DD297417A5

DD297417A5 - Interzellulares adhaesionsmolekuel-2 und seine bindungsliganden

Info

Publication number: DD297417A5
Application number: DD33851790A
Authority: DD
Inventors: Timothy Alan Springer; Michael Loran Dustin; Donald E Staunton
Original assignee: Center For Blood Research,Us
Priority date: 1989-03-09
Filing date: 1990-03-08
Publication date: 1992-01-09
Also published as: PT93394A; PT93394B; ZA901835B; RU1809837C

Abstract

Die Erfindung betrifft das interzellulare Adhaesionsmolekuel-2 * das in den Vorgang einbezogen ist, durch die Lymphozyten Entzuendungsherde zu erkennen und zu diesen zu wandern, sowie sich waehrend der Entzuendung an zellulare Substrate anzuheften. Die Erfindung betrifft derartige Molekuele, Siebanalysen fuer den Nachweis derartiger Molekuele und Antikoerper, die in der Lage sind, solche Molekuele zu binden. Die Erfindung schlieszt ebenfalls Anwendung fuer Adhaesionsmolekuele und fuer die Antikoerper, die diese binden koennen, ein.{interzellulare Adhaesionsmolekuele-2; Anti ICAM-2-Antikoerper; Entzuendung; rekombinates DNA; pharmazeutisches Praeparat}

Description

Text zu Abbildungen

Figuri: cell number-Zellanzahl

relative fluorescence intensity-relative Fluoreszenzstärke

% bound - % gebunden

control-Kontrolle

Figur 4: Anordnung von ICAM-2 und Amino-terminalen Domänen von ICAM-1

Hierzu 4 Seiten Zeichnungen

Hintergrund der Erfindung

Die Erfindung betrifft das interzelluläre Adhäsionsmolekül-2 („ICAM-2"), das an dem Prozeß beteiligt ist, vermittels dessen Lymphozytenpopulationen Zellsubstrate erkennen und sich an sie anheften, so daß sie an Entzündungsorte wandern und während entzündlicher Reaktionen mit Zellen in Wechselwirkung treten können. Die Erfindung betrifft darüber hinaus Ligandenmoleküle, die in der Lage sind, sich an die interzellulären Adhäsionsmoleküle ICAM-2 zu binden, sowie Anwendungsgebiet des interzellulären Adhäsionsmoleküls und der Ligandenmoleküle.

Beschreibung des Wesens der Erfindung

Leukozyten müssen in der Lage sein, sich an Zellsubstrate anzuheften, damit sie die Wirtszelle gegen fremde Eindringlinge, z. B. Bakterien oder Viren, angemessen verteidigen können. Eisen, H. W., (in „Microbiology", 3. Aufig., Harper & Row, Philadelphia, PA [1980], S. 290-295 und 381-418) gibt eine ausgezeichnete Übersicht über das Abwehrsystem. Sie müssen sich an Endothelzellen anheften können, damit sie im Blutkreislauf an den Ort einer Entzündung gelangen können. Außerdem müssen sie sich an Antigen enthaltende Zellen anheften, damit eine normale spezifische Immunantwort entstehen kann, und schließlich müssen sie sich an geeignete Zielzellen anheften, damit die virusinfizierten oder Tumorzellen aufgelöst werden können. Vor kurzem wurden Leukozytenoberflächenmoleküle, die an der Vermittlung derartiger Anheftungsvorgänge beteiligt sind, mit Hilfe der Hybridomtechnik identifiziert. Zusammengefaßt kann festgestellt werden, daß monoklonal Antikörper gegen menschliche T-Zellen (Davignon, D., u.a., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 78,4535-4539 [1981)) und Milzzellen der Maus (Springer, T., u.a. Eur. J. Immunol. 9,301-306 [1979]) identifiziert wurden, die sich an Leukozytenoberflächen banden und die beschriebenen mit der Anheftung in Zusammenhang stehenden Funktionen hemmten (Springer, T., u. a., Fed. Proc. 44,2660-2663 [1985]). Die von diesen Antikörpern identifizierten Moleküle wurden als Mac-1 und Lymphozytenfunktionsassoziiertes Antigen-1 (LFA-1) bezeichnet. Bei Mac-1 handelt es sich um ein Heterodimer, das auf Makrophagen, Granulozyten und großen granulären Lymphozyten vorkommt. LFA-1 ist ein Heterodimer, das auf den meisten Lymphozyten vorkommt (Springer, T., u.a. Immunol. Rev. 68,111-115 [1982]). Diese beiden Molekülesowie ein drittes Molekül, ρ 150,95 (dessen Verteilung im Gewebe der von Mac-1 ähnelt), spielen bei der zellulären Adhäsion eine Rolle (Keizer, G., u.a., Eur. J. Immunol. 15,1142-1147 [1985]). Es wurde festgestellt, daß die beschriebenen Leukozytenmoleküle zu einer Familie von Glycoproteinen gehören (Sanchez-Madrid, F., u.a., J. Exper. Med. 158,1785-1803 [1983]; Keizer, G.D., u.a. Euro. J. Immunol. 15,1142-1147 [1985]), die als die CD-18-Glycoproteinfamilie bezeichnet werden. Diese Glycoproteinfamilie besteht aus Heterodimeren, die eine alpha-Kette und eine beta-Kette aufweisen. Obwohl bei den einzelnen Antigenen die alpha-Kette unterschiedlich war, wurde festgestellt, daß die beta-Kette weitgehend beibehalten wurde (Sanchez-Madrid, F., u. a., J. Exper. Med. 158,1785-1803 [1983]). Die beta-Kette der Glycoproteinfamilie (die gelegentlich als „CD-18" bezeichnet wird) hat eine relative Molekülmasse von 95kd, während ermittelt wurde, daß die relative Molekülmasse der alpha-Ketten sich im Bereich von 150kd bis 180kd bewegt (Springer, T., u. a.. Fed. Proc. 44,2660-2663 [1985]). Obwohl die alpha-Untereinheiten der Membranproteine keine so weitreichende Homologie aufweisen wie die beta-Untereinheiten, ergab eine genaue Analyse der alpha-Untereinheiten der Glycoproteine, daß bei ihnen beträchtliche Ähnlichkeiten bestehen. Sanchez-Madrid, F. u.a. (J. Exper. Med., 158,586-602 [1983]); J. Exper. Med. 1785-1803 [1983]) geben einen Überblick über die Ähnlichkeit der alpha- und beta-Untereinheiten der mit LFA-1 verwandten Glycoproteine. Ef wurde eine Gruppe von Personen identifiziert, die nicht in der Lage sind, normale Mengen eines beliebigen Angehörigen dieser Familie von Adhäsionsproteinen auf der Zelloberfläche ihrer Leukozyten zu exprimieren (Anderson, D.C., u.a., Fed. Proc. 44,2671-2677 [1985); Anderson, D. C, u. a., J. Infect. Dis. 152,668-689 [1985]). Lymphozyten dieser Patienten wiesen bei In-vitro-Untersuchungen Defekte auf, die den bei normalen Probanden, deren CD-18-Molekülfamilie durch Antikörper antagonisiert

worden war, beobachteten Defekten ähnelten. Außerdem waren diese Personen wegen der Unfähigkeit ihrer Zellen, sich an Zellsubstrate anzuheften, zu einer normalen Immunantwort nicht in der Lage (Anderson, D.C., u. a., Fed. Proc. 44,2671-2677 [1985]; Anderson, D.C₁ u.a. J. Infect. Dis. 152,668-689 [1985]). Diese Angaben zeigen, daß Immunreaktionen abgeschwächt werden, wenn Lymphozyten aufgrund des Fehlens funktionaler Adhäsionsmoleküle der CD-18-Familie nicht in der Lage sind, sich normal anzuheften.

Zusammenfassend kann also festgestellt werden, daß die Fähigkeit von Leukozyten, ein Tier gesund und lebensfähig zu erhalten, es erfordert, daß sie in der Lage sind, sich an andere Zellen, (z. B. Endothelzellen) anzuheften. Es wurde festgestellt, daß dieses Anheften Kontakte zwischen den Zellen erfordert, an denen spezifische Rezeptormoleküle beteiligt sind. Diese Rezeptoren versetzen einen Leukozyten in die Lage, sich an anderen Leukozyten oder an Endothel- oder anderen nichtvaskulären Zelten anzuheften. Es wurde beobachtet, daß die Rezeptormoleküle der Zelloberfläche eng miteinander verwandt sind. Menschen, bei deren Leukozyten diese Zelloberfläche-Rezeptormoleküle fehlen, leiden unter chronischen und rezidivierenden Infektionen sowie unter anderen klinischen Symptomen, z. B. gestörten Antikörperreaktionen.

Da die Leukozytenadhäsion an dem Prozeß beteiligt ist, durch den Fremdgewebe identifiziert und abgestoßen wird, ist das Verständnis dieses Prozesses auf den Gebieten der Organ- und Gewebetransplantation, der Allergie und Onkologie von hohem Wert.

Zusammenfassung der Erfindung Die Erfindung betrifft das interzelluläre Adhäsionsmolekül-2 (ICAM-2) sowie seine funktionalen Derivate. Die Erfindung betrifft

ebenfalls Antikörper und Antikörperfragmente, die in der Lage sind, die Funktion von ICAM-2 zu hemmen, sowie andere

Inhibitoren der Funktion von ICAM-2. Die Erfindung schließt darüber hinaus die diagnostische und therapeutische Anwendung

aller beschriebenen Moleküle ein.

Im einzelnen umfaßt die Erfindung das interzelluläre Adhäsionsmolekül ICAM-2 oder ein funktionales Derivat dieses Moleküls,

das im wesentlichen frei von natürlichen Kontaminanten ist.

Die Erfindung betrifft außerdem ICAM-2, das mindestens ein Polypeptid aus der Gruppe enthält, die umfaßt:

(a) -S-S-F-G-Y-R-T-L-T-V-A-L-;

(b) -D-E-K-V-F-E-V-H-V-R-P-K-;

(c) -G-S-L-E-V-N-C-S-T-T-C-N-;

(d) -H-Y-L-V-S-N-I-S-H-T-D-V-;

(e) -S-M-N-S-N-V-S-V-Y-Q-P-P-;

(f) -F-T-I-E-C-R-V-P-T-V-E-P-;

(g) -G-N-E-T-L-H-Y-E-T-F-G-K-; (h) -T-A-T-F-N-S-T-A-D-R-E-D-; (I) -H-R-N-F-S-C-L-A-V-L-D-L-; (j) -M-V-H-V-T-V-V-S-V-L-L-;

(k) -S-L-F-V-T-S-V-L-L-C-F-I-; und (I) -M-G-T-Y-G-V-R-A-A-W-R-R-.

Die Erfindung betrifft ebenfalls ein rekombiniertes oder synthetisches DNA-Molekül, das in der Lage ist, ICAM-2 oder eines seiner

funktionalen Derivate zu codieren oder zu expr'mieren.

Außerdem betrifft die Erfindung einen Antikörper und speziell einen monoklonalen Antikörper, der in der Lage ist, sich an ein Molekül zu binden, das aus der ICAM-2 und ein funktionales Derivat von ICAM-2 umfassenden Gruppe ausgewählt wurde. Die Erfindung betrifft ebenfalls eine Hybridomzelle, die in der Lage ist, den monoklonalen Antikörper zu produzieren. Die Erfindung beinhaltet eine Methode zur Herstellung einer gewünschten Hybridomzelle, die einen Antikörper produziert, der in

der Lage ist, sich an ICAM-2 oder sein funktionales Derivat zu binden, die folgende Schritte umfaßt:

(a) Immunisierung eines Tieres mit einem Immunogen, das aus der Gruppe ausgewählt wurde, die umfaßt: eine ICAM-2 exprimierende Zelle, eine Membran einer ICAM-2 exprimierenden Zelle, ICAM-2, an einen Träger gebundenes ICAM-2, ein Peptidfragment von ICAM-2 und ein Peptidfragment von ICAM-2, das an einen Träger gebunden ist;

(b) Verschmelzung der Milzzellen des Tieres mit einer Myelomzellinie;

(c) Bildung von Antikörper absondernden Hybridomzellen durch die verschmolzenen Milz- und Myelomzellen und

(d) Screening der Hybridomzellen nach der gewünschten Hybridomzelle, die in der Lage ist, einen Antikörper zu produzieren, der sich an ICAM-2 bindet.

Die Erfindung umfaßt ebenfalls eine Methode zur Behandlung von Entzündungen, die sich aus der Reaktion des spezifischen Abwehrsystems eines Säugetierprobanden ergeben, die die Verabreichung einer zur Unterdrückung der Entzündung ausreichenden Menge eines entzündungshemmenden Agens an einen eine derartige Behandlung benötigenden Probanden umfaßt, wobei das entzündungshemmende Agens aus der Gruppe ausgewählt wird, die umfaßt: einen Antikörper, dar in der Lage ist, sich an ICAM-2 zu binden; ein Fragment eines Antikörpers, wobei das Fragment in der Lage ist, sich an ICAM-2 zu binden; ICAM-2; ein funktionales Derivat von ICAM-2; einen Nir.ht-Immunglobulinantagonisten von ICAM-2, der nicht ICAM-1 oder ein Angehöriger der CD-18-Molekülfamilie ist.

Die Erfindung umfaßt ebenfalls eine Methode zur Unterdrückung der Metastasenbildung einer Tumorzeile im blutbildenden System, wobei die Zelle für die Migration über einen Angehörigen der CD-18-Familie (insbesondere LFA-1) verfügt; nanh dieser Methode wird einem eine derartige Behandlung benötigenden Patienten eine zur Unterdrückung der Metastasenbildung ausreichende Menge eines Agens verabreicht; wobei das Agens aus dor Gruppe ausgewählt wird, die umfaßt: einen Antikörper, der in der Lage ist, sich an ICAM-2 zu binden; einen Toxin-derivatisierten Antikörper, der in der Lage ist, sich an ICAM-2 zu

binden; ein Fragment eines Antikörpers, wobei das Fragment in der Lage ist, sich an ICAM-2 zu binden; ein Toxin-derivatisiertes Fragment eines Antikörpers, wobei das Fragment in der Lage ist, sich an ICAM-2 zu binden; ICAM-2; ein funktionales Derivat von ICAM-2; und einen Nicht-Immunglobulinantagonlsten von ICAM-2, der nicht ICAM-1 oder ein Angehöriger der CD-18-Molekülfamilie ist.

Die Erfindung schließt ebenfalls eine Methode zur Unterdrückung des Wachstums einer ICAM-2 exprimierenden Tumorzelle ein, die die Verabreichung einer zur Unterdrückung des Wachstums ausreichenden Menge eines Agens an einen eine derartige Behandlung benötigenden Patienten umfaßt, wobei das Agens aus der Gruppe ausgewählt wird, die umfaßt: einen Antikörper, der in der Lage ist, sich an ICAM-? zu binden; einen Toxin-derivatisierten Antikörper, der in der Lage ist, sich an ICAM-2 zu binden; ein Fragment eines Antikörpers, wobei das Fragment in der Lage ist, sich an ICAM-2 zu binden; ein Toxin-derivatisiertes Fragment eines Antikörpers, wobei das Fragment in der Lage ist, sich an ICAM-2 zu binden; ICAM-2; ein funktionales Derivat von ICAM-2; einen Nicht-Immunglobulinantagonisten von ICAM-2, der nicht ICAM-1 oder ein Angehöriger der CD-18-Molekülfamilie ist; ein Toxin-derivatisierter Angehöriger der CD-18-Molekülfamilie; und ein Toxin-derivatisiertes funktionales Derivateines Angehörigen der CD-18-Molekülfamilie.

Die Erfindung betrifft ebenfalls eine Methode zum Nachweis des Vorhandenseins einer ICAM-2 exprimierenden Zelle, wobei die Methode umfaßt:

(a) Inkubation der Zelle oder eines Extraktes der Zelle in Anwesenheit eines Nuoleinsäuremoleküls, wobei das NucleinsSuremolekül sich zur Hybridisierung zu ICAM-2 mRNA eignet;

(b) Feststellung, ob das Nucleinsäuremolekül zu einem komplementären in der Zelle oder im Extrakt der Zelle enthaltenen Nucleinsäuremolekül hybridisiert wurde.

Die Erfindung betrifft ebenfalls eine pharmazeutische Zusammensetzung, die umfaßt:

(a) ein entzündungshemmendes Agens, das aus der Gruppe ausgewählt wird, die einen Antikörper, der in der Lage ist, sich an ICAM-2 zu binden; ein Fragment eines Antikörpers, wobei das Fragment in der Lage ist, sich an ICAM-2 zu binden; ICAM-2; ein funktionales Derivat von ICAM-2 und einen Nicnt-Immunglobulinantagonisten, der nicht ICAM-1 oder ein Angehöriger der CD-18-Molekülfamilie ist, entweder allein oder in Kombination mit (b) einem immunsuppressiven Agens umfaßt.

Kurze Beschreibung der Figuren

Figur 1 zeigt die Bindung transfizierter, ICAM-1 und ICAM-2 exprimierender COS-Zellen an Plastmaterial mit LFA-1-Überzug. A) mit ICAM-1 cDNAtransfiziertes COS-Zellen wurden auf mit LFA-1 beschichteten Platten abgetastet (panned), und die Expression von ICAM-1 wurde durch indirekte Immunfluoreszenz-Flow-Cytometrie mit dem Anti-ICAM-1 monoklonalen Antikörper RR1/1 als primärem MAb analysiert. Nicht abgetastete Zellen (gepunktete Linie), nicht haftende Zellen (gestrichelte Linie), haftende Zellen (durchgehende Linie). B) mit ⁶¹Cr markierte transfizierte COS-Zellen, die ICAM-1 oder ICAM-2 exprimieren, wurden in Anwesenheit von MAb an mit LFA-1 beschichtetes Plastmaterial gebunden.

