DE69520183T2

DE69520183T2 - Chemilumineszierende Reagenz und Verfahren mit einem substituierten Acetanilid zur Lichterzeugung

Info

Publication number: DE69520183T2
Application number: DE69520183T
Authority: DE
Inventors: Sarah A. Fingar; Alan E. Friedman; Thomas R. Kissel
Original assignee: Johnson and Johnson Clinical Diagnostics Inc
Current assignee: Ortho Clinical Diagnostics Inc
Priority date: 1994-08-29
Filing date: 1995-08-29
Publication date: 2001-08-02
Anticipated expiration: 2015-08-30
Also published as: ATE199399T1; KR960007788A; CA2157062C; AU3030195A; FI954029L; KR100377038B1; JPH08173191A; JP3532669B2; EP0704539A3; AU700528B2; CA2157062A1; NO953368D0; FI954029A0; FI112543B; NO316228B1; EP0704539B1; DE69520183D1; NO953368L; US5705357A; EP0704539A2

Description

Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung betrifft eine chemiluminesziente Zusammensetzung, ein Testkit und ein Verfahren zum Nachweis von verschiedenen Analyten unter der Verwendung eines substituierten Acetanilids als dem einzigen lichterzeugenden Reagens.

Hintergrund der Erfindung

Es ist gut bekannt, eine quantitative oder qualitative Analyse einer wäßrigen Flüssigkeit durch in Kontakt bringen dieser Flüssigkeit mit einer Kombination von Reagenzien, die in der Lage sind ein nachweisbares Produkt in Proportion zu der Konzentration des Analyten in der Flüssigkeit zu ergeben, durchzuführen. Ein Typ eines brauchbaren Assays verwendet enzymatische Reaktionen, wobei der Analyt nach Kontakt mit den geeigneten Reagenzien in Anwesenheit eines geeigneten Enzyms mit Sauerstoff reagiert, um Wasserstoffperoxid proportional zur Konzentration des Analyten zu produzieren. Ein nachweisbares Produkt wild dann durch die Reaktion von Wasserstoffperoxid in Proportion zu der Konzentration des Analyten in der Testflüssigkeit hergestellt. Im allgemeinen wird Peroxidase in solchen Assays verwendet.
In anderen Assays wild eine Peroxidase in Anwesenheit von Wasserstoffperoxid reagiert, welches dem System hinzugefügt wurde, um die Menge eines bestimmten Analyten zu messen. Analyten, wie Glucose, Triglyzeride, Harnsäure, Cholesterin, Kreatinkinase können auf diese Weise nachgewiesen werden, so wie spezifische Bindungsliganden in spezifischen Bindungsassays, wobei die Peroxidase als eine nachweisbare Markierung verwendet wild. Solche Bestimmungen können in Lösung durchgeführt werden, m trockenen analytischen Assays oder diagnostischen Testvorrichtungen. Die in solchen Assays erzeugten Signale können colorimetrisch, chemilumineszente oder Flureszenzsignale sein, wobei gut bekannte signalerzeugende Reagenzien verwendet werden.
Es gibt verschiedene Haupttypen von lumineszenten oder luminometrischen Assays, die eine Emission von licht als Ergebnis der Anwesenheit eines Analyten von Interesse produzieren. Diese Assays sind auch als Chemilumineszenzassays bekannt und sind zum Beispiel in US-A-4,729,950 (Kricka et al.) und darin erwähnen Publikationen beschrieben. Verschiedene aromatische Amine und Phenole, so wie p-Jodphenol werden als brauchbar zur Verstärkung der Lichtproduktion in solchen Assays betrachtet (siehe ebenfalls US-A-4,598,044 von Kricka et al.). Ein bevorzugter Verstärker von colorimetrischen Assays war 4'-Hydroxyacetanilid, der in US-A-4,828,983 (McClune) beschrieben ist.
Obwohl die verstärkten Chemilumineszenzsysteme ein geeignetes Lichtsignal für Immunoassays erzeugen, weist die Reagenzzusammensetzung bestimmte Nachteile auf. Der optimale pH zur Lichtemission unter der Verwendung von Luminol ist 8,5. Jedoch ist der optimale pH für die Aktivität der Rettichperoxidase niedriger (6 bis 7). Aufgrund der hohen nicht enzymatischen Oxidation von Luminol ist der Hintergrund hoch und die Sensttivität bei geringen Enzymkonzentrationen reduziert. Darüber hinaus hat die Reagenzzusammensetzung bei dem höheren pH eine reduzierte Haltackeit (Oxidansinstabalität und Oxidation von Luminol). Der Bedarf die Aktivität von verschiedenen Reagenzien in der Formulierung kritisch zu kontrollieren, ergibt beachtliche Herstellungs- und Lagerungsprobleme.
Eine Verbesserung bei der Sensitivität winde durch die Verwendung von kationischen Mizellen mit 4- Hydroxyacetanilid als ein Verstärkungsmittel erreicht, wie in US-A-5,279,940 (Kissel) beschrieben ist. Jedoch verbleiben die meisten der oben erwähnten Probleme auch nach diesem Fortschritt im Stand der Technik.
Die Literatur beschreibt eine Zahl von Peroxidase-basierten Reagenziensystemen, die eine Lichtemission ohne die zweckmäßige Zugabe eines bekannten Lumiphors so wie Luminol, Ludgenin, Acridinester oder Dioxothane produzieren. Es ist es bekannt, daß zum Beispiel Pyrogallol (1,2-Trihydroxybenzen) ein Substrat zur Lichteizeugung bei pH 7 ist. Jedoch ist die berichtete Sensiävität ziemlich gering (0,1 nmolar Nachweisgrenze) und das Substrat ist bemerkenswert instabil gegenüber Autooxidation. Verschiedene Verstärker, so wie o- Phenylendiamin sind dafür bekannt die Sensitivität zu verbessen aber ihre Verwendung erfordert die Kontrolle einer komplexeren und instabileren Reagezienzusammensetzung, genau so wie im Falle mit Luminol.
Es wurden Versuche unternommen, konventionelle Fluoreszenz- oder Phosphoreszenzfarbstoffe als Chiemilummeszenzsignal erzeugende Substrate für Peroxidase zu verwenden. Zum Beispiel Peroxidase bei pH 6,5 verwendet, um Peroxidaselevel hinunter bis zu picomolaren. Konzentrationen zu verfolgen. Jedoch kann dies nur durch Zugabe der Peroxidase zu der Mischung aus Farbstoff und Peroxidase erfolgen, und wenn dies erfolgt, ist der Hintergrund zu hoch und die Sensitivität ziemlich niedrig.
Rettichperoxiddase-katalysierte Oxidation von Ketonen und Aldehyden, so wie Aceton und Propanal kann Lichtemission mit bestimmten Fluoreszenzfarbstoffen erzeugen. Jedoch macht die geringe Umsatzzahl und die Substratinstabilität solche Systeme unpraktisch für die Kommerzialisierung.
Es wurde beobachtet, daß licht erzeugt werden kann, wenn die Peroxidase als eine Peroxidase verwendet wird, so wie mit NADH, Dihydroxylumarat oder Luciferin als den Substraten. Diese Systeme haben auch Ihre Probleme, zu erwähnen sind geringe Sensiävität, das Bedürfnis von Sauerstoff in dem System (was ihren Gebrauch in trockenen analytischen Elementen ausschließt) und komplizierte Reaktionsmechanismen Koukli et al (Amtyst, 114, 711, 1989) beschreibt die Bestimmung von Acetaminophen (4'- Hydiüxyacetanilid) basierend auf der durch ihre Reaktion mit Cerium (TV) in saurer Lösung produzierten Chemilumineszenz.
Schmitt et al (Photochem Photobiol., 51, 719,1990) zeigten, das 4'-Hydroxyacetanilid mit Peroxidasekatalyse h Anwesenheit einer kationischen Mizelle Licht produziert. Jedoch waren nur hohe Level (höher als 10 nmolar) der Peroxidase als dem Analyt nachweisbar, und eine maximale Lichtemission wurde nur bei pH 8,8 beobachtet. Es findet sich kein Hinweis, daß die Sensitivität erhöht werden könnte, so daß picomolare Level von Analyten bei neutralem pH gemessen werden könnten.
Trotz der bemerkenswerten Forschung in diesem Gebiet bleibt daher ein Bedürfnis für ein einfaches, hochsensitives Peroxidase Chemilumineszenz Nachwassystem, das bei einem neutralen pH arbeitet, einen niedrigen Hintergrund in Anwesenheit eines Oxidans aufweist und keinen Sauerstoff zur Lichterzeugung benötigt.

