ destilliertem Wasser; sowie Y, mit Ausnahme von 900 anstelle von 100 μΙ destilliertem Wasser;

10': sowie T mit Ausnahme von 1000 anstelle von 100μΙ destilliertem Wasser.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 zusammengefaßt, in der

- die erste Spalte sich auf die oben definierten Zusammensetzungen bezieht,

- die zweite Spalte die zu Beginn der Chemilumineszenzreaktion erzielten cpm angibt,

- in der dritten Spalte die cpm 10 Stunden nach Beginn der Reaktion aufgeführt sind,

- die vierte Spalte die cpm 24 Stunden nach Beginn der Reaktion aufführt,

- in der fünften Spalte die cpm 96 Stunden nach Beginn der Reaktion angegeben werden.

Tabelle 5

Nr.	cpm Beginn	nach	nach	nach
		1OStd.	24Std.	96 Std.
1	6.000.000	114.829	40.045	1.937
T	6.000.000	1.067.937	863.062	77.962
2	6.000.000	84.639	44.093	1.871
2' "	^ 6.000.000	6.000.000	6.000.000	6.000.000
3	6.000.000	95.548	50.379	3.346
3'	6.000.000	6.000.000	6.000.000	6.000.000
4	6.000.000	102.488	30.446	4.527
4'	6.000.000	6.000.000	6.000.000	6.000.000
5	6.000.000	902.453	38.983	2.878
5'	6.000.000	6.000.000	6.000.000	6.000.000

-21- 296 5Ö1

Fortsetzung Tabelle 5

Nr.	cpm Beginn	nach	nach	nach
		lOStd.	24Std.	96Std.
6	6.000.000	6.000.000	6.000.000	4.448
6'	6.000.000	6.000.000	6.000.000	6.000.000
7	6.000.000	6.000.000	6.000.000	3.183
T	6.000.000	6.000.000	6.000.000	6.000.000
8	6.000.000	6.000.000	6.000.000	1.419.279
8'	6.000.000	6.000.000	6.000.000	6.000.000
9	6.000.000	6.000.000	6.000.000	2.894.777
9'	6.000.000	6.000.000	6.000.000	6.000.000
10	6.000.000	6.000.000	6.000.000	6.000.000
10'	6.000.000	6.000.000	6.000.000	6.000.000

Schlußfolgerung 2: Die Angaben in Tabelle 5 demonstrieren auf anschauliche Weise die Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen, die die Verwendung eines wasserlöslichen Alkohols einschließen. Bei den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen wurden eine zuvor nicht beobachtete wesentliche Verbesserung der Quantenausbeute und eine längere Dauer der Chemilumineszenz demonstriert.

4) Chemilumineszenz, die mit den im folgenden definierten bisher verwendeten Zusammensetzungen 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13,14,15 und 16 und den im folgenden definierten erfindungsgemäßen Zusammensetzungen 1', 2', 3', 4', 5', 6', T₁ 8', 9', 10', 11', 12', 13', 14', 15'und 16'erzielt wurde

Die bisher verwendeten Zusammensetzungen 1,3,5,7,9,11,13 und 15 beinhalten folgendes:

- ΙΟΟμΙ destilliertes Wasser

- 100μΙ NaOH (Molarität wie in Tabelle 6 angegeben)

- 100μΙΗ₂Ο

- 100plLucigenin(10~⁴M).

Die bisher verwendeten Zusammmensetzungen 2, A₁ 6,8,10,12,14 und 16 entsprechen jeweils den Zusammensetzungen 1,3,5, 7,9,11,13 und 15, wobei die 100μΙ destilliertes Wasser durch 100μΙ Fructose 10"²M ersetzt wurden

Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen Y, 3', 5', T₁ 9', 11', 13' und 15' beinhalten folgendes:

- 100μΙ destilliertes Wasser

- 100μΙ NaOH (Molarität wie in Tabelle 6 angegeben)

- 100μΙΕΐΟΗ

Die Zusammensetzungen 2', 4', 6', 8', 10', 12', 14' und 16' entsprechen jeweils den oben definierten Zusammensetzungen Y, 3', 5', T, 9', 11', 13' und 15', wobei die 100 μΙ destilliertes Wasser durch 100μΙ Fructose 10"²M ersetzt wurden

Die 60 Minuten nach Beginn der Reaktion erzielten Chemilumineszenzergebnisse sind in Tabelle 6 dargelegt:

Tabelle 6

Bisher	NaOH	cpm	Erfindungs	cpm
verwendete		gemäße
Zusammen		Zusammen
setzung		setzung

