DD297189A5 - Verfahren zur enzymatischen herstellung von 4-, 5- und 6- methylindolpyruvat und 5- und 6-fluorindolpyruvat - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur enzymatischen Herstellung von 4-, 5- und 6-Methylindolpyruvat und 5- und 6-Fluorindolpyruvat, Biochemikalien, die fuer Forschungen auf dem Gebiet des Tryptophanmetabolismus und des Stoffwechsels anderer Indolverbindungen verwendet werden koennen, aus den entsprechenden Tryptophanderivaten. Zur enzymatischen Herstellung der erfindungsgemaeszen Verbindungen wird ein aufbereiteter Enzymrohextrakt aus der Hefe Candida maltosa (ZIMET HI 28) mit Tryptophanaminotransferase als dem wirksamen Enzym eingesetzt. Die waehrend der enzymatischen Umsetzung der Tryptophanderivate mit 2-Oxoglutarat unter Verwendung von Pyridoxalphosphat als Coenzym gebildeten Indolpyruvatderivate werden durch Aufarbeitung mit verschiedenen Anreicherungs- und Reinigungsverfahren (Extraktion, Saeulenchromatografie, Umkristallisation) in reiner, kristalliner Form gewonnen.{4-, 5-, 6-Methylindolpyruvat; 5-, 6-Fluorindolpyruvat; Biochemikalien; Candida maltosa; Tryptophanaminotransferase; Isolierung; Reinigung}

Description

Preparation des Eniym· Zur Gewinnung des Enzyms Tryptophanamlnotransferaso wurde die Hefe Candida maltose (ZIMET HI28) in einem flüssigen Vollmedium mit 10g Glucose, 10g Pepton und 5g Hefeextrakt kultiviert. Nach 24 Stunden Wachstum bei 3O⁰C in Schüttelkolben

auf einer Schüttelmaschine wurden die Zellen aus der Kulturflüssigkeit durch Zentrifugatlon (15MIn.) boi 1000Ox g abgetrennt.

Für dio Enzympräparation wurden die geernteten Zellen aus 15 Kolben vereinigt und mit 10OmM Tris/HCI-Puffer (pH8,5)

gewaschen (suspendiert und ornout abzentrlfuglert) und nach Resuspension im gleichen Puffer 2mal mit der X-Presso aufgebrochen.

Alle weiteren Schritte zur Enzympräparation wurden bei 4⁰C durchgeführt. Das Homogenat wurde bei 20000 χ g 10 Minuten

zentrifugiert und der Überstand bis zu einer Konzentration von 1,8M (40% Sättigung) mit festem (NH₄I]SO₄ versotzt. Nach 30 Mimjton wurdo die Lösung 10 Minuten bei 16000 χ g zontrifigiert, und zum Überstand wurde erneut Ammoniumsulfat bis zu einer Gesamtkonzentration von 3,15 M (70% Sättigung) zugesetzt. Nach weiteren 30 Minuten wurde abzontrifigiert, und das erhaltene Sediment wurde i 110OmM Tris/HCI-Puffer, pH8,5, der 40% Volumenanteil Glycerol enthielt, aufgenommen. Dieser

Enzymrohextrakt konnte bei -20⁰C mehrere Monate ohne Aktivitätsverlust aufbewahrt werden.

Bestimmung der Protein-, u id der Tryptophanderlvatmenge sowie der Enzymaktlvltat Die Proteinbestimmung im Enzymrohextrakt erfolgte nach LOWRY et al. (J. Biol. Chem. 193,265-275,1951) mit Rinderserumalbumin als Standard. Die Konzentration der Tryptophanderivate in den Ansätzen wurde nach einer Methode von MESSINEO und MUSARRA (Int. J. Biochem. 3,700-704,1972) mit Abänderungen nach BODE et al. (Cell. Mol. Biol. 26,615-620, 1980) bestimmt.