Zusammenfassung der Erfindung

Die oben genannten Probleme werden mit einer wäßrigen Zusammensetzung zur Erzeugung eines Chemilumineszenzsignals gelöst, das umfaßt:
a) ein Oxidans in einer Menge von ungefähr 1 bis ungefähr 10 mmolar,
b) ein kationischer oberflächenaktiver Stoff niederen Molekulargewichts vorhanden von ungefähr 0,05 bis ungefähr 2% über seiner kritischen Mizellenkonzentration, oder ein kationisches Polymer vorhanden von ungefähr 0.01 bis ungefähr 2 Gew.-%,
c) einen Puffer, um den pH der genannten Zusammensetzung bei von ungefähr 6 bis ungefähr 8,5 zu halten, und
d) ein substituiertes Acetanilid, welches in einer Gesamtmenge von ungefähr 0,05 bis ungefähr 10 mmolar als dem einzigen eh Chemilumineszenzsignal erzeugendes Reagenz vorhanden ist, das ein Signal in Antwort auf die katalytische Aktivität von Peroxidase erzeugt, wobei das substituierte Acetanilid die Struktur (I) hat:
worin R¹ Wasserstoff oder Alkyl von 1 bis 4 Kohlenstoffatomen ist,
R² Wasserstoff Alkyl von 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Alkoxyalkyl voni bis 4 Kohlenstoffatomen, Hydroxyalkyl von 1 bis 4 Kohlenstoflatomen, Aminoalkyl von 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Haloalkyl von 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, oder Alkenyl von 2 bis 5 Kohlenstoffatomen ist,
R³ Wasserstoff oder Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen ist,
R&sup4; und R&sup5; unabhängig voneinander Wasserstoffoder eine elektronenfangende Gruppe mit einem Hammett- Signalwert von mindestens ungefähr 0,01 ist, und
R&sup6; und R&sup7; unabhängig voneinander Wasserstoff, Halo, Cyano oder Methyl sind, mit der Voraussetzung, daß mindestens eine von R&sup4; und R&sup5; eine elektronenfangende Gruppe mit einem Hammett-Signalwert von mindestens ungefähr 0,01 ist, und
mit der weiteren Voraussetzung, daß die Zusammensetzung im wesentlichen frei von beliebigen anderen chemilumineszenten Agenzien ist
Diese Erfindung stellt weiterhin einen diagnostischen Tesddt zum Nachweis eines katalytisch mit Peroxidase verwandten Analyten zur Verfügung, wobei der Kit individuell verpackt umfaßt:
i) die wässrige Zusammensetzung wie oben beschrieben, und
ii) eine Peroxidase oder eine Peroxidase-markierte spezifische Bindespezies.
Weiterhin stellt diese Erfindung eine Testvorrichtung zum Nachweis von Peroxidase oder einem katalytisch mit Peroxidase verwandten Analyt zur Verfügung, wobei die Testvorrichtung eine absorbierendes Trägermaterial umfaßt, und enthält
den kationischen oberflächenaktiven Stoff niederen Molekulargewichts oder ein kationisches Polymer, wie oben beschrieben,
den Puffer, wie oben beschrieben, und
das substituierte Acetanilid, wie oben beschrieben, mit der Voraussetzung, daß das Element im wesentlichen frei von jedem anderen chemilumineszienten Agens ist
Weiterhin stellt diese Erfindung ein Verfahren zur Erzeugung eines nachweisbaren Signals in Antwort auf Peroxidase zur Verfügung, das umfaßt:
A) Reagieren einer Peroxidase in Anwesenheit der oben beschriebenen wäßrigen Zusammensetzung, um ein nachweisbares Chemilumineszenzsignal zu erzeugen und
B) Bestimmen des sich ergebenden Chemilumineszenzsigals als ein Maß von Peroxidase.
Diese Erfindung stellt weiterhin einen spezifischen Bindungsassay zur Bestimmung eines spezifischen Bindungsliganden zur Verfügung, der umfaßt:
A) Bildung eines Peroxidase-markierten spezifischen Bindungkomplexes eines spezifischen Bindungsliganden mit einem für den Liganden spezifischen Rezeptor,
B) nach Abtrennung unkomplexierten Materials von dem Peroxidase-markierten spezifischen Bindungskomplexes, in Kontaktbringen des Peroxidase Zusammensetzung, um ein nachweisbares Chemilumineszenz zu erzeugen, und
C) Bestimmung des sich ergebenden Chemitumineszenzsignals als ein Maß des spezifischen Bindungsliganden.
Die vorliegende Erfindung stellt ein vereinfachtes Chemilumineszenz-Nachweissystem für Peroxidase zur Verfügung, das ein beliebiges von bestimmten substituierten Acetaniliden als das chemilumineszente Agens anstelle von konventionellen Reagenzien verwendet. Dieses System ermöglicht es dem Verwender, pmolare Level der Peroxidase in Lösung oder bei Verwendung von trockenen analytischen Elementen bei relativ neutralem pH nachzuweisen und stellt daher hohe Sensitivität zur Verfügung. Ein niedriger Hintergrund in Abwesenheit von Peroxidase wird bei der Verwendung der Praxis dieser Erfindung ebenfalls beobachtet.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist ein Balkendiagramm, das ein Chemilumineszenzsignal für eine Zusammensetzung dieser Erfindung bei verschiedenen pH-Werten zeigt, wie unten in Beispiel 9 beschrieben wild.
Fig. 2 ist ein Balkendiagramm, das ein Chemilumineszenzsignal bei verschiedenen pH- Werten für eine Kontrollzusammensetzung zeigt, wie unten in Beispiel 9 beschrieben wird.
Fig. 3 ist eine graphische Darstellung von Chemilumineszenzsignal versus der logamytmischen Konzentration von Thyroid Stimulierendem Hormon (TSH) wie in Beispiel 18 unten beschrieben ist