1	5 x 10~5	30	T
35
2	5 X 10"5	10	2'
25
3	1 X 10""	20	3'
40
4	1 x 10"""	55	4'
50
5	5 x 10"""	40	5'
30
6	5 x 10""	20	6'
20
7	1 X 10"3	35	T
35
8	1 x 10~3	25	8'
15
9	5 X IGT3	35	9'
120

>3f

Fortsetzung Tabelle 6

Bisher	10	NaOH	cpm	Erfindungs	cpm
verwendete	1.090.960	5 x 10"3	1.325	gemäße
Zusammen	11			Zusammen
setzung	8.825	1 x 10~2	65	setzung
12			10'
6.000.000	1 x 10~2	603.420
13			1V
278.035	5 χ 10~2	4.910
14			12'
6.000.000	5 x 10"2	6.000.000
15			13'
6.000.000	1 x 10'1	83.065
16			14'
6.000.000	1 x 10~1	6.000.000
			15'
		16'

Schlußfolgerung 3: Wie in Schlußfolgerung 1 und 2 beschrieben, wird bei Verwendung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen eine höhere Quantenausbeute und eine langanhaltende Chemilumineszenz über einen Zeitraum von mehr als 60 Minuten demonstriert. Der Effekt von Zusammensetzungen mit Basen und von Reduktionsmittel hat eine deutlich verstärkende Wirkung auf die Lichtemission, ohne daß zuvor Wasserstoffperoxid verwendet wurde.

Claims (31)

1. Homogene hydroalkoholische chemilumineszente Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß sie folgendes enthält:

- eine acridinderivathaltige Lösung, wobei das Acridinderivat entweder wasser-oder alkohollöslich ist oder in der homogenen hydroalkoholischen Zusammensetzung löslich gemacht werden kann und die Lösung vorzugsweise wäßrig ist,

- einen mit Wasser mischbaren Alkohol, der entweder wasserlöslich ist oder in Wasser eine Suspension bildet, deren Stabilität ausreicht, um eine chemilumineszente Reaktion zuzulassen, unter der Voraussetzung, daß es sich bei dem Alkohol um keinen von einem Acridinderivat hergeleiteten Alkohol handelt, daß er kein Acridanol und kein von einem Acridanolderivat hergeleiteter Alkohol ist, der während derchemilumineszenten Reaktion entstehen könnte,

- ein Reduktionsmittel, das in Abhängigkeit von den jeweiligen pH-Bedingungen anwesend oder abwesend sein kann.

2. Homogene hydroalkoholische chemilumineszente Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der mit Wasser mischbare Alkohol ein primärer, sekundärer oder tertiärer aliphatischer oder ein primärer, sekundärer oder tertiärer aromatischer oder ein primärer, sekundärer oder tertiärer heterocyclischer Alkohol unter Ausschluß von Zucker, aber einschließlich Mercaptoalkoholen ist.

3. Homogene hydroalkoholische chemilumineszente Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Alkohol kein Mercaptoalkohol ist.

4. Chemilumineszente Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie folgendes enthält:

- eine Lösung aus einem Acridinderivat, wobei die Lösung vorzugsweise wäßrig ist, und

- einen mit Wasser mischbaren Alkohol, wobei

- der pH-Wert der Lösung die Auslösung einer chemilumineszenten Reaktion durch den Alkohol ermöglicht.

5. Chemilumineszente Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie folgendes enthält:

- eine Lösung aus einem Acridii (derivat, wobei die Lösung vorzugsweise wäßrig ist,

- einen mit Wasser mischbaren Alkohol und

- eine Base, wobei der pH-Wert der Lösung so eingestellt ist, daß der Alkohol die chemilumineszente Reaktion auslösen kann.

6. Chemilumineszente Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie folgendes enthält:

- eine Lösung aus einem Acridinderivat und einem Reduktionsmittel, die vorzugsweise wäßrig ist,

- einen wasserlöslichen Alkohol und

- eventuell eine Base.

7. Chemilumineszente Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen wäßrigen Puffer enthält.

8. Chemilumineszente Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Enzym wie beispielsweise Urease, alkalische Phosphatase oder Peroxydase enthält.

