DD296843A5

DD296843A5 - Monoklonale antikoerper zur indukzierung von tobranz

Info

Publication number: DD296843A5
Application number: DD90341218A
Authority: DD
Inventors: Stephen P Cobbold; Herman Waldmann
Original assignee: ��k��@��k��; Kk
Priority date: 1989-05-31
Filing date: 1990-05-31
Publication date: 1991-12-19
Also published as: CA2055615A1; ZA904174B; AU5725890A; WO1990015152A1; IE901949L; GB8912497D0; JPH04505919A; DK0474691T3; PT94214B; DE69029134D1; JP2763197B2; NZ233889A; IE80735B1; PT94214A; KR0183029B1; AU657255B2; EP0474691B1; ES2096588T3; MY135673A; DE69029134T2

Abstract

Toleranz gegenueber einem Antigen wird in einem Subjekt durch Verabreichung eines nichterschoepfenden monoklonalen CD4-Antikoerpers und eines nicht erschoepfenden monoklonalen CD8-Antikoerpers induziert. Toleranz gegenueber dem Antigen kann unter dem Schutz dieser Antikoerper induziert werden. Ein erschoepfender monoklonaler CD4-Antikoerper und/oder ein erschoepfender monoklonaler CD8-Antikoerper koennen vor den nichterschoepfenden Antikoerpern verabreicht werden.{Toleranz; Antigen; erschoepfend, nichterschoepfend, monoklonal, CD4-Antikoerper; CD8-Antikoerper; Antikoerper, verabreichen, induzieren}

Description

Andererseits haben In-vitro-Arbeiten gezeigt, daß CD4- (und CD8-) mAb die Lymphozytfunktion einfach durch Bindung an das Antigen auf der Zelloberfläche ohne Zellauflösung beeinflussen könnten. Außerdem wurden Immunsuppression und Toleranzinduktion in vivo unter Anwendung von sublytischen Konzentrationen von CD4-mAb und durch F(ab')₂-CD4-mAb-Fragmente erreicht, was vermuten läßt, daß für die mAb-vermittelte Immunregulation die Erschöpfung der Zielzellen nicht wesentlich zu sein braucht.

Bei früheren Untersuchungen wurden Antikörper verwendet, welche CD4-Zellen erschöpfen. Es wurde nun festgestellt, daß auch nichterschöpfende CD4- und CD8-Antikörper Toleranz gegenüber fremden Immunglobulinen, Knochenmark und Hauttransplantaten hervorrufen können. Tatsächlich ist diese Beobachtung generell auf alle Antigene anwendbar. Außerdem wurde festgestellt, daß die Verabreichung eines erschöpfenden CD4-mAb und/oder eines erschöpfenden CD8-mAb vor der Verabreichung der nichterschöpfenden mAb vorteilhaft bei der Schaffung einer toleranzzulassenden Umgebung sein kann. Vorliegende Erfindung schafft daher Produkte, die einen nichterschöpfenden CD4-mAb und einen nichterschöpfenden CD8-mAb als kombiniertes Präparat für die simultane, getrennte oder aufeinanderfolgende Anwendung bei der Induzierung von Toleranz gegenüber einem Antigen enthalten. Ein nichterschöpfender CD4-mAb zur Anwendung in einer Behandlungsmethode des menschlichen oder tierischen Körpers durch einen chirurgischen Eingriff oder Therapie und ein nichterschöpfender CD8-mAb zur Anwendung in einer Behandlungsmethode des menschlichen oder tierischen Körpers durch einen chirurgischen Eingriff oder Therapie sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung. Die Erfindung sieht außerdem vor:

- nichterschöpfende CD4- und CD8-mAb zur gemeinsamen Anwendung in einer Behandlungsmethode des menschlichen oder tierischen Körpers durch einen chirurgischen Eingriff oder Therapie, insbesondere zur Anwendung bei der Induzierung von Toleranz gegenüber einem Antigen, und

- ein Paket, das als getrennte Komponenten einen nichterschöpfenden CD4-mAb und einen nichterschöpfenden CD8-mAb, im typischen Fall in getrennten Abteilungen, umfaßt.

Durch das gemeinsame Verabreichen der nichterschöpfenden CD4-und CD8-mAb kann Toleranz auf ein primäres Antigen in einem Patienten übertragen werden. Die CD4- und CD8-mAb können zur Behandlung von Autoimmunkrankheiten und zur Verhinderung von Gewebeabstoßung ohne die Notwendigkeit einer langfristigen immunsuppressiven Chemotherapie eingesetzt werden. Es kann Toleranz gegenüber einem Transplantat, wie einem Organtransplantat oder einem Knochenmarktransplantat, erreicht werden.

Es ergeben sich Vorteile aus der Anwendung von nichterschöpfenden mAb in vivo. Beispielsweise ermöglicht die Injektion einer kurzen Folge von nichterschöpfenden mAb die schnellere Rückgewinnung von kompetenten Zellen aus der Blockade und kann daher das Risiko von möglichen Infektionen und anderen Komplikationen auf Grund von Immunmangel (z.B. Leukämierückfall nach T-erschöpfter Knochenmarktransplantation) nach einer mAb-Behandlung mindern. Außerdem ist bekannt, daß CD4-Zellen weiter in verschiedene funktionell Untergruppen unterteilt werden können, von denen einige an der Immunregulation beteiligt sein können. Die Massenausschaltung von T-Zellen kann natürlich zu einer Immunsuppression führen, aber sie kann auch einen möglichen Einfluß auf CD4+-regulatorische Zellen zerstören. Eine subtilere Manipulation kann daher für die Lenkung des Immunsystems in einen gewünschten Zustand vorteilhafter sein.

Toleranz kann vorzugsweise dadurch erreicht werden, daß einem Patienten zuerst erschöpfende CD4- und/oder CD8-mAb verabreicht werden. Die Erfindung sieht daher außerdem vor:

- nichterschöpfende CD4- und CD8-mAb und erschöpfende CD4- und/oder CD8-mAb für die gemeinsame Anwendung in einer Behandlungsmethode des menschlichen oder tierischen Körpers durch einen chirurgischen Eingriff oder Therapie, insbesondere bei der Induzierung von Toleranz gegenüber einem Antikörper;

- Produkte, die einen nichterschöpfenden CD4-mAb, einen nichterschöpfenden CD8-mAb und entweder einen erschöpfenden CD4-mAb oder einen erschöpfenden CD8-mAb oder beide als kombiniertes Präparat für die simultane, getrennte oder aufeinanderfolgende Anwendung bei der Induzierung von Toleranz gegenüber einem Antigen enthalten, und

- ein Paket, das einen nichterschöpfenden CD4-mAb, einen nichterschöpfenden CD8-mAb und entweder einen erschöpfenden CD4-mAb oder einen erschöpfenden CD8-mAb oder beide, im typischen Fall jeweils in getrennten Abteilungen, umfaßt.

Eine Kombination von nichterschöpfenden CD4- und CD8-mAb kann angewendet werden, um Toleranz gegenüber einem Antigen zu induzieren, ohne daß andere immunsuppressive Mittel erforderlich sind. Ein nichterschöpfender mAb ist ein mAb, der weniger als 50%, beispielsweise zwischen 10 und 25% und vorzugsweise weniger als 10%, der Zielzellen in vivo erschöpft. Sie können zur Induzierung von Toleranz gegenüber einem Antigen der Klasse I oder einem Antigen der Klasse Il oder gegenüber einem Antigen, das durch ein Antigen der Klasse I oder der Klasse Il präsentiert wird, eingesetzt werden. Sie können zur Induzierung von Toleranz gegenüber beiden Antigenen eingesetzt werden. Bei einem Transplantat beispielsweise können größere Histokompatibilitätsantigene (MHC-Antigene) der Klasse I und der Klasse Il und Nicht-MHC- oder kleinere Histokompatibilitätsantigene (Minore) vorhanden sein. Abgesehen von den Transplantationsantigenen, kann die vorliegende Erfindung angewendet werden, um Toleranz zu induzieren gegenüber globulären Proteinen, Glycoproteinen, wie Immunglobulinen, Stoffen, die auf solchen Teilen wie Pollenproteinen getragen werden, für die therapeutische Anwendung vorgesehenen Polypeptiden, wie Interferon, lnterleukin-2 oder dem Tumurnekrose-Faktor, oder Hormonersatz, wie dem leutinisierenden Hormon, seinen Analogen und Antagonisten. Zu den weiteren speziellen Antigenen, aufweiche Toleranz übertragen werden kann, gehören synthetische Peptidanaloge von therapeutischen Proteinmitteln, die als Rezeptorblockhilfsmittel verwendet werden, und Alloantigene. Es wird davon ausgegangen, daß Alloantigene für die Abstoßung von Fremdgewebe bei Gewerbetransplantaten oder Hautverpflanzungen verantwortlich sind.

Verwendet werden können die mAb, die für CD4-Oberflächenantigen (CD4-mAb) oder für das CD8-Oberflächenantigen (CD8-mAb) spezifisch sind. Unter CD4- und CD8-mAb versteht man nicht nur für die menschlichen CD4- und CD8-Oberflächenantigene spezifischen mAb, sondern auch mAb, die für die entsprechenden Oberflächenantigene in anderen Spezies spezifisch sind, wie das L3T4-Antigen bei Mäusen, welches das Mäuseäquivalent des menschlichen CD4-Antigens ist. Die mAb gehören im typischen Fall der lgG₂-Klasse an, wie Ratten-lgG₂₈, Mäuse-lgG_2b oder menschliches IgG₂, es kann sich aber auch um menschliches IgG₄ handeln. mAb-Fragmente, welche die Antikörperbindungsstelle umfassen, können eingesetzt werden, wie Fab- und F(ab)₂-Fragmente.

Die CD4- und CD8-mAb werden zusammen an einen Wirt verabreicht. Sie können als Teil derselben Zubereitung oder als getrennte Zubereitungen verabreicht werden. Im typischen Fall werden beide mAb 1-bis7mal wöchentlich, vorzugsweise 2- bis 4mal wöchtentlich, beispielsweise dreimal wöchentlich, über 2 bis 4 Wochen, vorzugsweise für drei Wochen, verabreicht. Es wird eine wirksame Menge der nichterschöpfenden mAb gegeben. Es wird folglich genügend von jedem der nichterschöpfenden mAb verabreicht, um eine toleranzzulassende Umgebung in einer in Behandlung befindlichen Person zu induzieren. Auf diese Weise können die CD4- und CD8-Zellen blockiert werden.

Die Menge des nichterschöpfenden CD4-mAb und des nichterschöpfenden CD8-mAb, die einem Patienten verabreicht wird, ist von einer Reihe von Faktoren abhängig, einschließlich Alter und Gewicht des Patienten, zu behandelndem Zustand und des Antigens (der Antigene), gegenüber dem (denen) Toleranz induziert werden soll. In einem Mäusemodellsystem werden auf einmal zwischen 1 \ig und 2 mg, vorzugsweise zwischen 400цд und 1 mg, verabreicht. Beim Menschen können 1 bis 400 mg, wie zwischen 3 und 30 mg, beispielsweise zwischen 5 und 20mg, des Antikörpers gegeben werden. Ein CD 11 a-mAb, ein nichterschöpfender mAb, kann neben den CD4- und CD8-mAb oder anstelle jedes oder beider der CD4- oder CD8-mAb eingesetzt werden.

Ein Fremdantigen (Fremdantigene), gegenüber dem Toleranz induziert werden soll, kann einem Wirt bis zu 5 Tage vor einer Aufnahme der Behandlung mit nichterschöpfenden CD4- und CD8-mAb und bis zu 5 Tage nach Abschluß der Behandlung verabreicht werden. Im allgemeinen aber wird ein Antigen innerhalb der ersten 14 Tage des Behandlungsbeginns, im typischen Fall innerhalb von 7 Tagen des Behandlungsbeginns, verabreicht. Das Antigen kann zu dem Zeitpunkt gegeben werden, zu dem der Zyklus der CD4-und CD8-mAb-Behandlung beginnt.

Toleranz kann also gegenüber einem Antigen in einem Wirt durch Verabreichen von nichterschöpfenden CD4- und CD8-mAb und, unter dem Schutz der mAb, des Antigens induziert werden. Ein Patient kann unter dem Schutz der nichterschöpfenden CD4- und CD8-mAb chirurgisch operiert werden, um ein Gewebetransplantat, wie ein Organtransplantat oder ein Knochenmarktransplantat, zu erhalten. Außerdem kann Toleranz gegenüber einem bereits in einer Person vorkommenden Antigen induziert werden. Langfristige spezifische Toleranz kann gegenüber einem Eigenantigen oder -antigenen induziert werden, um Autoimmunkrankheit, wie multiple Sclerose oder rheumatoide Arthritis, zu behandeln. Der Zustand eines an einer Autoimmunkrankheit leidenden Patienten kann daher erleichtert werden.