Genaue Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung kann mit Vorteilen in jeder analytischen Methode praktiziert weiden, die dazu gedacht ist, ein Chemilumineszenzsignal m Antwort auf die Anwesenheit von einer Peroxidase zu erzeugen. Solche Assays können den Nachweis eines organischen oder anorganischen Peroxids (so wie Wasserstoffperoxid) oder Peroxidase (m ihrer fielen Form) beinhalten, oder den Nachweis eines nichtimmunologischen Analyts, der sich von Peroxidase oder Wasserstonperoxid unterscheidet. Insbesondere ist die Erfindung bei der Praxis von spezifischen Bindungsassays, die ein Chemilumineszenzsignal erzeugen, brauchbar.
Der Assay kann qualitativ oder quantitativ oder beides sein und kann verwendet weiden, um eine biologische oder chemische Substanz (d. h. einen Analyten) in wäßrigen Flüssigkeiten nachzuweisen, einschließlich menschlichen oder tierischen biologischen Flüssigkeiten, Abwässern, Nahrungsmitteln, Abwässern aus der Umwelt, chemischen Verfahrensflüssigkeiten und anderen dem Fachmann geläufigen Proben. Insbesondere kann der Assay dazu verwendet werden, einen Analyten in menschlichen und tierischen biologischen Flüssigkeiten nachzuweisen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Gesamtblut, Serum, Plasma und Urin.
Wasserstoffperoxid (oder ein anderes Peroxid) kann mit dieser Erfindung bestimmt werden zusätzlich kann die Erfindung dazu verwendet werden um Analyten zu bestimmen, die in der Lage sind, Wasserstoffperoxid zu erzeugen, d. h. Analyten, die an einer oder mehreren Reaktionen teilnehmen, um so Wasserstonperoxid in Anwesenheit von geeigneten signalerzeugenden Reagenzien und einer Peroxidase zu erzeugen. Solche Analyten weiden hier als "katalytisch mit Peroxidase verwandte Analyten" betrachtet.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Erfindung zur Bestimmung eines spezifischen Bindungsliganden oder seines korrespondierenden Rezeptors (d. h. einer Substanz die spezifisch mit dem Liganden bindet) geeignet. Solche Liganden beinhalten, sind jedoch nicht beschränkt auf, Antikörper oder andere Proteine (einschließlich Lipoproteine, Blutproteine, Enzyme und Glycoproteine), Haptene, Drogen, Hormone, Steroide, Toxine, Viren, Bakterien, "Vitamine, Saccharide (einschließlich Polysaccharide), Modulatoren des Immunsystems (so wie Interieukme), Lipide, Nukleinsäuren, Mcht-Protein-Blut-Komponenten, oder jegliche Komponenten davon, wie dem Fachmann leicht ersichtlich ist.
Eine kritische Komponente der das chemilumineszente Signal erzeugenden wäßrigen Zusammensetzung dieser Erfindung sind ein oder mehrere substituierte Acetanilide der Struktur (I) wie unten definiert. Diese Verbindungen sind die Einzigen ein Chemhmineszenz-Signal erzeugenden. Reagenzien, die bei der Durchführung dieser Erfindung verwendet werden. In anderen Worten, die Zusammensetzungen, Testkits, Testvorrichtungen und Verfahren sind im wesentlichen fiel von allen anderen potenziell ein Chemilumineszenz- Signal erzeugenden Reagenzien. Mit "unwesentlichen frei" ist gemeint, daß solche Reagenzien entweder überhaupt nicht vorhanden sind oder in solch geringen Mengen vorhanden sind, daß jegliches Signal, das sie erzeugen, über das Hintergrundsignal hinweg nicht zu beobachten ist
Daher kann bei der Durchführung dieser Erfindung die Verwendung von verschiedenen anderen konventionellen Chemilumineszenz-Signal erzeugenden Verbindungen vermieden weiden. Zum Beispiel wenden Luminol und ähnliche 23-Dihydro-1,4-phthalazindion-Derivate mit der vorliegenden Erfindung vermieden.
Die zur Erzeugung eines Lichtsignals verwendeten Verbindungen sind durch die Struktur (I) definiert:
warn R¹ Wasserstoff oder Alkyl von 1 bis 4 Kohlenstoffatomen (so wie Methyl, Ethyl, Isopropyl, Hydroxymethyl, Aminomethyl und Methoxymethyi) ist Bevorzugterweise ist R¹ Wasserstoff oder Methyl und weiter bevorzugt ist er Wasserstoff
R² ist Wasserstoff Alkyl von 1 bis 4 Kohlenstoffatomen (so wie Methyl, Ethyl, Isopropyl, t-Butyl und Isobutyl), Alkoxyalkyl von 1 bis 4 Kohlenstoffatomen (so wie Methoxymethyl und Methoxyethyl), Hydroxyalkyl von 1 bis 4 Kohlenstoffatomen (so wie Hydroxymethyl, 1-Hydroxyethyl, 2- Hydroxyethyl, 2,3- Dihydroxypropyl), Aminoallyl von 1 bis 4 Kohlenstoffatomen (so wie Aminomethyl, 2-Aminoethyl, 3- Aminopropyl, 2,4-Diaminobutyl, Methylaminomethyl, 2-Diaminoethyl und 4-Aminobutyl), Haloalkyl von 1 bis 4 Kohlenstoffatomen (so wie Chlormethyl, Brommethyl, 2-Chlorethyl, 1,1-Dichloimethyl, 1,1,1- Trichlormethyl, 2-Trid-ilorethyl und 3-Chlorpropyl), oder Alkenyl von 2 bis 5 Kohlenstoffatomen (so wie Ethenyl, 1-Propenyl, Isopropenyl und 2-Butenyl). Bevorzugterweise ist R² Wasserstoff Methyl, Methoxymethyl, Hydroxymethyl, Chlormethyl oder Ethenyl. Weiter bevorzugt ist er Wasserstoffoder Methyl, wobei Methyl am meisten bevorzugt ist.
R³ ist Wasserstoffoder Alkyl von 1 bis 4 Kohlenstoffatomen (so wie Methyl, Ethyl, Isopropyl, t-Butyl, n-Butyl und Isobutyl). Bevorzugterweise ist R³ Wasserstoffoder Methyl und besonders bevorzugt ist er Wasserstoff
R&sup4; und R&sup5; sind unabhängig Wasserstoff oder eine Elektronen-fangende Gruppe mit einem Hammet-Sigma-Wert von mindestens ungefähr 0,01, und bevorzugterweise mindestens ungefähr 0,3, vorausgesetzt das mindestens einer der zwei Reste eine Elektronen fangende Gruppe.
Hammet-Sigma-Werte weiden in Übereinstimmung mit Standardverfahren berechnet, wie zum Beispiel in Steric Effects in Organic Chemistry. John Wiley & Sons, Inc., 1956, pp. 570-574 und Progress in Physical Organic Chemistry. Vol. 2, Intersrience Publishels, 1964, pp. 333-339 beschrieben. Repräsentative Elektoonenfangende Gruppen, die positive Hammet-Sigma-Werte haben, schließen Cyano, Carboxy, Nitro, Halo (Fluor, Brom, Chlor oder Jod), Trihalomethyl (zum Beispiel Trifluormethyl oder Trichlomethyl), Carbonyl, Carbamoyl, Sulfonyl, Sulfamoyl, Ester und andere dem Fachmann leicht ersichtliche ein. Bevorzugte Elektronen langende Gruppen sind Halo (sowie Chlor oder Brom) und Cyano. Chlor, Brom und Cyano sind die am meisten bevorzugten Elektronen-fangende Gruppen, und Chlor oder Brom ist für jeden von R&sup4; und R&sup5; am meisten bevorzugt.
R&sup6; und R&sup7; sind unabhängig Wasserstoff Methyl, Cyano oder Halo (so wie Chlor oder Brom). Bevorzugterweise ist einer oder beide Substituenten Wasserstoff Methyl oder Chlor und am meisten bevorzugt sind beide Wasserstoff:
Repräsentative Elektronen-Transferagenzien mit der Struktur (I) schließen ein:
3'-Chlor-4'-hydroxyacetanilid,
3',5'-Dichlor-4'-hydroxyacetanilid,
2'-Methyl-3'-Chlor-4'-hydroxyacetanilid,
2'3'-Dichlor-4'-hydroxyacetanilid,
2',5'-Dichlor-4'-hydroxyacetanilid,
3'-Fluor-4'-hydroxyacetanilid,
3',5'-Difluor-4'-hydroxyacetanilid,
3'-Brom-4'-hydroxyacetanilid,
3',5'-Dibrom-4'-hydroxyacetanilid,
3'-Chlor-4'-hydroxy-6'-methylacetanilid,
3'-Cyano-4'-hydroxyacetanilid,
3',5'-Dicyano-4'-hydroxyacetanilid,
N-Methyl-N-(3-chlor-4-hydroxyphenyl)acetamid,
N-(3-Chlor-4-hydrohyphenyl)methacrylamid,
N-(3-Chlor-4-methoxyphenyl)acetamid,
N-(3-Chlor-4-hydroxyphenyl)-2-chlorazetamid,
N-(3-Chlor-4-hydroxyphenyl)-2,2-dichloracetamid,
N-(3-Chlor-4-hydroxyphenyl)-2,2,2,2-trichloracetamid,
N-(3-Chlor-4-hydroxyphenyl)-2-hydroxyacetamid,
N-(3-Chlor-4-hydroxyphenyl)-2-methoxyacetamid, und
N-(3-Chlor-4-hydroxyphenyl)-2-aminoacetamid,
Die am meisten bevorzugten Verbindungen sind 3'-Chlor-4'hydroxyacetanilid und 3'- Brom-4'-hydroxyacetanilid.
Einige dieser Verbindungen können käuflich erhalten werden. Andere können allgemein aus bekannten Ausgangsmaterialien wie folgt hergestellt werden:
Die halogenierten Verbindungen von Struktur (I) werden durch Halogenierung des bekannten Precursor-Anilids (zum Beispiel, 4'-Hydroxy- oder Alkoxyacetanilid) mit einem bekannten halogenierenden Agens, so wie Sulfurylchlorid, Sulfurylbromid oder dem freien Halogen in Anwesenheit von Säure hergestellt Wo der gewünschte Precursor nicht zur Verfügung steht, kann ein geeignet substituiertes Phenol durch müde Nitration unter Verwendung bekannter Techniken (zum Beispiel mit schwefelhaltiger Säure in einem Lösemittel so wie Eisessig) nitriert weiden, gefolgt von Hydrogeniemng, typischerweise über Platin oder Palladium, um das Amin herzustellen (siehe J. Am Chem. Soc. 49,1093,1927). Das Amin wird dann acyliert, zum Beispiel durch Kondensation mit dem gewünschten acylierenden Agens, so wie einem Anhydrid (zum Beispiel Essigsäureanhydrid) oder einem sauren Chlorid, so wie Acrylsäurechlorid, um das Anilid beizustellen. Geeignete Acylietungsverfahren werden ebenfalls bei Challis et al. The Chemistry of Amides, pp. 731-857, Intersciences Publishing, New York, 1970 beschrieben. Wenn die ausgewählten Ausgangsmaterialien nicht schon die erforderlichen Elektronen-fangenden Gruppen zur Verfügung stellen, kann das sich ergebende Anilid bequem wie oben beschrieben halogeniert werden.
Alternativ kann der Amin-Vorläufer des Anilids mit einem acylierenden Agens acyliert werden, das die Gruppe an Position R² (zum Beispiel Trichloressigsäurechlorid oder Maleinanhydrid) zur Verfügung stellt, oder der aromatische Ring des Anilids kann an den Positionen R&sup4; oder R&sup5; (oder beiden) werden unter der Verwendung von bekannten Techniken alkyliert, acyliert oder nitriert werden, um so die erforderliche Elektronen-fangende Gruppe von R&sup4; und R&sup5; zur Verfügung zu stellen.
Eine zweite Komponente der wäßrigen Zusammensetzung dieser Erfindung ist ein kationischer oberflächenaktiver Stoff niederen Molekulargewichts, um Mizellen zur Verfügung zu stellen oder ein kationisches Polymer, um eine hydrophobe Umgebung für eine erhöhte Sensitivität, Lagerstabilität und kinetische Stabilität zur Verfügung zu stellen.
Oberflächenaktive Stoffe sind im allgemeinen Verbindungen, die die Oberflächenspannung von Wasser verringern, wie dem Fachmann generell geläufig ist. Im allgemeinen sind solche Materialien synthetisch, aber einige kommen natürlicherweise vor. Kationische oberflächenaktive Stoße haben eine positive Nettoladung und sind in einer Anzahl von Veröffentlichungen beschrieben, einschließlich zum Beispiel Surfactants and Interfadal Phenomena, By Milton J. Rosen, John Wiley and Sons, N. Y., 1978, Seiten 13-17 und sind durch Handelsnamen bezeichnet m McCutcheon's Emulsifiers and Detergents, North American Ed, McCutcheon's Division, The Manufacturing Coniectioner Publishing Co., 1988, Seite 259. Positive Ladungen in den oberflächenaktiven Stoffen können durch kationische Gruppen zur Verfügung gestellt werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf quaternäres Ammonium, quaternäres Phosphonium, Sulfonium, Pyridinium, Pyrimidinium, Imidazolium und Oxonium.
Besonders brauchbare kationische oberflächenaktive Stoße und Polymere können durch die Struktur (II) dargestellt werden:
worin R&sup8; substituiertes oder unsubsätuiertes Alkyl von mindestens 7 Kohlenstoflatomen ist, und bevorzugterweise von 10 bis 20 Kohlenstoffatomen (so wie n-Oktyl, Isononyl, Isodecyi, Dodecyl, Tetradecyl, Hexadecyl, Octadecyl, Bcosyl, 2,7,8-Trimethyldecyl, 4-Ethyl-6-methyldodecyl, Benzyl und Phenelhyl), substituiertes oder unsubsätuiertes Aryl von 6 bis 14 Kohlenstoffatomen im aromatischen Nukleus (so wie Phenyl, Naphthyl oder Anthryl) die mit einem oder mehreren hydrophoben Gruppen substituiert sein können, so wie lineares oder verzweigtes Alkyl von 1 bis 10 Kohlenstoffatomen (so wie Methyl, Ethyl, Isopropyl, t-Butyl, Hexyl, Octyl, Isooctyl, Nonyl oder Isononyl) Halo und andere dem Fachmann bekannte. Solche substituierten Arylgruppen schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf, Xylyl, Tolyl, Isononylphenyl, Dimethylphenyl und Trichlorphenyl R&sup8; kann ebenfalls substituiertes oder unsubstituiertes Alkenyl von 8 bis 20 Kohlenstonatomen (so wie 1-Octenyl, 1- Decenyl und 2-Dodecenyl) oder eine Polymergruppe (beschrieben unten) sein.
Bevorzugterweise ist R&sup8; Alkyl oder Alkenyl von 14 bis 16 Kohlenstonatomen, wobei Gruppen so wie 2,4-Dimethyl-6-ethyldecyl, Tetradecyl und Hexadecyl weiter bevorzugt sind.
In Struktur (II) kann R&sup9; Alkyl oder Alkenyi, so wie für R&sup8; definiert sein, substituiertes oder unsubstituiertes Alkyl von 1 bis 7 Kohlenstonatomen (so wie Methyl, Ethyi, Isopropyl, t-Butyl, Methoxymethyl, Benzyl und Hexyi), substituiertes oder unsubstituiertes Alkenyl von 2 bis 7 Kohlenstoffatomen (sowie ein Ethenyl, Allyl, Isopropenyl und n-Butenyl) oder carbozyklisches Aiyl von 6 bis 10 Kohlenstoffatamen im Ringsystem (so wie Phenyl, Tolyl, Xylyl, Naphthyl und D-Methoxypnenyl).
R¹&sup0; und R¹¹ sind unabhängig substituiertes oder unsubstituiertes Alkyl von 1 bis 7 Kohlenstoffatomen (so wie Methyl, Ethyl, Isopropyl, t-Butyl, Metboxymethyl, Benzyl und Hexyl), substituiertes oder unsubstituiertes Alkenyl von 2 bis 7 Kohlenstoffatomen (so wie ein Ethenyl, Isopropenyl und Alkyl) oder carbozyklisches Aryl von 6 bis 10 Kohlenstoffatomen im Ringsystem (so wie Phenyl, Tolyl, Xylyl, Naphthyl und p- Methoxyphenyl).
Alternativ können jede zwei oder drei von R&sup9;, R¹&sup0; und R¹¹ zusammengenommen weiden, um genügend Kohlenstoffatome zu bedeuten und ein Sauerstoff-, Stickstoff- oder Schwefelatom, ehe 5- bis 6- Mitgliederstaike heterozyklische kathonische Gruppe mit dem quaternären Ammoniumatom zu vervollständigen. Beispiele von solchen Gruppen schließen ein, sind aber nicht beschrankt auf, Pyridinium, Piperidinium, Pyrrolidinium, Molpholinium, Quinolinium, Pyrimidinium, Acridinium, Benzothiazolium Benzioxazolinium undimidazolium.
Bevorzugterweise sind R&sup9;, R¹&sup0; und R¹¹ unabhängig Methyl oder Ehyl,
Y&supmin; ist ein geeignetes monovalentes Säureanion, welches kein Substrat oder Inhibitor für Peioxidasenist, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Perchlorat, Halid (so wie Fluorid, Chlorid und Biomid), Teteafluorbotat, Triflat, Melhylsutfat, Hexafluorphosphat, Nitrat, p-Totuolsulfonat und andae dem Fachmann geläufige. Halidanionen sind bevorzugt.
