DD297190A5

DD297190A5 - Verfahren zur enzymatischen herstellung von indolpyruvat

Info

Publication number: DD297190A5
Application number: DD34325490A
Authority: DD
Inventors: Ruediger Bode; Dieter Birnbaum
Original assignee: Ernst-Moritz-Arndt-Universitaet Greifswald,De
Priority date: 1990-08-06
Filing date: 1990-08-06
Publication date: 1992-01-02

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur enzymatischen Herstellung von Indolpyruvat, einer Biochemikalie, die fuer Forschungen auf dem Gebiet des Tryptophanstoffwechsels und des Metabolismus anderer Indolverbindungen verwendet werden kann. Zur enzymatischen Herstellung der erfindungsgemaeszen Verbindung wird ein aufbereiteter Enzymrohextrakt aus der Hefe Candida maltosa (ZIMET HI 28) mit Tryptophanaminotransferase als dem wirksamen Enzym eingesetzt. Das waehrend der enzymatischen Umsetzung von Tryptophan mit 2-Oxoglutarat als Aminogruppenacceptor und Pyridoxalphosphat als Coenzym gebildete Indolpyruvat wird durch Aufarbeitung mit verschiedenen Anreicherungs- und Reinigungsverfahren (Extraktion; Saeulenchromatographie; Umkristallisation) in reiner, kristalliner Form gewonnen.{Indolpyruvat; Biochemikalie; Candida maltosa (ZIMET HI 28); Tryptphanaminotransferase; Isolierung; Umkristallisation}

Description

Preparation de» Enzym» Zur Gewinnung des Enzyms Ti yptophanamlnotransferase wurde die Hofe Candida maltosa (ZIMET Hl 28) in einem flüssigen Vollmedium mit 10g Glucose, 10g Pepton und 5g Hefeextrakt kultiviert. Nach 24 Stunden Wachstum bei 30⁰C in Schüttelkolben

auf einer Schüttelmaschine wurden die Zellen aur.der Kulturflüssigkeit durch Zentrifugation(15Min.) bei 10000 χ gabgetrennt.

Für die Enzympräparation wurden die geernteten Zellen aus 16 Kolben vereinigt und mit 1 Oj inM Tris/HCI-Puffor (pH 8,5)

gewaschen (suspendiert und erneut abzentrlfuglert) und nach Resuspenslon Im gleichen Puffer mittels einer X-Presse 2mal aufgebrochen.

Alle weiteren Schritte zur Enzympräparation wurden bei 4⁰C durchgeführt. Das Homogenat wurde bei 20000 χ g 10 Minuten

zentrifugiert und der Überstand bis zu einer Konzentration von 1,8M (40% Sättigung) mit festem (NHJ₂SO₄ versetzt. Nach 30 Minuten wurde die Lösung 10 Minuten bei 16000 χ g zentrifugiert, und zum Überstand wurde erneut Ammoniumsulfat bis zu einer Gesamtkonzentration von 3,15 M (70% Sättigung) zugesetzt.

Nach weiteren 30 Minuten wurde abzentrifigiert und das erhaltene Sediment wurde in 10OmM Tris/HCI-Puffer, pH 8,5, der 40% Volumenanteil Glycerol enthielt, aufgenommen. Dieser Enzymrohextrakt konnte bei -2O⁰C mehrere Monate ohne Aktivitätsverlust aufbewahrt werden. Protein·, Tryptophan· und Enzymaktivitatsbestlmmung

Die Proteinbestimmung im Enzymrohextrakt erfolgte nach LOWRY et al. (J. Biol. Chem. 193,265-275,1951) mit Rinderserumalbumin als Standard. Die Tryptophankonzentration in den Ansätzen wurde nach einer Methode von MESSINEO und MUSARRA (Int. J. Biochem. 3,700-704,1972) mit Abänderungen nach BODE et al. (Cell. Mol. Biol. 26,615-620,1980) bestimmt.