Es kann vorteilhaft sein, einen Wirt mit einem erschöpfenden CD4-mAb und/oder einem erschöpfenden CD8-mAb zu behandeln, bevor die Behandlung mit nichterschöpfenden mAb aufgenommen wird. Ein erschöpfender mAb ist ein mAb, der mehr als 50%, beispielsweise 90 bis 99%, der Zielzellen in vivo erschöpft. Zu den erschöpfenden Antikörpern gehören Ratten-lgG2b oder -IgGi, Mäuse-lgG_2a und menschliches IgGi und IgG₃. Ein erschöpfender CD4-mAb und/oder ein erschöpfender CD8-mAb kann daher eingesetzt werden, um die relevante Population an T-Zellen zu verringern. Die nichterschöpfenden mAb müssen dann mit weniger T-Zellen fertig werden. Die Erschöpfung kann alternativ dazu durch eine herkömmliche immunsuppressive Therapie, wie die Verabreichung eines anderen mAb, wie CAMPATH (Markenname) 1, von Steroiden, Cyclosporin, ALG (Antilymphozytglobulin) oder Bestrahlung, erreicht werden.

Der Pegel, bis zu dem eine Population von T-Zellen durch einen erschöpfenden mAb reduziert wird, kann von dem Antigen (den Antigenen) abhängig sein, gegenüber dem (denen) Toleranz erreicht werden soll. Es kann vorteilhaft sein, die T-Zellenpopulation außerdem für schwierige Antigen, für schlecht angepaßte Gewebetransplatate zu reduzieren, bei denen die Rezipienten vorher Spender-Antigenen ausgesetzt waren und vorbelastet sind (beispielsweise Patienten, die mehrfach Blutübertragungen erhalten haben) oder bei Autoimmunkrankheiten, wenn die Patienten sowohl vorbelastet sind als auch einer ständigen Aktivierung ihres Autoimmunzustandes unterliegen. Von einer schlechten Gewebeanpassung spricht man beispielsweise, wenn ein oder mehrere größere Histokompatibilitätsantigene der Klasse I nicht passen.

Es kann daher notwendig sein, eine Population von CD4-positiven Helfer-T-Zellen auf weniger als 70%, beispielsweise weniger als etwa 50%, 20% oder sogar 10%, des normalen Wertes zu reduzieren. Es ist wahrscheinlich um so schwieriger, Toleranz zu erreichen, je größer das Ausmaß der wünschenswerten Erschöpfung ist. CD8-positive T-Zellen können auf die gleiche Weise erschöpft werden.

Der erschöpfende CD4-mAb und/oder der erschöpfende CD8-mAb wird im typischen Fall 1 - bis 7mal wöchentlich, vorzugsweise 2- bis 4mal wöchentlich, beispielsweise dreimal wöchentlich oder einmal oder zweimal, vorzugsweise einmal, 1 bis 7 Tage, beispielsweise 1 bis 5 Tage, vor Beginn der Behandlung mit nichterschöpfenden CD4- und CD8-mAb verabreicht. Ein Antigen, gegenüber dem Toleranz induziert werden soll, kann gleichzeitig mit oder innerhalb von 5 Tagen der Verabreichung der erschöpfenden mAb gegeben werden. Die Menge des erschöpfenden mAb, die verabreicht wird, ist von einer Reihe von Faktoren abhängig, einschließlich des Pegels, auf den die relevante Population an T-Zellen gesenkt werden soll, des Alters und des Gewichts des Patienten, des zu behandelnden Zustandes und des Antigens (der Antigene), gegenüber dem (denen) Toleranz induziert werden soll. In einem Mäusemodellsystem kann eine Dosis von 1 μg bis 2 mg, vorzugsweise 400 pg bis 1 mg, eines erschöpfenden mAb gegeben werden. Beim Menschen können 1 bis 400mg, wie 3 bis 30mg, beispielsweise zwischen 5 und 20 mg, des Antikörpers gegeben werden.

Die erschöpfenden und nichterschöpfenden CD4- und CD8-mAb können auf herkömmliche Weise geschaffen werden. Sie können nach herkömmlichen Methoden durch Verschmelzen von immunen Rattenmilzzellen mit einem Ratten-Myelomzellstamm, wie Y3/Ag 1.2.3., hergestellt werden (Clark und Waldmann, Kapitel 1 von „Monoclonal Antibodies" (Monoklonale Antikörper), ein Buch, das von P.C.L. Beverley in der Reihe „Methods of Hematology" (Methoden der Hämatologie) herausgegeben wurde, Longman (Churchill Livingstone), 1986). Es kann auch jede andere Methode angewendet werden, wie das Verschmelzen von immunisierten Mäusemilzzellen mit einem Mäuse-Myelom, einem Ratten-Myelom oder menschlichen Myelom oder rekombinante DNA-Methodologien.

Alle mAb-Verabreichungen erfolgen parenteral, beispielsweise intravenös. Die mAb werden im allgemeinen durch Injektion oder durch Infusion gegeben. Zu diesem Zweck wird ein mAb in einer pharmazeutischen Zusammensetzung formuliert, welche ein pharmazeutisch akzeptables Trägermittel oder Verdünnungsmittel enthält. Es kann jedes geeignete Träger- oder Verdünnungsmittel verwendet werden, beispielsweise isotonische physiologische Kochsalzlösung. Wenn spezifische Antigene gegeben werden, auf welche Toleranz übertragen werden soll, werden diese parenteral verabreicht, beispielsweise iptravenös, intramuskulär oder subkutan. Das Antigen wird im typischen Fall wie oben mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger- oder Verdünnungsmittel formuliert.

Die entsprechenden hybridomproduzierenden mAb YTS177.9, YTS 191.1, YTS105.18 und YTS169.4 wurden am 30. Mai 1990 unter den Zugriffsnummern ECACC 90053005, ECACC 87072282, ECACC 90053004 und ECACC 87072284 bei der European Collection of Animal Cell Cultures, Porton Down, Großbritannien, deponiert

Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung. In den beigefügten Zeichnungen zeigt

Abb. 1 Synergie und Interferenz der Komplementlyse durch Kombinationen von NgG₂₈- und rlgG_2b-mAb. CBA/Ca-Thymozyten, die mit^s1~Cr (30μΰί/η"ΐΙ) markiert waren, wurden mit mAb inkubiert, wie das jeweils unter dem Streifen angegeben ist, und mit 2% Meerschweinchenserum als Komplementquelle. mAb-Konzentration: (A) 5цд/тІ, (B) 25pg/ml der verwendeten mAb;

Abb. 2 die Ergebnisse des Einspritzens von rlgG_2a-CD4 in vivo ohne T-Zellenerschöpfung. ATX-CBA/Ca-Mäuse (n = 3) erhielten eine einzige Injektion der angegebenen mAb (2 mg je Maus) und wurden 1,4 und 8 Wochen später zur Ader gelassen. BPL wurden mit biotinylierten mYb gegen &1 D *—(Y CKA ·), CD8 (YTS 156.7 A) und Thy-1 (YBM 29.2 T) gefärbt, gefolgt von einer Streptavidin-FITC. Die Ergebnisse wurden durch Durchflußzytometrie analysiert, und der Prozentsatz jeder Population wurde unter Zugrundelegung des der unbehandelten Kontrolle am Versuchstag als 100% berechnet;

Abb. 3, wie der Toleranz gegenüber HGG durch den IgG₂₁,-CD4-mAb YTS117.9 induziert wurde. Normale CBA/Ca-Mäuse erhielten YTS 177.9 oder YTS 191.1 in den angegebenen Dosen an den Tagen —1, 0 und 1.Am Tag 0 wurde 1 mg durch Wärme aggregiertes HGG injiziert. Die Mäuse wurden mit 0,5mg HGG an den Tagen 28 und 35 erneut belastet. Kontrollmäuse erhielten wie die anderen 1 mg YTS 177.9, wurden aber nur an den Tagen 28 und 35 mit HGG immunisiert. Die Serum-Anti-HGG-Titer wurden am Tag 45 durch enzymverbundene Immunadsorptionsbestimmung (ELISA) gemessen;

Abb.4 die Ergebnisse der Injektion von YTS117.9 zur Induzierung einer spezifischen Toleranz gegenüber Ratten-lgG_2a. Normale CBA/Ca-Mäuse erhielten an 3 aufeinanderfolgenden Tagen YTS 117.9 oder YTS191.1 in den angegebenen Dosen. Sechs Wochen später wurden sie erneut mit einer wöchentlichen Injektion von YTH 34.5 (IgG₂, Ratten-Anti-Mensch) und Campath (eingetragene Marke) 2 (lgG₂b Ratten-Anti-Mensch), zuerst in einem vollständigen, dann in einem umvollständigen Freundschen Adjuvans, belastet. In der zehnten Woche wurden sie zum Ader gelassen, und es wurden das Anti-lgG_2a- (offener Balken) und das AntilgG_2b-Titer (schraffierter Balken) mit ELISA unter Verwendung von Platten gemessen, die mit Ratten-lgG_2a- bzw. -lgG_2b-mAb, die durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie gereinigt worden waren, beschichtet waren;

Abb. 5 das verlängerte allogene Hauttransplantatüberleben nach lgG_2a-CD4- und -CDe-mAb-Behandlung. Normale CBA/Ca-Mäuse (n = 6) erhielten an den Tagen 0, 2 und 4 3 Injektionen von YTS 177.9 und YTS 105.18 oder YTS191.1 und YTS 169.4 (Antikörpergesamtmenge 3 mg/Maus). Am Tag 0 wurde BALB/c-Schwanzhaut der vollen Stärke verpflanzt. Statistischer Wert nach der Logrank-Methode: lgG_2b-mAb-behandelte (▲) zu unbehandelten Kontrollmäusen (·) ρ < 0,005; lgG_2a-behandelte (T) zu Kontrollmäusen ρ < 0,001, zu lgG_2b-behandelten ρ < 0,03;

Abb. 6 die Toleranz gegenüber allogenen Hauttransplantaten durch rlgG_2a-mAb. Normalen CBA/Ca-Mäusen wurde B 1O.Br-Haut verpflanzt, sie erhielten (Dein Gemisch aus YTS 177.9 und YTS 105.18 an den Tagen 0 und 2 (2 mg/Maus insgesamt); (2) die gleichen mAb über 3 Wochen (9 mg/Maus insgesamt). Am Tag 89 erhielten sie neue Verpflanzungen von Haut von B10.BR (3 und 4) und B10.D 2 (gepunktete Linien);

Abb. 7 die Ergebnisse von Experimenten, bei denen die Toleranz gegenüber Knochenmark- und Hautverpflanzungen untersucht wurde. A: Toleranz gegenüber B 10.BR. Die Rezipienten, CBA/Ca-Mäuse, (n = 8) erhielten 1 bis 3 Wochen Injektionen einer Kombination aus rigG_2a-CD4-und-CD8-mAb, gefolgt von einer Infusion von 10⁷T-erschöpften Milzzellen und 10⁷ Knochenmarkzellen. Kontrollmäusen (n = 4) wurde entweder Knochenmark und physiologische Kochsalzlösung oder nur Knochenmark injiziert. Allen Gruppen wurden 30 Tage später B 10.BR-Haut verpflanzt. Chimärismus des Spenderallotyps wurde 24 und 60 Tage nach dem Knochenmarktransplantat mit 2,6 ± 1,6 bzw. 1,3 ± 0,7% bei mit Mark und Antikörper behandelten Mäusen (·) gemessen. Weder die Gruppe mit physiologischer Kochsalzlösung (A) noch die nur mit BM behandelte Gruppe ( ) wiesen einen nachweisbaren Chimärismus auf.

B: Toleranz gegenüber AKR/J. Normale rezipiente CBA/Ca-Mäuse wurden 3 Wochen mit einer Kombination aus rigG_2a-CD4- und rigG_2b-CD8-mAb injiziert. Zwei Tage nach Beginn der mAb-Behandlung wurden intravenös 2 x 10⁷ AKR/J-Knochenmarkzellen infundiert. Vier Wochen später wurde AKR/J-Haut verpflanzt (·). Kontrollmäuse wurden nur mit dem Antikörper (A) behandelt;

Abb. 8, daß Toleranz gegenüber Hautverpflanzungen in ATx-Mäusen herbeigeführt werden kann. ATx-Mäusen (n = 9) wurden über 2 Wochen täglich rigG_2a-CD8- und -CD4-mAb injiziert. Drei Tage nach Beginn der mAb-Behandlung wurde B 1O.BR-Haut verpflanzt. Am Tag 60 erhielten sie erneut B 1O.BR-Verpflanzungen, und BALB/c-Verpflanzungen (·) wurden von ATX-Mäusen, die B10.BR-Hautverpflanzungen (A) hatten, abgestoßen. ATx-Kontrollmäuse erhielten B10.BR-Verpflanzungen (B);

Abb.9 das Überleben von allogenen Hautverpflanzungen bei Mäusen, die mit Differenzkombinationen von CD4- und CD8-Antikörpern behandelt worden waren. Die CBA/Ca-Rezipientenmäuse, die in drei Gruppen zu 8 bü 14 Tieren eingeteilt waren, erhielten am Tag 0 BALB/c-Hautverpflanzungen und wurden vom Tag 0 bis 2 mit monoklonalen Antikörpern behandelt, wie das im Beispiel 2 beschrieben wird. Die erste Gruppe (T) erhielt nur Ratten-lgG_2a-Antikörper, die zweite (♦) erhielt ein Gemisch aus Ratten-lgG_2b-Antikörpern, während der dritten Gruppen (·) das Kombinationsprotokoll von Ratten-lgG_2b-, gefolgt von RattenlgG_2a-Antikörpern, verabreicht wurde. Alle Mäuse in dieser dritten Gruppe erhielten am Tag 94 ohne weitere Antikörper neue BALB/C-(A) und B 10-(B) Hautverpflanzungen.