Beispiele von brauchbaren nicht-polymerischen kationischen oberflächenaktiven Stoffen sind Hexadecyltrimethylammoniumchlorid, Dodecyltrimethylammoniumchlorid, Cetyltrimethylammoniumbromid (auch bekannt als Hexadecyttrimethammoniumbromid), Cocotrimethylammoniumchlorid, Talgtrimethylammoniumchlorid, Sojatrimethylammoniumchlorid, Myristyltrimethylammoniumbromid, Stearyltrimethylammoniumchlorid, Cetylethyldmethylammoniumbromid, Didodecyldimediylammomumbromid, Cetylpyridinumchlorid und Myristdimeäbenzyiammoniumchlorid.
Cedtrimediammoniumbromid und Cetyltrimethylamniomumchlorid sind am meisten bevoizugt.
Viele dieser oberflächenaktiven Stoffe können fettig von einer Zahl von kommerziellen Quellen erhalten weiden. Andere können durch einen geschulten Chemiker unter der Verwendung von bekannten Ausgangsmaterialien und Vorschriften einfach hergestellt werden.
Wo R&sup8; in Struktur (II) eine polymerische Gruppe ist, kann das Rückrad von solchen Polymeren aus konventionellen Polyestem, Polyamiden, Polyethyleniminen, Polycarbonaten, Zellulose-haltigen Materialien und Vinyladditions-Homo- und Copolymeren, umfassend sich wiederholende Einheiten eines Monomers der gewünschten positiven Ladung, bestehen. Diese Materialien können aus konventionellen Materialien hergestellt werden unter der Anwendung von konventionellen Vorschriften. Die Polymere können die darin enthaltenen Ladungen aus den Ausgangsmaterialien enthalten oder von chemischer Reaktion nach der Herstellung.
Besonders brauchbare kationische Polymere sind Vinyladditions Homo- oder Copolymerie, die aus ethylenisch ungesättigten polymerisierbaren Monomeren hergestellt werden, die die gewünschten positiv geladenen Gruppen haben und einem oder mehreren Comonomeren die hydrophobe Regionen, die charakteristisch für oberflächenaktive Stoffe sind, kreuzvernetzte Regionen oder andere geeignete Eigenschaften zur Verfügung stellen.
Repräsentative kationische Monomere schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf, N- Cyclohexyl-N,N-dimethyl-N-(m- & p-vinylbenzyl)ammoniumchlorid, N-Benzyl-N,N-dimefhyl-N-(m- & p- vinylbenzyl)ammoniumchlorid, 3-(2-Hydropropyl)-1-vinylimmidazoliumchlorid und 1-Methyl-4- vinyipyridiniumchlorid. Brauchbare Comonomere schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf, Styrol und seine Derivate (so wie Vinyltoluol und p-t-Butylstyrol, acrylische und methacrylische Säureester (so wie Methylacrylat, Methylmethacrylat, Butylaoylat und Butylmethacrylat), kreuzvernetzbare Monomere (so wie Divinylbenzen, Elhylendiacrylat, Ethylendimethacrylat und N,N'-Methylenbis(acrylamid)]. Andere geeignete Polymere sind zum Beispiel beschrieben als Mordanis in US-A-4,069,017 (Wu et al) und US-A4,024,839 (Wu et al). Solche Materialien haben im allgemeinen quaternäre Ammonium oder quatemäre Phosphorgruppen die vom Polymerrückrad herabhängen, und bevorzugterweise mindestens von ungefähr 40 bis 100 Gewichtsprozent der von den ethylenisch ungesättigten polymerisierbaren Monomeren abstammenden sich wiederholenden Einheiten weisen solche Gruppen au. Die übrigen sich wiederholenden Einheiten können von einer großen Vielzahl von ethyienisch ungesättigten polymerisierbaren Monomeren abstammen, wie in den oben genannten Patenten bemerkt ist.
Repräsentative kationische Polymere schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Poly(N,N,N-trimethyl-N-vinylbenzylammoniumchlorid), Poly[styrol-co-benzyl-N,N-dimethyl-N-(m- & p- ylbenzyl)ammomumchlorid--divinylbenzenl, Poly(N,N,N-trio(-N-vinyibenzylphosphoniumchlorid), Poly[styrol-N-vinylbenzyl-N-Trihexylammoniumchorid], Poly(styrol-co-N,N,N-trimethyl-N- vinylbenzylammoniumchlorid), Poly[N-cyclohexyl-N,N-dimethyl-N-(m- & p- vinylbenzyl)ammoniumchlorid], Poly[stylrol-o-1-vinylimidazol-co-3-(2-hydroxyethyl)-1- vinylimidazoliumchlorid] und andere dem Fachmann geläufige. Ein bevorzugtes kationisches Polymer ist Poly[N-cyclohexyl-N]-dimethy-N-(m- & D-vinylbenzyl)ammoniumchlorid].
Die signalerzeugende Zusammensetzung dieser Erfindung ist im allgemeinen auf einen pH von ungefähr 6 bis ungefähr 8,5 (bevorzugterweise von ungefähr 6,5 bis ungefähr 8) gepuffert, wobei einer oder mehrere geeignete und gut aus dem Stand der Technik bekannte Puffer verwendet werden. Zum Beispiel können Puffer so wie Tris(hydroxymethyl)aminomethan, Bis(2- hydroxyethyl)iminotris(hydroxymethyl)methan, N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethansulfonsäure, 13- Bis[tris(hydroxymethyl)methylamino]propan, N-(2-hydroxyethyl)piperazin-N'(3-propansulfonsäure), N-(2- hydroxyethyl)piperazin-N'-(2-ethansulfonsäure) und Phosphat verwendet werden. Tris(hydroxymethyl)aminoethan ist bevorzugt. Bei seiner Verwendung zur Definition des pH bezieht sich der Ausdruck "ungefähr" auf ± 0,2 Einheiten.
Bei der Durchführung dieser Erfindung wird ein Qxidans gebraucht, um eine Excitation dies substituierten Acetanilids zu verursachen, so daß in Anwesenheit einer Peroxidase licht abgegeben wird. Verschiedene brauchbare Oxidantien sind bekannt, aber Perboration und Wasserstoffperoxid sind bevorzugt, wobei das letztgenannte am meisten bevorzugt ist.
Verschiedene optionale Zusatzstoffe, die h der wäßrigen Zusammensetzung dieser Erfindung enthalten sein können, sind Chelatbildner, verschiedene anorganische Salze zur Ionenstärke (so wie Natriumchlorid und Kaliumchlorid) und Stabilisatoren wie Natriumbenzoat.
In der wäßrigen signal-erzeugenden Zusammensetzung dieser Erfindung können die Mengen jeder Komponente in Abhängigkeit von dem Ort ihrer Verwendung variiert wenden, wobei die besonderen Sensitivitäten der Reagenzien und anderer Faktoren dem Fachmann gut geläufig sind.
Deshalb sind die folgenden allgemeinen Bereiche als Richtlinie für den Fachmann gedacht und nicht um die Praxis der Erfindung zu begrenzen.
Die Menge des Oxidans ist allgemein mindestens ungefähr 1 mmolar, wobei eine Menge meinem Bereich von ungefähr 1 bis ungefähr 10 mmolar bevorzugt ist. Das substituierte Acetanilid der Struktur (T) ist im allgemeinen in einer Menge von mindestens ungefähr 0,05 mmolar vorhanden, wobei eine Menge in einem Bereich von ungefähr 0,05 bis 10 mmolar bevorzugt ist. Der kationische oberflächenaktive Stoff ist im allgemeinen in einer Menge von ungefähr 0,05 bis ungefähr 2% oberhalb der kritischen Mizellenkonzentration vorhanden, und wenn das kadonische Polymer verwendet wird, ist es im allgemein in einer Menge von ungefähr 0,01 bis etwa 2 Gewichtsprozent vorhanden. Die Menge von Pufier kann in Abhängigkeit vom verwendeten Puffer variieren, aber im allgemeinen ist sie von 0,01 bis ungefähr 0,3 molar. Bei der Verwendung hierin zur Definition der Konzentrationen bezieht sich der Ausdruck "ungefähr" auf ± 10% des angegebenen Wertes.
Die "kritische Mizellenkonzentration" ist für viele oberflächenaktive Stoße gut bekannt oder sie kann durch beschriebene Verfahren leicht bestimmt werden, wie zum Beispiel in Surfactant Science and Technology, Meyers, VCH Publishers, New York, Kapitel 3, 1988.
Diese Erfindung stellt ebenfalls eine Peroxidase enthaltende wäßrige Zusammensetzung als Teil eines Kits zur Verfügung, wobei die Zusammensetzung eine Peroxidase in freier Form, oder als ein mit einem spezifischen Bindemolekül (so wie ein Antikörper, Avidin oder Biotin) konjugierter Marker enthält Solch eine Zusammensetzung kann ebenfalls wie oben beschrieben für die signalerzeugende Zusammensetzung dieser Erfindung gepuffert sein. Die in dieser Zusammensetzung vorhandenen Mengen von Peroxidase oder Peroxidase-mariderten spezifischem Bindemolekül wären dem Fachmann leicht ersichtlich.
Neben den oben beschriebenen Zusammensetzungen kann das Kit auch andere einzelne verpackte Reagenzien, Ausrüstung und Instruktionen, die brauchbar für die Durchführung verschiedener analytischer Methoden (beschrieben unten) sind, enthalten. Das Packen von KitKomponenten ist im Stand der Technik gut bekannt.
Wie hier verwendet, bedeutet "Peroxidase" jede peroxidative Substanz (enzymatisch oder andere), die die Oxidation eines Substrat katalysiert, d. h. das hier beschriebene substituierte Acetanilid, um so die geeignete Lichtemission zu erzeugen. Mikrobielle, Pilz- und Pflanzen-Peroxidasen sind bevorzugt, wobei Rettich-Peroxidase am meisten bevorzugt ist. Die Menge von Peroxidase kann aufgrund der Menge der anderen in der Reaktion verwendeten Komponenten weit variieren. Eine geeignete Menge wäre dem Fachmann leicht ersichtlich, aber eine minimale Menge wäre im allgemeinen mindestens ungefähr 1 · 10&supmin;&sup7; I. U/ml (oder eine äquivalente Menge für nicht-enzymatische peroxidative Substanzen). I. U. bezeichnet die Internationale Einheit für Enzymaktivität und ist definiert als die Menge von Enzymaktivität die benötigt wild, um die Konversion von 1 mikromol von Substrat zu Produkt pro Minute unter Standardbedingungen zu katalysieren.
Bei spezifischen Bindeverfahren wird die Peroxidase als ein Konjugat mit einem spezifischen Bindungsliganden oder dem Rezeptor dafür verwendet oder mit einem spezifischen Bindemolekül, welches entweder mit dem Liganden oder Rezeptor reaktiv ist. Der Ligand und Rezeptor werden in solchen Assays komplexiert und dabei mit der Peroxidase zu einem eventuellen Nachweis des markierten Komplexes oder markierten nicht komplexierten Materials markiert. Die Herstellung von solchen Konjugaten kann unter der Verwendung einer Vielzahl von bekannten Techniken (zum Beispiel wie von Yoshitake et al. Eur. J. Biochem., 101,395,1979 und in US-A-5,106,732 von Kondo et al beschrieben) erreicht werden.
Verschiedene spezifische Bindungsassayformate sind bei der Durchführung dieser Erfindung brauchbar und schließen Nukleinsäure-Hybridisieiungsassays, immunochemische Assays (so wie Enzym-Immunoassays, Sandwichassays, kompetitive Bindungsassays, direkte Bindungsassays) und andere gut aus dem Stand der Technik bekannte ein. Solche Assays sind im allgemeinen zum Beispiel in US-A4,598,044, US-A-4,745,077 (Hollan et al), US-A-5,077,198 (Shih et al), USA-5,085,986 (Mauck et al), Matthews et al. AnaL Biochem. 169, Seiten 1-25 (1988), und WO 88/01302 (veröffentlicht 25. Februar 1988) beschrieben. Dem Verfahren der Erfindung kann ein Amplifikationsprozeß, so wie Polymerasekettenreaktion (allgemein bekannt als PCR) wie beschrieben zum Beispiel in US-A-4,965,188 (Mullis et al) und Ligasekettenreaktion, die im allgemeinen bei Weiss, Science, 254, Seiten 1292-1293,1991 beschrieben ist, vorangehen, um die Menge von Zielnukleinsäure zu vergrößern, die dann unter Verwendung der Zusammensetzung dieser Erfindung nachgewiesen werden kann.
Besonders geeignete spezifische Bindemethoden dieser Erfindung sind solche, die im Stand der Technik als Sandwich-Assays bekannt sind und worin der ligand von Interesse mit mindestens einem ersten und zweiten Rezeptor entweder gleichzeitig oder m einer erwünschten Reihenfolge komplexiert wild. Einer dieser Rezeptoren ist ein Fangreagenz, das entweder auf einem geeigneten Träger (so wie einer Mikrotiterplatte, polymeren, magnetischen oder GlasPartikeln, Filmen, Membranen, Filtenapier und anderen im Stand der Technik bekannten Materialien) durch Adsorption, kovalente oder andere bekannte Bindeverfahren insolubilisiert ist, oder geeignet ist, durch weitere Komplexierung oder Reaktion insolubilisiert zu weiden. Zum Beispiel kann das Fangreagenz mit einer spezifischen Bindegruppe (zum Beispiel Biotin) maridert sein, die mit ihrer entsprechenden Rezeptorgruppe (zum Beispiel Avidin) reaktiv ist, die auf einem Träger insolubilisiert ist.
In den Sandwich-Assays ist der zweite Rezeptor für den Liganden von Interesse ein Nachweisreagenz, das mit einer Paoxidase maridert weiden kann oder dazu in der Lage ist, so durch zusätzliche spezifische Bindereaktionan (so wie durch einen Avidin-Biotin-Komplex) maridert zu werden. Nachweis des Markers wild durch diese Zusammensetzung der Erfindung erreicht.
In weiter bevorzugten Ausführungsformen ist der ligand von Interesse ein antigenisches Material, mit dem Antikörper reaktiv sind oder eine Nukleinsäure, mit der komplementäre Nukleinsäuren (so wie Oligonukleotide) hybridisiert werden können. Andere Ausführungsformen schließen kompetetive Bindungsassays ein, worin ein spezifischer Bindungsligand von Interesse mit einem Peroxidase-mariderten Analog des Liganden um einen einzelnen Rezeptor kompetetiv ist.
Die oben beschriebenen Assays können in Lösung oder in einem trockenen Format ausgeführt werden. Lösungsassays beziehen sich im allgemeinen auf Verfahren, die h Lösungen h einem geeigneten Behälter ausgeführt wenden, und im Fall von heterogenen spezifischen Bindungsassays weiden geeignete Trenntechnik-Ausrüstungen verwendet, um dann die ungebundenen Materialien von den gebundenen Materialien zu trennen. Bei trockenen Assays können die chemischen oder spezifischen Bindungsreakrionen in einem trockenen Element, einem Teststreifen oder einer lästigen Matte durchgeführt werden und die Anwesenheit des Analyten wird innerhalb des Elements nach Reaktion der verschiedenen Reagenzien nachgewiesen wenn eine Testprobe auf das Element oder die Testvorrichtung aufgeteagen wild. Details im Hinblick auf solche Elemente sind im Stand der Technik gut bekannt, einschließlich aus zum Beispiel US-A-3,992,158 (Przybylowicz et al), US-A-4,258,001 (Pierce et al), USA-4,292,72 (Kitajima et al), US-A-4,430,436 (Koyama et al) und US-A- 4,670,381 (Frickeyetal)die hiermit Zitat aufgenommen sind.
Im allgemeinen umfassen die Elemente mindestens ein absorbierendes Trägermaterial und optional zusätzliche Lagen oder Zonen von Reagenzien. Die für die vorliegende Erfindung geeigneten Reagenzien können in derselben oder einer unterschiedlichen Lage oder Zone des Elements vorliegen.
Die folgenden Beispiele sind zur Verdeutlichung der Praxis der Erfindung zur Verfügung gestellt, aber sind nicht als einschränkend gedacht. Alle Prozentangaben sind, falls nicht anders angegeben, Gewichtsprozent.
Außer wo angegeben, wurden alle Reagenzien und Ausrüstung von Eastman Kodak Company oder anderen gewerblichen Quellen erhalten.
Die folgenden Präparationen beschreiben repräsentative Verfahren zur Herstellung von einigen der substituierten Acetanilide, die bei der Durchführung dieser Erfindung brauchbar sind.