Figur 2 zeigt die Nucleotid- und Aminosäuresequenz von ICAM-2. Die Aminosäuresequenz ist numeriert, wobei beim ersten Rest nach der vorhergesagten Spaltstelle des Signalpeptids begonnen wird. Das hydrophobe Signalpeptid und die Transmembransequenzen (TM) sind unterstrichen. Potentielle N-verknüpfte Glycosylierungsorte sind eingerahmt. Das vermutliche Polyadenylierungssignal AATACA !st oben mit einem Strich gekennzeichnet. Beide Stränge der ICAM-2 cDNA wurden innerhalb von CDM8 mittels sequentieller Synthese der komplementären Oligonucleotid-Primer sowie der Terminationssequenzierung der Dideoxynucleotidkette (Sanger, F., u.a., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74,5463-5467 [1977]) entsprechend den Empfehlungen des Herstellers (Sequenase, U.S. Biochemical) sequenziert.

Figur 3 zeigt die Ergebnisse der Analysen der RNA- und DNA-Hybridisierung. Northern (Aund B) und Southern (C) Blots wurden zu 1,1 kb ³²P markierter ICAM-2 cDNA (A und C) hybridisiert und zu 3 kb ³²P markierter ICAM-1 cDNA rehybridisiert (B). (Aund B) 6 Mg PoIy(A)⁺ RNA von der Burkitt-Lymphom-Zellinie, Ramos (Spur 1), Endothelzellen (Spur 2), Endothelzellen, die 3 Stunden lang mit LPS stimuliert worden waren (Spur 3), eine EBV-immobilisierte B-Lymphoblastoid-Zellinie, BBN (Spur 4), Epithelzellkarzinom-Zeilinie, HeLa (Spur 5), T-Lymphom-Zellinie, Jurkat (Spur 6) und SKW-3 (Spur 7) sowie eine Promonozyten-Zellinie, U 937 (Spur 8). (C) 6\ig genomische DNA von den B-Zellinien BL-2 (Spuren 1 und 4), ER-LCL (Spuren 2 und 5) und Raji (Spuren 3 und 6) wurden mit EcoRI (Spuren 1-3) oder Hindill (Spuren 4-6) aufgeschlossen. ICAM-2 und ICSM-mKNAs sind mit Pfeilen bezeichnet.

Figur 4 zeigt die Verwandtschaft zwischen ICAM-2 und ICAM-1. Die gesamte 201 Reste umfassende extrazelluläre Sequenz von ICAM-2 wurde mit Hilfe des ALIGN-Programms (Dayhoff, M. 0., u.a., Methods Enzymol. 91,524-545 [1983]) sowie durch Inspektion den Resten 1-185 von ICAM-1 so zugeordnet, daß sich maximale Übereinstimmung ergab. Die ICAM-2-Reste sind numeriert. Übereinstimmende Teile sind eingerahmt. D1 und D2 bezeichnen die Grenze der Ig-ähnlichen Domäne von ICAM-2 und ICAM-1. Vorhersagen für den ß-Strang (Chou, P.Y., u.a.. Biochemistry 13,211-245 (1974) von ICAM-2 sind oben mit einem Strich versehen, während diejenigen von ICAM-1 unterstrichen sind.

Beschreibung der bevorzugten Anwendungsbeispiele

Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Entdeckung eines natürlichen Liganden für die Bindung an LFA-1. Moleküle, wie z. B. zur CD-18-Familie gehörende Moleküle, die am Prozeß der Zelladhäsion beteiligt sind, werden als „Adhäsionsmoleküle" bezeichnet.

I. LFA-1 und ICAM-1

Das Leukozytenadhäsionsmolekül LFA-1 vermittelt bei Immunität und Entzündung eine Vielzahl von Wechselwirkungen zwischen Lymphozyten, Monozyten, natürlichen Killerzellen und Granulozyten einerseits und anderen Zellen andererseits (Springer, T. A., u.a., Ann. Rev. Immunol. 5,223-252 (1987)).

LFA-1 ist ein Rezeptor für das interzelluläre Adha>ionsmolekül-1 (ICAM-1). Es handelt sich dabei um ein Oberflächenmolekül, das auf einigen Gaweben konstitutiv exprimiert und auf anderen bei einer Entzündung induziert wird (Marlin, S.D. u. a., Cell 51, 813-819 [19871; Dustin, M.L. u.a., J. Immunol. 137,245-254 [1986]; Dustin, M.L u.a., Immunol.Today 9,213-21511988]; US Patent-Anmeldung Seriennr. 07/019,440, registriert am 26. Februar 1987 und US Pa'.ant-Anmeldung Seriennr. 07/250,446, registriert am 28. September 1988, wobei beide Anmeldungen zu Vergleichszwecken hierin aufgenommen wurden). LFA-1 funktioniert sowohl in Antigen-spezifischen als auch Antigen-unabhängigen Wechselwirkungen zwischen für T-Zellentoxischen, T-Helfer- sowie natürlichen Killerzellen, Granulozyten und Monozyten und anderen Zelltypen (Springer, T. A. u.a., Ann. Rev. Immunol. 5,223-253 [1987]; Kishimoto, T.K. u.a., Adv. Immunol. [1988, im Druck]). LFA-1 ist ein Leukozyten-Integrin mit nichtkovalent assoziierten α und β Glycoprotein-Untereinheiten von 180 und 95kD.

ICAM-1 ist ein einkettiges Glycoprotein, dessen Masse je nach Zelltyp zwischen 76-114kD schwankt. Es gehört zur Ig-Großfamilie mit fünf C-ähnlichen Domänen (Dustin, M.L. u.a., Immunol. Today 9,213-215 (1988); Staunton, D. E. u. a.. Cell 52,925-933 [1988]; Simmons, D. u.a.. Nature 331,624-627 [1988]). ICAM-1 ist mit Cytokinen, wio z.B. IFN-γ, TNF und IL-I, auf einer Vielzahl von Zelltypen in hohem Maße induzierbar (Dustin, M. L. u. a., Immunol. Today 9,213-215 [1988]). Die Induktion von ICAM-1 auf Epithelzellen, Endothelzellen und Fibroblasten vermittelt die LFA-1-abhängige Adhäsion von Lymphozyten (Dustin, M. L. u.a., J. Immunol. 137,245-254(1986]; Dustin,M.L.u.a.,J.Cell. Biol. 107,321-331 [1988]; Dustin,M.L.u.a.,J.Exp.Med. 167,1323-1340 [1988]). Die Adhäsion wird durch die Vorbehandlung der Lymphozyten mit LFA-1 MAb oder die Vorbehandlung der anderen Zelle mit ICAM-1 MAb blockiert (Dustin, M. L u. a., J. Immunol. 137,245-254 [1986); Dustin, M. L. u.a., J. Cell Biol. 107,321-331 [1988]; Dustin, M. L. u. a., J. Exp. Med. 167,1323-1340 [1988]). Identische Ergebnisse mit gereinigtem ICAM-1 in künstlichen Membranen oder in Petrischalen zeigen, daß LFA-1 und ICAM-1 für einander als Rezeptor funktionieren (Marlin, S. D. u. a„ Cell 51,813-819 [1987]; Makgoba, M.W. u.a., Nature 331,86-88 [1988]). Aus Gründen der Klarheit werden sie hier als „Rezeptor" bzw. „Ligand" bezeichnet. Weitere Beschreibungen von ICAM-1 finden sich in den US-Patent-Anmeldungen mit den Seriennr. 07/045,963; 07/115,798; 07/155,943; 07/189,815 oder 07/250,446. Alle Anmeldungen in ihrer Gesamtheit wurden hierin zu Vergleichszwecken aufgenommen.

II. ICAM-2

Ein zweiter, von ICAM-1 verschiedener LFA-1-Llgand wurde postuliert (Rothlein, R. u.a., J. Immunol. 137,1270-1274(1986); Makgoba, M.W. u.a., Eur. J. Immunol. 18,637-640 [1988]; Dustin, M.L. u. a., J. Cell Biol. 107,321-331 [1988]). Die vorliegende Erfindung betrifft diesen zweiten Liganden, der als ICAM-2 (Kurzbezeichnung für „Interzelluläres Adhäsionsmciekül-2") bezeichnet wurde. ICAM-2 unterscheidet sich von ICAM-1 hinsichtlich der Verteilung in der Zelle und des Fehlens der Cytokinlnduktion. ICAM-2 ist ein integrales Membranprotein mit 2 Ig-ähnlichen Domänen, während ICAM-1 5 Ig-ähnliche Domänen aufweist (Staunton, D.E., u.a., Cell 52,925-933); Simmons, D. u.a., Nature 331,624-627 [1988]). Bemerkenswert ist die enge Verwandtschaft zwischen ICAM-2 und zwei der am meisten N-terminalen Domänen von ICAM-1 (34%ige Identität), die enger ist als zwischen ICAM-1 oder ICAM-2 und anderen Angehörigen der Ig-Großfamilie. Diese Tatsache weist auf eine Unterfamilei von Ig-ähnlichen Liganden hin, die an den gleichen zur Integrinfamilie gehörenden Rezeptor binden.

III. cDNA-Klonierung von ICAM-2

Jedes einer ganzen Reihe von Verfahren kann zur Klonierung des ICAM-2-Gens genutzt werden. Eine Methode umfaßt die Untersuchung einer Shuttle-Vektor-Bank von cDNA-lnserts (die von einer ICAM-2 exprimierenden Zelle stammen) auf Anwesenheit eines Inserts, das das ICAM-2-Gen enthält. Eine solche Analyse kann durchgeführt werden, indem Zellen mit dem Vektor transf iziert und danach auf die Expression von ICAM-2 untersucht werden.

Vorzugsweise wird ICAM-2-cDNA mittels einer neuartigen Modifizierung des Verfahrens von Aruffo und Seed (Seed, B. u.a., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84,3365-3369 [1987]) zur Identifizierung der Liganden von Adhäsionsmolekülen identifiziert. Bei dieser Methode wird eine cDNA-Bank aus ICAM-2 exprimierenden Zellen erstellt (z. B. Zellinien von Endothelzellen oder Ramos, BBN B-Lymphoblastoiden, U937-Monozyten oder SKW3-Lymphoblastoiden). Die cDNA-Bank wird vorzugsweise aus Endothelzellen hergestellt. Diese Bank wird genutzt, um Zellen, die ICAM-2 normalerweise nicht exprimieren (z. B. COS-Zellen) zu transfizieren. Die transfizierten Zellen werden in eine Petrischale gegeben, die zuvor mit einem LFA-Überzug versehen wurde. COS-Zellen, die entweder mit den Codierungssequenzen von ICAM-1 oder ICAM-2 transfiziert wurden und die einen dieser Liganden auf ihren Zelloberflächen exprimieren, werden sich auf der Oberfläche der Petrischale an LFA-1 anlagern. Nichtangelagerte Zellen werden abgewaschen, und die angelagerten Zellen werden dann aus der Petrischale herausgenommen und gezüchtet. Die rekombinierte ICAM-1 oder ICAM-2 exprimierende Sequenz dieser Zellen wird danach entnommen und sequentiell, um zu bestimmen, ob sie ICAM-1 oder ICAM-2 codiert.

In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der beschriebenen Methode wird ein Anti-ICAM-1-Antikörper in die Petrischale gegeben, um das Anhaften von Zellen zu verhindern, die ICAM-1 exprimieren. Die Bindung von mit ICAM-2 transfizierten COS-Zellen an LFA-1 wird durch EDTA und einen Anti-LFA-1 monoklonalen Antikörper (MAb), jedoch nicht durch einen Anti-LFA-1 monoklonalen Antikörper inhibiert. Folglich sind in diesem Ausführungsbeispiel die ICAM-1 exprimierenden Zellen nicht in der Lage, sich mittels ICAM-1 an die Petrischale anzuheften, und der größte Teil von ihnen wird aus diesem Grunde zusammen mit allen anderen nichthaftenden Zellen abgewaschen.

Im Ergebnis dessen sind nur ICAM-2 exprimierende Zellen in der Lage, an der Petrischale £u haften. Auf diese Weise werden cDNA-Klone auf ihre Expression in COS-Zellen sowie durch Abtasten (panning) auf mit Liganden versehene COS-Zellen unter Verwendung von funktionell aktivem, gereinigtem LFA-1, das zuvor an Petrischalen aus Plastmaterial gebunden worden war, geprüft. Nach dem Abtasten weisen die nichthaftenden Zellen keine ICAM-2⁺-ZelIen auf, während die haftenden Zellen, die mittels EDTA von der mit LFA-1 beschichteten Plastschale gelöst werden, fast ausschließlich ICAM-2⁺ sind. Das Haften von ICAM-⁺-Zellon an den mit LFA-1 beschichteten Plastträgern kann mit RR1/1 Anti-ICAM-MAb inhibiert werden.

Folglich wird entsprechend dieser Methode zur Klonierung von cDNA für ICAM-2 eine cDNA-Bank aus Endothelzellen erstellt, die sowohl die ICAM-1-abhöngigen als auch die ICAM-1 -unabhängigen Komponenten der LFA-1-abhängigen Adhäsion aufweisen (Dustin, M.L. u. a., J. Cell. Biol. 107,321-331 (1988)), wobei ein geeignetes Plasrnid, z.B. der Plasmidvektor CDM8, verwendet wird, Transfizierte COS-Zellen werden in LFA-1 -beschichteten Petrischalen in Anwesenheit von Anti-ICA M-1 MAb inkubiert, um die Wahrscheinlichkeit zu verringern, daß ICAM-1 cDNAs isoliert werden. Haftende Zellen werden mit EDTA eluiert, und die Plasmide werden isoliert und in E. coil amplifiziert. Nach etwa drei jeweils Transfektion, Adhäsion und Plasmidisolierung umfassenden Zyklen und einer Größenfraktionierung können die Plasmide durch Aufschluß mit Restriktionsendonuclease analysiert werden. Etwa Va der Plasmide, die Inserts von über 1 ,Okb aufwiesen, zeigten nach dem Einbau in COS-Zellen mittels Transfektion Adhäsion an LFA-1.

Als Alternative kann ein cDNA-Klon von ICAM-2 unter Verwendung des genetischen Codes (Watson, J. D., in: „Molecular Biology of the Gene", 3. Aufig., W.A.Benjamin, Inc. Menlo Park, CA [1977], S.356-357) gewonnen werden, um die Sequenz eines Polynucleotide zu bestimmen, das In der Lage ist, das ICAM-2-Protein zu codieren.

Ein Klon der ICAM-2 cDNA kann ebenfalls gewonnen werden, indem man die Aminosäuresequenzen der Peptidfragmente des iCAM-2-PfOtoins identifiziert und danach den genetischen Code verwendet, um Oligonucleotid-Sondenmoleküle zu konstruieren, die in der Lage sind, das ICAM-2-Peptid zu codieren. Die Sonden werden dann verwendet, um (mittels Hybridisierung) diejenigen Teile einer cDNA-Bank (die ausgehend von der cDNA von ICAM-2 exprimierenden Zellen hergestellt wurde) nachzuweisen, die das ICAM-2-Protein codieren.

Solche oder den beschriebenen ähnelnde Techniken ermöglichten es, Gene für Human-Aldehyddehydrogenasen (Hsu, L. C. u. a., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82,3771-3775 [1985)), Fibronectin (Suzuki, S. u.a., Eur. Mol. Biol. Organ. J. 4,2519-2524 [19851), das Human-Östrogenrezeptoren (Walter, P. u.a., Proc. NtI. Acad. Sei. USA 82,7889-7893 [1985]), den Plasminogen-Aktivator vom Gewebetyp (Pennica, D. u.a., Nature 301,214-221 [1983]) und die komplementäre DNA der alkalischen Phosphatase, die beim Menschen bei Erreichen des Goburtstermins in der Plazenta entsteht (human term placental alkaline phe sphatase complementary DNA) (Kam, W. u.a., Proc. Natl. Acad. Sei. USA82,8715-8719 [1985]) zu klonieren. Bei einer weiteren alternativen Methode der Klonierung des ICAM-2-Gens wird eine Bank von Expressionsvektoren durch Klonierung von DNA oder besser cDNA, aus einer Zelle, die in der Lage ist, ICAM-2 in einem Expressionsvektor zu exprimieren, angelegt. Die Bank wird danach auf Mitglieder geprüft, die in der Lage sind, ein Protein zu exprimieren, das sich an den Anti-ICAM-2-Antikörper bindet und eine Nucleotidsequenz aufweist, die in der Lage ist Polypeptide zu codieren, die die gleiche Aminosäuresequenz wie ICAM-2 oder Fragmente von ICAM-2 aufweisen.

Das Monierte ICAM-2-Gen, das durch Verwendung einer der beschi iebenen Methoden gewonnen wurde, kann durch Operation mit einem Expressionsvektor verbunden und in Bakterien oder eukaryotische Zellen eingebaut werden, um ICAM-2 zu produzieren. Methoden für derartige Manipulationen werden von Maniatis, T. u.a., a.o.a.O. offenbart und sind Fachleuten gut bekannt.

IV. Die Agenzien der vorliegenden Erfindung: ICAM-2 und seine funktionalen Derivate, Agonisten und Antagonisten Die Erfindung betrifft ICAM-2, seine „funktionalen Derivate" und seine „Agonisten" und „Antagonisten".

A. Funktionale Derivate von ICAM-2

Ein „funktionales Derivat" von ICAM-2 ist eine Verbindung, die eine biologische Aktivität (funktional oder strukturell) aufweist, die im wesentlichen einer biologischen Aktivität von ICAM-2 ähnelt. Der Terminus „funktionale Derivate" schließt die „Fragmente", „Varianten", „Analoga" oder „chemischen Derivate" eines Moleküls ein.