Analyse des Überlebens der Verpflanzungen: lgG_2a-Gruppe MST = 28 Tage im Verhältnis zu lgG_2b-Gruppe MST = 55 Tage; P < 0,006; Kombinierte Protokollgruppe, ursprüngliche BALB/c-Verpflanzungen MST = 121 Tage im Vergleich zu den IgG₂₈- oder lgG_2b-Gruppen P < 0,001; Kombinierte Protokollgruppe, zweite BALB/c-Verpflanzungen MST = 43 Tage im Vergleich zur dritten Gruppe B 10-Verpflanzung MST = 16 Tage P < 0,04;

Abb. 10 die Induktion von Toleranz gegenüber MHC-fehlangepaßten Hautverpflanzungen. Gruppen von 8 bis 12 CBA/Ca-Mäusen erhielten am Tag 0 ВЮ-Hautverpflanzungen und wurden vom Tag 0 bis 21 mit monoklonalen Antikörpern behandelt, wie das in Beispiel 2 beschrieben wird.

(a) Die erste Gruppe waren Kontrollmäuse (T), denen keine Antikörper verabreicht wurden. Eine weitere Gruppe (♦) erhielt nur Ratten-lgG_2a-Antikörper, während die restlichen Gruppen (·) alle das kombinierte IgG₂I,- und lgG_2a-Protokoll erhielten. Diese letzte Gruppe erhielt neue ВЮ-Hautverpflanzungen (▲) und eine dritte Partie BALB/c-Haut ( ) am Tag 119.

Analyse des Überlebens der Verpflanzungen: Kontrollgruppe (keine Antikörper) MST = 14 Tage im Vergleich zur lgG_2a-Gruppe MST = 48 Tage P < 0,001; kombiniertes Protokoll, Original-B 10-Verpflanzungen MST > 250 im Vergleich zu zweiten B10-Verpflanzungen MST = 44Tage (von Tag 119 an) P < 0,002; zweite B 10-Verpflanzungen im Vergleich zu BALB/c-Verpflanzungen der dritten Partie MST = 13, P < 0,003.

(b) Eine Gruppe von 8 CBA/Ca-Mäusen erhielt B 10-Hautverpflanzungen zusammen mit dem kombinierten lgG_2b-, IgG₂,-Antikörperprotokoll (•!.Am Tag 91 erhielten die Mäuse zweite B 10-Hautverpflanzungen ( ), zusammen mit einer dritten Partie B10.BR-Haut(B).

Analyse des Überlebens der Verpflanzungen: alle Gruppen MST > 200 Tage;

Abb. 11 die Induktion von Toleranz gegenüber mehrfach im kleineren Antigen fehlangepaßter Haut. Am Tage 0 erhielten zwei Gruppen zu 8 und 10 CBA/Ca-Mäusen AKR/J-Hautverpflanzungen. Kontrollmäuse erhielten keinen Antikörper (T). Die andere Gruppe erhielt das kombinierte Protokoll von Ratten-lgG₂t>, gefolgt von Ratten lgG_2a-Antikörper (·), und wurde am Tag 122 erneut mit frischer AKR/J-Hauttransplantiert (▲) und in der dritten Partie mit in den Minoren unterschiedlicher B10.BR-Haut ( ). Analyse des Überlebens der Verpflanzungen: Kontrollmäuse ohne Antikörper MST = 13, im Vergleich zu Original-AKR/J-Verpflanzungen mit kombiniertem Protokoll MST > 250 Tage; P < 0,001; zweite AKR/J-Verpflanzungen MST > 128 Tage, im Vergleich zu B 10.BR-Verpflanzungen der dritten Partie MST = 27 Tage, P < 0,009;

Abb. 12 die Induktion von Toleranz gegenüber mehrfach im kleineren Antigen fehlangepaßter Haut bei vorbelasteten Patienten. Die Rezipienten, CBA/Ca-Mäuse wurden auf die kleineren Antigene des Spenders durch ip-lnjektion mit 10⁷ bestrahlten (2000 rad) Milzzellen von AKR/J (a, b) oder B 10.BR (c, d) drei Wochen vor der Hautverpflanzung vorbereitet. Gruppen von 5 bis 13 Mäusen erhielten Verpflanzungen von AKR/J- (a, b) oder B10.BR-Haut (c, d) unter dem Schutz von monoklonalen Antikörpern vom Tag 0 bis 21, wie das in Beispiel 2 beschrieben wird. Zwei Gruppen erhielten das kombinierte IgG₂I,- und lgG_2a-Protokoll (a,

c) und zwei erhielten nur Ratten-lgG_2a-Antikörper (b, d). Die Mäuse erhielten erneute Verpflanzungen am Tag 89 (a, c) oder am Tag 96 (b, d) mit Transplantaten eines zweiten Spendertyps (▲) (AKR/J bei den Gruppen a und b; B10.BR bei den Gruppen с und

d) und mit in den Minoren unterschiedlicher Haut der dritten Partie ( ) (B 10.BR in den Gruppen a und b; AKR/J in den Gruppen с und d).

Analyse des Überlebens der Verpflanzungen: (a) kombiniertes Protokoll, Original-AKR/J-Verpflanzungen MST > 225 Tage, im Vergleich zu B10.BR-Verpflanzungen der dritten Partie MST = 41 Tage (vom Tag 89 an), P < 0,007. (b) lgG_2a-behandelte Original-AKR/J-Verpflanzungen MST > 200 Tage, im Vergleich zu B10.BR-Verpflanzungen der dritten Partie MST = 42 Tage (vom Tag 96 an), P < 0,02. (c) Alle Gruppen MST > 225. Tag des Experiments, (d) Alle Gruppen MST > 200. Tag des Experiments;

Abb. 13 die Induktion von Toleranz bei Mäusen, die aktiv eine erste Hautverpflanzung abstoßen. Zwei Gruppen von 6 und 11 Mäusen (CBA/Ca) erhielten am Tag 0 ohne jede Behandlung mit monoklonalen Antikörpern Verpflanzungen von AKR/J-Haut. Am Tag 14, nachdem etwa die Hälfte der Mäuse diese ersten Verpflanzungen abgestoßen hatte (·), wurden zweite AKR/J-Hauttransplantate in ein frisches Verpflanzungsbett eingebracht und die Behandlung mit monoklonalem Antikörper aufgenommen (▲). Die Mäuse erhielten dann das kombinierte Protokoll aus Ratten-lgG_2b und -IgG₂, über drei Wochen (a) oder nur den Ratten-lgG_2a-Antikörper (b).

Analyse des Überlebens der Verpflanzungen: (a) erste AKR/J-Verpflanzungen MST = 12 Tage, im Vergleich zu zweiten, nach dem kombinierten Protokoll behandelten AKR/J-Verpflanzungen MST > 92 Tage, P < 0,004. (b) Zweite lgG_2a-behandelte AKR/J-Verpflanzungen MST > 75 Tage, im Vergleich zu allen ersten Verpflanzungen in (a) und (b) MST = 12 Tage, P < 0,003.

Beispiel 1

Materialien und Methoden

Versuchtstiere

CBA/Ca-, B10.BR- und BALB/c-Mäuse wurden gezüchtet und in der üblichen Tierzuchtanlage im Department of Pathology, University of Cambridge, gehalten und in alters- und geschlechtsabgestimmten Gruppen eingesetzt.

Identifizierung der monoklonalen Antikörper durch Durchflußzytometrie

Ein Ratten-T-Zellstamm N B2-6TG (der freundlicherwiese von Dr. J. Howard zur Verfügung gestellt wurde) wurde mit dem Mäuse-CD4-Gen transfiziert (Gorman u.a., PNAS USA 84, 7644,1987). Dieser Stamm, NB2.L3T4.Hyg/2.1, wurde dazu genutzt, neue CD4-mAb aus einer Ratten-Antimaus-Thymozytenfusion auszulesen. Zellen (1-5 χ 10⁶) wurden mit Test-Überständen inkubiert, gefolgt von FITC-konjugiertem Kaninchen-Antiratten-Ig-Serum (Dako, Glostrup, Dänemark). Die Fluoreszenzfärbung wurde durch Durchflußzytometrie in einem Zytofluorografen (Modell 50-H Ortho, Westwood, MA, USA) analysiert, und die Daten wurden mit einem Computer Ortho 2150 verarbeitet.

Zur kompetitiven Bindung der mAb wurden L3T4/Hyg/2.1 -Zellen zuerst mit biotinylierten mAb (1 мд/10⁵ Zellen) auf Eis bei Anwesenheit von 10 μg unmarkiertem mAb für 30 Minuten inkubiert. Für eine weitere Inkubation von 15 Minuten Dauer wurde Streptavidin-FITC (Amersham, Großbritanien) zugesetzt. Die Ergebnisse wurden durch den Ortho-Zytofluorografen analysiert. Die zweifarbige Fluoreszenzfärbung wurde durch Inkubation von Mäusemilzzellen nacheinander mit biotinylierten ersten mAb, Streptavidin-Phykoerythrin (Serotech, Kidlington, Großbritanien), zweiten mAb und FITC-konjugierten, isotopenspezifischen mAb vorgenommen. Die grüne und rote Fluoreszenz wurde durch den Ortho-Zytofluorografen auf einer logarithmischen Skala festgestellt und angezeigt.

Immunfluoreszenzfärbung von peripheren Blutlymphozyten (PBL)

Mäuse-PBL wurden durch Zentrifugieren auf Ficoll (spezifische Dichte 1,079, Pharmacia, Schweden) bei 3000 χ g für die Dauer von 20 Minuten abgetrennt. Die Zellen an der Grenzfläche wurden aufgefangen und in PBS/BSA/Azid gewaschen. Sie wurden dann entweder mit rlgG₂b-mAb im Gewebekulturüberstand, gefolgt von FITC-konjugierten NORIG 7.16 (Anti-rlgG_2b), oder mit biotinylierten mAb und gefolgt von FITC-Streptavidin (Amersham), gefärbt. Die Ergebnisse wurden wie oben durch Durchflußzytometrie analysiert.

Komplementlyse

Die Komplementlyse wurde so ausgeführt, wie das bereits beschrieben wurde. Kurz gesagt, mAb wurden verdünnt und mit ⁵¹Cr-markierten Mäusethymozyten inkubiert, und 2% Meerschweinchenserum wurde als Komplementquelle zugesetzt. Nach 45 Minuten bei 37°C wurde der Überstand aufgenommen und die Radioaktivität mit einem automatischen Gammazähler von Philips (Philips, Eindhoven, Niederlande) gemessen. Die spezifische Lyse wurde berechnet als

% Lyse = (e - s)/(t - s) χ 100, wobei e die Probenzählung ist, s die Spontanfreisetzung ist und t die Gesamtzählung ist.

Induktion von Toleranz gegenüber menschlichem γ-Globulin (HGG)

Die Methode der Toleranzinduktion gegenüber HGG wurde bereits früher beschrieben (Benjamin u.a., J. Exp. Med. 163,1539, 1986). Normale CBA/Ca-Mäuse wurden intravenös (iv) am Tag 1, intraperitoneal (ip) am Tag 0 und 1 mit CD4-mAb injiziert. Am Tag 0 wurde 1 mg durch Wärme aggregiertes HGG intraperitoneal verabreicht. Die Mäuse wurden mit 0,5 mg HGG erneut an den Tagen 21 und 31 belastet. Am Tag 38 wurde die IgG-Anti-HGG-Reaktion durch ELISA gemessen.