Herstellung A:

In eine 1-Liter-Rundflasche (mit einem Magnetrührer ausgestattet) wurde Eisessig (700 ml) mit 4'-Hydroxyacetanilid (50 g) gemischt, bis der Feststoff vollständig gelöst war. Die erhaltene Lösung wurde auf zwischen 10-15ºC gekühlt und dazu SO&sub2;Cl&sub2; (47 g) hinzugefügt und die so erhaltene Lösung wurde für eine Stunde gerührt. Dann wurde Wasser (200 ml) zugefügt und 3'-Chlor-4'-Hydroxyacetanilid wunde als ein weißer Niederschlag kristallisiert (60 g, 98% Ausbeule).

Herstellung B:

In eine 500-ml-Rundflasche (mit einem Magnetmhrer ausgestattet) wurde Wasser (200 ml) mit 4-Amino-2,6-Dichlorphenolhydrochlorid (20g) gemischt, bis der Feststoff vollständig gelöst war. Die so emaltene Lösung wurde auf 70ºC erwärmt und Essigsämeanhydrid (11 g) wurde hinzugefügt und die so emaltene Lösung für eine Stunde geführt. Bei Abkühlung bildeten sich Kristalle von 3"-Dichlor-4'- Hydroxyacetanilid (19,6 g, 95% Ausbeute).

