PT93394B - Processo para a preparacao de celulas de hibridonas produzindo anticorpos ligaveis a moleculas de adesao intercelular - Google Patents

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ENQUADRAMENTO GERAL DA. INVENÇÃO

A presente invenção refere-se à molécula de adesão intercelular: 2 (ICAM-2), que é envolvida no processo através do qual as populações de linfócitos reconhecem e aderem a substratos celulares de modo a que eles podem migrar para sítios de inflamação e interactuar com células durante reacções inflamatórias, A presente invenção refere-se adicionalmente a moléculas de ligandos capazes de se liga- 1 -

rem a moléculas de adesão intercelular ICAM-2 e às utilizações da molécula de adesão intercelular e das moléculas de ligando.

Descrição do E_stado da Técnica Relacionada

Os leucócitos tem de ser capazes de se ligarem a substratos celulares a fim de defenderem apropriadamente o hospedeiro contra invasores estranhos tais como bactérias ou vírus. Um excelente resumo do sistema de defesa encontra-se no trabalho de H. W. Eisen (Microbioloqy, 3^a Edição, Harper & Row, Filadélfia PA (1980), páginas 290- 295 e 381 - 418).

Os leucócitos tem de ser capazes de se ligarem a células endoteliais de modo que podem migrar da circulação para sítios de inflamação em progresso. Além disso devem ligar-se a células que apresentam antigenes de modo que possa ocorrer uma resposta imune específica normal e, finalmente, devem ligar-so a células alvo apropriadas de modo que possa ocorrer a lise de células infectadas por vírus ou células de tumores.

Recentemente, as moléculas superficiais de leucócitos envolvidos no mecanismo dessa ligação foram identificadas usando tecnologia de hibridomas. Resumidamente foram identificados anticorpos monoclonais dirigidos contra células T humanas (:D. Davignon e col., Proc. N_atl, Acad. Sei. USA, 78, 4535 - 4539 (1981)) e células de baço de rato (T. Springer e col. , Eur. J. Immunol. 9 : 301 - 306 (1979)) que se ligam às supex'fícies dos leucócitos e inibem as funções relacionadas com a ligação acima descritas (T. Springer e col. Fed. Proc. 44 : 2660 - 2663 (1985)).

As moléculas identificadas por estes anticorpos foram designadas Macél e Antigenes-1 associado com a função dos linfócitos (LFA-1). Mac-1 é um hétero-dímero

que se encontra em macrófagos, granulócitos e linfócitos granulares de grandes dimensões. LFA-1 é um hétero-dímero que se encontra na maior parte dos linfócitos (T. A. Springer e col./ Immunol. Rev. 68 : 111 - 135 (1982)). Estas duas moléculas e mais uma terceira molécula, pl50,95 (que tem uma distribuição nos tecidos semelhante a Mac-1) desempenham um papel importante na adesão celular (G. Keizer e col.,

Eur. J. Immunol.. 15 : 1142 - 1147 (1985)).

As moléculas dos leucócitos acima descritos verificou-se serem membros de uma família relacionada com as glicoprotelnas (F. Spancbez-Madrid e col., J. Exper. Med. 158 : 1785 - 1803 (1983); G. D. Keizer e col., Eur. J. Immunol.. 15 : 1142 - 1147 (1985)), designada como família CD-18 de glicqroteínas. Esta família de glicoprotelnas e compost^ por hetero-dímeros que tem uma cadeia alfa e uma cadeia beta. Muito embora a cadeia alfa de cada um dos antigenes seja diferente da do outro, verificou-se que a cadeia beta era muito conservada (F. Sancbez-Madrid e col., J. Expnr. Med. 158 : 1785 - 1803 (1983)). A cadeia beta da família das glicoprotelnas (por vezes designada como CD18) verificou-se ter um peso molecular igual a 95 kd, enquanto a cadeia alfa verificou-se variar entre 150 kd e 180 kd (T. Springer, Fed, Proc. 44 : 2660 - 2663 (1985)).

Muito embora as subunidades alfa das proteínas da membrana nSo compartilhem a extensiva homologia compartilhada pelas sub-unidades beta, a análise apertada das sub-unidades alfa das glicoprotelnas revelou que há semelhanças substanciais entre elas. Estudos sobre as semelhanças entre as sub-unidades alfa e beta das glicoprotelnas relaciona das com LFA-1 são proporcionadas por F. Sanchez-Madrid e col.

(J. Exper, Med. 158, 568 - 60 2 (1983): J. Exper. Med. 158 :

: 1785 - 1803 (1983) ) .

Identificou-se um grupo de indivíduos que são incapazes de exprimir quantidades normais de qualquer

membro desta família da proteína de adesão sobre a sua superfície das células dos leucófcitos (D.C. Anderson e col., Fed. Proc. 44 : 2671 - 2677 (1985); D. C. Anderson e col., J» Infect. Pis. 152 : 668 - 689 (1985)).