Nachweis der Maus-Antikörper-Reaktionen durch ELISA

Um die Maus-Antikörper-Reaktionen zu messen, wurden Probenseren nacheinander in flexiblen Flachbodenplatten (Becton Dickinson, USA), die mit gereinigten Proteinantigenen beschichtet waren, verdünnt und 30 Minuten inkubiert. Die Platten wurden mit PBS/0,05%Tween 20 (Sigma, Poole, Großbritannien) gewaschen und dann 30 Minuten mit biotinyliertem Schaf-Antimaus-lgG (Amersham) inkubiert und wie oben gewaschen. In den Platten wurde für 15 Minuten Streptavidin-Meerrettich-Peroxidase (Amersham) zugegeben, und nach weiteren 3 Waschungen wurde die Reaktion durch 5mg/ml o-Phenolendiamin und 0,1 % Wasserstoffperoxid entwickelt. Es wurden das Absorptionsvermögen bei490nm abgelesen und die Titer durch Vergleich mit einer positiven Standardkontrolle bestimmt.

Hauttransplantation

Hauttransplantate wurden nach einer modifizierten Methode von Billingham u.a. (Nature 172,603,1953) transplantiert. Die Mäuseempfänger wurden mit 1 цд/Maus Hypnodil und 0,2 pg je Maus Sublimase (Janssen, Oxford, Großbritannien) über ip-lnjektion narkotisiert. Hauttransplantate in voller Dicke von einem Spenderschwanz (0,5cm χ 0,5cm) wurden auf das Verpflanzungsbett auf der seitlichen Brustwand transplantiert, mit Vaselingaze und Baumwollbandage abgedeckt und 7 Tage durch Pflaster geschützt. Es wurde das Überleben des verpflanzten Gewebes beobachtet und täglich aufgezeichnet, wobei als Endprodukt des Überlebens der letzte Tag betrachtet wurde, an dem kein lebendes, verpflanztes Gewebe mehr zu sehen war. Es wurde die mittlere Überlebenszeit (MST) berechnet und nach der Log-Rank-Methode (Peto u.a., Br. J. Cancer 35,1,1977) analysiert. Die Mäuse wurden in einem Alter von 4 Wochen thymektomisiert, wobei die Methode von Monaco u.a. (J. Immunol. 96,229,1966) angewendet wurde, und wenigstens 4 Wochen später benutzt. Alle wurden nach dem Töten kontrolliert, und es wurde kein Tier festgestellt, das unvollständig thymektomisiert war.

Herstellung von Knochenmarkzellen für die Transplantation

Knochenmarkzellen wurden von Spendermäusen geerntet, die mit CD4- und CD8-erschöpfenden Antikörpern vorbehandelt worden waren, um T-Zellen zu entfernen. In geeignet vorbereitete Rezipienten wurden 2 x 10⁷ Zellen transferiert, um festzustellen, ob Toleranz induziert werden konnte. Der Chimärismus konnte durch Messung des Spender-Ig-Allotyps oder des Spender-Thy-1.1-Allotyps bestimmt werden, wie das oben beschrieben wurde (Qin u.a., 1989, J. Exp. Med. 169,779).

Adoptive Übertragung auf Milzzellen

Spendermilzzellen wurden entweder von natürlichen CBA/Ca-Mäusen oder von CBA/Ca-Mäusen gewonnen, die 4 bis 8 Wochen vorher gegenüber B 10.BR-Milzzellen und Hauttransplantaten vorsensitisiert worden waren. Diese wurden in tolerante CBA/Ca-Rezipienten transferiert, die mit mAb behandelt worden waren, B 10.BR-hautverpflanzungen erhalten und die Transplantate mehr als 200 Tage getragen hatten. Jeder Empfängermaus wurden intravenös 5 χ 10⁷ Milzzellen injiziert. Als Kontrolle wurden erwachsene, thymektomisierte (ATx-) Mäuse mit rlgG₂t>-CD4- und -СОв-тАЬ behandelt, um CD4⁺- und CD8⁺-Zellen zu erschöpfen. Diese Mäuse sind nicht in der Lage, allogene Transplantate abzustoßen (Cobboldu.a., 1984, Nature 312, 548), und wurden hier dazu genutzt zu zeigen, daß transferierte Zellen funktionieren können.

Gemischte Lymphozytenkultur

Antwortmilzzellen wurden gewaschen und wieder in Iscoveschem modifizierten Dulbecco-Medium (IMDM), das mit 10% wärmeinaktiviertem menschlichen AB-Serum ergänzt war, suspendiert. Stimulatormilzzellen wurden mit 25 цд/тІМйотусіп-С (Sigma, Poole, Großbritannien) bei 37⁰C 30 Minuten lang behandelt und zweimal mit IMDM gewaschen. In Flachboden-Mikrotiter-Platten mit 96 Vertiefugnen wurde 3 x 10⁵ Antwortzellen und 3 χ 10⁵ Simulatoren bei 37°C mit 5% CO₂ gezüchtet. Am Tag 4 wurden die Zellen mit 10цСі/тІ¹²⁵Іоааеохуигіаіп (Amersham) sechs Stunden lang einer Pulsmarkierung unterzogen. Die Einbeziehung wurde in einem Gammazähler gemessen. Es wurden die geometrischen Mittelwerte von Triplikaten berechnet.

Stimulierung von Lymphozyten mit monoklonalen Antikörpern

DermitogeneAnti-Vß6 mAb^e-eBSwurdefreundlicherweisevonDr H Hengartner(Payneu a , 1988,PNASUSA85,7695)zur Verfugung gestellt Der mAb wurde mit 1 цд/ті bei 37°C über Nacht auf die Flachbodenplatten mit 96 Vertiefungen gekoppelt, anschließend wurde vor der Verwendung umfassend mit IM DM gespult DerCD3-mAb, 145-2C11 wurde freundlicherweise von Dr J Bluestone (Leo u a , 1987, PNAS USA 84,1374) zur Verfugung gestellt und wurde in einer Verdünnung von 1 100 des serumfreien Gewebekulturuberstandes eingesetzt In jede Vertiefung wurden 4,5 x 10⁵Milzzellen, in IMDM und 10% durch Warme inaktiviertem menschlichen AB-Serum, gegeben Die Proliferation nach 4 Tagen Kultur wurde wie oben gemessen

Ergebnisse Identifizierung der rlgG₂,-mAb-Bindung an das CD4-Molekul

Ein mAb, YTS 177 9 wurde auf der Grundlage seiner Bindung an den L3T4-transfizierten Zellstamm unter Anwendung der Immunfluoreszenzfarbung isoliert (Tabelle 1) Der Isotyp wurde durch Reaktion mit einem Anti-rlgG_2a-mAb, RG 7/1 7 (Springer u a , Hybridoma 1, 257,1982) durch ELISA bestimmt (Daten werden nicht gezeigt) Es wurden weitere Analysen durchgeführt, um diesen mAb mit zwei anderen CD4-mAb, die früher beschrieben wurden, zu vergleichen Bindungsinhibierungsuntersuchungen zeigten, daß sich YTS177 9 an das gleiche Epitop wie YTS191 1 band (Cobbold u a , 1984, Nature 312, 548) und GK1 5 (beides CD4-mAb), aber verschieden von dem war, das durch einen anderen CD4-mAb, YTA3 1 (Qm u a,Eur J Immunol 17,1159,1987), gebunden wurde, derein gesondertes Epitop erkennt Bei der Zweifarben-Durchflußzytometrie färbten YTS177 9 und YTA3 1 die gleiche Population von Mausermlzzellen, die sich von denen unterscheiden, die durch einen CD8-mAb, YTS169 4 (Cobbold u a , 1984, Nature 312, 548), gefärbt werden DieSpezifizitatvonYTS177 9 wurde auch durch eine spezifische⁶¹ Cr-Freisetzungsuntersuchung geprüft Zwar war der mAb bei der Lyse unwirksam, wenn eralleineingesetztwurde, wies aberSynergie mit dem CD4-mAbYTA3 1 auf (Abb 1a) Andererseits beeinträchtigte YTS177 9 die Lyse, die durch den rlgG₂b-mAb 191.1 vermittelt wurde, die sich in der Fluoreszenzfarbung als querhemmend zeigte (Abb 1 b)

Der rlgG_2a-mAb erschöpft T-Zellen in vivo nicht

Um die Wirkung des rlgG_2a-mAb auf dieln-vivo-Zellerschopfungzu bestimmen, wurden erwachsene thymektomisierte (ATX-) Mause eingesetzt, da bei diesen Tieren die T-Zellenruckgewinnung nach einer mAb-Erschopfung weit weniger effizient als bei normalen Mausen ist, was auf das Fehlen derthymusabhangigen T-Zellenregeneration zurückzuführen ist Durch Überwachung der Änderung der peripheren T-Zellen nach mAb-lnjektion war es möglich, echte Erschöpfung von zeitweiliger antigener Modulation oder Lympozytenumverteilung zu unterscheiden Jede Maus erhielt 2 mg von IgG₂₃- oder IgG^-Antikorpem, und die peripheren Blutlymphozyten wurden durch Durchflußzytometrie vor und zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Behandlung analysiert Wie aus der Abb 2 hervorgeht, waren eine Woche nach Abschluß der lgG₂b-mAb-Therapie etwa 90 % der CD4⁺-Zellen aus der Peripherie erschöpft Damit einher gingen ein verringerter Prozentsatz an T-Zellen insgesamt und eine leichte Zunahme an CD8⁺-Zellen Im Gegensatz dazu verringerte die lgG_2a-mAb-Behandlung zwar den Prozentsatz der CD4⁺-Zellen, der Gesamtprozentsatz der Thy-1 "'"-Zellen aber veränderte sich nicht signifikant, ebensowenig der der CD8⁺-Zellen Das wird als Ergebnis der antigenen Modulation von CD4-Molekulen nach der Antikorperbindung betrachtet Vier Wochen nach der Behandlung war die Anzahl der T-Zellen in lgG_2b-behandelten Gruppen immernoch gering, wahrend die mit YTS177 9 behandelte Gruppe einen normalen Pegel an CD4^-Zellen aufwies

Induktion von Toleranz gegenüber HGG unter dem Schutz von rlgG₂i-CD4-mAb

Aus früheren Arbeiten unter Verwendung von CD4-F(ab')₂-mAb-Fragmenten laßt sich die Vermutung ableiten, daß mAberleichterte Toleranz gegenüber Proteinantigenen nicht die Erschöpfung von CD4⁺-T-Zellen erforderlich zu machen braucht Bei der vorliegenden Studie wurde untersucht, ob die mchterschopfendenCD4-mAb, wie die F(ab')₂-Fragmente, die gleiche Wirkung haben konnten Mausen wurde YTS177 9 oder YTS191 1 meiner dreitatigen Behandlung und eine Injektion von HGG (0,5 mg/ Maus) am zweiten Tag (Tag 0) verarbeitet Bei einer erneuten Belastung mit HGG 4 Wochen spater waren die mit YTS191 1 behandelten Mause und Mause, die eine hohe Dosis (1 mg/Maus) YTS177 9 erhalten hatten, tolerant gegenüber HGG geworden (Abb 3). Mause aber, die 0,1 mg oder weniger von mAb bekommen hatten, konnten noch auf HGG ansprechen.

Die Fähigkeit von YTS177 9, Toleranz gegenüber HgG₂.-mAb zu induzieren

Die In-vivo-Verabreichung von xenogenen Antikörpern ruft in der Regel Antiglobulmreaktionen im Wirt hervor Eines der Merkmale von CD4-mAb ist ihre Fähigkeit, diese Antiglobulinreaktion zu unterdrucken und sogar Toleranz gegenüber anderen Antikörpern desselben Isotyps zu induzieren In der vorliegenden Studie wurde festgestellt, daß der rlgG_2a-CD4-mAb YTS177 9 dieselbe Eigenschaft hat

Mause, denen 0,1-1 mg/Maus YTS177 9 gegeben worden waren, zeigten keine primäre Antiglobulmreaktion (Titer < 1 20) Dagegen wiesen Mause, denen 0,01 mg/Maus YTS177 9 verabreicht worden war, eine schwache Reaktion auf (1 160) Sechs Wochen nach der ersten Antikorperinjektion wurden diese Tiere erneut mit „irrelevanten" (Ratten-Antimensch) rlgG_2a und rlgG_2b-mAbin Freundschem Adjuvans belastet, um eine angemessene Stimulation zu gewahrleisten Der rlgG_2a war YTH 34 5, ein mAb gegenüber menschlichem CDw52 DerrlgG₂b war YTH12 5, ein mAb gegenüber menschlichem CD3 (Waldmann u a , 1985) Die Mause wurden 4 Wochen spater zur Ader gelassen, und ihr Serum-Antiratten-Ig-Titer wurde durch ELISA gemessen So wie rlgG_2b-mAb Mause tolerant gegenüber rlgG_2b-lmmunglobulinen machten, wurde gezeigt, daß Mause, denen eine hohe Dosis an YTS177 9 (1 mg) gegeben wurde, vollkommen tolerant gegenüber rlgG_2a, selbst nach wiederholten Schüben, geworden waren (Abb 4) Eine Menge von 0,1 mg YTS177 9 reichte nicht aus, um Toleranz zu induzieren, obwohl sie fur die Primarreaktionen immunsuppressiv war Mause, denen 0,01 mg YTS177 9 verabreicht worden war, oder nichtbehandelte Kontrolliere zeigten Antiglobulmreaktionen des Sekundartyps Die so induzierte Toleranz war spezifisch, da mit YTS177 9 behandelte Mause noch in der Lage waren, auf rlgG_2b-lmmunglobulin anzusprechen, wahrend mit YTS191 1 behandelte und tolerante Mause noch auf rlgG_2a ansprechen konnten

Verzögerung der Allo-Verpflanzungsabstoßung durch rlgG₂,-mAb-Behandlung

Es wurde festgestellt, daß YTS 177.9 ebenso wirksam wie rlgG_2b-CD4-mAb in der Fähigkeit ist, das Überleben von allogenen Hautverpflanzungen nach einer kurzen Behandlungsdauer zu verlängern. Beim ersten Experiment wurden normalen CBA/Ca-Mäusen täglich Injektionen von HgG₂, (YTS 177.9) oder rlgG_2b (YTS 191.1) über die Zeit von 2 Wochen, beginnend 3 Tage vor der allogenen (BALB/c) Hauttransplantation (etwa 7mg/Maus mAb insgesamt), gegeben. Bei der mit YTS 177.9 behandelten Gruppe wurde die MST signifikant auf 20 Tage verlängert (unbehandelte Kontrollgruppe: 11,3 Tage; ρ < 0,05, Tabelle 2). Dieses verlängerte Überleben des verpflanzten Gewebes ist dem sehr ähnlich, das durch rlgG₂b-CD4-mAb erreicht wurde, welche die Zellen erschöpften (MST 19 Tage).