9. Chemilumineszente Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Acridinderivat folgende Formel hat:

2 Χ" oder X²"

worin 2X oder X² für ein negativ geladenes Gegenion wie ein Nitrat, Sulfat, Phosphat oder Chlorat steht, R eine aliphatische Kette von 1-6 Kohlenstoffatomen, insbesondere 1-4 Kohlenstoffatomen und speziell CH₃ darstellt, wobei wenigstens einer der Phenylringe wahlweise substituiert wird, vorausgesetzt, das Acridinderivat ist entweder wasser- oder alkohollöslich oder kann in einer homogenen hydroalkoholischen Zusammensetzung, die vorzugsweise wasserlöslich ist, löslich gemacht werden, das Acridinderivat vorzugsweise Lucigenin ist; oder

worin R die genannte Bedeutung hat,

wobei wenigstens einer der Phenylringe wahlweise substituiert wird, vorausgesetzt, das Acridinderivat ist mit Wasser mischbar, entweder wasser- oder alkohollöslich oder kann in einer homogenen hydroalkoholischen, vorzugsweise wasserlöslichen Zusammensetzung löslich gemacht werden.

10. ChemilumineszenteZusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Acridinderivat folgende Formel hat:

C*0

worin Y für ein negativ geladenes Gegenion wie FSO₃" oder NO₃" steht,

darstellt, wobei wenigstens einer der Phenylringe zur Substitution neigt, vorausgesetzt, das Acridinderivat ist entweder wasser-oder alkohollöslich oder kann in der homogenen hydroalkoholischen, vorzugsweise wasserlöslichen Zusammensetzung löslich gemacht werden, oder - tr=: '

-3- 296 50]

worin R₁ die genannte Bedeutung hat,

wobei wenigstens einer der Phenylringe zur Substitution neigt, vorausgesetzt, das Acridinderivat ist entweder wasser- oder alkohollöslich oder kann in der homogenen hydroalkoholischen, vorzugsweise wasserlöslichen Zusammensetzung löslich gemacht werden.

11. Chemilumineszente Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Alkohol ein wasserlöslicher primärer, sekundärer oder tertiärer Alkohol mit 1-6 Kohlenstoffatomen, insbesondere 1-4 Kohlenstoffatomen und speziell Methanol, Ethanol,! n-Propanol, Isopropanol oder Butanol ist.

12. Chemilumineszente Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1, 2,3 und 5 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Reduktionsmittel in situ erzeugt wird.

13. Chemilumineszente Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1, 2, 3 und 5 bis 12, dadurch J gekennzeichnet, daß das Reduktionsmittel über ein Redoxpotential von mindestens 0,3 V verfügt | und die Molekularstruktur des Acridinderivats, besonders die für die chemilumineszente Reaktion f verantwortliche(n) Zwischenverbindung(en), nicht stört, wobei das Reduktionsmittel beispielsweise Ascorbinsäure, Mannose, Glucose, NADH oder NADPH oder Hydrochinon ist.

14. Chemilumineszente Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß der Puffer ein Phosphatpuffer, Trispuffer, Acetatpuffer, Diethanolaminpuffer, Barbitalpuffer oder Citratpuffer ist.

15. Chemilumineszente Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 14, gekennzeichnet durch folgendes:

- Acridinderivat: Volumenanteil von etwa 0,01%-etwa 99,99%, speziell von etwa 10%-etwa 99%, bei einem Konzentrationsbereich von ca. 10~⁴-10~¹⁰M/l, insbesondere von etwa 10-⁴-10"⁶M/l,

- Alkohol: Volumenanteil von etwa 0,5%-etwa 99,9%, speziell von etwa 10%-etwa 90%, wobei alle diese Prozentangaben Volumenangaben bezogen auf das Gesamtvolumen der Zusammensetzung sind,

- pH-Wert von etwa 4- etwa 8, speziell von etwa 6 - etwa 7,6.

16. Lumineszenter oder luminometrischer Test, dadurch gekennzeichnet, daß die chemilumineszente Reaktion auf derchemilumineszenten Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 15 basiert.

17. Verfahren zur Bestimmung der Konzentration eines Acridinderivats in einer wäßrigen Lösung entsprechend dem Test in Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration des Reduktionsmittels, die Konzentration des Alkohols und der pH-Wert konstant sind und die in der chemilumineszenten Reaktion erzeugte Lichtrate eine Funktion der Acridinderivatkonzentration ist.

18. Verfahren zur Bestimmung der Konzentration des Reduktionsmittels in einer wäßrigen Lösung entsprechend dem Test in Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration des Acridinderivats, die Alkoholkonzentration und der pH-Wert konstant sind und die in der chemilumineszenten Reaktion erzeugte Lichtrate eine Funktion der Reduktionsmittelkonzentration ist.

19. Verfahren zur Bestimmung des pH-Wertes von wäßrigen Lösungen, speziell bei Kleinstmengen an gelöstem Stoff von beispielsweise weniger als 10μΙ, speziell von etwa 0,1 μΙ - etwa 1 μΙ, entsprechend dem Test in Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration des Acridinderivats, die Alkoholkonzentration und die Reduktionsmittelkonzentration konstant sind und die in der chemilumineszenten Reaktion erzeugte Lichtrate eine Funktion des pH-Wertes ist.