Ein „Fragment" eines Moleküls wie z. B. ICAM-2 bezeichnet jede beliebige Polypeptidstruktureinheit des Moleküls. Fragmente von ICAM-2, die eine !CAM-2-Aktivität aufweisen und löslich (d.h. nicht membrangebunden) sind, werden besonders bevorzugt.

Eine „Variante" eines Moleküls wie z. B. ICAM-2 bezeichnet ein Molekül, das bezüglich der Struktur und Funktion entweder dem gesamten Molekül oder einem Fragment davon im wesentlichen ähnelt.

Ein „Analogem" eines Moleküls wie z.B. ICAM-2 bezeichnet ein Molekül, dessen Funktion dem gesamten Molekül oder einem Fragment davon im wesentlichen ähnelt.

Ein Molokül „ähnelt im wesentlichen" einem anderen Molekül, wenn beide Moleküle im wesentlichen ähnliche Strukturen oder eine ähnliche biologische Aktivität aufweisen. Vorausgesetzt, zwei Moleküle besitzen eine ähnliche Aktivität, so werden sie als Varianten betrachtet, da dieser Terminus hierin sogar dann verwendet wird, wenn die Struktur eines der Moleküle nicht im anderen wiederkehrt bzw. wenn die Sequenz der Aminosäurereste nicht identisch ist.

Entsprechend der Verwendung in dieser Anmeldung wird ein Molekül als ein „chemisches Derivat" eines anderen Moleküls bezeichnet, wenn es zusätzliche chemische Anteile enthält, die normalerweise nicht Bestandteil des Moleküls sind. Solche Anteile können die Löslichkeit, Absorption, die biologische Halbwertzeit usw. des Moleküls verbessern. Die Anteile können entweder die Toxizität des Moleküls verringern, eine unerwünschte Nebenwirkung des Moleküls beseitigen oder vermindern usw. Anteile, die in der Lage sind, darartige Wirkungen zu vermitteln, werden in „Remington's Pharmaceutical Sciences" (1980) beschrieben.

„Toxin-derivatisierte" Moleküle stellen eine Sonderklasse der „Chemischen Derivate" dar. Ein „Toxin-derivatisiertes" Molekül ist ein Molekül (wie z.B. ICAM-2 oder ein Antikörper), das einen Toxinanteil enthält. Die Bindung eines solchen Moleküls an die Zelle bringt den Toxinanteil in engen Kontakt mit der Zelle und fördert dadurch den Tod der Zelle. Jeder geeignete Toxinanteil kann genutzt werden, vorzugsweise werden jedoch Toxine an sich, z. B. das Ricintoxin, das ,holeratoxin, das Diphtherietoxin, radioisotopische Toxins, Membran-Kanal-bildende Toxine usw., verwendet. Verfahren zur Kopplung derartiger Anteile an ein Molekül sind Fachleuten gut bekannt.

Funktionale Derivate von ICAM-2, die bis zu etwa 100 Reste aufweisen, können bequem durch In-vitro-Synthese hergestellt werden. Wenn es gewünscht wird, können derartige Fragmente durch Umsetzung gezielter Aminosäurereste des gereinigten oder Rohproteins mit einem organischen Derivatisierungsmittel modifiziert werden, das in der Lage ist, mit ausgewählten Seitenketten oder endständigen Resten zu reagieren. Die so erhaltenen kovalenten Derivate können zur Identifizierung von Resten verwendet werden, die für die biologische Aktivität von Bedeutung sind.

Cystelnylreste werden gewöhnlich mit α-Halogenacetaten (und entsprechenden Aminen), ζ.B. Chloressigsäure oder Chloracetamid, umgesetzt, um Carboxy methyl- oder Carboxyamidomothylderivate zu erhalten. Cysteinylreste werden ebenfalls

durch Umsetzung mit Bromtrifluoraceton, a-Brom-ß-(6-imidozoyl)propionsäure, Chloracetylphosphat, N-Alkylmaleimiden,3-Nitro-2-pyridy!disulfid, Methyl-2-pyridyldisulfid, p-Chlormercuribenzoat, 2-Chlormercuri-4-nitrophenol oder Chlor-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol derivatisiert.

Histidylreste werden durch Umsetzung mit Diethylprocarbonat bei einem pH-Wert von 5,5-7,0 derivatisiert, weil dieses Mittel

auf die Histidylseitenkette relativ spezifisch wirkt. Para-bromphenacylbromid ist ebenfalls nützlich; die Umsetzung wirdvorzugsweise in 0,1 M Natriumcacodylat bei pH 6,0 vorgenommen.

Endständige Lysinyl- und Aminoreste werden mit Succin- oder Carbonsäureanhydriden umgesetzt. Die Derivatisiorung mit

diesen Agenzien bewirkt die Umkehrung der Ladung der Lysinylreste. Andere geeignete Agenzien zur Derivatisierung vona-Amino-enthaltenden Resten schließen Imidoester, wie z.B. Methylpicolinimidat; Pyridoxalphosphat, Pyridoxal;

Chlorborhydrid; Trinitrobenzensulfonsäure; O-Menthyl-isoharnstoff; 2,4-Pentandion und die Transaminase-katalysierte Umsetzung mit Glyoxylat ein. Arginylreste werden durch Umsetzung mit einem oder mehreren konventionellen Reagenzien, u. a. Phenylglyoxal; 2,3- Butandion; 1,2-Cyclohexandion und Ninhydrin, modifiziert. Die Derivatisierung von Argininresten macht wegen des hohen pK,

der funktionalen Guanidingruppe die Umsetzung unter alkalischen Bedingungen erforderlich. Außerdem können diese

Reagenzien mit den Lysingruppen sowie mit der Epsiolon-Aminogruppe des Arginins reagieren. Die spezifische Modifikation der Tyrosylreste an sich wurde ausführlich untersucht, wobei dem Einbau ν jktralmarkern in Tyrosylreste durch Umsetzung mit aromatischen Diazoniumverbindungen oder Tetranitromethan base .. β Aufmerksamkeit

geschenkt wurde. Am häufigsten werden N-Acetylimidizol und Tetranitromethan zur Bildung von O-Acetyltyrosylarten bzw.3-Nitroderivaten verwendet. Tyrosylreste werden zur Herstellung markierter Proteine für den Einsatz in Radioimmunoassay-

Verfahren mit ¹²⁵I oder ¹³¹I iodiert, wobei die Chloramin-T-Methode besonders geeignet ist. Carboxylseitengruppen (Aspartyl oder Glutamyl) werden durch Umsetzung mit Carbodiimiden (R'-N-C-N-FO, z.B.

1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinyl-(4-ethyl)carbodiimid oder 1-Ethyl-3 (4 azonia 4,4-dimethylpentyl)carbodiimid, selektivmodifiziert. Darüber hinaus werden Aspartyl- und Glutamylreste durch Umsetzung mit Ammoniumionen zu Asparaginyl- und

Glutaminylresten umgewandelt. Die Derivatisierung mit bifunktionalen Agenzien ist für die Quervernetzung eines funktionalen Derivat-Moleküls von ICAM-2 an

eine wasserunlösliche Trägermatrix oder -Oberfläche nützlich, die in der Methode zum Spalten eines Fusionspolypeptids einesfunktionalen Derivats von ICAM-2 verwendet wird, um das gespaltene Polypeptid freizusetzen und rückzugewinnen. Zu denhäufig verwendeten Quervernetzungsagenzien zählen z.B. 1,1-bis(Diazoacetyl)-2-phenylethan, Glutaraldehyd,

N-Hydroxysuccinimidester, z.B. Ester mit 4-Azldosalicylsäure, homobifunktionale Imidoester, einschließlich der Disuccinimidester, wie z. B. S^'-Dithiobislsuccinimidylpropionat), und bifunktionale Maleimide, z. B. Bis-N-maleimido-1,8-octan. Derivatisierende Agenzien, z.B. Methyl-3-[(p-azidophenyl)dithio]-propioimidat ergeben photoaktivierbare Zwischenprodukte,

die in der Lage sind, in Anwesenheit von Licht Quervernetzungen zu bilden. Als Alternative werden reaktionsfreudigewasserunlösliche Matrizen, wie z.B. Cyanogenbromid-aktivierte Kohlenwasserstoffe und die in den US Patenten Nr.3,969,287;3,691,016; 4,195,128; 4,247,642; 4,229,537 und 4,330,440 beschriebenen reaktionsfreudigen Substrate zur

Proteinimmobilisierung verwendet. Glutaminyl- und Asparaginylreste werden häufig zu den entsprechenden Glutamyl- und Aspartyl resten desamidiert. Als Alternative werden diese Reste unter schwach sauren Bedingungen desamidiert. Jede der beiden Formen dieser Reste ist im Geltungsbereich der Erfindung eingeschlossen. Weitere Modifizierungen schließen die Hydroxylierung von Prolin und Lysin, die Phosphorylierung der Hydroxylgruppen von Seryl-oderTheonylresten, die Methylierung dera-Aminogruppen von Lysin-, Arginin-und Histidin-Seitenketten (T.E.Creighlon,

„Proteins: Structure and Molecule Properties", W.H.Freeman & Co., San Francisco, S.79-86 [1983]), die Acetylierung des

N-terminalen Amins und in einigen Fällen die Amidierung der C-terminalen Carboxylgruppen ein. Funktionale Derivate von ICAM-2 mit veränderten Aminosäuresequenzen können ebenfalls durch Mutationen in der DNA

hergestellt werden. Die Nucleotidsequenz, die das ICAM-2-Gen codiert, wird in Figur 2 gezeigt. Solche Varianten schliefen z.B.

Deletionen von Resten innerhalb der in Figur 2 gezeigten Aminosäuresequenz bzw. Insertionen oder Substitutionen ein. Jede Kombination von Deletion, Insertion und Substitution kann ebenfalls vorgenommen werden, um das endgültige Konstrukt zu

erhalten, vorausgesetzt, dieses besitzt die gewünschte Aktivität. Es versteht sich von selbst, daß die in der die Variantecodierende DNA vorgenommenen Mutationen die Sequenz nicht aus dem Leseraster drängen und vorzugsweise keinekomplementären Regionen schaffen dürfen, die eine sekundäre mRNA-Struktur ergeben könnten (vgl. Veröffentlichung der EP

Patentanmeldung Nr.75444). Auf der genetischen Ebene werden diese funktionalen Derivate normalerweise durch ortsgerichtete Mutagenese von Nucleotiden in der das ICAM-2 codierenden DNA, wodurch die das funktionale Derivat codierende DNA produziert wird, und

durch nachfolgende Expresston der DNA in der Rokombina'.ionszellkultur gewonnen. Die funktionalen Derivate weisennormalerweise die gleiche qualitative biologische Aktivität wie das natürlich auftretende Analogen auf. Hinsichtlich der

Eigenschaften des auf normale Weise produzierten ICAM-2-Moleküls können sie sich jedoch beträchtlich von diesem

unterscheiden.

Obwohl der Ort für den Einbau einer Aminosäuresequenzvariation vorherbestimmt ist, braucht das bei der Mutation als solcher

nicht der Fall zu sein. So kann z. B. zur Optimierung der Leistung einer Mutation an einem bestimmten Ort eine Zufallsmutageneseam Zielcodon oder der Zielregion vorgenommen werden, und die exprimierten funktionalen Derivate von ICAM-2 können aufdie optimale Kombination der gewünschten Aktivität geprüft werden. Methoden für Substitutionsmutationen anvorherbestimmten Orten in der DNA mit einer bekannten Sequenz sind gut bekannt, wie z. B. die ortsspezifische Mutagenese.

Ci Präparation eines Moleküls eines funktionalen Derivats von ICAM-2 gemäß der Erfindung wird vorzugsweise durch ortsspezifische Mutagenese der DNA durchgeführt, die e'n früher hergestelltes funktionales Derivat oder eine nicht als Variante geltende Version des Proteins codiert. Ortsspezifische Mutagenese gestattet die Produktion von funktionalen Derivaten von ICAM-2 durch Verwendung spezifischer Ollgonucleotidsequenzen, die die DNA-Sequenz der gewünschten Mutation sowie eine genügende Anzahl benachbarter Nucleotide codieren, um eine Primersequenz ausreichender Größe und Sequenzkomplexität zur Bildung einer stabilen Doppelstrang-DNA auf beiden Seiten der zu überbrückenden Deletionsstelle zu liefern. Normalerweise wird ein Primer von etwa 20 bis 25 Nucleotiden Länge mit etwa 6 bis 10 Resten auf beiden Seiten der zu verändernden Sequenzstelle verwendet. Im allgemeinen ist die Methode der ortsspezifischen Mutagenese im Fachgebiet gut bekannt, wofür Publikationen wie Adelman u. a., DNA 2,183 {1983), ein Beispiel sind, deren Offenbarung hierin zu Vergleichszwecken eingeschlossen ist.

Wie ersichtlich ist, bedient sich die ortsspezifische Mutagenesemethode normalerweise eines Phagenvektors, der sowohl in einzelsträngiger wie auch doppelstränglger Form vorkommt. Zu typischen Vektoren, die bei der ort6gerichteten Mutagenese nützlich sind, zählen Vektoren, wie z. B. der M13 Phage, der von Messing u. a., „Third Cleveland Symposium on Macromolecules and Recombinant DNA", Editor A.Walton, Elsevier, Amsterdam (1981), beschrieben wurde, dessen Offenbarung hierin zu Vergleichszwecken eingeschlossen ist. Dieser Phage kann problemlos käuflich erworben werden, und seine Verwendung ist Fachleuten im allgemeinen bekannt. Als Alternative können Plasmidvektoren, die einen Replikationsausgangspunkt in Form eines einzelsträngigen Phagen enthalten (Veira u.a., Moth. Enzymol. 153,3 [1987]) zur Gewinnung von einzelsträngiger DNA verwendet werden.

Im allgemeinen wird ortsgerichtete Mutagenese gemäß der Erfindung vorgenommen, Indem man zuerst einen einzelsträngigen Vektor gewinnt, der Innerhalb seiner Sequenz eine das entsprechende Protein codierende DNA-Sequenz enthält. Ein die gewünschte mutierte Sequenz tragender Oligonucleotidprimer wird präpariert, was im allgemeinen synthetisch nach der Methode von Crea u. a., Proc. Natl. Acad. Sei (USA) 75,5765 (1978) geschieht. Dieser Primer wird dann mit dem einzelsträngigen, die Proteinsequenz enthaltenden Vektor verklebt und DNA polymerislerenden Enzymen ausgesetzt, wie z. B. dem Polymerase-I Klenow-Fragment von E. coil, um die Synthese des die Mutation tragenden Stranges abzuschließen. Auf diese Welse erhält man eine mutierte Sequenz, und der zweite Strang trägt die gewünschte Mutation. Dieser Heteroduplexvektor wird dann zur Transformation geeigneterZellen, wie z. B. der JM101 Zeilen, genutzt, und es werden Klone selektiert, die die mutierte Sequenz tragende rekombinierte Vektoren enthalten.

Nach der Selektion eines derartigen Klons kann die mutierte Proteinregion entnommon und in einen für die Proteinproduktion geeigneten Vektor eingesetzt werden. Im allgemeinen handelt es sich dabei um einen Expressionsvektor eines Typs, der zur Transformation einer geeigneten Wirtszelle genutzt werden kann.

Aminosäuresequenzdeletionen betragen im allgemeinen von etwa 1 bis 30 Reste, vorzugsweise 1 bis 10 Reste und grenzen normalerweise aneinander. Deletionen können auch eine Immunglobulindomäne, wie z.B. die Domänen 1 oder 2 von ICAM-2, umfassen.

Aminosäuresequenzinsertionen schließen Amino- und/oder Carboxyl-terminale Fusionen von einem Rest bis zu Polypeptiden unbegrenzter Länge ein, sowie auch Insertionen eines oder mehrerer Aminosäurereste innerhalb einer Sequenz. Intrasequenzinsertionen (d.h. Insertionen innerhalb der vollständigen Sequenz des ICAM-2-Moleküls) können im allgemeinen von etwa 1 bis 10 Reste, vorzugsweise 1 bis 5 Reste, betragen. Ein Beispiel für eine terminale Insertion schließt eine Fusion einer Signalsequenz, wobei es gleichgültig ist, ob sie der Wirtzelle heterolog oder homolog ist, mit dem N-Terminus des Moleküls ein, um die Absonderung des funktionalen Derivats von ICAM-2 durch die rekombinierten Wirtszellen zu erleichtern. Bei der dritten Gruppe funktionaler Derivate handelt es sich um diejenigen, bei denen mindestens ein Aminosäurerest im ICAM-2-Molekül - und vorzugsweise nur eins - entfernt und ein anderer Rest an seiner Stelle eingefügt wurde. Derartige Substitutionen werden vorzugsweise entsprechend der folgenden Tabelle vorgenommen, wenn die Feinabstimmung der Merkmale des ICAM-2-Moleküls gewünscht wird.

Tabelle 1

Onginalrest	Typische Substitutionen
AIa	gly; ser
Arg	lys
Asn	gin;his
Asp	glu
Cys	ser
GIn	asn
GIu	asp
GIy	ala;pro
His	asn;gin
Ue	leu;val
Leu	ile;val
Lys	arg; gin; glu
Met	leu;tyr;ile
Phe	met; leu; tyr
Ser	thr
Thr	ser
Trp	tyr
Tyr	trp; phe
VaI	ile; leu

Wesentliche Veränderungen der funktionalen oder im-nunologischen Identität werden dadurch vorgenommen, daß Substitutionen ausgewählc werden, die umfangreicher sind als die in Tabelle 1 ausgewiesenen, d. h. indem Reste ausgewählt werden, deren Wirkung auf die Beibehaltung (a) der Struktur des Polypeptidskellets im Substitutionsgebiet zum Beispiel als Schicht oder Helixkonformatlon, (b) der Ladung oder Hydrophobizität des Moleküls am Zielort oder (c) der Masse der Seitenkette unterschiedlicher ist. Bei den im allgemeinen erwarteten Substitutionen handelt es sich um diejenigen, in denen (a) Glycin und/oder Prolin durch eine andere Aminosäure substituiert, deletiert oder eingefügt wird; (b) ein hydrophiler Rest, z.B. Seryl oder Threonyl, für (oder durch) einen hydrophoben Rest, z. B. Leucyl, Isoleucyl, Phenylalanyl, VaIyI oder Alanyl substituiert wird; (c) ein Cystainrest für (oder durch) einen anderen Rest substituiert wird; (d) ein Rest mit einer elektropositiven Seitenkette, z. B. Lysyl, Arginyl oder Histidyl für (oder durch) einen Rest mit elektronegativer Ladung, z.B. Glutamyl oder Aspartyl, substituiert wird; oder (e) ein Rest mit einer voluminösen Seitenkette, z.B. Phenylalanin, für (oder durch) einen Rest substituiert wird, der keine derartige Seitenkette hat, wie z.B. Glycin.