Bei der Gewebeabstoßung über Fehlanpassungen MHC der Klassen I und Il hat, wie gezeigt wurde, die Erschöpfung der CD4⁺- sowie der CD8⁺-Untermengen das Überleben des verpflanzten Gewebes signifikant gegenüber den Wirkungen nur der CD4-mAb verbessert (Cobbold u. a., Transplantation, 42, 239,1986). Bei der vorliegenden Untersuchung wurde ein anderer rlgG_2a-CD8-mAb eingesetzt, der nur wenig Wirkung auf die In-vivo-Zellerschöpfung zusammen mit dem rlgG_2a-CD4-mAg hat. Es wurde festgestellt, daß dieser CD8-mAb, YTS 105.18, synergistisch mit dem rlgG_2a-CD4-mAb, YTS177.9, dahingehend zusammenwirkt, das Überleben des voll allogenen Hauttransplantats weiter zu verlängern. Zu Vergleichszwecken wurden gleiche Mengen der beiden rlgG_2b-mAb (YTS 191.1 und YTS 169.4) oder der beiden rlgG_2a-mAb verabreicht. An den Tagen 0,2 und 4, bezogen auf die Hautverpflanzung, wurden insgesamt 3 mg/Maus der monoklonalen Antikörper verabreicht. Die rlgG_2b-behandelten CBA/Ca-Mäuse stießen die BALB/c-Haut bei einer MST von 24 Tagen ab (im Vergleich zu 10,5 Tagen bei den Kontrolltieren, ρ < 0,005, Abb. 5). Überraschenderweise war das Überleben des Transplantats bei der Gruppe, die mit rlgG_2a-CD4- und CD8-mAb behandelt worden war, sogar noch größer als bei den mit rlgG₂b-mAb-behandelten Mäusen. Drei der vier rlgG_2a-behandelten CBA-Mäuse stießen die BALB/c-Hautverpflanzungen bis zu 45 Tage nach der Transplantation nicht ab (MST 46,5 Tage, im Verhältnis zur lgG_2b-behandelten Gruppe ρ < 0,03).

Toleranz gegenüber Hautalloverpflanzungen

Obwohl es Berichte gibt, die das permanente Überleben von bestimmten Allotransplantaten, wie Herz oder Pankreas, nach einer CD4-mAb-Behandlung dokumentieren, wurde es im allgemeinen als schwieriger festgestellt, eine langdauernde Hautgewebeverpflanzung allein durch Behandlung mit monoklonalen Antikörpern zu erhalten. Es wurde bereits gezeigt, daß die Behandlung mit CD4-erschöpfenden monoklonalen Antikörpern die Akzeptanz von mehrfach kleiner fehlangepaßtem Knochenmark ermöglichte und daß solche Mäuse dann tolerant gegenüber Spenderhaut waren. In der vorliegenden Untersuchung wurde auf CBA/Ca-Mäuse die Haut von B 10.BR-Mäusen verpflanzt, und die Empfänger wurden mit YTS 177.9 (CD4) und YTS 105.18 (CD8) behandelt. Bei dieser Н-2-kompatiblen, mehrfach im kleineren Transplantationsantigen fehlangepaßten Kombination akzeptierten alle Mäuse, die einer dreiwöchigen Behandlung mit dem monoklonalen Antikörper unterzogen wurden, die erste Haut für die Dauer von 90 Tagen. Zu diesem Zeitpunkt wurde eine zweite Spendertyphaut, zusammen mit einer dritten Partie-Verpflanzung (B10.D2)transplantiert. Die Daten in der Abb. 6 zeigen, daß die ersten und zweiten Transplantate alle auf unbestimmte Zeit (> 9O⁺ Tage) weiter überlebten, während die B10.D2-Haut prompt abgestoßen wurde. Von den Mäusen, die nur 2 Injektionen der monoklonalen Antikörper erhalten hatten, behielten 3 von 6 die B 1O.BR-Haut über 90 Tage, aber nach der zweiten Hautverpflanzung wurde sie langsam abgestoßen.

Toleranz und Anergie bei Mäusen, denen mehrfach im kleineren Antigen fehlangepaßtes Knochenmark verpflanzt wurde

Die Injizierung von CBA/Ca-Mäusen mit der Kombination aus rlgG_2s-CD4- und -CD8-mAb ermöglichte Knochenmarkverpflanzungen und Toleranz gegenüber B10.BR-Haut (Abb.7). Ein ähnliches Protokoll ermöglichte auch Chimärismus und Toleranz durch AKR/J-Mark (Mls-1^a) (Abb.7). Da Toleranz ohne Erschöpfung der CD4-Zellen erreicht werden konnte, ergab sich die Möglichkeit, das Schicksal von Vß 6⁺-CBA/Ca-T-Zellen in der Peripherie des Empfängers zu verfolgen. Vier Wochen nach der Infusion von monoklonalen Antikörpern und Mark waren die Milzzellen dieser Tiere nicht in der Lage, in vitro auf Mls-1^azu reagieren, und waren schlecht reaktiv gegenüber der Stimulierung in der festen Phase mit einem mitogenen V6-mAb (Tabelle 3). Die FACS-Analyse ergab normale Zahlen von Vß6⁺-Zellen in der Peripherie (es wurde nachgewiesen, daß sie dem Empfänger-Thy1.2-Allotyp entsprachen). Natürlich waren die Vß6⁺-T-Zellen anergen gegenüber Stimulierung. Da der CD4-mAb die T-Zellen nicht erschöpft, wurde angenommen, daß diese periphere T-Zellen waren, die anergisiert wurden. Um zu bestätigen, daß der Thymus für die Toleranz von peripheren T-Zellen nicht wesentlich war, wurde erneut AKR/J-Knochenmark verwendet, in diesem Fall, um in ATx-Mäusen Toleranz gegenüber Mls-1^a hervorzurufen. Auch in diesem Fall wurden die Milz-T-Zellen anergen gegenüber Mls-1^a- und Vß6-Stimulierung (Tabelle 4). Weder das Knochenmark, noch der Antikörper allein konnten das reproduzieren. Es war eindeutig die Kombination aus Antikörpern und Mark notwendig, um die periphere T-Zellenanergie herbeizuführen.

Nachweis der peripheren Toleranz gegenüber Haut-Allotransplantaten bei erwachsenen thymektomisierten Mäusen Um nachzuweisen, daß es sich um knochenechte periphere Toleranz handelte, die durch die Hauttransplantate induziert worden war, wurde das Experiment bei ATx-Mäusen wiederholt. Da die rlgG_2a-mAb T-Zellen nicht abtöten, wurde erwartet, daß die Immunfunktionen bei diesen Mäusen wieder in den Normalzustand zurückkehren würden, sobald die Antikörpertherapie beendet war. Wie bei euthymischen Mäusen festgestellt wurde, wurde Toleranz gegenüber der Versuchshaut induziert und wurden Verpflanzungen der dritten Partie prompt abgestoßen (Abb.8).

Der „periphere" Toleranzzustand ist gegenüber der Infusion von normalen Lvmphozvten unempfindlich

Bei beiden oben angeführten Haut-Allotransplantat-Toleranzmodellen wurde die Frage gestellt, ob die adoptive Übertragung von normalen Lymphozyten den Toleranzzustand beenden könnte. In keinem der Fälle konnten 50 Mill. Milzzellen, die von normalen Spendern transfundiert wurden, die Fähigkeit zur Abstoßung wiederherstellen. Ein ständiges Problem bei diesem Typ von Experiment ist es, zu zeigen, daß die infundierten Zellen überleben und funktionieren. Zum Teil wurde das durch Übertragung der gleichen Zahl von Milzzellen auf T-erschöpfte ATx-Mäuse kontrolliert. In diesem Fall waren die übertragenen Zellen in der Lage, die Abstoßung des Hauttransplantats zu vermitteln. Nur „vorbereitete Zellen", die in tolerante Mäuse übertragen wurden, konnten den Toleranzzustand brechen (Tabelle 5). Ähnliche Ergebnisse wurden bei Mäusen festgestellt, die gegenüber HGG tolerant waren, bei denen die Toleranz durch adoptive Übertragung von Normalzellen nicht gebrochen werden

konnte, solange nicht zuerst die CD4⁺-T-Zellen des Empfängers erschöpft worden waren. Wie groß aber auch die Schwierigkeiten bei der Kontrolle dieser Experimente sein mögen, es muß geschlußfolgert werden, daß es das Immunsystem von toleranten Tieren normalen ursprünglichen T-Zellen nicht gestattet, ihr Immunpotential auszuprägen.

Beispiel 2 Materialien und Methoden

CBA/Ca-, C57 BlЛ0/Pc-, BALB/c, B 10.BR- und AKR/J-Mäuse wurden gezüchtet und in der herkömmlichen Tieranlage des Department oft Pathology, University of Cambridge, gehalten. Geschlechtsabgestimmte Gruppen von Mäusen wurden im Alter von 6 bis 12 Wochen eingesetzt.

Monoklonale Antikörper

Alle monoklonalen Antikörper von Ratten, die in diesen Experimenten eingesetzt wurden, werden in der Tabelle 1 aufgeführt. Die Antikörper wurden aus Aszitisflüssigkeit hergestellt, die in pristan-vorbereiteten (DAxLOU)F,-Ratten durch Ausfällung mit 50% gesättigtem Ammoniumsulfat, gefolgt von der Dialyse in phosphatgepufferte physiologische Kochsalzlösung (PBS; pH-Wert 7,2), produziert wurde. Die Proteinkonzentration wurde auf 10 mg/ml abgestimmt, wie durch OD₂so geschätzt wurde, die 2-5mg/ ml des monoklonalen Antikörpers enthielt. Alle Antikörperpräparate wurden durch einen 0,2-ym-Filter passiert, bevor sie den Mäusen verabreicht wurden.

Hautgewebeverpflanzung

Hautgewebetransplantate wurden so durchgeführt, wie das an anderer Stelle berichtet wurde (Cobbold u.a., 1986, Transplantation, 41,634). Kurz dargestellt, Schwanzhauttransplantate des Spenders (0,5cm bis 1,0cm im Quadrat) wurden auf die seitliche Brustwand von Empfängermäusen unter Narkose transplantiert. Die Transplantate wurden mit Gaze abgedeckt und mit Pflasterbandage für 7 Tage versehen. Der Gewebezustand wurde dreimal wöchentlich im ersten Monat, anschließend wöchentlich dokumentiert. Unterschiede im Überleben wurden nach der Log-Rank-Methode analysiert (Peto u.a., 1977, Br. J. Cancer, 35,1). Bei der Durchführung von mehrfachen Wiederverpflanzungen bei einem Bereich von Spendern wurden diese Gewebe in ein einziges vorbereitetes Transplantationsbett transplantiert, in der Regel auf der gegenüberliegenden Seite zur ursprünglichen Hauttransplantation (Cobbold u.a., 1986, Nature, 323,164). Die Gewebeverpflanzungen wurden anfangs dreimal wöchentlich, später wöchentlich überwacht. Die mittleren Überlebenszeiten der Transplantate (MST) werden als Zahl der Tage bis zur vollständigen Abstoßung gegeben, aber tolerierte Gewebeverpflanzungen mit unbegrenzten Überlebenszeiten waren im allgemeinen in gutem Zustand mit normalem Haarwuchs.