Beispiele 1-4: Wäßrige Chemilumineszenz-Zusammensetzung

Wäßrige Zusammensetzungen dieser Erfindung zur Erzeugung eines chemilumineszenten Signals wurden durch Mischung von Cetyltrimethylammoriumcnlorid (0,1%), Wasserstoffperoxid (3 mmolar) und verschiedenen chemilumineszenten Agenzien (1 mmolar) in Tris(hydroxymelhyl)aminomethanhydrochlorid-Puffer (0,05 molar, pH 7,2) hergestellt. Verschiedene Kontrollzusammensetzungen wurden auf ähnliche Weise hergestellt, um bekannte Fluoreszenzfarbstoffe zu enthalten. Die Signalerzeugung wurde bei 37ºC unter Verwendung eines konventionellen Turner TD-20e-Luminometers gemessen, wenn verschiedene Mengen von Rettichperoxidase (Sigma Chemical XD) mit den Zusammensetzungen (finales Volumen von 200 ul) gemischt wurden.
Als chemilumineszente Agenzien enthielt Beispiel 1 3'-Chlor4'-hydroxyacetenilid, Beispiel 2 enthielt 3'-Fluor-4'-hydroxyacetanilid, Beispiel 3 enthielt 2'-Methyl-3'chlor-4'-hydroxyacetanilid, und Beispiel 4 enthielt 3'-Brom4'-hydroxyacetanilid.
Kontrolle A enthielt Fluoreszin, Kontrolle B enthielt Eosin Y und Kontrolle C enthielt Coumarin 343.
Tabelle 1 unten zeigt die durchschnittlichen Lichtsignale, die von den Zusammensetzungen bei drd Wiederholungen h jedem Experiment (10 Sekunden integrale Lichteinheiten bei t = 4 Minuten) nach Zugabe von Peroxidase erzeugt wurden. Das "Signal-zu-Rauschen"-Verhältnis (S/N) ist das Verhältnis von dem durch die Zusammensetzung in Anwesenheit von Rettichperoxidase erzeugte Lichtsignal zu Signal erzeugt durch Hintergrund (keine Peroxidase). Tabelle 1
Die Ergebnisse m Tabelle l zeigen, daß die Zusammensetzungen dieser Erfindung einen niedrigen Hintergrund und eine hohe Sensitivität in Anwesenheit von Rettichperoxidase aufweisen, sogar bei der 1 pmolar-Konzentration des Enzyms. Die Kontrollzusammensetzungen zeigten entweder einen hohen Hintergrund (Kontrollen A und B) oder ein inakzeptables niedriges S/N-Verhältnis (Kontrolle C) oder beides, bei dem 100 pmolar Enzymlevel.

Beispiel 5: Bevorzugte wäßrige Chemilumineszenz-Zusammensetzung

Eine bevorzugte Zusammensetzung dieser Erfindung wurde durch Mischen von Diethylentriaminpentaessigsäure (100 umolar), Wasserstoffperoxid (2 mmolar), Cetyltrimethylammoniumbromid (0,1 %) und 3'-Chlor-4'-hydroxyacetanilid (0,5 mmolar) in Tris(hydroxymethyl)aminomethanhydrochlorid (0,05 molar, pH 8) hergestellt Kontrollen D, E und F wurden ähnlich hergestellt, enthielten aber 4'-Hydroxyacetanilid (0,05 mmolar), 4-Jodphenol (l mmolar) und 4'-Hydroxyannsäure (0,5 mmolar) anstelle des substituierten 4'- Hydroxyacetanilids. Das finale Volumen jedes Reaktionsgemisches nach Zugabe verschiedener Konzenteationen von Retrichperoxidase (Sigma Chemical XII) war 200 ul.
Tabelle II unten listet die durchschnittlichen Lichtsignaldaten (10 Sekunden integrale Lichtsignale bei t = 5 Minuten) von drei Wiederholungen, erhalten unter Verwendung eines konventionellen TumerTD-20e-Luminometers bei 37ºC auf. Die vorliegende Erfindung zeigt eine größere Sensitivität als die Zusammensetzungen, die Verbindungen nach dem Stand der Technik enthalten. Tabelle II

Beispiel 6: Vergleichsbeispiel

Dieses Beispiel vergleicht die vorliegende Erfindung mit Zusammensetzungen, die unter der Verwendung von im Stand der Technik beschriebenen chemilumineszenten Agenzien hergestellt wurden.
Eine Zusammensetzung dieser Erfindung (Beispiel 6) wurde durch die Mischen von Diethylentriaminpentaessigsäure (10 umolar), Wassastoffperoxid (3 mmolar), Cetyllrimethylammoniumchlorid (0,1%) und 3'-Chlor-4'-hydroxyacetanilid (1 mmolar) m Tris(hydroxymehyl)amninomethanhydrochlorid (0,05 molar, pH 7) hergestellt Beispiel 6a wunde unter der Verwendung derselben Zusammensetzung, aber an einem anderen Tag durchgeführt.
Kontrollzusammensetzungen G und H enthielten Purpurogallin (Sigma Chemical) (0,2 mmolar), Ethanol (25% für Kontrolle G und 5% für Kontrolle H), Wasserstoffperoxid (12,5 mmolar) und Chelatbildner (10 umolar) in Phosphatpuffer (0,01 molar, pH 6,5). Kontrollzusammensetzungen I und J wurden wie die Zusammensetzung der Erfindung hergestellt, mit der Ausnahme, daß sie 7-Hydroxycoumarin oder Esculinmonohydrat als die chemilumineszenten Agenzien (jedes bei 1 mmolar) enthielten.
Tabelle III unten listet die durchschnittlichen Signaldaten, erhalten aus drei Wiederholungen auf, bei denen verschiedene Mengen von Rettichperoxidase unter der Verwendung der Verfahren und Ausrüstung beschrieben wie in den Beispielen 1 bis 4 hinzugefügt wurden. Das finale Volumen jedes Reaktionsgemisches war 200 ul. Tabelle III

Beispiel 7: Hintegrundvergleiche

Dieses Beispiel zeigt, daß die wäßrige Zusammensetzung der Erfindung ein niedriges Hintergrundsignal im Vergleich zu den Zusammensetzung Standes der Technik aufweist.
Eine Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung wurde durch Mischen von 3'-Chlor- 4'-hydroxyacetanilid (1 mmolar), Cetyltrimethylammomumchlorid (0,1%), Diethylentriaminpentaessigsäure (10 umolar) und Wasserstonperoxid (3 mmolar) in Tris(hydroxymethyl)-amiomethanhydrochloridpuffer (0,05 molar, pH 8) hergestellt
Eine Kontrolle K-Zusammensetzung war wie die Zusammensetzung der Erfindung, mit der Ausnahme, daß sie Fluoreszin als chemilumineszentes Agens enthielt und einen pH von 7,2 aufwies, und Kontrolle L war ähnlich zu Kontrolle K mit der Ausnahme, daß sie Eosin Y anstelle von Fluorcenzin enthielt.
Kontrolle M war wie die Zusammensetzung der Erfindung mit der Ausnahme, daß sie ebenfalls Luminol (1 mmolar) enthielt und einen pH von 8 aufwies. Käuflich erhältliches AMERLTIETM Signalerzeugendes Reagenz, welches Luminol (0,2 mmolar) und D-Jodphenol (0,25 mmolar) m Natriumpechoratpuffer (1 mmolar, pH 8,5) enthielt, wurde als Kontrolle N verglichen.
Tabelle IV unten listet das durchschnittliche Hintergrundsignal und die Standardabweichung, erhalten aus drei Wiederholungen unter der Verwendung eines TumerTD-20eLuminometers bei 37ºC (10 Sekunden Integrale) auf. Das Volumen des Reaktionsgemisches für jede Zusammensetzung war 200 ul. Tabelle IV
Diese Ergebnisse zeigen, daß die Zusammensetzung dieser Erfindung in Abwesenheit einer Peroxidase im wesentlichen Null Hintergrund aufweist, während viele der bekannten Chemilumineszenz- Zusammensetzungen einen beobachtbaren Hintergrund aufweisen.

Beispiel 8: Nachweis von Pilz-Peroxidase

Dieses Beispiel zeigt die Brauchbarkeit der vorliegenden Erfindung beim Nachweis einer Pilz-Peroxidase, so daß es klar ist, daß die Erfindung nicht auf eine bestimmte Peroxidase in ihrer Praxis beschränkt ist
Eine Zusammensetzung dieser Erfindung wurde durch Mischen von 3'-Chlor-4'- hydroxyacetanilid (1 mmolar), Dietethylentriaminpentaessigsäure (10 umolar), Cetrimethylammoniumchlorid (0,1%) und Wasserstoflperoxid (3 mmolar) in Tris(hydroxymethyl)aminomethanhydrochloridpuffer (0,05 molar, pH 7,2) hergestellt. Mittels des für Beispiele 1 bis 4 beschriebenen Verfahrens wurden Daten (Durchschnitt von drei Wiederholungen) des Nachweis von verschiedenen Mengen von Peroxidase des Pilzes Atrthymyces ramosus (Sigma Chemical) erhalten, die unten m Tabelle V aufgelistet sind. Tabelle V