Es wird nicht erwartet, daß die Mehrzahl der Deletionen und Insertionen und inabusondere der Substitutionen tiefgreifende Veränderungen der Merkmale des ICAM-2-Moleküls bewirkt. Wenn es jedoch schwierig ist, die exakte Wirkung der Substitution, Deletion oder Insertion im voraus zu bestimmen, werden Fachleute es gewiß zu schätzen wissen, daß die Wirkung durch routinemäßige Screening-Tests bestimmt wird. So wird ein funktionales Derivat normalerweise durch ortsspezifische Mutagenese der das native ICAM-2-Molekül codierenden Nucleinsäure, Expression der veränderten Nucleinsäure in einer Rekombinations-Zellkultur und-wahlweise-Reinigung von der Zellkultur z. B. durch Immunaffinitätsadsorption an einer Säule, die einen Antikörper für Anti-ICAM-2-Molekül enthält (um das funktionale Derivat durch Bindung mindestens eines der verbliebenen Immunepitop zu absorbieren), gewonnen.

Mutationen, die die Affinität von ICAM-2 erhöhen sollen, können durch die Einfügung der Aminosäurereste, die in ICAM-1 an gleichen Positionen vorhanden sind, gelenkt werden. Ana'og dazu können derartige mutierte ICAM-2-Moleküle präpariert werden, die keine N-verknüpfte CHO an den gleichen Positionen in ICAM-1 aufweisen.

Die Aktivität des Zellysats oder des gereinigten funktionalen Derivats des ICAM-1-Moleküls wird dann in einem geeigneten Screening-Test auf das gewünschte Merkmal geprüft. So wird z, B. eine Veränderung des immunologischen Charakters des funktionalen Derivats, z. B. die Affinität für einen bestimmten Antikörper, durch einen kompetitiven Immuntest gemessen. Veränderungen in der Immunmodulationsaktivität werden durch den entsprechenden Test gemessen. Modifikationen solcher Proteineigenschaften wie Redox- oder thermische Stabilität, biologische Halbwertzeit, Hydrophobizität, Anfälligkeit gegenüber proteolytischem Abbau oder die Tendenz zur Zusammenlagerung mit Trägern oder zu Multimeren werden mit Hilfe von Methoden geprüft, die dem über durchschnittliche Kenntnisse verfügenden Fachmann gut bekannt sind.

B. Agonisten und Antagoniaten von ICAM-2

Ein „Agonist" von ICAM-2 ist eine Verbindung, die die Fähigkeit von ICAM-2 erhöht, jede beliebige seiner biologischen Funktionen zu erfüllen. Ein Beispiel eines derartigen Agonisten ist ein Agens, das die Fähigkeit von ICAM-2 erhöht, sich an einen zellulären Rezeptor oder ein Virusprotein zu binden.

Ein „Antagonist" von ICAM-2 ist eine Verbindung, die die Fähigkeit von ICAM-2 vermindert bzw. verhindert, daß es jede beliebige seiner biologischen Funktionen erfüllt. Zu den Beispielen für solche Antagonisten zählen ICAM-1, funktionale Derivate von ICAM-1, Anti-ICAM-2-Antikörper, Anti-LFA-1 Antikörper usw.

Die Zellaggregationstests, die in den US Patentanmeldungen mit den Seriennr. 07/045,983; 07/115,798; 07/155,943; 07/189,815 bzw. 07/250,446 beschrieben wurden, deren Anmeldungen in ihrer Gesamtheit hierin zu Vergleichszwecken aufgenommen wurden, sind in der Lage, die LFA-1 -abhängige Aggregation zu messen und können genutzt werden, um die Agenzien zu bestimmen, die das Ausmaß der von ICAM-2/LFA-1 ausgelösten Aggregation beeinflussen. Solche Tests können genutzt werden, um Agonisten und Antagonisten von ICAM-2 zu identifizieren. Antagonisten können dadurch wirken, daß sio die Aggregation vermittelnde Fähigkeit von LFA-1 oder ICAM-2 beeinträchtigen. Darüber hinaus können Nicht-Immunglobulin (d. h. chemische) Agenzien unter Verwendung des beschriebenen Tests untersucht werden, um zu bestimmen, ob sie die Aggregation von ICAM-2/LFA-1 als Agonisten oder Antagonisten beeinflussen.

C. Anti-ICAM-2-Antikörper

Der bevorzugte Immunglobulinantagonist der vorliegenden Erfindung ist ein Antikörper gegen ICAM-2. Geeignete Antikörper können auf verschiedene Weise gewonnen werden.

Ein Antigenmolekül, wie z. B. ICAM-2, wird auf natürliche Weise auf der Oberfläche von Lymphozyten exprimiert. Folglich wird das Einbringen solcher Zellen in ein geeignetes Tier auf dem Wege der Intraperitonealinjektion usw. zur Produktion von Antikörpern führen, die in der Lage sind, ICAM-2 oc er Angehörige der CD-18-Molekülfamilie zu binden. Wenn es gewünscht wird, kann das Serum eines solchen Tieres entnommen und als Quelle für polygonale Antikörper, die zur Bindung dieser Moleküle fähig sind, genutzt werden.

Als Alternative können Anti-ICAM-2-Antikörper durch Adaptation der Methode von Seiden, R. F. (Publikation der Europäischen Patentanmeldung Nr.289034) oder Seiden, R. F. u.a. (Science 236,714-718 (1987]) gewonnen werden. Entsprechend einer solchen Adaptation dieser Methode werden die Zellen eines geeigneten Tieres (d. h. z. B. einer Maus usw.) mit einem Vektor transfiziert, der in der Lage ist, entweder das intakte ICAM-2-Molekül oder ein Fragment von ICAM-2 zu exprimieren. Die Produktion von ICAM-2 in den transfizierten Zellen des Tieres wird in dem Tier eine Immunreaktion hervorgerufen und das Tier veranlassen, Anti-ICAM-2-Antikörper zu produzieren.

Als Alternative können Anti-ICAM-2-Antikörper dadurch gewonnen werden, daß ICAM-2 oder dessen Peptidfragmente in ein geeignetes Tier eingebracht werden. Das immunisierte Tier wird als Reaktion darauf polygonale Antikörper produzieren. Die Verwendung von Peptidfragmenten von ICAM-2 ermöglicht es, regionsspezifische Antikörper zu gewinnen, die nur mit dem Epitop (den Epitopen) reagieren, die in den zur Immunisierung der Tiere verwendeten Peptidfragmenten enthalten waren. Es ist jedoch vorzuziehen, den Tieren (die wie oben beschrieben immunisiert wurden) Milzzellen zu entnehmen, diese Milzzellen mit einer Myelom-Zellinie zu verschmelzen und die Bildung von Hybridomzellen durch die Fusionszellen zu ermöglichen. Diese Hybridomzellen sondern monoklonale Antikörper ab, die in der Lage sind, sich an ICAM-2 zu binden.

Die auf die besch; iebene Art und Weise gewonnenen Hybridomzellen Können mit verschiedenen Methoden geprüft werden, um

diejenigen Hybridomzellen zu ermitteln, die einen Antikörper absondern, welcher in der Lage ist, sich an ICAM-2 zu binden. Ineinem bevorzugten Screening-Test werden solche Moleküle durch hire Fähigkeit identifiziert, die Aggregation von ICAM-2exprimierenden, ICAM-1-nicht exprimieronden Zellen zu hemmen. Antikörper, die in der Lage sind, eine derartige Aggregationzu hemmen, werden danach weiter geprüft, um zu bestimmen, ob sie die Aggregation durch Bindung an ICAM-2 oder an einen

Angehörigen der CD-18-MolekUlfamilie hemmen. In einem solchen Screening-Test kann jedes beliebige Mittel, das geeignet ist, ICAM-2 von der CD-18-Molekülfamllie zu unterscheiden, genutzt werden. So kann z. B. das von dem Antikörper gebundene Antigen z. B. mittels Immunpräzipitation und Polyacrylamid-Gelelektrophorese analysiert werden. Fs ist möglich, zwischen Antikörpern, die sich an Angehörige der CD-18-Molekülfamilie binden, und Antikörpern, die sich an Zellen binden, die LFA-1,

aber nicht ICAM-2 exprimieren (oder umgekehrt), zu unterscheiden.

Die Fähigkeit eines Antikörpers, sich an eine Zelle, die LFA-1, jedoch nicht ICAM-2 exprimiert, zu binden, kann durch Methoden

nachgewiesen werden, die von Personen, die über durchschnittliche Fachkenntnisse verfügen, im allgemeinen angewendetwerden. Dazu gehören Immuntests (besonders diejenigen, die sich der Immunfluoreszenz bedienen), Zellagglutination,

Filterbindungsuntersuchungen, Antikörperausfällung usw. Neben den beschriebenen funktionalen Derivaten von ICAM-2 schließen weitere Agenzien, die entsprechend der vorliegenden Erfindung zur Behandlung von Virusinfektionen oder Entzündungen genutzt werden können, Antikörper gegen ICAM-2,

antiidiotypische Antikörper gegen Anti-ICAM-2-Antikörper und Rezeptormoleküle oder Fragmente solcher Moleküle ein, die inder Lage sind, sich an ICAM-2 zu binden.

Bei den für die Verwendung in Frage kommenden Antikörpern gegen ICAM-2 (oder fu iktionalen Derivaten von ICAM-2) handelt

es sich entweder um polyklrnale oder monoklonal Antikörper.

Die anti-idiotypischen Antikörper, die für die Erfindung von Interesse sind, sind in der Lage, sich in Konkurrenz mit (oder unter Ausschluß von) ICAM-2 zu binden. Derartige Antikörper können z. B. dadurch gewonnen werden, daß ein Antikörper gegen einen Anti-ICAM-2-Antikörper gezüchtet und dann der Antikörper auf die Fähigkeit geprüft wird, sich an den natürlichen Bindungsliganden von ICAM-2 zu binden. Da die Moleküle der CD-18-Familie in der Lage sind, sich an ICAM-2 zu binden, kann die Verabreichung solcher Moleküle (z. B. als Heterodimere, die sowohl alpha- als auch beta-Untereinheiten aufweisen, oder als Moleküle, die Fragmente von einer oder

beiden Untereinheiten enthalten) mit HRV um die Bindung an auf den Zellen vorhandenes ICAM-21 konkurrieren (oder HRVausschließen).

Die Anti-Aggregations-Antikörper der vorliegenden Erfindung können auf verschiedene Weise identifiziert und titriert werden. So kann z. B. die Fähigkeit der Antikörper zur unterschiedlichen Bindung an ICAM-2 exprimierende Zellen (wie z. B. aktivierte Endothelzellen) und ihre Unfähigkeit, sich an Zellen zu binden, die ICAM-2 nicht exprimieren, gemessen werden. Geeignete Tests

der Zellaggregatinn sind diejenigen die in den US- Patentanmeldungen mit den Seriennr. 07/045,963; 07/115,798; 07/155,943;07/1 £9,815 bzw. 07/250,446 beschrieben werden. Die Anmeldungen werden in ihrer Gesamtheit zu Vergleichszwecken in dievorliegende Anmeldung eingeschlossen. Als Alternative kann die Fähigkeit der Antikörper, sich an ICAM-2 oder Peptidfragmentevon ICAM-2 zu binden, gemessen werden. Personen mit durchschnittlichen Fachkenntnissen werden ohne weiteres erkennen,daß die genannten Prüfungen modifiziert oder in anderer Reihenfolge durchgeführt werden können, so daß man auf diese Weiseeine Vielzahl potentieller Screening-Tests erhält, die geeignet sind, Antikörper, die in der Lage sind, sich an ICAM-1 zu binden,von denen, die sich an die CD-18-Molekülfamilie binden, zu unterscheiden bzw. sie zu identifizieren.

In einer bevorzugten Methode kann der Antikörper wegen seiner Fähigkeit ausgewählt werden, sich zwar an COS-Zellen, die ICAM-2 exprimieren, jedoch nicht an COS-Zellen, die ICAM-2 nicht exprimieren, zu binden. D. Herstellung der Agenzien der Erfindung

Die Agenzien der Erfindung können durch natürliche Prozesse (wie z. B. dadurch, daß ein Tier, eine Pflanze, Pilze, Bakterien usw. veranlaßt werden, einen Nicht-Immunglobulinantagonisten von ICAM-2 zu produzieren, oder dadurch, daß ein Tier veranlaßt wird, polygonale Antikörper zu produzieren, die in der Lage sind, sich an ICAM-2 zu binden); durch synthetische Methoden (wie z. B. durch Anwendung der Methode nach Merrifield zur Synthetisierung von Polypeptiden, die zur Synthetisierung von ICAM-2, funktionalen Derivaten von ICAM-2 oder Proteinantagonisten von ICAM-2 (entweder Immunglobulin oder Nicht-Immunglobulin) verwendet werden; durch Hybridomtechnik (wie z. B. die Produktion monoklonaler Antikörper, die in der Lage sind, sich an ICAM-2 zu binden) oder durch die Rekombinationstechnik (wie z. B. die Produktion von erfindungsgemäßen Agenzien in verschiedenen Wirtszellen [d. h. Hefen, Bakterien, Pilzen, gezüchteten Säugetierzellen usw.] oder aus rekombinierten Plasmiden oder Virusvektoren gewonnen werden). Die Entscheidung darüber, welche Methode genutzt werden soll, wird von solchen Faktoren wie Bequemlichkeit, gewünschte Ausbeute usw. abhängen. Es ist nicht erforderlich, zur Produktion eines bestimmten entzündungshemmenden Agens nur eine(s) der beschriebenen Methoden, Verfahren oder Techniken einzusetzen; die genannten Verfahren, Methoden und Techniken können zur Gewinnung eines bestimmten Mittels kombiniert werden.

V. Anwendungsgebiete von ICAM-2 und seinen funktionalen Derivaten, Agonisten und Antagonisten A. Unterdrückung von Entzündungen Ein Aspekt der Erfindung beruht auf der Fähigkeit von ICAM-2 und seiner funktionalen Derivate, mit Rezeptoren der CD-18- Molekülfamilie, insbesondere mit LFA-1, oder mit Virusproteinen (wie z. ß. den Proteinen des Rhinovirus usw.) in Wechselwirkung zu treten. Dank seiner Fähigkeit, mit Angehörigen der CD-18-Glycoproteinfamilie in Wechselwirkung zu treten,

kann ICAM-2 zur Unterdrückung (d. h. zur Verhinderung oder Abschwächung) von Entzündungen genutzt werden.

Der Begriff ,Entzündung", wie er hierin verwendet wird, schließt sowohl die Reaktionen des spezifischen Abwehrsystems als

auch die Reaktionen des unspezifischen Abwehrsystems ein.

Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „spezifisches Abwehrsystem" auf die Komponente des Immunsystems, die auf die Anwesenheit spezifischer Antigene reagiert. Eine Entzündung wird auf eine Antwort des spezifischen Abwehrsystems

zurückgeführt, wenn die Entzündung durch eine Reaktion des spezifischen Abwehrsystems verursacht oder vermittelt wird odermit ihr in Zusammenhang steht. Beispiele für eine Entzündung, die auf eine Antwort des spezifischen Abwehrsystems

zurückzuführen ist, schießen die Antwort au'Antigene, wie z.B. das Rubeliavirus, Autoimmunkrankheiten, durch T-Zellen vermittelte verzögerte Hypersensitivitätsantwort (die z. B. bei Personen beobachtet wird, die beim Mantoux-Tesi „positiv" sind) usw. ein. Chronische entzündliche Erkrankungen und die Abstoßung transplantierter Gewebe und Organe sind weitere Beispiele entzündlicher Reaktionen des spezifischen Abwehrsystems.

Wie hierin verwendet, bezieht sich eine Reaktion des „unspdzifischen Abwehrsystems" auf eine Reaktion, die von Leukozyten vermittelt wird, die über kein immunologisches Gedächtnis verfügen. Zu solchen Zellen zählen Granulozyten und Makrophagen. Wie hierin verwendet, ist eine Entzündung das Ergebnis einer Antwort des unspezifischen Abwehrsystems, wenn din Entzündung von einer Reaktion des unspezifischen Abwehrsystems verursacht oder vermittelt wurde oder mit ihr in Zusammenhang steht. Beispiele für Entzündungen, die - wenigstens zum Teil - auf eine Reaktion des unspezifischen Abwehrsystems zurückzuführen sind, schließen Entzündungen ein, die mit folgenden Leiden einhergehen: Atemnotsyndrom im Erwachsenenalter (ARDS) oder nach Septikämie oder Trauma auftretendes Syndrom einer Schädigung mehrerer Organe; Schädigung des Myokards oder anderer Gewebe nach Behebung einer Durchblutungsstörung; akute Glomerulonephritis; sekundäre Arthritis; Dermatosen mit akuten entzündlichen Komponenten; akute eitrige Meningitis oder andere entzündliche Störungen des Zentralnervensystems; Wärmeschäden; Hämodialyse; Leukapherese: Colitis ulcerosa; Crohnsche Krankheit; nekrotisierende Enterocolitis; Syndrome, die mit Granulozytentransfusion in Zusammenhang stehen und Cytokin-induzierte Toxizität.