Induzierung von Toleranz gegenüber Hautverpflanzungen

Hautverpflanzungen wurden als einzige Quelle für Antigen/Tolerogen genutzt, und die Verpflanzungen wurden am gleichen Tag, an dem auch die Behandlung mit dem monoklonalen Antikörper begann, so ausgeführt, wie das oben beschrieben wurde. Monoklonale Antikörper wurden dreimal wöchentlich vom Tag 0 bis zum Tag 21 (eisnchließlich) verabreicht, wobei die beiden ersten Injektionen (Tag 0 und Tag 2) intravenös, die übrigen intraperitoneal erfolgten. Die Gesamtdosis aller je Injektion gegebenen Antikörper betrug 2 mg der aszitischen Immunglobulinfraktion in 0,2ml PBS. Bei Ratten-rlgG₂t,-Antikörpern waren das jeweils 0,5 mg von YTS191.1.2, YTA3.1.2, YTS169.4.2 und YTS156.7.7 (ein synergistischer, erschöpfender Cocktail der monoklonalen Antikörper CD4 und CD8; Qin u. a., 1987, Eur. J. Immunol. 17,1159). Bei Ratten-lgG_2a-Antikörpern wurden jeweils 1 mg von YTS 177.9.6 (CD4) und YTS 105.18.10 (CD8) eingesetzt. Für das kombinierte Erschöpfungs-und Blockierungsprotokoll wurde der synergistische Ratten-lgG₂b-Cocktail intravenös an den Tagen 0 und 2 und anschließend dreimal wöchentlich RattenlgG_2a-CD4 und -CD8 bis zum Tag 21 intraperitoneal gegeben.

Pegel des aktiven monoklonalen Antikörpers im Serum

Serumproben, die von einzelnen Mäusen zu verschiedenen Zeitpunkten während und nach der Verabreichung des monoklonalen Antikörpes entnommen wurden, wurden mit 25 μΙ in einer Verdünnung von 1/5 in PBS, die 1 %Gew./Vol. Rinderserumalbumin (BSA) plus 5% (Vol./Vol.) durchwärme inaktiviertes, normales Kaninchenserum enthielt, zu 5 x 10⁵ CD4- oder CD8-transfizierten Zellen gegeben. Der CD4-Transfektant war der Ratten-NB2-6GT-Stamm, der Maus-L3/T4 ausprägt (Beispiel 1), während das CD8-Gen (Lyt-2) mit hohem Pegel in Maus-L-Zellen ausgeprägt wurde (Zamoyska, 1985, Cell, 43,153). Gebundene Antikörper wurden unter Einsatz von monoklonalem Antiratten-lgG_2a, das mit der vom Hersteller empfohlenen Verdünnung an FITC gekoppelt war (MARG2 A-FITC; Serotec, Oxford, Großbritannien), nachgewiesen, und die Analyse wurde auf einem Zytofluorografen Ortho 5OH mit einem Computer 1250 (Ortho, Westwood, MA, USA) durchgeführt. Die mittlere Fluoreszenz wurde mit einer Standardverdünnungsserie von gereinigtem CD4- oder CD8-Antikörper (YTS 177.9.6 oder YTS105.18.10) in normalem Mäuseserum verglichen, um äquivalente Konzentrationswerte für die Serumproben abzuleiten. Wenn die Fluoreszenz Antikörpersättigung zeigte oder keine nachweisbare Fluoreszenz über dem Hintergrund vorhanden war, wurde angenommen, daß das Ergebnis größer oder kleiner als der titrierbare Bereich der Standardkurve war.

Herstellung von peripheren Blutleukozyten

Mäusen wurde einzeln Blut aus der Schwanzvene (ca. 0,1 ml) in sterile Röhrchen entnommen, die 1 Einheit Heparin enthielten. Nach zweiminütigem Zentrifugieren (6000U/min) in einer Mikrofuge wurde dann das Plasma entfernt. Die roten Blutzellen wurden zweimal durch Zusatz von 0,9ml Wasser für die Dauer von 10s bei Zimmertemperatur, gefolgt von 0,1 ml von 10x phosphatgepufferter physiologischer Kochsalzlösung, aufgelöst, und die weißen Zellen wurden durch Zentrifugieren mit 1000U/min für die Dauer von 7 Minuten aufgefangen (Chandler u.a., 1979, J. Immunol. Methods, 31,341).

Überwachung von T-Zellen-Untermengen auf Erschöpfung

Von den einzelnen behandelten Mausen wurden periphere Blutleukozyten präpariert, wie das oben beschrieben wurde Diese wurden mit Überstanden gefärbt, welche monoklonale Antikörper gegen CD4- (YTS 191 1 2 plus YTA3 1 2) oder CD8-Antigene (YTS 169 4 2 plus YTS156 7 7) enthielten Als Kontrolle wurden auch andere monoklonale Antikörper (siehe Tabelle 6) verwendet Gebundene Antikörper wurden unter Verwendung eines Gemischs aus monoklonalen Antiratten-lgG₂b-FITC (NORIG-7 17-FITC, Clark, 1986, Methods Enzymol 121, 548) und der leichten Kette von monoklonaler Antiratten-Kappa (MAR-18 5-FITC, Lanier u a , 1982, Hybridoma 1,125) nachgewiesen Die Fluoreszenz wurde unter Verwendung eines Zytofluorografen Ortho 50 H mit 1 250 Computer und linearen Verstarkern mit Ausblendung bei der vorderen und der 90°-Streuung, um nach lebenden Lymphozyten auszuwählen, analysiert

Gemischte Lymphozytenkulturen

Ansprechzellen wurden aus einzelnen Mauseblutproben (ca 0,2 ml) durch Wasserlyse gewonnen, wie das oben beschrieben wurde Jede Probe wurde durch Splitten der Zellen in drei Gewebekultur-Mikrotitervertiefungen mit U-Boden, die 4 χ 10⁵gut gewaschene, mit Mitomycin C behandelte (Sigma, Poole, Großbritannien, 25цд/тІ) Stimulator-Milzzellen enthielten, auf Proliferation untersucht (etwa 4 χ 10⁵ weiße Zellen je Vertiefung) Das Endvolumen des Iscoveschen modifizierten Dulbecco-Mediums (IMDM), das 10% durch Warme inaktiviertes menschliches AB-Serum enthielt, betrug 0,1 ml Nach 3 Tagen bei 37°C in einem mit 5% CO₂ begasten Inkubator wurden 5μΙ ¹²⁵l-Deoxyundin (IUDR, 10pCi/ml Amersham, Großbritannien) fur die Dauer von sechs Stunden zugesetzt Die ¹²⁵l-Einbeziehung wurde durch Ernten der Zellen auf Glasfaserfilter und Zahlen auf einem automatischen Gammazahlervon Philips gemessen.

Eine Kombination aus erschöpfenden und blockierenden CD4- und CDe-Antikörpern laßt Toleranz gegenüber MHC-fehlangepaßten Hautverpflanzungen zu

Beispiel 1 hat gezeigt, daß eine dreiwöchige Therapie mit nichterschopfenden CD4 und CD8-Antikorpern Toleranz gegenüber mehrfachen kleinen inkompatiblen Hautverpflanzungen zulaßt Um ein Behandlungsprotokoll zu erstellen, daß bei starken MHC-Unterschieden Toleranz ermöglichen wurde, wurden die Wirkungen der Verabreichung von erschöpfenden (Ratten-lgG_2b), nichterschopfenden (blockierenden Ratten-lgG_2a) und einer Kombination von erschöpfenden, gefolgt von blockierenden CD4- und CDS-Antikorpern, auf CBA/Ca-Mause (H-2^k), denen BALB/c-Haut(H-2^d) verpflanzt worden war, verglichen (Abb 9) Wie bereits berichtet wurde, verzögerte ein streng erschöpfendes Protokoll die Abstoßung wesentlich, aber alle Mause stießen das Transplantat innerhalb von 70 Tagen ab (MST = 55 Tage) Nichterschopfende Antikörper waren hier weniger wirksam (MST = 28 Tage), aber eine Kombination von zwei erschöpfenden Dosen, gefolgt von einer Blockade durch Ratten-lgG_2a-Antikorper, ergab das längste Überleben des verpflanzten Gewebes (MST > 100 Tage), obwohl die meisten (aber nicht alle) Gewebeverpflanzungen bis zum 200 Tag abgestoßen wurden Bei diesem Experiment wurden zweite BALB/c-Versuchstransplantate am Tag 94 gegeben, zusammen mit einer Haut dritter Partie B10 (H-2^b) Diese Verpflanzungen der dritten Partie wurden prompt abgestoßen (MST =16 Tage), was zeigt, daß die Mause zu Immunkompetenz zurückgekehrt waren, wahrend die zweite BALB/c-Verpflanzung im Durchschnitt 43 Tage überlebte Das zeigt, daß ein gewisses Maß an spezifischer Unempfindhchkeit gegenüber BALB/C-Transplantat-Antigenen vorhanden sein muß Obwohl bei dieser Stammkombination keine vollständige Toleranz erreicht wurde, konnte festgestellt werden, daß das gleiche kombinierte Protokoll vollkommen toleranzzulassig ist, wenn B 10-Haut (H-2^b) auf MHC-inkompatible CBA/Ca-Mause (H 2^k) verpflanzt wurde Abb 10 zeigt, daß 6 von 8 Empfangermausen ihre ursprünglichen Hauttransplantate unbegrenzt behielten (>250 Tage), wahrend alle Mause die BALB/c-Haut, die am Tag 119 verpflanzt wurde, innerhalb von 15 Tagen abstießen Die zweiten B10 Hautverpflanzungen hatten beachtlich verlängerte Uberlebenszeiten (MST = 44 Tage), aber alle wurden letztendlich abgestoßen, auch wenn die ersten Transplantate, die als genetisch identisch angenommen wurden, beibehalten wurden Dieses Ergebnis ist reproduzierbar und zeigt deutlich, daß das tolerierte erste Transplantat das Privileg des Besitzes hat, trotz des Vorhandenseins von Effektorzellen, die zur Abstoßung des zweiten Transplantats in der Lage sind Wie auch immer der Mechanismus sein mag, das ursprüngliche Hauttransplantat muß einen Zustand der Unempfindhchkeit gegen sich induziert und aufrechterhalten haben Die Fähigkeit der Mause, zwischen dem ersten und zweiten B10-Transplantatzu unterscheiden, schien von der Abstoßung der Haut der dritten Partie abhangig zu sein, da 5 von 8 Mausen, denen B10 BR-Transplantate anstelle von BALB/c-Transplantaten gegeben wurden, tolerant gegenüber allen drei bleiben (Abb 10) Das zeigt, daß die Empfanger tolerant gegenüber kleineren B10 Antigenen im Zusammenhang der beiden Spender-MHC waren, was bedeutet, daß das Transplantat selbst Toleranz und auch MHC des Empfangertyps präsentieren kann, was durch eine Neubearbeitung der ursprunglichen Transplantat Antigene und die Präsentation zur Toleranz durch Empfanger-APC geschehen muß Dies ist der erste Bericht über durch Antikörper vermittelte Toleranz über die vollständigen MHC-Barneren unter Verwendung von immunogenen Hauttransplantaten als der einzigen Quelle fur das Tolerogen Es sollte betont werden, daß das Transplantat selbst die gesamte Antigen-Prasentation geschaffen haben muß, die fur das Auftreten der Toleranz notwendig ist

Die Kombination von erschöpfenden und blockierenden Antikörpern ermöglicht auch Toleranz gegenüber Haut, die für MHC angepaßt, für mehrfache kleinere Nicht-MHC-Antigene aber fehlangepaßt ist Im Beispiel 1 wurde gezeigt, daß die Blockierung mit monoklonalen Antikörpern gegenüber CD4 und CD8 ausreichend ist, um Toleranz bei Hautverpflanzungen zu erreichen, die sich in mehrfachen kleineren Antigenen unterscheiden (B 10 BR auf CBA/Ca) In der Abb 11 wird gezeigt, daß ein kombiniertes erschöpfendes, gefolgt von einem blockierenden Protokoll auch bei 8 von 10CBA/Ca-Mausen dahingehend wirksam war, die AKR/J-Transplantate unbegrenzt zu behalten Sechs dieser Mause behielten auch zweite AKR/J-Transplantate (Haut wurde am Tag 122 ohne weitere Antikorpertherapie verpflanzt), wahrend alle Mause kleiner fehlangepaßte Haut der dritten Partie (B 10 BR) abstießen Die Abstoßung dieser Haut der dritten Partie erfolgte jedoch etwas langsamer als bei normalen CBA-Kontrolltieren (27 Tage im Vergleich zu normalerweise 14 Tagen, Cobbold u a , 1986, Transplantation 41,634) Auch die umgekehrte Kombination (B10 BR auf CBA/Ca) wurde tolerant, wenn mit Erschöpfung, gefolgt von einem Blockierungsprotokoll gearbeitet wurde (4/5 Verpflanzungen >220 Tage), aber 2 von 5 Mausen akzeptierten sowohl die Minor-Differenz-AKR/J-Haut der dritten Partie als auch das zweite B10 BR-Transplantat (Daten nicht gezeigt) Das widerspiegelt wahrscheinlich die große Zahl von gemeinsamen kleineren oder Minor-Antigenen und erinnert an das Ergebnis der „dominanten" Toleranz, die in einem anderen Versuchsmodell beobachtet wurde (Zamoyska u a , 1989, Eur J Immunol 19,111)