Beispiel 9: Vergleich bei neutralem pH

Eine Zusammensetzung dieser Erfindung und eine Zusammensetzung des Standes der Technik (Kontrolle P) wurden bei verschiedenen Assay-pH-Werten verglichen.
Die Zusammensetzung dieser Erfindung wurde durch Mischen von Diethytentoaminpentaessigsäure (10 umolar), Wasserstoffperoxid (2 mmolar), S'-Chlor-4'-Hydroxyacetanilid (1 mmolar) und Cetyltrimethylammoniumbromid (0,1%) in tris(Hydroxymethyl)aminomethanhydrochloridpuffer (0,2 molar) hergestellt.
Die Kontrolle-P-Zusammensetzung enthielt Luminol (1 mmolar), 4'-Hydroxyacetanilid (0,15 mmolar), Cetyltrimelhylammoraumbromid (0,1%) und Wasserstoffperoxid (2 mmolar) in Puffer (0,05 molar).
Sigma-Chemical-XII-Rettich-Peroxidase wurde zu jeder Zusammensetzung hinzugefügt (250 pmolar für die Erfindung, 25 pmolar für Kontrolle P), um ein finales Volumen des Reaktionsgemisches von 200 ul zu ergeben. Das sich ergebende Signal wurde unter der Verwendung eines käuflich ermöglichen Lumino-skan-Platten-Lesegeräts bei entweder 25 oder 37ºC (10 Sekunden Integral bei t = 5 Sekunden) für Kontrolle P, und einem TurnerTD-20eLuminometer bei 37ºC (10 Sekunden Integral bei t = 5 Sekunden) für die Erfindung erhalten. Die Ergebnisse stammen aus drei Wiederholungen für jede Zusammensetzung und sind in Fig. 1 für die Erfindung und in Fig. 2 für Kontrolle P gezeigt. In Fig. 2 zeigt der erste Balken bei jedem pH-Wert das bei 25ºC erhaltene Signal und der zweite Balken zeigt das bei 37ºC erhaltene Signal
Es ist offensichtlich, daß die vorliegende Erfindung Licht optimal nahe dem neutralen pH erzeugt, während die Kontrolle-P-Zusammensetzung eine optimales Signal bei pH 8,5 bis 8,75 zur Verfügung stellt.

Beispiel 10: Analytisches Element

Dieses Beispiel zeigt die Herstellung einer Testvorrichtung dieser Erfindung und ihre Verwendung zum Nachweis von Peroxidase bei verschiedenen Konzentrationen unter der Verwendung der vorliegenden Erfindung.
Eine wäßrige Zusammensetzung dieser Erfindung wurde durch Mischen von Cetyltrimethylammoniumbromid (0,1%), Diethylentriaminpentaessigsäure (10 Mmolar), Wasserstoffperoxid (2 mmolar) und 3'Chlor-4'-hydroxyacetanilid (1 mmolar) in Trishydroxymethyl)-aminomethanhydiiochloridpuffer (0,05 molar, pH 8) hergestellt.
Eine Vorratslösung von Sigma-Chemical XII-Rettich-Peroxidase (8 umolar) wurde in demselben Pufier hergestellt. Diese Lösung wurde in dem angegebenen Puffer seriell verdünnt, um Lösungen beizustellen, die verschiedene Mengen von Peroxidase zur Mischung mit einer Zusammensetzung dieser Erfindung aufweisen.
Trockene analytische Elemente wunde hergestellt, welche die allgemeine Struktur wie in Fig. 1-3 der gleichfalls anhängigen U. S. S. N. 07/938,460 (eingereicht 31. August 1992 von Belly et al) aufwiesen, wobei diese Whatman GF/B-Glasmikrofsern als die absorbiercode Lage enthielten, um eine hohe Waschkapazität im Element zur Verfügung zu stellen. Diese hier gezeigten Elemente sollen die vorliegende Erfindung verdeutlichen und sind für ihre Durchführung nicht wesentlich. Verschiedene andere Elementstrukturen können ähnlich verwendet werden.
Jedes hergestellte Element hatte die folgenden Komponenten h der Reagenzmatrix, die m Kontakt mit der absorbierenden Lage ist Struktur des Elements
Die Zusammensetzung dieser Erfindung (100 ul) wurde auf das Hement aufgetragen und wurde in die absorbierende Lage eingezogen lassen. Eine andere Probe der Zusammensetzung wurde mit einer Peroxidaselösung in einem 40 : 1 Volumenverhältnis gemischt und dieses Gemisch (5 ul) wurde auf das Hement aufgeteagen. Nach einer 5 minütigen Inkubationsphase bei Raumtemperatur wurde der Rahmen vom Element abgenommen und die Lage, welche die Reagenzien und Reaktionsprodukte enthielt, wunde in ein konventionelles Luminometer für 5 Minuten gelegt, um die Lichtemission aufzuzeichnen (10 Sekunden Integral).
Tabelle VI unten listet die aus zwei Wiederholungen von jeder Peroxidasekonzentration (erhalten durch Variieren der Menge von Peroxidaselösung, die in dem Reaktionsgemisch verwendet wurde) erhaltenen Daten auf. Diese Ergebnisse zeigen die Brauchbarkeit der vorliegenden Erfindung, um Peroxidase unter der Verwendung eines trockenen analytischen Elements mit akzeptabler Sensitivität und niedrigem Hintergrund nachzuweisen. Tabelle VI

Beispiele 11-17: Vergleich von verschiedenen kationischen oberflächenaktiven Stoffen

Die Brauchbarkeit von verschiedenen kationischen oberflächenaktiven Stoffen und kationischen Polymeren wurde durch die Verwendung verschiedener dieser Verbindungen in Zusammensetzungen dieser Erfindung und Messung von Peroxidase als einem Analyten gezeigt.
Die Zusammensetzungen wurden durch Mischen von 3'-Chlor-4'- hydroxyacetanilid (1 mmolar), Wasserstoffperoxid (3 mmolar), Diethylentriammpentaesigsäure (10 umolar) und dem kationischen Material (unten aufgeführt, verschiedene Mengen) h Tris(hydroxymethyl)- aminomethanhydrochloridpuffer (0,05 molar, pH 7,2) hergestellt.
SigmaChamical XII-Rettich-Peroxidase (100 pmolar) wurde mit der Zusammensetzung gemischt und die erhaltenen lichtsignale aus dem Reaktionsgemisch (200 ul) wurden unter der Verwendung eines TumerTD-20eLummometeils bei 37ºC (10 Sekunden Integral bei 1 = 4 Minuten) gemessen. Hintergrundsignale der Zusammensetzungen wurden in Abwesenheit von der Peroxidase gemessen.
Die erhaltenen Daten sind unten in Tabelle VII als Durchschnitt von drei Wiederholungen der Zusammensetzungen der Erfindung aufgeführt. Die Hintergrundsignale sind der Durchschnitt von 12 Datenpunkten über 1 bis 4 Minuten. Diese Daten zeigen, daß verschiedene kationische Materialien in den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung auf Grund von niedrigem Hintergrund und hoher Sensitivität verwendet werden können.
Die verwendeten kationischen Materialien sind wie folgt:
Beispiel 11: Cetyltrimethylammoniumchlorid (0,1%)
Beispiel 12: Poly[styrol--N-vinyliimdazol-3-(2-hydroxyethyl)-1- vinylimidazoliumchlorid](50 : 40 : 10 molares Verhältnis)(0,025%)
Beispiel 13: Cetylpyridiniumchlorid(0,1%),
Beispiel 14: Poly[styrol-co-N-benzyl-N,N-dimethyl-N-(m- & p- vinylbenzyl)ammoniumchlorid-co-divhylbenzen] (45 : 45 : 0,1 molares Verhältnis) (0,05 %),
Beispiel 15: Poly(N-cyclohexyl-N,N-dimethyl-N-(m- & p- vinylbenzyl)ammoniumchlorid] (0,25%),
Beispiel 16: Cetyltrimethylammonuimbromid (0,1%), und
Beispiel 17: Poly[styrol-co-N-vinylimidazol-co-3-(2-hydroxyethyl)-1vinylhmdazoliumchlorid] (44 : 20 : 36 molares Verhältns) (0,1%). Tabelle VII Hintergrund

Beispiel 18: Lösungsimmunoassay für Thyroid stimulierendes Hormon (TSH)

Dieses Beispiel zeigt die Durchführung dieser Erfindung zum Nachweis von TSH in einer biologischen Probe. Der Assay wurde unter der Verwendung eines kommerziell erhältlichen AMERUTE Fast TSH-Immunoassaykits (Kodak Clinical Diagnostics, Ltd.), eines Plattenwäschers/inkubators und eines Chemilumineszenz-Lesegerätes durchgeführt.
Das Chemilumineszenzsignal wurde unter der Verwendung einer Zusammensetzung dieser Erfindung, enthaltend 3'-Chlor4'hydroxyacetanilid (1 mmolar), Wasserstonperoxid (3 mmolar), Diethylentriaminpentaessigsäure (10 umolar) und Cetyltrimethylammoniumchlorid (0,1%) in Tris(hydroxymethyl)aminomethanhydrochloridpuffer (0,05 molar, pH 7) erzeugt.
Es wurde dem in dem oben genannten kommerziellen AMERUTE Fast TSH-Kit beschriebenen Protokoll gefolgt:
1) Eine Probe enthaltend 0-100 ul. U./ml TSH wurde m einen Testnapf der Kit-Testvorrichtung, welcher an seine Wände absorbierte And-TSH-monodonale Antikörper enthielt hinzugefügt
2) Anti-β-TSH-Rettichperoxidasekonjugat des kommerziellen Kies wurde in den Testnapf hinzugegeben, um einen ternären Komplex zu bilden.
3) Die Inkubation bei 37ºC wurde für ungefähr 30 Minuten durchgeführt.
4) Nichtgebundenes Material wurde mittels der kommerziellen Kit-Waschlösung aus dem Testnapf ausgewaschen.
5) Die Lösung (oben beschrieben) zur Erzeugung des Chemilumineszenzsagnals wurde dann hinzugefügt, und das sich ergebende Signal wurde nach 5 Minuten unter der Verwendung des "Scan-only"- Softwaremodus des Chemilumineszenzlesegerätes ermittelt.
Fig. 3 zeigt die Signalergebnisse. Ein annehmbares Signal wurde m der Anwesenheit von 4,20 und 100 ul.. U./ml TSH (letzte drei Datenpunkte) erzeugt. Daher ist die vorliegende Erfindung für den Nachweis eines immunologischen Analyten brauchbar.