Das Standardreaktion&medium zur Bestimmung der Tryptophanaminotransferase-Aktivität enthielt nach entsprechenden Vorversuchen40MMolL-Tryptophan,80pMol2-Oxoglutarat,0,iMMolPyridoxalphospat, 100MolTris-HCI-Puffer(pH8,1)unddie notwendige Menge Enzymextrakt (2,5mg/ml Protein) in einem Endvolumen von 1 ml. Die Aktivitätsbestimmung erfolgte durch Messer, des gebildeten Indolpyruvats (GORDON, S.A., PALEG, L.G.: Physiol. Plantarum 10,3&-47,1957). Zu diesem Zweck wurden dem Reaktionsmedium nach 2 Stunden Inkubation bei 37⁰C 1,5ml Salkowski-Reagenz (1 ml 0,5M FeCI₃ + 50ml Perchlorsäure, 35% Volumenanteil) zugesetzt. Proben mit einem zu hohen Gehalt an Indolpyruvat (mehr als 30OnMoI) mußten vor Zugabe des Reagenz entsprechend verdünnt werden. Die Messung erfolgte nach 30 Minuten bei 530 nm.

Enzymatlsche Herstellung und Isolierung des Indolpyruvats

Für die enzymatische Herstellung des Indolpyruvats wurde ein Reaktionsansatz von 100 ml Gesamtvolumen verwendet, der entsprechend dem beschriebenen Standardreaktionsmedium zur Bestimmung der Enzymaktivität zusammengesetzt war (4OmM L-Typrophan, 8OmM 2-Oxoglutarat, 0,1 mM Pyridoxalphosphat, 10OmM Tris-HCI-Puffer, pH8,1,2,5mg/ml Protein). Nach 2stündiger Inkubation bei 37⁰C wurde das Reaktionsmedium mit konz. HCI auf pH 2 angesäuert und danach 20 Minuten bei 16000 χ g zentrifugiert. Der Überstand wurde 2mal mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten Ethylacetat-Extrakte wurden bei 30⁰C eingeengt und der verbleibende Rückstand in 10ml Ethanol ,in diesem und in allen weiteren Schritten wurden Ethanol mit 50% Volumenanteil verwendet) aufgenommen. Diese Ethanol-Lösung wurde auf eine Säule (2x 10cm) von DEAE-Sephadex A-25 (Acetat-Form) gegeben. Nach Waschen der Säule mit 30ml Ethanol wurde mit 200 ml eines Gradienten (0-0,5 M) Essigsäure in Ethanol eluiert. Es wurden Fraktionen von 6,6ml gesammelt. Die r-idktionen, die Indolpyruvat enthielten, wurden vereinigt, und bei 3O⁰C eingeengt. Der Rückstand wurde in Ethanol aufgenommen, erneut eingeengt, und dieser Schritt wurde ein weiteres Mal wiederholt. Nach Resuspenslon des verbleibenden Rückstandes in Ethanol und langsamer Evaporation der Ethanol-Lösung bildeten sich bräunliche Kristalle. Es wurden 590mg Indolpyruvat erhalten, was einer Ausbeute von 72% (Masseanteil) entspricht.

Claims

Verfahren zur aromatischen Herstellung von Indolpyruvat, dadurch gekennzeichnet, daß L-Tryptophan mit
2-Oxoglutarat als Aminogruppenacceptor unter Verwendung von Pyridoxalphosphat als Coenzym und derTryptophanaminotransferase aus Candida maltose (ZIMET Hl 28) in einem gepufferten Reaktionsmedium umgesetzt und das gebildete Indolpyruvat durch Extraktion, Säulenchromatographie und mehrfache Umkristallisation in reiner, kristalliner Form gewonnen wird.