20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert in situ entweder stöchiometrisch oder zeitabhängig erzeugt wird.

21. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration der Acridinverbindungen und der wasserlöslichen Verbindungen konstant ist und bei Erreichen oder Überschreiten eines vorab festgelegten pH-Wertes stöchiometrisch oder zeitabhängig eine konstante Menge Reduktionsmittel erzeugt wird.

22. Verfahren zur Quantifizierung von pH-steigernden Substanzen nach Anspruch 16, gekennzeichnet durch die Einbringung einer pH-steigernden Substanz wie basischer oder polybasischer lone oder solche lone erzeugender Enzyme-wie beispielsweise NH₄₊ erzeugende Urease-in eine Lösung aus Acridinderivat und Alkohol, wobei die erzeugte Lichtrate eine Funktion der pH-steigernden Substanz ist.

23. Verfahren zur Quantifizierung von Antigenen oder Antikörpern nach Anspruch 16, gekennzeichnet durch die Einbringung einer Lösung, die das zu quantifizierende Antigen - gebunden an eine pH-steigernde Substanz-enthält, in eine Lösung aus Acridinderivat und Alkohol, am besten in

^at Anwesenheit eines Reduktionsmittels, wobei die erzeugte Lichtrate eine Funktion der pH-steigernden

Substanz ist, von der die Quantifizierung des Antigens oder Antikörpers durch Vergleich mit Eichkurven abgeleitet werden kann.

24. Verfahren zur Messung der alkalischen Phosphataktivität auf einem Substrat, das Phosphat nach Anspruch 16 enthält, dadurch gekennzeichnet, daß die chemilumineszente Zusammensetzung

° ' gepufferte Lösungen aus Lucigenin und Mannose in Gegenwart eines Alkohols enthält und die in der

chemilumineszenten Reaktion erzeugte Lichtrate eine Funktion der Phosphatgruppen ist, die durch die Einwirkung von alkalischer Phosphatase auf das Substrat freigesetzt werden.

25. Verfahren zur Bestimmung von Antigenen oder Antikörpern in einem Test nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß das zu bestimmende Antigen oder der Antikörper an alkalische Phosphatase gebunden ist, die auf einem Substrat zur Reaktion gebracht wird, das Phosphatgruppen wie ATP,

^on 1,2-Glycerolphosphat, p-Nitrophenylphosphat oder Indolylphosphat enthält, und daß die in der

chemilumineszenten Reaktion erzeugte Lichtrate eine Funktion der durch das Einwirken von alkalischer Phosphatase auf das Substrat freigesetzten Phosphatgruppen ist, oder daß das zu bestimmende Antigen oder der Antikörper an ein Substrat gebunden ist, das eine oder mehrere ^er'i Phosphatgruppen wie ATP, 1,2-Glycerolphosphat, p-Nitrophenylphosphat, ß-Glycerolphosphat oder

Phosphokreatin enthält, das auf alkalischer Phosphatase zur Reaktion gebracht wird, und daß die in der chemilumineszenten Reaktion erzeugte Lichtrate eine Funktion der Phosphatgruppen ist, die

) durch das Einwirken der alkalischen Phosphatase auf das Substrat freigesetzt werden.

26. Verfahren zum quantitativen und qualitativen Nachweis der Hybridisierungsreaktion einer Probe mit einer nachzuweisenden Nucleinsäure unter Einbeziehung des Tests nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe mit einem Marker vormarkiert ist, daß ein mit alkalischer Phosphatase

^el markierter, z. B. monoklonaler oder polyklonaler, Antikörper gegen den Marker für die enzymatische

Reaktion genutzt wird, die zwischen der alkalischen Phosphatase und einem eine oder mehrere Phosphatgruppen enthaltenden Substrat stattfinden soll, und daß die in der chemilumineszenten Reaktion erzeugte Lichtrate eine Funktion von Phosphatgruppen ist, die durch die alkalische Phosphatase freigesetzt werden.

27. Verfahren zum Nachweis und zur Quantifizierung von Aminosäuren entsprechend dem Test in Anspruch 16, gekennzeichnet durch das Hinzugeben von Ninhydrin zu einer erfindungsgemäßen chemilumineszenten Zusammensetzung, die die nachzuweisende und zu quantifizierende Aminosäure enthält, zur Bestimmung der Menge Ninhydrin, die mit der nachzuweisenden und zu quantifizierenden Aminosäure reagiert hat, und.damit zur Bestimmung der Menge nachzuweisender und zu quantifizierender Aminosäure mittels Vergleichs mit Eichkurven.