Zusammenfassend kann fur diesen Abschnitt gesagt werden, daß die Schlußfolgerung erlaubt ist, daß CD4- und CD 8-Antikorper, wenn sie entsprechend eingesetzt werden, die Induzierung von Toleranz gegenüber MHC-wie auch Nicht-MHC-Antigen-Unterschieden allein auf Grund von Hautverpflanzungen ermöglichen, ohne die Notwendigkeit einer weiteren hamopoetischen Antigenquelle oder einer myeloablativen Therapie Hautverpflanzungen sind eindeutig in der Lage, das Antigen direkt den peripheren T-Zellen entweder zur Aktivierung, was zur Abstoßung fuhrt, oder zur Inaktivierung zu präsentieren, was stattdessen zu Akzeptanz und Toleranz fuhrt

Die Wirkungen von kombinierten Ratten-lgGab- und -IgG₂.-Antikörpern auf zirkulierende T-Zellen

Angesichts der bemerkenswerten tolerogenen Wirkungen, die in den oben beschriebenen Experimenten sichtbar wurden, war es wichtig, die Wirkungen der monoklonalen Antikörper auf zirkulierende CD4⁺ und CD8⁺-T-Zellen einzuschätzen Es wurde bereits gezeigt, daß Ratten-lgG₂b-Antikorper gegenüber CD4 oder CD 8 ihre Ziel-T-Zellen erschöpfen (Cobbold u a , 1984, Nature, 312, 548) Im Beispiel 1 tendierten die Ratten-lgG2_a-Antikorper in den verabreichten Dosen nur dazu, das Antigen von der Zelloberflache zu modulieren Bei dem kombinierten Protokoll bewirkten die anfänglichen Dosen von Ratten-lgG₂b-CD4 und -CD 8 monoklonalen Antikörpern eine Verringerung in der Anzahl der T-Zellen, wie das erwartet worden war, und dann begann sich der Anteil der CD4⁺- und CD8⁺-Zellen tatsachlich wahrend der fortgesetzten Behandlung mit lgG_2a-Antikorpern wiederherzustellen (Tabelle 7), obwohl die Menge des ausgeprägten Antigens stark reduziert war (Daten nicht gezeigt) Restlicher Antikörper war wahrend der Verabreichungsperiode an den T-Zellen vorhanden, wodurch die detaillierte Messung der CD4⁺- und CD8⁺-Zellen erschwert wurde Anschließend blieb der Anteil der T-Zellen im peripheren Blut über mindestens einen Monat nach Ende der Antikorperbehandlung verschwindend gering, eine Wirkung, die bei der Gabe nur der IgG₂₁₁-Antikorper in äquivalenten Dosen nicht beobachtet wurde (Daten nicht gezeigt) Ein Mechanismus fur die Unterdrückung derTransplantatabstoßung durch nichterschopfende monoklonale Antikörper ist der durch Blockierung der Funktion der CD4- und CD8-Begleitmolekule auf der T-Zellenoberflache wahrend der Antigenprasentation Dieser ware nur äußerst wirksam, wenn Serumantikorper in ausreichenden Werten beibehalten wurden, um die antigenpositiven Zellen zu sattigen Es wurde tatsächlich festgestellt, daß die Werte des aktiven Antikörpers in den behandelten Mausen ausreichend waren, um die Ziel-CD4- und -CD8-Antigene wahrend der drei Wochen wahrenden Behandlung zu sattigen, bei einigen Mausen sogar bis zu drei Wochen nach Ende der Antikorpergabe (Tabelle 8) Am Tag 60 aber war kein nachweisbarer (<0,5ng/ml CD4 und < 10ng/ml CD8) monoklonaler Antikörper mehr im Serum, das anderweitig eine nichtspezifische Immununterdruckung beibehalten haben konnte Es sollte beachtet werden, daß keine der Mause nachweisbares Antiglobulin (weder Antispezies noch Antiidiotyp) herstellte, wie durch eine Einfang-ELISA gemessen wurde, was darauf hinweist, daß die Mause durch dieses Protokoll auch tolerant gegenüber Rattenimmunglobulin gemacht worden waren

Tolerante Mause können noch in vitro ansprechen

Es wurde festgestellt, daß CBA-Mause, die in der oben beschriebenen Weise tolerant gegenüber B 10-Haut gemacht worden waren, noch in der Lage waren, in vitro gegenüber B 10-Stimulator-Milzzellen zu prolifeneren (Tabelle 9), was zeigt, daß eine signifikante Anzahl von alloreaktiven T-Zellen nicht erschöpft wurde Das Immunsystem der Empfanger ist eindeutig tolerant gegenüber Antigenen, die durch das ursprüngliche Transplantat präsentiert werden, ist aber noch in der Lage, auf die In-vitro-Prasentation durch Milzstimulatorzellen oder ein zweites Hauttransplantat anzusprechen

Die Induzierung von Toleranz bei Mausen, die vorher gegenüber kleineren oder Minor-Antigenen vorbereitet wurden

Unter der Voraussetzung, daß ursprungliche T-Zellen im peripheren Immunsystem von Antigenen mit Ursprung im Transplantat toleriert werden konnten, wurde festzustellen versucht, ob auch vorbereitete T-Zellen toleranzanfallig waren Es wurde festgestellt, daß beide Behandlungsprotokolle (nur Blockierung oder Erschöpfung, gefolgt von Blockierung) wirksam bei der Induzierung von Toleranz gegenüber AKR/J- oder B10 BR-Haut bei CBA/Ca-Mausen, die vorher mit bestrahlten Spendermilzzellen belastet worden waren, waren (Abbildungen 12a bis 12d) Dagegen wurde bereits gezeigt, daß die Erschöpfung der CD4⁺- und CD8⁺-Zellen zwar gleichermaßen immunsuppressive bei naturlichen oder vorbereiteten Mausen war, nicht aber toleranzzulassig fur mehrfach im kleineren Antigen fehlangepaßte Haut, da alle Transplantate letztlich abgestoßen wurden (Cobbold u a , 1986, Transplantation, 41,634)

Der einzige Unterschied zwischen den natürlichen Mausen in der Abb 11 und den vorbelasteten Mausen in der Abb 12 konnte nach der erneuten Belastung festgestellt werden Etwa die Hälfte der Mause in der Gruppe, die vorbereitet und gegenüber AKR/J tolerisiert wordne waren, stieß letztlich sowohl das erste als auch das zweite AKR/J-Transplantat ab, wenn auch langsamer als die B10 BR Transplantate der dritten PartiefMST = 63bzw 21 Tage,Abb 12a) BeiderKombinationBIO BR aufCBA behielt die Mehrzahl der Mause das ursprüngliche Transplantat über unbestimmte Zeit, wahrend bei einigen Mausen sowohl das zweite B10 BR- als auch das AKR/J-Transplantat langsam abgestoßen wurden (Abb 12c) Dieser Unterschied im Verhalten der Stammkombinationen ist mit der bei natürlichen Mausen festgestellten (siehe Abb 11) kompatibel und beruht wahrscheinlich auf dem komplexen Schema von gemeinsamen und einzigartigen kleineren Antigenen

Toleranzinduzierung wahrend der aktiven Abstoßung eines Hauttransplantats

Das Ergebnis, daß selbst sensitisierte T-Zellen tolensierbar sind, hat klinische Bedeutung Es ware eindeutig vorteilhaft, Toleranz angesichts einer beginnenden Immunreaktion zu induzieren, vor allem bei Autoimmumtat oder wahrend einer Organabstoßungskrise nach einer Transplantation In der Abb 13 kann festgestellt werden, daß es tatsächlich möglich ist, eine beginnende Abstoßung von mehrfach im kleineren Antigen fehlangepaßten Hautverpflanzungen umzukehren und ein langwahrendes Überleben herbeizufuhren, in einigen Fallen sowohl beim ersten als auch beim zweiten Transplantat Bei diesem Experiment war die Kombination aus Erschöpfung, gefolgt von Blockade, am wirksamsten (Abb 13 a), aber da 3 von 6 Mausen, denen die blockierenden (nichterschopfenden) Antikörper verabreicht wurden, auch die zweiten Transplantate behielten (Abb 13 b), muß es möglich sein, selbst Effektor-T-Zellen inaktiv oder tolerant zu machen.

Tabelle 1

Bindung von YTS 177.9 an L3T4-transfizierte Zellen

Monoklonaler Antikörper

% der positiven L3T4-Zellen^a

YTS177.9^b	98,7
YTS191.1^b	99,1
YTS117.9^C und YTS 191.1	1,1
YTS177.9^cundYTA3.1	98.1

a L3T4-transfizierteZell8tämme, die mit entsprechenden monoklonalen Antikörpern gefärbt und durch Durchflußzytometrie analysiert wurden. b Monoklonale Antikörper wurden als Gewebekulturüberstand verwendet, gefolgt von FITC-konjugiertem Kaninchen-Antiratten-Ig. с Biotinylierte monoklonale Antikörper, die mit einem Überschuß an »kalten" monoklonalen Antikörpern, die darunter gegeben wurden, inkubiert wurden. Die Fluoreszenz wurde mit FITC-Streptavidin entwickelt.

Tabelle 2

Verzögerung der Abstoßung von Hautverpflanzungen durch IgG₂,-und IgG₂I₃-CD4-mAb

mAb-Behand-	%derZellen^b	CD8⁺	Thy-1 ⁺	Überleben der Verpflanzung	BALB/c
lung*		17,3 ±1,7	20,2 ± 4,4	(Tage)
	CD4⁺			B10.BR
YTS191.1	1,9 ±1,5	18,1 ±2,3	24,5 ± 3,6	28,29,32,	15,18,19,
				58,65.	19,20,21.
YTS 191.1	1,2±1,1	15,3 ±0,4	48,8 ± 5,0

YTS 177.9	28,3 ± 9,8	16,1 ±1,2	46,9 ± 4,2	15,20,22, > 120,	19,19,20,
				> 120, > 120.	20,21,21.
YTS 177.9	27,5 ±10,1	12,5 ±1,5	47,0 ± 2,8		9,10,10,
					11,12,12.
Keine	39,8 ± 3,0		10,11,12,
			12,13.

a Normale CBA/Ca-Mäuse erhielten über 2 Wochen, beginnend 3 Tage von der Hautverpflanzung, CD4-mAb (ca. 7 mg/Maus).

b Peripheres Blut, das 4 Tage nach der letzten Injektion von monoklonalen Antikörpern entnommen wurde, wurde mit biotinyliertem YTA 3.1 (CD4), YTS 156.7 (CD8) und YTS 154.7 (Thy-1) gefärbt, gefolgt von Streptavidin-FITC. Die Ergebnisse wurden durch Durchflußzytometrie analysiert.

^cMSTvon B10.BR-Transplantaten: nichtbehandelte Kontrollgruppe: 12 Tage; YST 191.1-behandelte Gruppe: 32 Tage (im Verhältnis zur Kontrollgruppe: ρ < 0,005); YTS 177-behandelte Gruppe: 22 Tage (im Verhältnis zur Kontrollgruppe: ρ < 0,004, im Verhältnis zur YTS 191.1-behandelten Gruppe: ρ < 0,7).

MST von BALB/c-Transplantaten: nichtbehandelte Kontrollgruppe: 10,5 Tage; YST191.1-behandelte Gruppe: 19 Tage (im Verhältnis zur Kontrollgruppe: ρ < 0,006); YST177.9-behandelte Gruppe: 20 Tage (im Verhältnis zur Kontrollgruppe: ρ < 0,006, im Verhältnis zur YST191.1-behandelten Gruppe: ρ < 0,4).