Für aio Bestimmung der Tryptophenaminotransferaseaktivität enthielt das Reaktionsmedium 40μΜ des entsprechenden Tryptophandorivats, 80μΜ 2-Oxoglutarat, 0,1 μΜ Pyridoxalphospat, 100M Tris-HCI-Puffer (pH8,1) und die notwendige Menge Enzymextrakt (2,5mg/ml Protein) in einem Endvolumen von 1 ml. Hie Aktivitätsbestimmung erfolgte durch Messen der gebildeten Indolpyruvatderivate (GORDON, S.A., PALEG, L.G.: Physiol. Plantarum 10,39-47,1957). Zu diesem Zweck wurden dem Reaktionsmedium nach 2 Stunden Inkubation bei 37⁰C 1,5ml Salkowski-Reagenz (1 ml 0,5M FeCI₁ + 50ml Perchlorsäure, 35% Volumenanteil) zugesetzt. Proben mit einem zu hohen Gehalt an Indolpyruvatderivaten (mehr als 30OnMoI) mußten vor Zugabe des Reagenz entsprechend verdünnt werden. Die Messung erfolgte nach 30 Minuten bei 530 nm.

Enzymatlsche Herstellung und Isolierung des 4-, 5- und β-Methyllndolpyruvats und des 5· und 6-Fluorlndolpyruvats Für die enzymatische Herstellung der Derivate des Indolpyruvats wurde ein Reaktionsansatz vor. 100ml Gesamtvolumen verwendet, der entsprechend dem beschriebenen Standardreaktionsmedium zur Bestimmung der Enzymaktivität zusammengesetzt war (4OmM der DL-Verbindung des entsprechenden Tryptophanderivats, 8OmM 2-Oxoglutarat, 0,1 mM Pyridoxalphosphat, 10OmM Tris-HCI-Puffer, pH8,1,2,5mg/ml Protoin). Nach 2stündiger Inkubation bei 37⁰C wurde das Reaktionsmedium mit konz. HCI auf pH 2 angesäuert und danach 20 Minuten bei 16000 χ g zentrifugiert. Der Überstand wurde 2mal mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten Ethylacetat-Extrakte wurden bei 3O⁰C eingeengt und der verbleibende Rückstand in 10ml Ethanol (in diesem und in allen weiteren Schritten wurden Ethanol mit 50% Volumenanteil verwendet) aufgenommen. Diese Ethanol-Lösung wurde auf eine Säule (2x 10cm) von DEAE-Sephadex A-25 (Acetat-Form) gegeben. Nach Waschen der Säule mit 30ml Ethanol wurde mit 200ml eines Gradienten (0-0,5M) Essigsäure in Ethanol eluiert. Es wurden Fraktionen von 6,6ml gesammelt. Die Fraktionen, die das gebildete Derivat des Indolpyruvats enthielten, wurden vereinigt und bei 3O⁰C eingeengt. Der Rückstand wurde in Ethanol aufgenommen, ernout eingeengt, und dieser Schritt wurde ein weiteres Mal wiederholt. Nach Resuspension des verbleibenden Rückstandes in Ethanol und langsamer Evaporation der Ethanol-Lösung bildeten sich bräunliche Kristalle des entsprechenden Methyl- oder Fluorderivats des Indolpyruvats. Die jeweils erhaltene Ausbeute ist in Tabelle 1 wiedergegeben.

Tabelle 1 Ausbeute bei der enzymatischem Umsetzung von Methyl- und Fluortryptophan m den entsprechenden Derivaten des Indolpyruvats Eingesetzte Verbindung Ausbeute in % Massenanteil DL-4-Methyltryptophan 16 DL-5-Methyltryptophan 31 DL-6-Methyltryptophan 23 DL-5-Fluortryptophan 11 DL-6-Fluortryptophan 20

Claims (2)

1. Verfahren zur Herstellung von 4-, 5- und 6-Methyllndolpyruvat und 5- und 6-Fluorindolpyruvat, dadurch gekennzeichnet, daß diese Biochemikalien mittels enzymatischer Umsetzung von 4-, 5- und 6-Methyltryptophan und 5- und 6-Fluortryptophan mit
2. 2-Oxoglutarat unter Verwendung von Pyridoxalphosphat als Coenzym und der Tryptophanaminotransferase aus Candida maltose (ZIMET HI28) hergestellt und durch Extraktion, Säulenchromatographie und mehrfache Umkristallisation in reiner, kristalliner Form gewonnen werden.