28. Testsatz für den Nachweis und die Quantifizierung von jeglichen in einem Testmedium wie

. Körperflüssigkeit und Zeilüberstand vorhandenen Antigenen oder Antikörpern, gekennzeichnet

dadurch, daß er folgendes enthält:
^ \ - Mittel zur Fixierung eines Antikörpers oder Antigens, das dazu neigt, einen immunologischen

~ Komplex mit dem zu bestimmenden Antigen oder Antikörper zu bilden, " "'"

- einen monoklonalen oder polyklonalen Antikörper, der mit einer pH-steigernden Substanz oder einem pH-steigernden Enzym wie Urease oder einem Phosphat erzeugenden Enzym wie alkalischer Phosphatase einen Komplex bildet, wobei der Antikörper in der Lage ist, mit dem zu bestimmenden Antigen oder Antikörper eine spezifische Bindung einzugehen,

— eine chemilumineszente Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 15.

-5- 296 50

29. Testsatz für den Nachweis und die Quantifizierung eines jeglichen Antigens oder Antikörpers in einem Testmedium wie Körperflüssigkeit und Zeliüberstand, gekennzeichnet dadurch, daß er J folgendes enthält:

- einen festen Träger, vorzugsweise Mikrotestplatten, Luminometergefäße aus Plast oder proteinbindende Membranen, an die kovalent oder nichtkovalent Proteine d. h. ein Antikörper, wenn die zu bestimmende Substanz ein Antigen ist, oder ein Antigen, wenn die zu bestimmende Substanz ein Antikörper ist, gebunden sind, wobei die Proteine in der Lage sind, mit dem zu | bestimmenden Antigen oder Antikörper in dem Testmedium einen immunologischen Komplexf zu bilden, ·.«.

- einen monoklonalen oder polyklonalen Antikörper, der einen Komplex mit einer pH-steigernden,| Substanz oder einem pH-steigemden Enzym wie Urease oder einem Phosphat erzeugenden ; Enzym wie alkalischer Phosphatase bildet und dazu neigt, mit dem zu bestimmenden Antigen · oder Antikörper eine spezifische Bindung einzugehen,

- eine chemilumineszente Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 15. j

30. Testsatzfür den Nachweis und die Quantifizierung einer bestimmten Target-Nucleinsäure- | Sequenz in einem Testmedium, dadurch gekennzeichnet, daß er in einem oder mehreren ι Behältern folgendes enthält:

- eine erste einsträngige Nucleotidprobe, die in der Lage ist, mit einer in der nachzuweisenden Target-Nucleinsäure-Sequenz vorhandenen Nucleotidsequenz zu hybridisieren, und die auf .; einem Fixierungsmittel befestigt ist, ^!

- eine zweite chemisch oder enzymatisch markierte Nucleotidprobe, die in der Lage ist, mit einer in der Target-Nucleinsäure-Sequenz vorhandenen Nucleotidprobe zu hybridisieren, die aber nicht mit der ersten, auf Fixierungsmitteln befestigten Probe hybridisieren kann,

- Mittel zum Nachweis des Markers der zweiten Probe, wobei das Mittel an Urease, alkalische Phosphatase oder lucigeninbeladene Liposome konjugiert ist,

- eine chemilumineszente Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 15.

31. Testsatz zum Nachweis und zur Quantifizierung einer bestimmten Target-Nucleinsäure-Sequenz in einem Testmedium, dadurch gekennzeichnet, daß erfolgendes in einem oder mehreren Behältern beinhaltet:

- eine erste Polynucleotidprobe, bestehend aus einer einsträngigen Nucleotidsequenz, die in der Lage ist, mit der nachzuweisenden Target-Nucleinsäure-Sequenz zu hybridisieren und die auf einem festen Träger, vorzugsweise in Form von Streifen, Mikrotiterplatten oder Luminometergefäßen aus Plast befestigt sind,

- eine zweite chemisch oder enzymatisch markierte Nucleotidprobe (z.B. mit Biotin oder Digoxigenin markiert), die in der Lage ist, mit einer in der Target-Nucleinsäure-Sequenz vorhandenen Nucleotidsequenz zu hybridisieren, jedoch nicht mit der ersten, auf einem festen Träger fixierten Probe hybridisieren kann,

- ein Protein oder eine andere Substanz, die an dem Marker angebracht werden und beispielsweise Avidin oder Anti-Digoxigenin-Antikörper etc. sein kann und mit Urease, alkalischer Phosphatase oder lucigeninbeladenen Liposomen konjugiert ist,

- eine geeignete chemilumineszente Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 15.