Tabelle 3

Toleranz von Mls-1^b-Mäusen gegenüber dem Mls-1 "-Antigen ist mit Anergie von Vß6⁺-Zellen assoziiert

Mäuse	Reaktionen auf:	(cpm)	Anti-Vß6	CD3	-ve	%Vß6⁺-Zellen
	AKR/J	BALB/c	583 1 173 1050 1 163 764	12 350 9 879 7719 13496 11230	596 460 703 1082 977	10,2 12,1 8,7 7,5 7,8
1 2 3 4 5	772 439 961 1 203 859	11117 8964 6498 12 866 10784	10440 10 530	11980 13291	868 642	7,0 10,2
Normale Mäuse	20756 27 529	9633 17 253	13950 7 267	19087 13563	815 976	8,1 9,0
Nur Mark	38 264 15832	10042 8679

Normale CBA/Ca-Mäuse wurden drei Wochen lang mit rlgG_2e-CD4 (YTS 177.9) und rlgG_2b-CD8 (YTS 156.7) bei insgesamt 10mg mAb/Maus behandelt. Es wurden 2 χ 10⁷ AKR/J-Knochenmarkzellen injiziert. Vier Wochen später wurden Milzzellen von diesen Mäusen in MLC getestet und für die Durchflußzytometrie fluoreszenzgefärbt. Die gegebenen Zahlen sind geometrische Mittel derTriplikate.

Tabelle 4

Toleranz und Anergie gegenüber MIs-T in ATx-Mls-1^b-Mäusen^a

Mäuse Reaktionen auf: (cpm)^b

AKR BALB/c Anti-Vß6 %Vß6⁺-Zellen^c

1	1348	8081	696	2,8
2	1145	10231	812	2,9
3	998	7311	976	3,7
4	1 039	6508	793	3,3

Kon- 12463 10 283 7374 3,8

troll"

Mäuse 15 578 8864 5924 2,9

a ATx-CBA/Ca-Mäusen wurden über 2 Wochen gleiche Mengen an rlgG₂,-CD4-mAb (YTS 177.9) und rlgG_2b-CD8-mAB (YTS 156.7) injiziert (insgesamt 7 mg mAb/Maus. Zwei Tage nach Beginn der mAb-Behandlung wurden 2 χ 10⁷ AKR-Knochenmarkzellen injiziert. Acht Wochen später wurden die Milzzellen in vitro stimuliert, wie das im Beispiel 2 beschrieben wurde.

b Die gegebenen Zahlungen sind Zählungen/min (geometrisches Mittel von Triplikatproben) jeder einzelnen Maus.

с MiIz-V ß6⁺-Zellen, die mit mAb 44-22-1 (Payne u.a., 1988, PNAS USA, 85,7695) gefärbt und durch die Durchflußzytometrie analysiert wurden.

d Die Kontrollmäuse waren ATx-CBA-Mäuse, denen nur mAb injiziert worden waren.

Tabelle 5

Übertragung von normalen Lymphozyten bricht nicht die Toleranz bei normalen Mäusen

Tiere	Injizierte Zellen^a	Überlebendes Transplantats nach Zellübertragung
Tolerante CBA	B10.BR-Milzzellen Natürliche CBA-Milzzellen Sensitisierte CBA-Milzzellen^c	>100Tagex4 >100Tagex4 15,17,17,21
T-erschöpfte^b ATx-CBA	natürliche CBA-Milzzellen sensitisierte CBA-Milzzellen keine	12,14,14,15 8,8,9,10 >100Tagex4

CBA/Ca-Mäuse wurden tolerant gegenüber B10.BR-Haut gemacht, wie das in der Legende zu Abb. 13a beschrieben wird.

a Mäuse, die B 1O.BR-Haut langer als 200 Tage getragen hatte, wurden ausgewählt und ihnen intravenös 5 χ 10⁷ Milzzellen injiziert.

b ATx-CBA-Mäusen wurden von T-Zellen erschöpft durch Injektion von CD4- und CD 8-mAb wenigstens 4 Wochen vor der Verpflanzung von

BIO.BR-Hautaufdiese

с Die sensitisierten Milzzellen stammten von CBA-Mäusen, denen B lO.BR-Milzzellen injiziert worden waren und die B 1O.BR-Hauttransplantate

abgestoßen hatten.

Tabelle 6

Verwendete monoklonale Antikörper

Monoklonaler Spezifizität Epitop Isotyp Referenz

Antikörper

Cobboldu.a., 1984,Nature,312,548 Qinu.a.,Eur.J.lmmunol. 17,1159,1987

Cobbold u. a., 1984, Nature, 312,548 Qin u.a., 1989, J. Exp. Med. 169,779

Cobbold u.a., 1984, Nature, 312,548 Cobbold u.a., 1984, Nature, 312,548

YTS 191.1.2	Maus-CD4	a	lgG_2b
YTA 3.1.2	Maus-CD4	b	IgG₂₆
YTS 177.9.6	Maus-CD4	a	IgG₂₃
YTS 169.4.2	Maus-CD8	Lyt-2(a)	igG_2b
YTS 156.7.7	MausCD8	Lyt-3(b)	igG_2b
YTS 105.18.10	Maus-CD8	Lyt-2 (c)	IgG₂₈
YTS 154.7.7	Maus-Thy-1	monomorphes	igG_2b
YTS 121.5.2	Maus-CD5	Lyt-1	lgG_2b

Tabelle 7

Restliche T-Zellen in mit CD4 + CDe-antikörperbehandelten Mäusen

	B 10-tolerante CBA, % der positiv färbenden Milzzellen	CD8⁺	Thy-1+CDS+	Antiratten-Ig*	Geprüfte
Zeit	CD4⁺				Zahl
(Tage)		16±1	47 ±1	0±0	4
O	34 ±2	12±5	13±4	6 + 1	8
5	12±3	18±6	18±5	3±1	3
12	18 + 4	22±3	26 ±5	3±3	6
19	27 ±4	11±2	28 ±4	0±0	8
45	24 ±5

* Antiratten-Ig war ein Gemisch aus MAR.18.5-FITC und MORIG-7.16-FITC.

Alle Mäuse erhielten Ratten-lgG₂b-CD4 und -CD8, gefolgt von Ratten-lgG_2a-CD4 und -CD8, wie das im Beispiel 2 beschrieben wurde, vom Tag 0 bis

Tabelle 8

Serumpegel von aktiven lgG_2a-CD4- und -CDe-monoklonalen Antikörpern

	CD4-Serumantikörper	<0,5	<0,5	<0,5	CD 8-Seru mantikörper	<10	<10	<10
Zeit	(ng/ml)	>100	>100	>100	(ng/ml)	120	150	>1000
(Tage)		>100	>100	>100		>1000	>1000	>1000
0		>100	>100	>100		250	>1000	>1000
12	(Vier einzelne Mäuse)	90	>100	>100	(Vier einzelne Mäuse)	600	>1000	>1000
19	<0,5	100	>100	>100	<10	85	500	>1000
29	>100	15	70	>100	>100	<10	12	25
32	50	<0,5	<0,5	1,0	190	<10	<10	<10
36	50	<0,5	<0,5	<0,5	75	<10	<10	<10
43	80	<0,5	<0,5	<0,5	500	<10	<10	<10
46	5		60
60	<0,5		<10
78	<0,5		<10
<0,5	<10
<0,5	<10

Die monoklonale Antikörperbehandlung bestand aus Gaben von Ratten-lgG₂b-CD4 und -CD8 an den Tagen 0 und 2, gefolgt von Ratten-lgG2a-CD4 und -CD8 dreimal wöchentlich bis zum Tag 21 (je Injektion insgesamt 2g).

Tabelle 9

Proliferation von peripheren Blutlymphozyten von BIO-toleranten CBA-Mäusen

Proliferation (¹²⁵IUDR-Einbeziehung) gegenüber Stimulatoren

Gruppe CBA BALB/c B10

(Zählungen/min)

Normale CBA-Kontrollgruppe 370 + 236-121 4952 + 5236-2624 2210 + 2622-1285

ВЮ-toleranteCBA-Gruppe 716+800-448 4952 + 3470-2091 3592 + 2875-1656

Individuellen B 10-toleranten CBA/Ca-Mäusen oder normalen Kontrolltieren wurde am Tag 78 Blut aus der Schwanzvene entnommen.

Proliferation der peripheren Blutzellen wurde wie im Beispiel 2 bestimmt.

Die gegebenen Zahlen sind die logarithmischen Mittelwerte und Standardabweichungen von sechs Mäuse je Gruppe.

Claims

1. Produkte, welche einen nichterschöpfenden monoklonalen CD4-Antikörper und einen nichterschöpfenden monoklonalen CD 8-Antikörper als kombiniertes Präparat für die gleichzeitige, getrennte oder aufeinanderfolgende Anwendung zur Induzierung von Toleranz gegenüber einem Antigen enthalten.

2. Produktenach Anspruch 1, welche außerdem einen erschöpfenden monoklonalen CD 4-Antikörper und/oder einen erschöpfenden monoklonalen CD 8-Antikörper enthalten.

3. Nichterschöpfender monoklonaler CD 4-Antikörper zum Einsatz bei einer Behandlungsmethode des tierischen oder menschlichen Körpers durch Chirurgie oder Therapie.

4. Nichterschöpfender monoklonaler CD8-Antikörper zum Einsatz bei einer Behandlungsmethode des tierischen oder menschlichen Körpers durch Chirurgie oder Therapie.

5. Antikörper nach Anspruch 3 oder 4 zum Einsatz bei der Induzierung von Toleranz gegenüber einem Antigen.

6. Einsatz eines nichterschöpfenden monoklonalen CD4-Antikörpers bei der Herstellung eines Medikamentes zur Verwendung zur Induzierung von Toleranz gegenüber einem Antigen.

7. Einsatz eines nichterschöpfenden monoklonalen CD8-Antikörpers bei der Herstellung eines Medikamentes zur Verwendung zur Induzierung von Toleranz gegenüber einem Antigen.

8. Agens für den Einsatz bei der Induzierung von Toleranz gegenüber einem Antigen, wobei das Agens dadurch gekennzeichnet ist, daß es einen nichterschöpfenden monoklonalen CD4-Antikörper und einen nichterschöpfenden monoklonalen CD8-Antikörper umfaßt.

9. Agens nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß es außerdem einen erschöpfenden monoklonalen CD 4-Antikörper und/oder einen erschöpfenden monoklonalen CD 8-Antikörper umfaßt.

10. Paket, dadurch gekennzeichnet, daß es als getrennte Komponenten einen nichterschöpfenden monoklonalen CD 4-Antikörper und einen nichterschöpfenden monoklonalen CD8-Antikörper umfaßt.

11. Paket nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß es außerdem als getrennte Komponenten einen erschöpfenden monoklonalen CD4-Antikörper und/oder einen erschöpfenden monoklonalen CD8-Antikörper umfaßt.

12. Nichterschöpfende monoklonale CD4- und CD8-Antikörperzum gemeinsamen Einsatz in einer Behandlungsmethode des menschlichen oder tierischen Körpers durch Chirurgie oder Therapie.

13. Antikörper nach Anspruch 12 zum gemeinsamen Einsatz bei der Induzierung von Toleranz gegenüber einem Antigen.

14. Antikörper nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß sie außerdem einen erschöpfenden monoklonalen CD4-Antikörper und/oder einen erschöpfenden monoklonalen CD8-Antikörper enthalten.

15. Methodezurübertragung von Toleranzgegenüber einem Antigen auf ein Subjekt, welches diesem verabreicht werden soll, dadurch gekennzeichnet, daß dem Subjekt eine wirksame Menge eines nichterschöpfenden monoklonalen CD4-Antikörpers und eines nichterschöpfenden monoklonalen CD8-Antikörpers und des Antigens verabreicht wird.

16. Methode zur Übertragung von Toleranz gegenüber einem Antigen auf ein Subjekt, welches dieses Antigen bereits besitzt, dadurch gekennzeichnet, daß dem Subjekt eine wirksame Menge eines nichterschöpfenden monoklonalen CD4-Antikörpers und eines nichterschöpfenden monoklonalen CD8-Antikörpers verabreicht wird.

17. Methode nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, daß dem Subjekt außerdem eine wirksame Menge eines erschöpfenden monoklonalen CD4-Antikörpers und/oder eines erschöpfenden monoklonalen CD8-Antikörpers vor der Verabreichung der nichterschöpfenden monoklonalen CD4- und CD8-Antikörper verabreicht wird.

Hierzu 14 Seiten Zeichnungen

Die Erfindung betrifft die Toleranzinduktion unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern.

Monoklonale Antikörper (mAb) gegen dasMaus-CD4-Antigen (L3T4) haben sich als starke immunsupressive Mittel zur Bekämpfung von humoraler Immunität, Transplantatabstoßung und Autoimmunität erwiesen. Außerdem wurde gezeigt, daß CD4-mAb in vivo eine toleranzzulassende Umgebung schaffen, mit welcher Toleranz gegenüber bestimmten löslichen Proteinantigenen sowie Transplantationsantigenen erreicht werden kann. Der Mechanismus (die Mechanismen) aber, nach dem (denen) CD4-mAb diese Wirkungen hervorrufen, ist (sind) noch nicht klar. In den meisten früheren Berichten wurde die Immunsuppression unter Bedingungen erzielt, bei denen die Zielzellen in vivo erschöpft wurden. Die einfache Interpretation lautete, daß die so erreichte Immunsuppression auf das Fehlen von CD4-T-Zellen zurückzuführen sei.