Wie bereits festgestellt wurde, ist die Bindung der ICAM-2-Moleküle an die Angehörigen der CD-18-Molekülfamilie von eminenter Bedeutung für die Zelladhäsion. Durch den Adhäsionsprozeß sind Lymphozyten in der Lage, ein Tier ständig auf die Anwesenheit fremder Antigene zu überwachen. Obwohl diese Prozesse normalerweise erwünscht sind, verursachen sie jedoch auch die Abstoßungsreaktionen transplantierter Organe, die Abstoßung von Gewebetransplantaten und zahlreiche Autoimmunkrankheiten. Folglich wäre jede beliebige Methode zur Abschwächung oder Hemmung der Zelladhäsion bei Empfängern von Organtransplantaten (insbesondere Nierentransplantaten), Gewebetransplantaten sowie für Patienten, die unter Autoimmunkrankheiten leiden, sehr erwünscht.

Monoklonale Antikörper gegen Angehörige der CD-18-Familie hemmen zahlreiche von der Adhäsion abhängige Funktionen der Leukozyten, einschließlich ihrer Bindung an das Endothel (Haskard, D., u.a. J. Immunol. 137,2901-2906 (1986)), homotypische Adhäsionen (Rothlein, R., u. a., J. Exp. Med. 163:1132-1149 [1986]), durch Antigen und Mitogen induzierte Vermehrung von Lymphozyten (Davignon, D., u.a., Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 4535-4539 [1981 ]), die Antikörperbildung (Fischer, A., u. a., J. Immunol. 136,3198-3203 [1986]) und die Effektorfunktionen aller Leukozyten, wie z.B. die lytische Aktivität der zytotoxischen T-Zellen (Krensky, A. M., u. a. J. Immunol. 132,2180-2182 [1984]), Makrophagen (Strassman, G., u. a., J. Immunol. 136,4328-4333 [1986]) und aller Zellen, die an Antikörper-abhängigen zellulären zytotoxischen Reaktionen beteiligt sind (Kohl, S., u.a., J. Immunol. 133,2972-2978 [1984]). Bei allen der genannten Funktionen hemmen die Antikörper die Fähigkeit der Leukozyten, an dem geeigneten Zellsubstrat zu harten, was wiederum das Endergebnis beeinflußt. Soweit diese Funktionen die Wechselwirkungen zwischen ICAM-2 und LFA-1 betreffen, können sie mit einem Anti-ICAM-2-Antikörper unterdrückt werden. So können monoklonale Antikörper, die in der Lage sind, sich an ICAM-2 zu binden, bei einem Säugetier als entzündungshemmende Agenzien verwendet werden. Wichtig ist, daß solche Mittel sich dadurch von allgemeinen entzündungshemmenden Mitteln unterscheiden, daß sie in der Lage sind, die Adhäsion selektiv zu hemmen und daß sie keine anderen Nebenwirkungen aufweisen bzw. nicht wie herkömmliche Mittel nierenschädigend wirken.

Da ICAM-2 besonders in löslicher Form in der Lage ist, wie ein Antikörper gegen Angehörige der CD-18-Familie zu wirken, kann es zur Unterdrückung von Entzündungen verwendet werden. Darüber hinaus können die funktionalen Derivate und Antagonisten von ICAM-2 ebenfalls zur Unterdrückung von Entzündungen genutzt werden.

1. Suppressoran der Hypersensitivitätsreaktionen vom verzögerten Typ

ICAM-2-Moleküle vermitteln zum Teil Adhäsionsereignisse, die erforderlich sind, um entzündliche Reaktionen hervorzurufen, wie z. B. Hypersensitivitätsreaktionen vom verzögerten Typ. Folglich weisen Antikörper (speziell monoklonale Antikörper), die in der Lage sind, sich an ICAM-2-Moleküle zu binden, ein therapeutisches Potential zur Abschwächuno oder Verhinderung derartiger Reaktionen auf.

Da ICAM-2 ein Antagonist der Wechselwirkung zwischen ICAM-1 und LFA-1 ist, können als Alternative ICAM-2 (besonders in löslich gemachter Form) oder seine funktionalen Derivate zur Unterdrückung von Hypersensitivitätsreaktionen vom verzögerten Typ genutzt werden.

Diese therapeutischen Anwendungsmöglichkeiten können auf unterschiedliche Weise genutzt werden. Erstens kann einem Patienten mit Hypersensitivitätsreaktionen vom verzögerten Typ eine einen monoklonalen Antikörper enthaltende Zusammensetzung verabreicht werden. So könnten derartige Zusammensetzungen z. B. einer Person gegeben werden, die mit Antigenen, wie z.B. Giftsumach (Rhus toxicodendron), Amerikanischem Lacksumach (Rhus vernix) usw. Berührung hatte. Im zweiten Ausführungsbeispiel wird der zur Bindung an ICAM-2 fähige monoklonale Antikörper einem Patienten zusammen mit einem Antigen verabreicht, um eine spätere entzündliche Reaktion zu verhindern. So kann die zusätzliche Verabreichung eines Antigens zusammen mit einem ICAM-2 bindenden monoklonalen Antikörper bewirken, daß eine Person die nachfolgende Verabreichung dieses Antigens zeitweilig toleriert.

2. Behandlung chronischer entzündlicher Erkrankungen

Da LAD-Patienten, die kein LFA-1 haben, keine entzündliche Antwort hervorbringen, nimmt man an, daß der Antagonist des natürlichen Liganden von LFA-1 - das ICAM-2- eine entzündliche Antwort ebenfalls hemmen wird. Die Fähigkeit von Antikörpern gegen ICAM-2,eine Entzündung zu hemmen, stelltdie Basis fürihre therapeutische Anwendung in der Behandlung chronischer entzündlicher Erkrankungen >nd Autoimmunkrankheiten dar, wie z. B. Lupus erythematosus, autoimmune Thyroiditis, experimentelle allergische Encephalomyelitis (EAE), multiple Sklerose, einige Diabetesformen, Reynaud-Syndrom, Rheumatoid-Arthritis usw. Solche Antikörper können ebenfalls zur Behandlung der Psoriasis genutzt werden. Im allgemeinen können monoklonale Antikörper, die in der Lage sind, sich an ICAM-2 zu binden, zur Behandlung derjenigen Krankheiten verwendet werden, die derzeit mittels Steroidtherapie behandelbar sind

Erfindungsgemäß können solche entzündlichen und immunologischen Abstoßungsreaktionen unterdrückt (d. h. entweder

verhindert oder abgeschwächt) werden, Indem einem Probenden, der eine derartige Behandlung benötigt, ein entzündungshemmendes Agens In zur Unterdrückung der Entzündung ausreichenden Mengen verabreicht wird. Zu geeigneten entzündungshemmenden Agenzien zählen: ein Antikörper, der in der Lage ist, sich an ICAM-2 zu binden; ein Fragment eines Antikörpers, wobei das Fragment in der Lage ist, sich an ICAM-2 zu binden; ICAM-2; ein funktionales Derivat von ICAM-2; ein Nicht-Immunglobulinantagonist von ICAM-2, der nicht ICAM-1 ist, oder ein Nicht-lmmun-globulinantagonist von ICAM-2, der nicht LFA-1 ist. Besonders bevorzugt werden entzündungshemmende Agenzien, die aus einem löslichen funktionalen Derivat von ICAM-2 bestehen. Eine entzündungshemmende Behandlung kann auch die zusätzliche Verabreichung eines Agens einschließen, das aus der Gruppe ausgewählt wurde, die umfaßt: einen Antikörper, der in der Lage ist, sich an LFA-1 zu binden; ein funktionales Derivat eines Antikörpers, wobei besagtes funktionales Derivat in der Lage ist, sich an LFA-1 zu bindon; und einen Nicht-Immunglobulinantagonisten von LFA-1.

Die Erfindung schließt darüber hinaus die beschriebenen Methoden zur Unterdrückung einer entzündlichen Antwort des spezifischen Abw»hrsystems ein, in denen dem Probanden zusätzlich ein Immunsuppressivum verabreicht wird. Ein solches Immunsuppressivum wird vorzugsweise in einer Dosis verabreicht, die niedriger ist (d.h. eine „suboptimale" Dosis) als diejenige, die normalerweise erforderlich wäre. Die Anwendung einer suboptimalen Dosis ist wegen der synergistischen Wirkung der erfindungsgemäßen Agenzien möglich. Beispiele geeigneter Immunosuppressiva schließen Dexamethason, Azathioprin, ICAM-1, Cyclosporin A usw. ein.

3. Therapie unspezifischer Entzündungen

Die Erfindung beruht zum Teil auf der Entdeckung, daß die Granulozyten-Endothelzell-Adhäsion auf die Wechselwirkung von Glycoproteinen der CD-18-Familie mit dem Endothel zurückzuführen ist. Da die Zelladhäsion erforderlich ist, damit Leukozyten an Entzündungsorte wandern und/oder verschiedene zur Entzündung beitragende Fffektorfunktionen ausführen können, werden Agenzien, die die Zelladhäsion hemmen, die Entzündung abschwächen oder verhindern. Solche entzündliche Reaktionen sind auf Reaktionen des „unspezifisclien Abwehrsystems" zurückzuführen, das von Leukozyten vermittelt wird, die kein immunologisches Gedächtnis haben. Granulozyten und Makrophagen sind solche Zellen. Wie der Begriff hierin verwendet wird, ist eine Entzündung das Ergebnis einer Antwort des unspezifischen Abwehrsysttims, wenn die Entzündung von einer Reaktion des unspezifischen Systems verursacht oder vermittelt wird oder mit ihr in Zusammenhang steht. Beispiele von Entzündungen, die-zumindest zum Teil-auf eine Reaktion des unspezifischen Abwehrsystems zurückzuführen sind, schließen Entzündungen ein, die mit folgenden Leiden einhergehen: Atemnotsyndrom im Erwachsenenalter (ARDS); nach Septikamie oder Trauma auftretendes Syndrom der Schädigung mehrerer Organe; Schädigung des Myokards oder anderer Gewebe nach Behebung von Durchblutungsstörungen; akute Glomerulonephritis; sekundäre Arthritis; Dermatosen mit akuten entzündlichen Komponenten; akute eitrige Mengingitis or'ar andere entzündliche Störungen des Zentralnervensystems; Wärmeschäden; Hämodialyse, Leukapherese; Colitis ulcerosa; Crohnsche Krankheit; nekrotisierende Enterocolitis; Syndrome, die mit Granulozytentransfusion in Zusammenhang stehen und Cytokin -induzierte Toxizität.

Die erfindungsgemäßen entzündungshemmenden Agenzien sind Verbindungen, die in der Lage sind, der Wechselwirkung des CD-18-Komplexes auf Granulozyten mit Endothelzellen in spezifischer Weise entgegenzuwirken. Solche Antagonisten umfassen: ICAM-2; ein funktionales Derivat von ICAM-2; einen Nicht-Immungfobulinantagonisten von ICAM-2, der nicht ICAM-1 ist oder einen Angehörigen der CD-18-Molekülfamilie.

B. Suppressoren der Organ- und Gewebeabstoßung

Da ICAM-2 speziell in löslicher Form in der Lage ist, genauso zu wirken wie ein Antikörper gegen die Angehörigen der CD-18-Familie, kann es zur Unterdrückung der Organ- oder Gewebeabstoßung verwendet werden, die durch eine der von der Zelladhäsion abhängigen Funktionen verursacht wird. Darüber hinaus können Anti-ICAM-2-Antikörper und die funktionalen Derivate und Antagonisten von ICAM-2 ebenfalls zur Unterdrückung dieser Abstoßungsreaktion genutzt werden. ICAM-2 und Antikörper, die sich an ICAM-2 binden können, können zur Verhinderung der Organ- oaer Gewebeabstoßung oder zur Modifizierung von Autoimmunantworten bei Säugetieren verwendet werden, ohne daß Nebenwirkungen zu befürchten sind. Wichtig ist die Tatsache, daß der Einsatz monoklonaler Antikörper, die in der Lage sind, ICAM-2 zu erkennen, es möglicherweise gestattet, Organtransplantationen sogar zwischen Personen vorzunehmen, deren HLA nicht übereinstimmt.

C. Zusatz zu Antigenmaterial, das für therapeutische und diagnostische Zwecke verabreicht wird Immunantworten auf therapeutische oder diagnostische Agenzien, wie z. B. Rinderinsulin, Interferon, Plasminogenfaktor (Gewebeaktivator) oder monoklonale Antikörper von Maus schränken den therapeutischen oder diagnostischen Wert solcher Agenzien stark ein und können sogar Krankheiten, wie z. B. die Serumkrankheit, hervorrufen. Diese Situation kann durch Verwendung der erfindungsgemäßen Antikörper behoben werden. In diesem Ausführungsbeispiel würden derartige Antikörper in Kombination mit dem therapeutischen oder diagnostischen Agens verabreicht. Der Zusatz von Antikörpern verhindert, daß der Empfänger das Agens erkennt und verhindert folglich, daß der Empfänger eine Immunantwort dagegen gibt. Das Fehlen einer solchen Immunantwort bewirkt, daß das therapeutische oder diagnostische Agens dem Patienten weiterhin verabreicht werden kann.

ICAM-2 (besonders in löslich gemachter Form) oder seine funktionalen Derivate sind bei der Behandlung von Krankheiten austauschbar gegen ICAM-1 oder Antikörper, die in der Lage sind, sich an LFA-1 zu binden. So können solche Moleküle in löslich gemachter Form verwendet werden, um die Abstoßung von Organen oder Transplantaten zu hemmen. ICAM-2 oder seine funktionalen Derivate können in der gleichen Weise wie Anti-ICAM-2-Antikörper zur Senkung der Immunogenität der therapeutischen oder diagnostischen Agenzien genutzt werden.

D. Suppressoren der Tumormetastasenbildung

Die erfindungsgemäßen Agenzien können ebenfalls zur Unterdrückung der Metastasierung einer Tumorzelle des blutbildenden Systems, für dersn Wanderung ein funktionaler Angehöriger der CD-18-Familie erforderlich ist, genutzt werden. Entsprechend diesem Ausführungsbeispiel der Erfindung erhält ein eine solche Behandlung benötigender Patient ein Agens (z. B. einen Antikörper, der in der Lage ist, sich an ICAM-2 zu binden; einen Toxin-derivatisierten Antikörper, der in der Lage ist, sich an ICAM-5! zu binden; ein Fragment eines Antikörpers, wobei das Fragment in der Lage ist, sich an ICAM-2 zu binden; ein Toxinderivatisiertes Fragment eines Antikörpers, wobei das Fragment in der Lage ist, sich an ICAM-2 zu binden; ICAM-2; ein

funktionales Derivat von !CAM-2; und einen Nicht-lmmunglobulinantagonlsten von lCAM-2, der nicht ICAM-1 ist) in einer zur Unterdrückung der Metastasierung erforderlichen Menge.

Die Erfindung betrifft ebenfalls eine Methode zur Unterdrückung des Wachstums einer ICAM-2 exprimierenden Tumorzelle, die die Verabreichung einer zur Unterdrückung des Wachstums ausreichenden Menge eines Agens an einen eine solche Behandlung benötigenden Patienten umfaßt. Zu Geeigneten Agenzien zählen ein Antikörper, der in der I ige ist, sich an ICAM-2 zu binden; ein Toxin-derivatisierter Antikörper, der in der Lage ist, sich an ICAM-2 zu binden; ein Fragment eines Antikörpers, wobei das Fragment in der Lage ist, sich an ICAM-2 zu binden; ein Toxin-derivatisiertes Fragment eines Antikörpers, wobei das Fragment in der Lage ist, sich an ICAM-2 zu binden; ICAM-2; ein funktionales Derivat von ICAM-2; ein Nicht-Immunglobulinantagonist von ICAM-2, der nicht ICAM-1 ist; ein Toxin-derivatisierter Angehöriger der CD-18-Molekülfamilie und ein Toxin-derivatisiertes funktionales Derivat eines Angehörigen der CD-18-Molekülfamilie.

Die Erfindung betrifft ebenfalls eine Methode zur Unterdrückung des Wachstums einer LFA-1 exprimierenden Tumorzelle, die die Verabreichung einer zur Unterdrückung des Wachstums ausrr chenden Menge eines Toxins an einen eine solche Behandlung benötigenden Patienten umfaßt. Geeignete Toxine schließen ein Toxin-derivatisiertes ICAM-2 oder ein Toxinderivatisiertes funktionales Derivat von ICAM-2 ein.

E. Suppressoren von Virusinfektionen

Kürzlich wurde nachgewiesen, daß die wichtige Gruppe der Rhinoviren die Stellung von ICAM-1 als Rezeptor in Frage stellt (Greve, J. M., u. a„ Cell 56,839-847 [1989]; Staunton, D.E., u. a., Cell 66,849-853 [1989]; Tomassini, J. E., u.a., Proc. Natl., Acad. Sei. USA 86,4907-4911 [1989], alle diese Literaturangaben sind zu Vergleichszwecken hierin eingeschlossen). Rhinoviren, Angehörige der kleinen, RNA enthaltenden Protein-gekapselten Familie der Picornaviron verursachen 40-50% aller Erkältungskrankheiten (Riieckert, R.R., in: „Field's Virology", Fields, B.N., u.a. (Herausg.) Raven Press, NY [1985] S. 705-738; Sperber, S. J., u.a. Antimicr. Agents Chemo. 32,409-419 [1988], alle diese Literaturangaben sind hierin zu Vergleichszwecken eingeschlossen). Über 100 keine immunologische Kreuzreaktivität aufweisende Rhinoviren wurden definiert, 90% von ihnen binden sich an ICAM-1.