   Hierzu 1 Seite Zeichnungen

   Anwendungsgebiet dor Erfindung

   Methyl- und Fluorderivate des Indolpyruvdts sind Biochemikalien, die neben Indolpyruvat In wissenschaftlichen Einrichtungen für Forschungsuntersuchungen zum Stoffwechsel der essentiellen Aminosäure Tryptophan und Ihrer Analoga und von diesen abgeleiteter wichtiger Verbindungen (Alkaloide, Phytohormone) eingesetzt worden.

   Charakteristik des bekannten Standes der Technik

   Methyl· und Fluorderivate des Indolpyruvats sind Biochemikalien, die neben Indolpyruvat für wichtige Laboruntersuchungen zum Stoffwechsel der Aminosäure Tryptophan und anderer bedeutsamer Indolverbindungen sowie ihror entsprechenden Analoga genutzt werden können.

   Durch ihre Verwendung zusätzlich zum Indolpyruvat können sterisch bedingte Wechselwirkungen zwischen Enzym und Substrat besser untersucht werden. Publikationen oder Patente, in denen die Herstellung dieser Biochemikalien beschrieben wird, sind nicht bekannt. In Biochemikalienkatalogen werden sie nicht angeboten.

   Ziel der Erfindung

   Es ist das Ziel der Erfindung, ein einfaches enzymatlsches Verfahren zur Herstellung von Methyl- und Fluorderivaten des Indolpyruvats zu entwickeln, um diese Biochemikalien für analytische Untersuchungen zum Stoffwechsel der biotechnologicch bedeutsamen Aminosäure Tryptophan und ihrer entsprechenden Analoga sowie für von dieser Aminosäure abgeleitete Vorbindungen zu gewinnen.

   Darlegung des Wesens der Erfindung

   Aufgabe der Erfindung ist es, ein geeignetes enzymatisches Herstellungsverfahren zu entwickeln, um Methyl- und Fluorderivate des Indolpyruvats aus einfachen Ausgangsstoffen in wenigen Schritten zu produzieren. Erfindungsgemäß wird die Aufgabe gelöst, indem dafür als Enzym die Tryptophanaminotransferase aus der Hefe Candida maltosa (ZIMET Hl 28) eingesetzt wi'd, die 4-, 5- und 6-Methyltryptophan und 5- und 6-Fluortryptophan in einem geeigneten Reaktionsmedium zu den entsprechenden Derivaten des Indolpyruvats umzusetzen vermag. Das erfindungsgemäße Verfahren beruht darauf, daß mit einem aufbereiteten Enzymrohextrakt unter Zusatz von 2-Oxoglutarat und Pyridoxalphosphat in einem gepufferten, flüssigen Medium aus den 4-, 5- und 6-Methyl- und den 5- und G-Fluorderivaten des Tryptophane die entsprechenden Derivate des Indolpyruvats gebildet und danach isoliert, gereinigt und kristallin gewonnen werden.

   Ausführungsbeispiel

   Die Erfindung ist dargelegt in den Figuren 1-2.

   Fig. 1: Zeitlicher Verlauf der enzymatischen Conversion von A- (G), 5- (O) und 6-Methyltryptophan ( ) und 5- (Δ) und 6-Fluortryptophan (▲) zu den entsprechenden Methyl- und Fluorderivaten des Indolpyruvats.

   Fig. 2: Chromatographie von 4- (O), 5- (·) und 6-Methylindolpyruvat ( ) und 5- (Δ) und 6-Fluorindolpyruvat (A) auf einer Säule (2x 10cm) von DEAE-Sephadex X-25 (Acetat-Form).

   Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von 4-, 5- und 6-Methylindolpyruvat und 5- und 6-Fluorindolpyruvat beruht darauf, daß die entsprechenden Tryptophanderivate in einem gepufferten Medium mit 2-Oxaglutarat sls Aniinogruppenacccptor und Pyridoxalphosphat als Coenzym enzymatisch umgesetzt und die gebildeten Methyl- und Fluorderivate des Indolpyruvats aus dem Medium isoliert, gereinigt und in kristalliner Form gewonnen werden. In unserem Beispiel wird als Enzym die Tryptophanaminotransferase der Hefe Candida maltosa (ZIMET Hl 28⁽ in Form eines aufbereiteten Rohextraktes für die katalytische Umsetzung verwendet.