Beispiele 19-21 Zusätzliche Chemilumineszenz-Zusammensetzungen

Verschiedene wäßrigen Zusammensetzungen wurden ähnlich denen in Beispielen 1-4 oben hergestellt und getestet. Die Zusammensetzungen wurden durch Mischen von Cetyltrimethoylammoniumchlorid (0,1 %), Wasserstoffperoxid (3 mmolar), Dielhientriaminpentaessigsäurs (10 umolar) und verschiedenen chemilumineszenten Agenzien (1 mmolar) in Tris(hydroxymeyl)aminomethanhydrochloridpuffer (0,05 mmolar, pH 7,2) hergestellt. Die Signalerzeugung wurde bei 37ºC unter der Verwendung eines konventionellen Turner TD- 20e Luminometers gemessen, wenn verschiedene Mengen von Rettichperoxidase (Sigma Chemical XII) mit den Zusammensetzungen gemischt wurden (finales Volumen von 200 ul).
Als chemiluminesziente Agenzien enthielt Beispiel 19 3'-chlor-4'4-hydroxyacetanilid, Beispiel 20 enthielt 2',5'-Dichlor-4'-hydroxyacetanilid und Beispiel 21 enthielt 2'3'-Dichlor-4'-hydroxyacetanilid.
Tabelle Vin unten zagt die von den Zusammensetzungen erzeugten durchschnittlichen Lichtsignale aus drei Wiederholungen für jedes Experiment (10 Sekunden integrale Lichteinheiten bei 1 = 4 Minuten) nach Zugabe von Peroxidase. Das "Signal zu Rauschen"-Verhältnis (S/N) ist das Verhältnis von dem durch die Zusammensetzung erzeugten Lichtsignal m Anwesenheit von Rettichperoxidase zu dem vom Hintergrund erzeugten Signal (keine Peroxidase). Tabelle VII
Die Erfindung winde genauer mit besonderer Berücksichtigung von ihren bevorzugten Ausführungsformen beschrieben, aber es wild verstanden weiden, daß Variationen und Modifikationen innerhalb des Bereichs der Erfindung durchgeführt weiden können.

Claims

1. Eine wässrige Zusammensetzung zum Erhalt eines Chemilumineszenzsignals, umfassend:

a) ein Oxidans in einer Menge von ungefähr 1 bis ungefähr 10 mmolar,

b) ein kationischer oberflächenaktiver Stoff niederen Molekulargewichts vorhanden von ungefähr 0,05 bis ungefähr 2% über seiner kritischen Mizellenkonzentration, oder ein kationisches Polymer vorhanden von ungefähr 0,01 bis ungefähr 2 Gew.-%,

c) einen Puffer um den pH der genannten Zusammensetzung bei von ungefähr 6 bis ungefähr 8,5 zu halten, und

d) ein substituiertes Acetanilid, welches in einer Gesamtmenge von ungefähr 0,05 bis ungefähr 10 mmolar vorhanden ist als dem einzigen ein Chemilumineszenzsignal erzeugendes Reagenz, das ein Signal in Antwort auf die katalytische Aktivität von Peroxidase erzeugt, wobei das substituierte Acetanilid die Struktur (I) hat:

worin R¹ Wasserstoff oder Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen ist,

R² Wasserstoff, Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Alkoxyalkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Hydroxyalkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Aminoalkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Haloalkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, oder Alkenyl mit 2 bis 5 Kohlenstoffatomen ist,

R³ Wasserstoff oder Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen ist,

R&sup4; und R&sup5; unabhängig Wasserstoff oder eine elektronenfangende Gruppe mit einem Hammett- Sigmawert von mindestens ungefähr 0,01 ist, und

R&sup6; und R&sup7; voneinander Wasserstoff, Halo, Cyano oder Methyl sind,

unter der Voraussetzung, daß mindestens eine von R&sup4; und R&sup5; eine elektronenfangende Gruppe mit einem Hammett-Sigmawert von mindestens ungefähr 0,01 sind, und

unter der weiteren Voraussetzung, daß die Zusammensetzung im Wesentlichen frei von beliebigen anderen chemilumineszenten Agenzien ist.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei R¹ Wasserstoff oder Methyl ist. R² Wasserstoff, Methyl, Metoxymethyl, Hydroxymethyl, Chlormethyl oder Ethenyl ist, R³ Wasserstoff oder Methyl ist, R&sup4; und R&sup5; unabhängig Wasserstoff, Halo oder Cyano sind, und R&sup6; und R&sup7; unabhängig Wasserstoff, Chlor oder Methyl sind.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 2, wobei R¹ Wasserstoff ist, R² Wasserstoffoder Methyl ist, R³ Wasserstoff ist, mindestens eine von R&sup4; und R&sup5; Chlor oder Brom ist, und R&sup6; und R&sup7; jeweils Wasserstoff sind.

4. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der kationische oberflächenaktive Stoff Cetyltrimethylammoniumbromid oder Cetyltrimethylammoniumchlorid ist.

5. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Oxidans Wassserstoffperoxid ist, der Puffer Tris(hydroxymethyl)aminomethan ist und das substituierte Azetanilid 3'-chlor-4'- hydroxyacetanilid oder 3'-brom-4'-hydroxyacetanilid ist.

6. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, weiterhin umfassend Peroxidase oder ein Peroxidase-markiertes spezifisches Bindemolekül.

7. Diagnostischer Testkit zur Bestimmung eines Analyten, der katalytisch mit Peroxidase verwandt ist, wobei der Kit individuell verpackt umfaßt:

i) die wässrige Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, und

ii) eine Peroxidase oder eine Peroxidase-markierte spezifische Bindespezies.

8. Testkit nach Anspruch 7, worin die Peroxidase-markierte spezifische Bindespezies ein Peroxidase-markierter Antikörper oder ein Peroxidase-markiertes spezifisches Bindungsligandanalog ist.

9. Testvorrichtung zur Detektion von Peroxidase oder einem katalytisch mit Peroxidase verwandten Analyt, wobei die Testvorrichtung eine absorbierendes Trägermaterial umfaßt, und enthält:

einen kationischen oberflächenaktiven Stoff niederen Molekulargewichts in von ungefähr 0,05 bis ungefähr 2% über seiner kritischen Mizellenkonzentration, oder ein kationisches Polymer vorhanden in von ungefähr 0,01 bis ungefähr 2 Gew.-%,

einen Puffer, um den pH der Zusammensetzung bei von ungefähr 6 bis ungefähr 8, 5 zu halten, und

ein substituiertes Acetanilid, das in einer Gesamtmenge von ungefähr 0,05 bis ungefähr 10 mmolar als das einzige ein Chemilumineszenzsignal erzeugende Reagenz vorhanden ist, das ein Signal in Antwort auf die katalytische Aktivität von Peroxidase erzeugt, wobei das substituierte Acetanilid die Struktur (I) wie m einem der Ansprüche 1 bis 3 definiert hat.

10. Verfahren zur Erzeugung eines nachweisbaren Signals in Antwort auf Peroxidase, umfassend:

A) Reagieren einer Peroxidase in Anwesenheit von

a) einem Oxidans in einer Menge von ungefähr 1 bis ungefähr 10 mmolar

b) einem kationischen oberflächenaktiven Stoff niederen Molekulargewichts, der in von ungefähr 0,05 bis ungefähr 2% oberhalb seiner kritischen Mizellenkonzentration vorhanden ist, oder einem kationischen Polymer, das von ungefähr 0,01 bis ungefähr 2 Gew.-% vorhanden ist,

c) einem Puffer um den pH der Zusammensetzung bei von ungefähr 6 bis ungefähr 8,5 halten, und

d) einem substituierten Acetanilid, das in einer Gesamtmenge von ungefähr 0,05 bis ungefähr 10 mmolar als dem einzigen ein Chemilumineszenzsignal erzeugenden Reagenz vorhanden ist, das ein Signal in Antwort auf die katalytische Aktivität von Peroxidase erzeugt, wobei das substituierte Acetanilid die Struktur (I), wie in einem der Ansprüche 1 bis 3 definiert, aufweist

um ein nachweisbares Chemilumineszenzsignal zu erzeugen, und

B) Bestimmung des sich ergebenden Chemilumineszenzsignals als ein Maß von Peroxidase.

11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Peroxidase als Teil eines Peroxidase-markierten spezifischen Bindekomplexes nachgewiesen wird.

12. Spezifischer Bindungsassay zur Bestimmung eines spezifischen Bindungsliganden, umfassend:

A) Bildung eines Peroxidase-markierten spezifischen Bindungkomplexes eines spezifi sehen Bindungsliganden mit einem für den Liganden spezifischen Rezeptor,

B) nach Abtrennung unkomplexierten Materials von dem Peroxidase-markierten spezifischen Bindungskomplexes, in Kontaktbringen des Peroxidase-markierten Komplexes mit der Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 um ein nachweisbares Chemilumineszenzsignal zu erzeugen, und

C) Bestimmung des sich ergebenden Chemilumineszenzsignals als ein Maß des spezifischen Bindungsliganden.

13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei der spezifische Bindungsligand mit einem ersten und zweiten Rezeptor dafür komplexiert wird, wobei der erste Rezeptor ein Fangreagenz ist und der zweite Rezeptor ein Nachweisreagenz ist, das mit Peroxidase bindet oder ein Peroxidase-markiertes Reagenz ist, wodurch ein Sandwich des Liganden und dem ersten und dem zweiten Rezeptor gebildet wird.

14. Verfahren nach Anspruch 13 zur Bestimmung eines Antigens als spezifischer Bindespezies, und wobei der erste und zweite Rezeptor für das Antigen spezifische Antikörper sind.

15. Verfahren nach Anspruch 12, wobei der spezifische Bindungsligand mit einem peroxidasemarkierten spezifischen Bindungsliganten um einen einzelnen für den spezifischen Bindungsliganden spezifischen Rezeptor kompetitiv ist.

16. Verfahren nach Anspruch 13 zur Bestimmung einer Nukleinsäure, wobei der erste und zweite Rezeptor Oligonukleotide sind, die komplementär zu verschiedenen Sequenzen der Nukleinsäure sind.