Kürzlich wurde festgestellt, daß neben ICAM-1 das Zelladhäslonsmolekül CD4 und der Komplementrezeptor CR 2 durch HIV- bzw. EBV-Viren als Virusrezeptoren in Frage gestellt werden (Maddon, P. J., Cell 47,333-348 [1986]; Fingeroth, J.D., u.a., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81,4510-4514 [1984], diese Literaturangaben sind hierin zu Vergleichszwecken eingeschlossen). Außerdem wirkt ein Molekül mit einer ICAM-1 ähnelnden Ig-Domäne-Struktur, das bei der Zeltadhäsion wirksam werden kann, als Rezeptor f,V das Poliovirus. (Mendelsohn, CL, u. a., Cell 56,855-865 [1089]).

ICAM-2 und seine funktionalen Derivate können als Rezeptoren für die Anlagerung von Viren (besonders von Rhinoviren vom geringeren Serotyp) odor Infektion wirken. Folglich können Antikörper gegen ICAM-2 (oder dessen Fragmente), ICAM-2 oder funktionale Derivate von ICAM-2 zur Blockierung der Anheftung oder Infektion und dadurch zur Unterdrückung der Virusinfektion genutzt werden.

F. Diagnostische und prognostische Anwendungsgebiete

Monoklonal Antikörper, die in der Lage sind, sich an ICAM-2 zu binden, können genutzt werden, um bei einem Patienten ^.'. Orte eichtbar zu machen, an denen es zur ICAM-2 Expression und zur Entzündung kommt. Zu diesem Zweck werden die monoklonalen Antikörper durch Verwendung von Radioisotopen, Affinitätsmarkern (z. B. Biotin, Avidin usw.), Fluoreszenzmarkern, paramagnetischen Atomen, markierten Anti-ICAM-2-Antikörpern usw. zu Nachweiszwecken markiert. Fachleuten sind Verfahren für eine solche Markierung gut bekannt. Ein Überblick über die Verwendung von Antikörpern in der Klinik zur diagnostischen Bildgebung wurde von Grossman, H. B., Urol. Clin. North Amer. 13,465-474 (198o), Unger, E. C, u. a., Invest. Radiol. 20,693-700 (1985) und Khaw, B.A., u.a., Science 209,295-297 (1980) gegeben.

Das Vorhandensein der ICAM-2-Expression kann durch die Nutzung der Bindungsliganden, wie z. B. mRNA, cDNA oder DNA, die sich an ICAM-2-Gensequenzen oder ICAM-2-mRNA-Sequenzen von ICAM-2 exprimierenden Zellen binden, nachgewiesen werden. Methoden zur Durchführung solcher Hybridisierungstests werden von Maniatis, T., u. a., in: „Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Coldspring Harbor, NY (1982) und von Haymus, B.D., u.a. in: „Nucleic Acid Hybridization, a Practical Approach", IRL Press, Washington, DC (1985), deren Literaturangaben hierin zu Vergleichszwecken eingeschlossen sind, beschrieben.

Der Nachweis von Herden solcher zu Nachweiszwecken markierten Antikörper zeigt einen Ort an, wo es zur Expression von ICAM-2 oder zur Tumorentw' klung kommt. In einem Ausführungsbeispiel wird diese Untersuchung auf die Expression durchgeführt, indem Gewebe- oder Blutproben entnommen und diese Proben in Anwesenheit von Antikörpern, die markiert sind bzw. werden können, inkubiert werden. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel geschieht das auf unblutige Weise durch magnetische Bildgebung, Fluorographie usw. Ein solcher diagnostischer Test kann zur Überwachung von Organtransplantatempfängern auf Frühzeichen einer möglichen Gewebeabstoßung eingesetzt werden. Solche Tests können ebenfalls durchgeführt werden, um die Anfälligkeit einer Person für Rheumatoid-Arthrit's oder andere chronische entzündliche Erkrankungen zu ermitteln.

S" ist es z. B. durch die radioaktive Markierung der Antikörper ode- Antikörperfragmente möglich, das Antigen durch Anwendung von Radioimmuntests nachzuweisen. Eine gute Beschreibung eines Radioimmuntests (RIA) wird in dem Buch „Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology" von Work, T.S., u.a., North Holland Publishing Company, NY (1978) gegeben, speziell in dem Kapital „An Introduction to Radioimmun-j Assay and Related Techniques (Einführung in den Radioimmuntest und verwandte Methoden) von Chard, T., das hierin zu Vergleicl.szwecken aufgenommen wird. Als Alternative können Fluoreszenz-, Enzym- oder andere geeignete Marker verwendet werden.

Zu den Beispielen der Markertypen, die in der Erfindung verwendet werden könne, ι, zählen Enzymmarker, Radioisotopenmarker, nichtradioaktive Isotopenmarker, Fluoreszenzmarker, Toxinmarker und Chemolu niniszenzmarker, sind jedoch nicht auf sie beschränkt.

Zu den Beispielen fürgeeignete Enzymmarkerzählen Mplatdehydrogenase, Staphylokokkennuclease, Della-5-steroidisomerase, Hefe-A'koholdehydrogenase, Alpha glycerolphosphatdehydrogenase, Triosephosphatisomerase, Pdroxidase, alkali sehe Phosphatase, Asparaginase, Glucoseoxldase, Beta-galactosidase, Ribcnuclease, Urease, Catalase, Glucose-6-phosphatdehydrogenase, Glucoamylase, Acetylcholinesterase usw.

Zu den Beispielen geeigneter radioaktiver Marker zählen ³H, ¹¹¹In, "⁶I, "¹1,³²P, ³⁶S, ¹⁴C, ⁶¹Cr, ⁶⁷To, ⁶⁸Co, ⁶⁹Fe, ⁷⁶Se, ¹⁶²Eu, ⁸⁰Y, ⁶⁷Cu, ²¹⁷Ci, ²¹¹At, ²¹²Pb, ⁴⁷Sc, ¹⁰⁸Pd usw. Zu den Beispielen geeigneter nichtradioaktiver Marker zählen ¹⁶⁷GD, ⁶⁶Mn, ¹⁸²Dy, ⁶²Tr, ⁶⁶Fe usw. Zu den Beispielen geeigneter Fluoreszenzmarker zählen ein ¹⁶²Eu-Marker, ein Fluoreszinmarker, ein Rhodaminmarker, ein Phycoerythrinmarker. ein Phycocyaninmarker, ein Allophycocyaninmarker, ein o-Pthaldehydmarker, ein Fluroeszaminmarker usw.

Zu den Beispielen der Chemolumineszenzmarker zählen ein Luminalmarker, ein Isoluminalmarker, ein aromatischer Acridinestermarker, ein Imidazolmarker, ein Acridinsalzmarker, ein Oxalatestermarker, ein Luciferinmarker, ein Luciferasemarker, ein Aequorinmarker usw.

Vl. Verabreichung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen

Die therapeutischen Wirkungen von ICAM-2 können erzielt werden, indem einem Patienten das gesamte ICAM-2-Molekül oder beliebige therapeutisch aktive Peptidfragmente davon verabreicht werden. Von besonderem Interesse sind therapeutisch aktive Peptidfragmente von ICAM-2, die löslich sind.

ICAM-2 und seine funktionalen Derivate können entweder synthetisch durch Anwendung der DNA-Rekombinationstechnik oder durch Proteolyse oder eine Kombination dieser Methoden gewonnen werden. Der therapeutische Wert von ICAM-2 kann durch die Verwendung von funktionalen Derivaten von ICAM-2, die zusätzliche Aminosäurereste besitzen, die zur Verstärkung der Kopplung an den Träger oder zur Steigerung der Aktivität von ICAM-2 genutzt werden, erhöht werden. Der Geltungsbereich der Erfindung schließt außerdem funktionale Derivate vor ι ICAM-2 ein, bei denen bestimmte Aminosäurereste fehlen oder die geänderte Aminosäurereste enthalten, solange diese Derivate eine biologische oder pharmakologische Aktivität von ICAM-2 aufweisen oder diese beeinflussen.

Sowohl die erfindungsgemäßen Antikörper als auch das hierin offenbarte ICAM-2-Molekül sind „im wesentlichen frei von natürlichen Verunreinigungen", wenn Präparate, die sie enthalten, im wesentlichen frei von Materialien sind, mit denen diese Produkte normalerweise und in der N juir angetroffen werden.

Die Erfindung erstreckt sich auf Antikörper und deren biologisch aktive Fragmente (unabhängig davon, ob es sich um polygonale oder monoklonal Antikörper handelt), die in der Lage sind, sich an ICAM-2 zu binden. Solche Antikörper können entweder durch ein Tier, eine Gewebekultur oder durch DNA-Rekombinationstechnik produziert werden.

Bei der Verabreichung von Antikörpern oder deren Fragmenten, die in der Lage sind, sich an ICAM-2 zu binden, an einen Patienten oder bei der Verabreichung von ICAM-2 (oder einem Fragment, einer Variante oder Derivat davon) an einen Patienten, wird die Dosierung des verabreichten Agens von solchen Faktoren wie Alter, Gewicht, Größe, Geschlecht, Allgemeinzustand, Anamnese usw. abhängen. Im allgemeinen ist es wünschenswert, dem Empfänger eine Antikörperdosis im Bereich von etwa 1 pg/kg bis 10pg/kg (Körpergewicht des Patienten) zu verabreichen, obwohl eine geringere oder höhere Dosis ebenfalls möglich ist. Wenn einem Patienten ICAM-2-Moleküle oder ihre funktionalen Derivate verabreicht werden, ist es wünschenswert, die Moleküle in einer Dosierung zu verabreichen, die ebenfalls von 1 pg/kg bis 10pg/kg (Körpergewicht des Patienten) beträgt, obwohl eine geringere oder höhere Dosierung ebenfalls möglich ist. Wie noch festgestellt werden wird, kann die therapeutisch wirksame Dosis reduziert werden, wenn der Anti-ICAM-2-Antikörper zusätzlich mit einem Anti-LFA-1 -Antikörper verabreicht wird. Wie der Begriff hierin verwendet wird, gilt eine Verbindung als zusätzlich zu einer zweiten Verbindung verabreicht, wenn die Verabreichung der zwei Verbindungen in einem so kurzen Zeitabstand erfolgte, daß beide Verbindungen gleichzeitig im Serum des Patienten nachgewiesen werden können.

Sowohl der Antikörper, der in der Lage ist, sich an ICAM-2 zu binden, als auc.i ICAM-2 selbst können den Patienten intravenös, intramuskulär, subkutan, enteral oder parenteral verabreicht werden. Wenn der Antikörper der ICAM-2 durch Injektion verabreicht werden, kann dies durch kontinuierliche Infusion oder durch einen Bolus oder mehrere BoIi geschehen. Die erfindungsgemäßen Agenzien sollen den Empfängern in einer zur Unterdrückung der Entzündung ausreichenden Menge verabreicht werden. Eine Menge gilt als für die „Unterdrückung" der Entzündung ausreichend, wenn die Dosierung, die Verabreichungsroute usw. des Agens zur Abschwächung oder Verhinderung der Entzündung ausreichen. Anti-ICAM-2-Antikörper oder dessen Fragmente können entweder allein oder in Kombination mit einem oder mehreren zusätzlichen Immunsuppressiva verabreicht werden (besonders an einen Empfänger eines Organ- oder Gewebetransplantats). Die Verabreichung einer solchen Verbindung (solcher Verbindungen) kann entweder einem „prophylaktischen" oder „therapeutischen" Zweck dienen. Wenn sie prophylaktisch verabreicht werden, wird (werden) dia immunsuppresive(n) Verbindung(en) vor dem Auftreten einer entzündlichen Reaktion oder eines Symptoms gegeben (z. B. vor, bei oder kurz nach) dem Zeitpunkt der Organ- oder Gewebetransplantation, jedoch vor Auftreten eines der Organabstoßungssymptome). Die prophylaktische Verabreichung der Verbindung(en) dient dazu, eine nachfolgende entzündliche Antwort (z. B. die Abstoßung eines transplantation Organs oder Gewebes usw.) zu verhindern oder abzuschwächen. Wenn sie therapeutisch eingesetzt wird, wird (werden) die immunsuppressive(n) Verbindungen) bei (oder kurz nach) Auftreten eines Symptoms der tatsächlichen Entzündung (z. B. Organ- oder Geweoeabstoßung) verabreicht. Die therapeutische Verabreichung der Verbindung(en) dient zur Abschwächung einer tatsächlichen Entzündung (wie z. B. der Abstoßung eines transplantierten Organs oder Gewebes). Die erfindungsgemäßen entzündungshemmenden Agenzien können folglich entweder vor dem Auftreten der Entzündung (zur Unterdrückung einer erwarteten Entzündung) oder nach Auftreten der Entzündung verabreicht werden. Eine Zusammenarbeit gilt als „pharmakologisch verträglich", wenn sie von einem Patienten, dem sie verabreicht wurde, vertragen wird. Ein solches Agens gilt als in einer „therapeutisch wirksamen Menge" verabreicht, wenn die verabreichte Menge physiologisch signifikant ist. Ein Agens ist physiologisch signifikant, wenn seine Anwesenheit eine nachweisliche Veränderung der Physiologie des Empfängers bewirkt.

Der erfindungsgemäße Antikörper und die ICAM-2-Moleküle können entsprechend bekannten Methoden zur Herstellung pharmazeutisch wirksamer Zusammensetzungen zubereitet werden, wodurch diese Materialien oder ihre funktionalen Derivate einer pharmazeutisch verträglichen Trägersubstanz beigemischt werden. Geeignete Trägersubstanzen und ihre Zubereitung, einschließlich der für andere menschliche Proteine, z. B. Human-Serumalbumin, geeigneten, werden z. B. in „Remington's Pharmaceutical Sciences" (16.Auflg. Osol, A. (Herausg.), Mack, Easton PA [1980]) beschrieben. Damit sie eine für die wirksame Verabreichung geeignete pharmazeutisch verträgliche Zusammensetzung bilden, enthalten solche Zusammensetzungen eine wirksame Menge Anti-ICAM-2-Antikörper oder ICAM-2-Molekül oder ihre funktionalen Derivate zusammen mit einer geeigneten Menge Trägersubstanz.

Weitere pharmazeutische Methoden können zur Steuerung der Wirkungsdauer genutzt werden. Präparate mit kontrollierter Freisetzung können durch Verwendung von Polymeren zur Komplexbildung mit oder Absorption der Anti-ICAM-2-Antikörper oder ICAM-2 oder ihrer funktionalen Derivaten erzielt werden. Die kontrollierte Freisetzung kann durch die Auswahl entsprechender Makromoleküle (z. B. Polyester, Polyaminosäure, Polyvinyl, Pyrrolidon, Ethylenvinylacetat, Methylcellulose, Carboxymethylcellulose oder Protaminsulfat) und durch Konzentration der Makromoleküle sowie Einarbeitungsverfahren zur kontrollierten Freisetzung erzielt werden. Eine andere mögliche Methode zur Steuerung der Wirkungsdauer durch Präparate mit kontrollierter Freisetzung besteht darin, Anti-ICAM-2-Antikörper oder ICAM-2-Moleküle oder ihre funktionalen Derivate in Teilchen eines Polymermaterials, z. B. Polyester, Polyaminosäuren, Hydrogele, Poly(Milchsäure) oder Ethylenvinylacetatcopolyriere einzubauen. Als Alternative ist es anstatt des Einbaus dieser Agenzien in Polymerteilchen möglich, diese Materialien in Mikrokapseln einzuschließen, die z. B. durch Koazervierungstechniken oder durch Grenzschichtpolymerisierung, hergestellt wurden, z. B. Hydroxymethylcellulose- oder Gelatinemikrokapseln bzw. Poly(methylmethacylat)mikrokapseln oder in kolloidale ArzneimÜtelfreisetzungssysteme, wie z. B. Liposome, Albuminmikrosphären, Mikroemulsionen, Nanopartikel und Nanokapseln oder in Makroemulsionen. Derartige Methoden sind in „Remington's Pharmaceutical Sciences" (1980) offenbart.

Die Erfindung betrifft weiterhin eine pharmazeutische Zusammensetzung, die folgende enthält: (a) ein entzündungshemmendes Agens (wie z. B. einen Antikörper, der in der Lage ist, sich an ICAM-2 zu binden; ein Fragment eines Antikörpers, wobei das Fragment in der Lage ist, sich an ICAM-2 zu binden; ICAM-2; ein funktionales Derivat von ICAM-2; und einen Nicht-Immunglobulinantagonisten von ICAM-2, der nicht ICAM-1 ist und (b) mindestens ein Immunsuppresivum. Beispiel für geeignete Immunsuppressiva sind Dexametheson, Azathioprin und Cyclosporin A.

Nach der allgemeinen Darlegung des Wesens der Erfindung wird das Verständnis der Erfindung durch Verweis auf die folgenden Beispiele gefördert die zur Erläuterung gegeben werden, die Erfindung jedoch nicht einschränken sollen, es sei denn es wird ausdrücklich darauf hingewiesen.

Beispiel 1 Klonierung von ICAM-? -u)NA

Zur Klonierung von cDNA, die in der Lage ist, ICAM-2 zu codieren, wurde eine Modifikation des Verfahrens von Aruffo und Seed (Seed, B., u.a., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84,3365-3369 (1987]) zur Auswahl von cDNAs durch Expression in COS-Zellen eingesetzt, um sie nach Liganden tragenden COS-Zellen auf funktional aktiver gereinigter LFA-1, die an Petrischalen aus Plastmaterial gebunden waren, abzutasten.