Hierzu 4 Seiten Zeichnungen

Anwendungsgebiet der Erfindung

Indolpyruvat Ist eine Biochemikalie, die In wissenschaftlichen Einrichtungen für Forschungsuntersuchungen zum Stoffwechsel der essentiellen Aminosäure Tryptophan und von dieser abgeleiteter wichtiger Verbindungen (Alkaloide, Phytohormone) eingesetzt wird.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Indolpyruvat Ist ein-, Biochemikalie, die für wichtige l.aboruntersuchungen zum Stoffwechsel der Aminosäure Tryptophan und ande^rer bedeutsamer Indolverbindungen oft benötigt wird. Diese Biochemikalie wird bisher nur durch aufwendige chemische Synthese aus schwer zugänglichen Ausgangsstoffen hergestellt (SHAW, K. N. F., MC MILLAN, A., GUDMUNDSON, A. G., ARMSTRONG. M. D.: J. Organ. Chem. 23,1171-1178,1953; BENTLEY, J. A., FARRAR, K. R., KONSLEY, S., SMITH, G. F., TAYLOR, W. C: Biochem. J.64,44-49,1956). Patente, die sich auf die Herstellung von Indolpyruvat beziehen, wurden nicht gefunden. Die Biochemikalienfirma Fluka, die in ihrem Katalog 1990/91 Indolpyruvat anbietet, verweist indirekt auf die oben genannten Herstellungsmöglichkeiten (Beil 22, III/IV, 1128)

Ziel der Erfindung

Es ist das Ziel der Erfindung, ein einfaches enzymatisches Verfahren zur Herstellung von Indolpyruvat zu entwickeln, um diese Biochemikalie für analytische Untersuchungen zum Stoffwechsel der biotechnologisch bedeutsamen Aminosäure Tryptophan und für von dieser Aminosäure abgeleitete Verbindungen zu gewinnen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Aufgabe der Erfindung ist es, ein geeignetes enzymatisches Herstellungsverfahren zu entwickeln, um Indolpyruvat aus einfachen Ausgangsstoffen in wenigen Schritten zu produzieren. Erfindungsgemäß wird die Aufgabe gelöst, indem dafür als Enzym die Tryptophanaminotransferase aus der Hefe Candida maltose (ZIMET Hl 28) eingesetzt wird, die L-Tryptophan in einem geeigneten Reaktionsmedium zu Indolpyruvat umzusetzen vermag. Das erfindungsgemäße Verfahren beruht darauf, daß mit einem aufbereiteten Enzymrohextrakt unter Zusatz von 2-Oxoglutarat und Pyrisoxalphosphat in einem gepufferten, flüssigem Medium aus L-Tryptophan Indolpyruvat gebildet und danach isoliert, gereinigt und kristallin gewonnen wird.

Ausführungsbeispiel

Dio Erfindung ist dargelegt in den Figuren 1-4.

Fig. 1: Zeitlicher Verlauf der enzymatischen Conversion (·) von L-Tryptophan (O) zu Indolpyruvat durch die Aminotransferase

vonCandia maltosa.
Fig. 2: Conversion (·) von L-Tryptophan zu Indolpyruvat (O) durch die Aminotransferase von Candida maltosa in Abhängigkeit

von der Konzentration des 2-Oxoglutarats; Konzentration von L-Tryptophan: 8OmM; Pyridoxalphospat: 0,1 mM. Fig.
3: Conversion (·) von L-Tryptophan zu Indolpyruvat (O) durch die Aminotransferase von C. maltosa in Abhängigkeit von

der L-Tryptophan-Konzentration; Konzentration von 2-Oxoglutarat: 8OmM; Pyridoxalphosphat: 0,1 mM. Fig.
4: Chromatographie von Indolpyruvat auf einer Säule (2x 10cm) von DEAE-Sephadex A-25 (Acetat-Form).

Das erfindungsgemäßo Verfahren zur Herstellung von Indolpyruvat beruht darauf, daß L-Tryptophan in einem gepufferten Medium mit 2-Oxoglutarat als Aminogruppenacceptor und Pyridoxalphosphat als Coenzym enzymatisch umgesetzt und das gebildete Indolpyruvat aus dem Medium isoliert, gereinigt und in kristalliner Form gewonnen wird. In unserem Beispiel wird als Enzym die Tryptophanaminotransferase der Hefe Candida maltosa (ZIMET Hl 28) in Form eines aufbereiteten Rohextraktes für die katalytische Umsetzung verwendet.