Im einzelnen wurde LFA-1 mittels Immunaffinitätschromatographie auf TS 2/4 LFA-1 MAb Sepharose von dem SKW-3-Lysat gereinigt und bei pH 11,5 in Anwesenheit von 2mM MgCI₂ und 1%igem Octylglucosid eluiert. LFA-1 (10pg/200 μΙ/ecm Platte) wurd'j durch Verdünnen von Octylglucosid bis auf 0,1 % in PBS mit 2 nM MgCI₂ und Inkubation über Nacht bei 4°C an bakteriologische Petrischalen gebunden. Die Platten wurden mit 1 % BSA blockiert und in PBS/2mM MgCI₂/0,2% BSA/0,025% Azid/5C Mg/ml Gentamycin gelagert.

Die Synthese einer cDNA-Bank aus LPS-stimulierten Endothelzellen aus der Nabelvene nach der von Gubler und Hoffmann entwickelten Methode wurde wie von Staunton u.a. beschrieben durchgeführt (Staunton, D.E., u.a.. Cell 52,925-933 (1988]). Nach der Synthese des zweiten Stranges wurde die cDNA an Bst Xl-Adaptoren ligiert (Seed, B., u.a., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84,3365-3369 (1987]) und cDNAs >600bp wurden mittels Elektrophorese mit niedrig schmelzendem Agarosegel (LMP) ausgewählt. Die cDNA wurden danach an CDM8 ligiert (Seed, B., Nature 329,840-842 [1987]), in E. coll Wirtsorganismen MC1061/P3 eingebaut und plattiert, so daß 5 x 10⁵ Kolonien gewonnen wurden. Die Kolonien wurden in LB-Medium suspendiert,gepoolt, und das Plasmid wurde mit der Alkali-Lysis-Standardmethodegewonnen (Maniatis,T., u.a., in „Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory (1982]). Zehn 10cm große Platten mit COS-Zellen, die zu 50% zusammengewachsen waren, wurden mit 10pg/Platte der Plasmid-cDNA-Bank unter Verwendung von DEAE-Dextran transfiziert (Kingston, R. E., in „Current Protocols in Molecular Biology", 9.0.1-9.9.6, Greene Publishing Associates [1987]). ICAM-2 ist auf Endothel- und SKW-3-Zellen Trypsin-resistent. COS-Zellen wurden drei Tage nach der Transfektion durch Behandlung mit 0,025%igem Trypsin/1 mM EDTA/HBSS (Gibco) suspendiert und auf Platten mit LFA-1-Überzug abgetastet (Seed, B., u. a., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84,3365-3369 [1987]), wie es weiter unten für die mit ⁶¹Cr markierten COS-Zellen beschrieben ist. Anhaftende Zellen wurden durch Zugabe von EDTA bis zu 1OmM abgelöst.

Das Plasmid wurde aus der anhaftenden Population von COS-Zellen in Überständen von Hirtscher Lösung gewonnen (Hirt, B. J., J. Mol. Biol. 26,365-369 (1967]). Der E. coli-Stamm MC 1061/P3 wurde danach mit dem Plasmid transformiert, die auf den Platten befindlichen Kolonien wurden in LB-Medium suspendiert, gepoolt und das Plasmid nach der Alkali-Lysis-Methode hergestellt. Zwei weitere die Selektion der an LFA-1 haftenden transfilierten COS-Zellen und die Plasmidgewinnung umfassende Zyklen wurden durchgeführt. Die nach dem dritten Zyklus gewonnenen gepoolten Kolonien wurden bis in 100ml LB-Medium mit IB^g/ml Tetracyclin und 20pg/ml Ampicillin zur Sättigung gezüchtet. Das Plasmid wurde dargestellt und durch 1 % LMP-Agarosegelelektrophorese fraktioniert, und MC 1061/P3 wurde gesondert mit Plasmid aus neun verschiedenen Größenklassen transformiert. Einzelne Plasmide aus der Fraktion, die die höchste Aktivität hinsichtlich der Förderung der Haftung der COS-Zellen an LFA-1 aufwies, wurden mittels Aufschluß mit Xb&l auf die Größe des Inserts untersucht und in einem COS-Zelladhäsionstest geprüft. Er ergab ein Plasmid mit einem ICAM-2 cDNA-lnsert von 1,1 kb, pCDIC 2,27. Für die Adhäsionstests wurde das ICAM-2 Plasmid pCDIC2,27 oder ein ICAM-1-Konstrukt, das das 1,8kb Sail, Kpnl-Fragment (Staunton, D.E., u.a.. Cell 52,925-933 [1988]) in CDM8 (2Mg/10cm Platte) enthielt, unter Verwendung von DEAE-Dextran in COS-Zellen eingebaut. Die COS-Zellen wurden drei Tage nach der Transfektion mit 0,025%igem Trypsin/1 mM EDTA/HBSS suspendiert und mit ⁶¹Cr markiert. Etwa 2 x 10⁵⁶¹Cr markierte COS-Zellen in 2 ml PBS/5% FCS/2 mM MgCI₂/0,025% Azid (Puffer) mit δμρ/σιΙ des erwähnten MAb wurden in 6cm großen Platten mit LFA-1 Überzug 1 Stunde lang bei 25°C inkubiert. Nichthaftende Zellen wurden durch vorsichtiges Schütteln und drei Spülvorgänge mit dem Puffer entfernt. Haftende Zellen wurden durch Zugabe von EDTA bis auf 1OmM eluiert und im Gammazähler gezählt.

Die Durchführbarkeit dieses Verfahrens wurde unter Verwendung von COS-Zellen, die mit der zuvor Monierten ICAM-1 cDNA transfiziert waren, (Fig. 1a) nachgewiesen.ICAM-1 wurdeauf25%dertransfiziertenZellenexprimiert. Nachdem Abtasten wiesen die nichthaftenden Zellen keine ICAM-1 ⁺-Zellen auf, während die haftenden Zellen, die mit EDTA von dem mit LFA-1 Überzug versehenen Plastmaterial abgelöst wurden, fast vollständig ICAM-I⁺ waren. Die Adhäsion von ICAM-1 ^-Zellen an mit LFA-1

beschichtetem Plastmaterial wurde mit RR1/1ICAM-1 MAb gehemmt. LFA-1-Überzüge auf Petrischalen waren bis zu > 5 Zyklen COS-Zelladhäsion und Elution mit EDTA stabil. Die Platten wurden zwischen den Arbeitsgängen in Mg²⁺ bei 4°C gelagert. Zur Klonierung von ICAM-2 wurde in dem Plasmidvektor CDM8 eine cDNA-Bank aus Endothelzellen, die sowohl die ICAM-1-abhängige als auch die ICAM-1-unabhängige Komponente der LFA-1-abhängige Adhäsion aufweisen, hergestellt (Dustin, M. L, u.a., J. Cell. Biol. 107,321-331 [1988]). Transfizierte COS-Zellen wurden in mit LFA-1-Überzug versehenen Petrischalen in Anwesenheit von ICAM-1 MAb inkubiert, um die Isolierung von ICAM-1 cDNAs zu verhindern. Haftende Zellen wurden mit EDTA eluiert, und Plasmide wurden isoliert und in E. coil amplifiziert. Nach drei Transfektion, Adhäsion und Plasmidisolierung umfassenden Zyklen und einer Größenfraktionierung wurden 30 Plasmide durch Restriktionsendonucleaseaufschluß analysiert. Von drei Plasmiden, die Inserts > 1,Okb enthielten, zeigte ein in COS-Zellen durch Transfektion eingebautes Piasmid Adhäsion an LFA-1. '

Das isolierte Piasmid übertrug die Adhäsion an LFA-1 auf einen größeren Prozentsatz der transfizierten Zellen. Der Prozentsatz entsprach ungefähr demjenigen, der bei der ICAM-1-Transfektion erzielt wurde (Fig. 1 B). Die Adhäsion wurde durch LFA-1 MAb (Fig. 1 B), im Gegensatz zu den ICAM-1 transfizierten Zellen jedoch nicht durch ICAM-1 MAb (Fig. 1 B) blockiert. Außerdem reagierten die mit diesem Piasmid transfizierten Zellen nicht mit einer Gruppe von vier ICAM-1 MAb. Auf diese Weise waren alle funktionalen Kriterien für eine einen zweiten LFA-1-Liganden codierende cDNA erfüllt, und der Ligand wurde als „ICAM-2" bezeichnet.

Beispiel 2 Charakterisierung der ICAM-2 cDNA-Sequenz

Die ICAM-2 cDNA-Sequenz von 1052bp (Fig. 2) enthält eine nichttranslatierte Region bei 62 bp 5' und bei 167 bp 3'. Einem AATACA Polyadenylierungssignal bei Position 1019, das im Gegensatz zu AATAAA in etwa 2% der mRNA der Wirbeltiere vorkommt (Wickens, M., u.a., Science 226,1045-1051 (1984]), folgt bei 1058bp ein Poly(A)-Schwanz. Der längste offene Leseraster beginnt mit der ersten ATG bei Position 63 und endet mit einem TAG-Terminationscodon bei Position 885. Aufgrund der Hydrophobizitätsanalyse (Kyle, J., u.a., J. Mol. Biol. 157,105-132 (1982)) und der Nutzung von Aminosäuren an Spaltstellen (von Heijne, G„ Nucleic Acids Research 14,4683-4690 [1986]) wurde ein Signalpeptid mit 21 Resten vorhergesagt (Fig.2). Die vorhergesagte reife Sequenz enthält von Aminosäure 1 bis 201 eine vermutliche extrazelluläre Domäne, der eine hydrophobe vermutliche Transmembrandomäne mit 26 Resten und eine zytoplasmatische Domäne mit 26 Resten folgt. Vier Schleifen eines vermutlichen Transmembransegments mit Alphahelix sind amphipathisch, wobei Treonin- und Serinreste auf eine Seite fallen, was auf die Möglichkeit der Selbstassoziation oder Assoziation mit anderen Membranproteinen auf Membranebene hindeutet. Die zytoplasmstische Domäne ist ungewöhnlich basisch und weist im Gegensatz zu den meisten zytoplasmatischen Domänen, die hydrophil .-sind, eine durchschnittliche Hydrophobizität auf. Die vorhergesagte Masse des reifen Polypeptids beträgt 28176 Dalton, was, falls die sechs vorhergesagten N-verknüpften Glycosylierungsorte genutzt werden, ein ICAM-2-Glycoprotein von etwa 46Kd ergeben würde.

Beispiel 3 Analysen der Hybridisierung von DNA und RNA Die isolierten ICAM-2 cDNA-Klone wurden sowohl mittels Northern- als auch Southern-Hybridisierung analysiert. Bei den Northern Blots wurde 6Mg PoIy(A)⁺ RNA, die mit einem 1 % Agarose-Formaldehydgel (Maniatis, T., u. a. in: „Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory (1982)) denaturiert, elektrophoretisch aufgetrennt und auf eine Nylonmembran elektrisch übertragen wurde (Zeta Probe, BioRad) eingesetzt. Der Abschluß der Übertragung wurde durch UV-Transillumination des Gels und Fluoreszenzfotografie des Blots bestätigt. Die genomischen DNAs wurden fünf Mal mit der vom Hersteller empfohlenen Menge EcoR I und Hind III Endonucleasen (New England Biolabs) aufgeschlossen. Nach der Elektrophorese durch ein 0,8%iges Agarosegel wurden die DNAs auf die Zeta Probe

übertragen. RNA und DNA Blots wurden gemäß Standardverfahren prähybridisiert und hybridisiert (Maniatis, T., u.a. in„Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory [1982]), wobei ICAM-2 oder ICAM-1 cDNAsverwendet wurden, die durch Zufallspriming (Boehringer Mannheim mit a[^32p)^dXTPs) markiert waren.

Die 1,1 kb ICAM-2 cDNA hybridisiert zu einer 1,4 kb PoIy(A)⁺ mRNA und schwach zu einer 3 kb mRNA (Fig. 3 A), die sich von der

3,3 kb und 2,4 kb ICAM-1 mRNA unterscheidet (Fig.3B). mRNA wurde in Zellen untersucht, die entsprechend ihrer Funktion als

Zellen charakterisiert wurden, die eine ICAM-1-abhängige und vom zweiten Liganden abhängige Bindung an LFA-1 aufweisen. ICAM-1 mRNA wird durch LPS in Endothelzellen stark induziert (Fig. 3 B, Spuren 2 und 3). Im Gegensatz dazu wird ICAM-2 mRNA

in Endothelzellen stark basal exprimiert und durch LPS nicht weiter induziert (Fig. 3A, Spuren 2 und 3). Diese Feststellung stimmtüberein mit der starken basalen und nichtinduzierbaren Expression des LFA-1-abhängigen, ICAM-1-unabhängigen

Stoffwechselganges in Endothelzellen und der Induzierbarkeit des ICAM-1 -abhängigen Stoffwechselweges (Dustin, M. L., u. a., J.

Cell. Bio. 107,321-331 [1988)).

ICAM-2 mRNA ist in einer Vielzahl von Zelltypen vorhanden, u. a. Ramos und BBN B-Lymphoblastoid-, U 937-Monozyten- und SKWS-Lymphoblatoid-Zellinien (Fig.3A, Spuren 1,4,6 und 8), wie aus mäßiger oder langer Autoradiographie ersichtlich ist. Es

wurde nachgewiesen, daß von diesen Zellen SKW3, U937 und BBN eine LFA-1-abhängige, ICAM-1-unabhängige Adhäsion an

LFA-1⁺-Zellen (Rothlein, R., u.a., J. Immunol. 137,1270-1274 [1986]; Makgoba, M.W., u.a., Eur. J. Immunol. 18,637-640 [1988])

aufweist, zeigt auch nach längerer Autoradiographie keine ICAM-2 mRNA (Fig.3 A, Spur 5). Die Zellverteilung von ICAM-2 stimmtalso mit der ICAM-1-unabhängigen Komponente der LFA-1-abhängigen Adhäsion überein.

Southern Blots der genomischen DNA (Fig.3D), die mit der ICAM-2 cDNA hybridisiert wurde, zeigten ein einziges

vorherrschendes EcoR I-Fragment von 8,2 kb und ein Hind Ill-Fragment von 14 kb, was auf ein einziges Gen in 8 kb hinweist, indem die Mehrzahl der codierenden Informationen enthalten ist.

Beispiel 4 Vergleich der Aminosäuresequenzen von ICAM-1 und ICAM-2 Die Aminosäuresequenzen von ICAM-2 und ICAM-1 wurden wegen ihrer funktionalen Ähnlichkeit als LFA-1-Liganden verglichen. ICAM-1 gehört zur Ig-Großfamilie, und seine extrazelluläre Domäne besteht völlig aus fünf C-ähnlichen Domänen. Die 201 Aminosäuren umfassende extrazelluläre Domäne von ICAM-2 besteht aus 2 Ig C-ähnlichen Domänen, wobei die vermuteten,

Innerhalb der Domäne enthaltenen Disulfid-gebundenen Cysteine 43 und 56 Rt ste voneinander entfernt angeordnet sind, und eine vorhergesagte ß-Strengstruktur (Fig.4) enthalten ist. Bemerkenswert ist, de ß die beiden Ig-ähnlichen Domänen von ICAM-2 hinsichtlich ihrer Aminosäuresequenz eine 34%ige Identität mit den zwei am stärksten N-terminalen ig-ähnlichen Domänen von ICAM-1 aufweisen (Fig.4), wobei die ALIGN-Punktzahl 15 s.d. über dem Mittelwert liegt, sowie eine 27%ige Identität mit den ICAM-1-Domänen 3 unr, 4 aufweisen, wobei die ALIGN-Punktzahl 3 s.d. über dem Mittelwert liegt. Recherchen in den Pro\eindatenbanken von NBRF und SWISS-PROT ergaben beim Vergleich mit anderen Angehörigen der Ig-Großfamilie, in erster Linie mit den HLA-Antigenen der Klasse II, nur bei Teildomänen Homologie. ICAM-2 weist weniger beibehaltene Reste, die für die IG-Domäne charakteristisch sind, auf als ICAM-1. ICAM 2 weist 17%ige bzw. 19%ige Identität mit den zwei N-terminalen Domänen der Adhäsionsmoleküle NCAM (Cunningham, B. Α., u.a., Science 236,799-806 [1987)) bzw. MAG (Saizer, J. L, u. a., J. Cell. Bio). 104,957-965 (1987]) auf, während ICAM-1 19%ige bzw. 20%ige Identität mit ihnen aufweist. DasLymphozytenfunktionsassoziierteAntigen-1 (LFA-1) und das interzelluläre Adhäsionsmolekül-1 ilCAM-1) wurden identifiziert, indem man MAb auswählte, die die von T-Lymphozyten vermittelte Abtötung bzw. die homotypische Adhäsion blockierten (Rothlein, R., u.a., J. Immunol. 137,1270-1274 (1986); Davignon, D., u.a., Proc. Nati. Acad. Sei. USA 78,4535-4539 (1981 ]). Im Gegensatz dazu wurde ICAM-2 unter Verwendung eines Auswahlverfahrens für funktionale cDNA bestimmt, das keine vorherige Identifizierung des Proteins durch biochemische oder immunologische Verfahren erfordert. Die Isolierung einer cDNA für ICAM-2 bestätigt die postulierte Existenz eines zweiten LFA-1-Liganden. Die Verteilung von mRNA für ICAM-2 auf einer begrenzten Anzahl von Zellen, die wegen ihrer ICAM-1-abhängigen und ICAM-1-unabhängigen Adhäsion an LFA-1 bekannt sind, deutet darauf hin, daß ICAM-2 die gesamte beobachtete ICAM-1-unabhängigen LFA-1-abhängige Adhäsion erklären könnte.

ICAM-2 und die beiden N-terminalen Domänen von ICAM-1 ähneln sich viel stärker als andere Mitglieder der Ig-Großfamilie, was auf eine Unterfamilie von Ig-ähnlichen Molekülen, die sich an LFA-1 binden, hinweist. Wichtig ist, daß die LFA-1 bindende Region von ICAM-1 mittels Domänendeletlon und systematischerAminosäurensubstitution als Domäne 1 und 2 kartiert wurde. Folglich besteht sowohl strukturelle als auch funktionale Homologie. ICAM-2 ist das zweite Beispiel eines Angehörigen Giner Ig-Familie, das sich an ein Integrin bindet. Obwohl es kaum eine Rangordnung unter den Zelladhäsions-Rezeptoren gibt, wurde nachgewiesen, daß bei den Integrinen eine Reihe von Rezeptoren für extrazelluläre Matrixkomponenten Mehrfachliganden erkennen (Hynes, R.O., Cell 48,549-554 (1987]; Ruoslahti, E., u.a., Science 238,491-497 (1978]).

Weder ICAM-1 noch ICAM-2 enthält eine RGD-Sequenz und folglich kann die Art und Weise der Erkennung durch LFA-1 andere sein als die der Integrine, die extrazelluläre Matrixkomponenten binden (Hynes, R.O., Cell 48,549-554 (1987); Ruoslahti, E., u. a., Science 238,491-497 (1987]). Die zellulären Liganden, die von Mac-1 und ρ 150,95 erkannt wurden - Leukozytenintegrine, die eng mit LFA-1 verwandt sind - gehören möglicherweise zur gleichen Ig-Unterfamilie. Kürzlich wurde gezeigt, daß ICAM-1 ein Rezeptor für die wichtige Gruppe der Rhinoviren ist, die 50% der Erkältungskrankheiten verursachen. ICAM-2 kann ebenfalls als Rezeptor für Rhinoviren oder andere Picornaviren wirken. Es kann also in einer Therapie zur Unterdrückung (d. h. Verhinderung der Abschwächung) von Infektionen genutzt werden, die von solchen Viren verursacht werden.

Eine Familie von Liganden für LFA-1 unterstreicht die Bedeutung dieses Erkennungsweges und kann ein Mechanismus für die Vermittlung der Feinspezifik und der funktionalen Vielfalt sein. Einige Unterschiede zwischen ICAM-1 und ICAM-2 sind von potentieller Bedeutung. ICAM-1 ist auf den meisten Zellen induzierbar, während die ICAM-2-Expression durch Cytokine auf den bisher getesteten Zellen nicht beeinflußt wird. Es wird erwartet, daß wegen der drei zusätzlichen Domänen auf ICAM-1 sein LFA-1 -Bindungsort weiter von der Zelloberfläche weg angesiedelt ist als das bei ICAM-2 der Fall ist, was darauf hinweist, daß bei der Wechselwirkung von LFA und ICAM-2 ein engerer Kontakt zwischen den Zellen erforderlich ist als bei der Wechselwirkung zwischen LFA-1 und ICAM-1. Wenn die beim Spülen wirkende Scherkraft erhöht wird, werden mit ICAM-2 transf izierte COS-Zellen leichter als mit ICAM-1 transfizierte COS-Zellen von mit LFA-1 beschichtetem Plastmaterial abgelöst. Das kann auf die geringere Größe von ICAM-2 zurückzuführen sein, wodurch es auf dem künstlichen Substrat für LFA-1 weniger gut zugänglich ist. Es kann aber auch auf Sequenzunterschiede, die Affinitätsunterschiede vermitteln, zurückzuführen sein. Die einzelnen zytoplasmatischen Domänen von ICAM-1 und ICAM-2 können unterschiedliche Signale vermitteln oder eine unterschiedliche Lokalisierung auf der Zelloberfläche bewirken. Abhängig davon, ob ICAM-1 oder ICAM-2 gebunden ist, können auch die Signalisierung oder die Wechselwirkung von LFA-1 mit dem Zellskelett unterschiedlich sein. ICAM-1 und ein zweiter LFA-1-Gegenrezeptor, ICAM-2, stellen folglich eine Unterfamilie der Immunglobulin (Ig)-Großfamilie dar (Staunton, D.E., u.a., Cell 52,925-933 (1988]). Diese Literaturangabe ist zu Vergleichszwecken hierin aufgenommen). ICAM-1 besitzt fünf Ig-ähnliche C-Domänen, während ICAM-2 zwei besitzt, die mit den Amino-terminalen Domänen von ICAM-1 besonders eng verwandt sind. ICAM-1 und ICAM-2, die auf einer Vielzahl von Zelltypen exprimiert werden, unterstützen verschiedene von der Leukozytenadhäsion abhängige Funktionen, u. a. die Induktion und Effektorfunktionen in der Immunantwort. Die Expression von ICAM-1 kann durch Cytokine stark induziert werden, und folglich kann das LFA-1/ICAM-1-Adhäsionssystem bei einer Entzündung die Wanderung und Lokalisierung von Leukozyten lenken (Rothlein, R., J. Immunol. 137, 1270-1274 (1986]); Marlin, S.D., u.a., Cell 51,813-819 [19871; Kishimoto,T.K., u.a., Adv. Immunol.46,149-182 [1989]; Dustin, M.L., u.a., Immunol. Today 9,213-215 [1988], alle diese Literaturangaben werden zu Vergloichszwecken hierin aufgenommen). ICMA-1-Reste, von denen weiter oben festgestellt wurde, daß sie für die LFA-1-Bindung wichtig sind, sind in anderen ICAMs beibehalten (Staunton, D.E., u. a., Nature 339,61-64 (1989). Dieser Hinweis ist zu Vergleichszwecken hierin aufgenommen). Menschliches ICAM-1 weist 50%ige Identität mit Mäuse-ICAM-1 und 35%ige Identität mit menschlichem ICAM-2 auf (Staunton, D. E., u. a., Nature 339,61-64 [1989]). Die für die LFA-1-Bindung wichtigsten Reste - E34 und Q73 - sind sowohl im ICAM-1 der Maus als auch im menschlichen ICAM-2 enthalten. Das stimmt überein mit der sowohl bei Mäuse-ICAM-1 als auch menschlichem ICAM-2 beobachteten Fähigkeit (Staunton, D.E., u. a., Nature 339,61-64 [1989]), sich an LFA-1 zu binden. Ein D2 N-verknüpfter Glycosylierungsort bei N156, der die LFA-1-Bindung beeinflußt, findet sich ebenfalls im ICAM-2. Mehrere Reste, die für die Bindung des Rhinovirus-14 von Bedeutung sind, d.h. Q58,G46,D71,K77 und R166, finden sich nicht im Mäuse-ICAM-1 oder im menschlichen ICAM-2 (Staunton, D.E., u.a., Cell 56,849-853 [1989]) (diese Literaturangabe wird zu Vergleichszwecken hierin aufgenommen), was mit der offensichtlichen Unfähigkeit der Mäusezellen (Colonno, R. J., u. a„ J. Virul. 57,7-12 [1986]) und des ICAM-2 zur Bindung des Rhinovirus-14 übereinstimmt.

Obwohl die Erfindung im Zusammenhang mit spezifischen AusfUhrungsbeispielen der Erfindung beschrieben wurde, dürfte es klar sein, daß andere Modifizierungen der Erfindung möglich sind, und diese Anmeldung umfaßt jede Abwandlung, Verwendung oder Anpassung der Erfindung, die im wesentlichen den Prinzipien der Erfindung entspricht, einschließlich derjenigen Abweichungen von der vorliegenden Offenbarung, die Bestandteil der bekannten odtr üblichen Praxis des Fachgebietes sind, auf das sich die Erfindung bezieht, bzw. die an den wesentlichen Merkmalen vorgenommen werden, die in den nachfolgenden Patentansprüchen dargelegt sind.

Claims

1. ICAM-2 oder ein funktionales Derivat, dadurch gekennzeichnet, daß es im wesentlichen frei von natürlichen Verunreinigungen ist.

2. iCAM-2 nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ICAM-2 zusätzlich in der Lage ist, sich an ein auf der Oberfläche einer Zelle vorhandenes Molekül oder an ein Virus zu binden.

3. ICAM-2-Molekül nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Molekül mindestens ein Polypeptid aus der Gruppe enthält, die umfaßt:

(a) -S-S-F-G-Y-R-T-L-T-V-A-L-;

(b) -D-E-K-V-F-E-V-H-V-R-P-K-;

(c) -G-S-L-E-V-N-C-S-T-T-C-N-;

(d) -H-Y-L-V-S-N-I-S-H-T-D-V-;

(e) -S-M-N-S-N-V-S-V-Y-Q-P-P-;

(f) -F-T-I-E-C-R-V-P-T-V-E-P-;

(g) -G-N-E-T-L-H-Y-E-T-F-G-K-; (h) -T-A-T-F-N-S-T-A-D-R-E-D-; (i) -H-R-N-F-S-C-L-A-V-L-D-L-; (j) -M-V-I-I-V-T-V-V-S-V-L-L-;

(k) -S-L-F-V-T-S-V-L-L-C-F-I-; und (I) -M-G-T-Y-G-V-R-A-A-W-R-R-.

4. Rekombiniertes DNA-Molekül, dadurch gekennzeichnet, daß es in der Lage ist, ICAM-2 oder dessen funktionales Derivat zu codieren.

5. DNA-Molekül nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß ICAM-2 oder dessen funktionales Derivat in der Lage ist, mindestens ein Polypeptid aus der Gruppe zu codieren, die umfaßt:

(a) -S-S-F-G-Y-R-T-L-T-V-A-L-;

(b) -D-E-K-V-F-E-V-H-V-R-P-K-;

(c) -G-S-L-E-V-N-C-S-T-T-C-N-;

(d) -H-Y-L-V-S-N-I-S-H-T-D-V-;

(e) -S-M-N-S-N-V-S-V-Y-Q-P-P-;

(f) -F-T-I-E-C-R-V-P-T-V-E-P-;

(g) -G-N-E-T-L-H-Y-E-T-F-G-K-; (h) -T-A-T-F-N-S-T- \-D-R-E-D-; (i) -H-R-N-F-S-C-L-A-V-L-D-L-; (j) -M-V-I-I-V-T-V-V-S-V-L-L-;

(k) -S-L-F-V-T-S-V-L-L-C-F-I-; und (I) -M-G-T-Y-G-V-R-A-A-W-R-R-.

6. Rekombiniertes DNA-Molekül nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Molekül zusätzlich in der Lage ist, ICAM-2 oder dessen funktionales Derivat in einer Zelle zu exprimieren.

7. Antikörper oder Antikörperfragment, dadurch gekennzeichnet, daß er (es) in der Lage ist, ein aus der ICAM-2 und ein funktionales Derivat von ICAM-2 umfassenden Gruppe ausgewähltes Molekül zu binden.

8. Antikörper nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Molekül in der Lage ist, sich an einen an der Oberfläche der Zelle befindlichen Rezeptor zu binden und aufgrund der Bindung des Antikörpers an das Molekül die Fähigkeit des Moleküls, sich an das Rezeptormolekül zu binden, beeinträchtigt,

9. Hybridomzelle, dadurch gekennzeichnet, daß sie den nnonoklonalen Antikörper nach Anspruch produziert.

10. Methode zur Produktion einer gewünschten Hybridomzelle, die einen Antikörper produziert, der in der Lage ist, sich an ICAM-2 oder sein funktionales Derivat zu binden, dadurch gekennzeichnet, daß folgende Schritte ausgeführt werden:

(a) Immunisierung eines Tieres mit einer ICAM-2 exprimierenden Zelle

(b) Verschmelzung der Milzzellen des Tieres mit einer Myelomzellinie

(c) Schaffung von Voraussetzungen, daß die verschmolzenen Milz- und Myelomzellen Antikörper absondernde Hybridomzellen bilden und

(d) Screening der Hybridomzellen nach der gewünschten Hybridomzelle, die in der Lage ist, einen Antikörper zu produzieren, der in der Lage ist, sich an ICAM-2 zu binden.

11. Methode zur Behandlung von Entzündungen bei einem Säugetierprobanden, dadurch gekennzeichnet, daß dem eine solche Behandlung benötigenden Probanden eine zur Unterdrückung der Entzündung ausreichende Menge eines entzündungshemmenden Agens verabreicht wird, wobei das entzündungshemmende Agens aus der Gruppe ausgewählt wird, do umfaßt: einen Antikörper, der in der Lage ist, sich an ICAM-2 zu binden; ein Fragment eines Antikörpers, wobei das Fragment in der Lage ist, sich an ICAM-2 zu binden; ICAM-2; ein funktionales Derivat von ICAM-2; und einen Nicht-Immungiobinantagonisten von ICAM-2, der nicht ICAM-1 oder ein Angehöriger der CD-18-Molekülfamilie ist.

12. Methode nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Entzündung eine Reaktion auf ein Leiden ist, das aus der Gruppe ausgewählt wird, welche umfaßt: verzögerte Hypersensitivitätsreaktion, Psoriasissymptom, Autoimmunkrankheit, Abstoßung eines Organoder Gewebetransplants.

13. Methode nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Autoimmunkrankheit zu einet folgende Leiden umfassenden Gruppe gehört: Reynaud-Syndom, Autoimmunthyroiditis, EAE, multiple Sklerose, Rheumatoid-Arthritis und Lupus erythematosus.

14. Methode nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Entzündung eine Reaktion auf ein Leiden ist, das zu der Gruppe gehört, die umfaßt: Atemnotsyndom im Erwachsenenalter (ARDS), Syndrom durch Schädigung mehrerer Organe nach Septikämie oder Trauma, Schädigung des Myokards oder anderer Gewebe nach Behebung einer Durchblutungsstörung, akute Glomerulonephritis, sekundäre Arthritis, Dermatosen mit akuten entzündlichen Komponenten, akute eitrige Meningitis oder andere entzündliche Störungen des Zentralnervensystems, Hitzeschäden, Hämodialyse, Leukapherese, Colitis ulcerosa, Crohnsche Krankheit, nekrotisierende Enterocolitis, Syndrome, dia mit Granulozytentransfusion in Zusammenhang stehen und CytokininduzierteToxizität.

15. Methode zur Unterdrückung der Metastasenbildung einer Tumorzelle im blutbildenden Gewebe wobei diß Zelle für ihre Wanderung einen funktionalen Angehörigen der CD-18-Familie benötigt - dadurch gekennzeichnet, daß einem diese Behandlung benötigenden Patienten eine zur Unterdrückung der Metastasenbildung ausreichende Menge eines Agens verabreicht wird; wobei das Agensaus der Gruppe ausgewählt wird, die umfaßt: einen Antikörper, der in der Lage ist, sich an ICAM-2 zu binden; einen Toxin-derivatisierten Antikörper, der in der Lage ist, sich an ICAM-2 zu binden; ein Fragment eines Antikörpers, wobei das Fragment in der Lage ist, sich an ICAM-2 zu binden; ein Toxin-derivatisiertes Fragment eines Antikörpers, wobei das Fragment in der Lage ist, sich an ICAM-2 zu binden; ICAM-2; ein funktionales Derivat von ICAM-2; einen Nicht-Immunglobulinantaoonisten von ICAM-2, der nicht ICAM-Ί oder ein Angehöriger der CD-18-Molekülfamilie ist.

16. Methode zur Unterdrückung des Wachstums einer ICAM-2 exprimierenden Zelle, dadurch gekennzeichnet, daß einem eine solche Behandlung benötigenden Patienten eine zur Unterdrückung des Wachstums ausreichende Menge eines Agens verabreicht wird, wobei das Toxin aus der Gruppe ausgewählt wird, die umfaßt: einen Antikörper, der in der Lage ist, sich an ICAM-2 zu binden; einen Toxin-derivatisierten Antikörper, der in der Lage ist, sich an ICAM-2 zu binden; ein Fragment eines Antikörpers, wobei das Fragment in der Lage ist, sich an ICAM-2 zu binden; ein Toxin-derivatisiertes Fragment eines Antikörpers, wobei das Fragment in der Lage ist, sich an ICAM-2 zu binden; ICAM-2; ein funktionales Derivat von ICAM-2; einen Nicht-Immunglobulinantagonisten von ICAM-2, der nicht ICAM-1 oder ein Angehöriger der CD-18-Molekülfamilie ist; einen Toxin-derivatisierten Angehörigen der CD-18-Molekülfamilie und ein Toxin-derivatisiertes funktionales Derivat eines Angahörigen derCD-ie-Molekülfamilie.

17. Methode zur Unterdrückung des Wachstums einer LFA-1 exprimierenden Tumorzelle, dadurch gekennzeichnet, daß einem eine solche Behandlung benötigenden Patienten eine zur Unterdrückung des Wachstums ausreichende Menge Toxin verabreicht wird, wobei dasToxin aus der Gruppe ausgewählt wird, die ein Toxin-derivatisiertes ICAM-2 und ein Toxin-derivatisiertes funktionales Derivat von ICAM-2 umfaßt.

18. Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß ein Agens aus der Gruppe ausgewählt wird, die umfaßt: einen Antikörper, der in der Lage ist, sich an ICAM-2 zu binden; ein

Fragment eines Antikörpers, wobei das Fragment in der Lage ist, sich an ICAM-2 zu binden; ICAM-2; ein funktionales Derivat von ICAM-2 und einen Nicht-Immunglobulinantagonisten von ICAM-2, der nicht ICAM-1 oder ein Angehöriger der CD-18-Familie ist.

19. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß sie zusätzlich ein immunsuppressives Agens enthält.

20. Methode zum Nachweis des Vorhandenseins einer ICAM-2 exprimierenden Zelle, dadurch gekennzeichnet, daß

(a) die Zelle oder ein Extrakt der Zelle in Anwesenheit eines Nucleinsäuremoleküls inkubiert wird, wobei das Nucleinsäuremolekül in der Lage ist, sich zu ICAM-2 mRNA zu hybridisieren und

(b) bestimmt wird, ob das Nucleinsäuremolekül zu einem in derZelle oder in dem Extrakt der Zelle enthaltenen komplementären Nucleinsäuremolekül hybridisiert wurde.