Os linfócitos destes pacientes apresentaram in vitro defeitos seroelhantes às contrapartidas normais cuja família CD18 tinba sido antagonizada por anticorpos.

Além disso, estes indivíduos eram incapazes de estabelecer uma resposta imune normal devido à incapacidade das suas células em aderir a substratos celulares. (D. C. Anderson e ço1., Fed. Proc. 44 : 2671 - 2677 (1985): (D. C. Anderson e col., j, Infect. Pis 152 : 668 - 689 (1985)). Estes dados mostram que as reações imunes são mitigadas quando os linfócitos são incapazes de aderir de maneira normal devido à falta de moléculas de adesão funcionais da família CD-18.

Assim, em resumo, a capacidade dos leucócitos para manterem a saúde e a viabilidade de um animal necessita que eles sejam capazes de aderir a outras células (tais como células endoteliais). Esta aderência verificou-se necessitar de eontactos de células a célula que envolvem moléculas receptoras específicas presentes na superfície das células dos leucócitos. Estes receptores permitem que o leucócito adira a outros leucócitos ou a células endoteliais e outras células não vasculares. Verificou-se que as moléculas receptoras das superfícies das células estavam altamente relacionadas umas com as outras. Os seres humanos cujos leucócitos não possuem estas moléculas receptoras nas superfícies das células possuem infecções crónicas e recorrentes, assim como outros sintomas clínicos incluindo respostas defeituosas a anticorpos.

Como a adesao dos leucócitos está envolvida no processo através do qual o tecido estranho é identificado ou rejeitado, uma compreensão deste processo tem uma importância significativa nos campos da transplantação de órgãos, enxertia de tecidos, alergia e oncologia.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-sa à molécula da adesão intercelular 2 (ICAM-2), assim como aos seus derivados funcionais. A invenção refere-se adicionalmente a anticorpos e fragmentos de anticorpos capazes de inibirem a função de ICAM-2 e a outros inibidores da função de ICAM-2. Adicionalmente, a invenção refere-se a utilizações de todas as moléculas acima descritas oara fins de diagnóstico e para fins terapêuticos.

Pormenorizadamente, a invenção refere-se à molécula de adesão intercelular ICAM-2 ou a um seu derivado funcional, substancialmente isenta de contaminantes naturais.

A invenção refere-se também a ICAM-2 que contém, pelo menos, um polipeptido escolhido do grupo que consiste em (a) -S-S-F-G—Y-R-T-L-T-V—A-L-;

(b) -D-E-K-V-F-E-V-II-V-R-P-K- ;

(_c) -G-S-L-E-V-N-C-S-T-T-C-N-;

(d) -H-Y-L-V-G-N-I-G--H-T-D-Y- ;

(_e) -S-M-N-S-N-V-C-Y-Y-Q-P-P- ;

(f) -F-T-I-E-C-R-V-P-T-V-S-P-;

(g) -G-N-E-T-L-H-Y-E-T-F-G-K-;

(h) -T-A-T-F-N-G-T-A-D-R-3-D-;

(i) -H-R-N-F-G-C-L-A-V-L—D-L-?

(j) -M-V-I-I-V-T-V-V-G-V—L-L-;

(k) -S-L-F-V-T-5-V-L-L-C-F-I-; e (l) -M-G-T-Y-G-V-R-A-A-W-R-R-.

A presente invenção proporciona uma molécula de ADN recombinante ou sintética capaz de codificar ou de expressar ICAM-2 ou um seu derivado funcional.

A invenção refere-se adicionalmente a um anticorpo e, especialmente, a um anticorpo monoclonal, capaz de se ligar a uma molécula escolhida do grupo que consiste em ICAM-2 e os derivados funcionais de IGAM-2.

A invenção refere-se também a uma molécula de hibridoma capaz de produzir o anticorpo monoclonal acima descrito.

A invenção refere-se também a um processo para a preparação de unua célula de hibridoma pretendida que produz o anticorpo que é capaz de se ligar a ICAM-2 ou aos seus derivados funcionais, que compreende as operações que consiste em

a) se imunizar um animal com um imunológico escolhido do grupo que consiste em uma célula que expressa ICAM-2, uma membrana de uma célula que expresse ICAM-2, ICAM-2, ICAM-2 ligadas a um veículo, um fragmento de péptido de ICAM-2 e um fragmento de péptido de ICAM-2 ligado a uma substância veicular;

b) se fundirem as células 4e baço do animal com uma linha de células de mieloma;

c) permitir que as células fundidas de baço e de mieloma formem células de hibridoma que segrega o anticorpo;

e

d) eeleccionar as células de hibridoma relativamente à célula de hibridoma pretendida que é capaz de produzir um anticorpo capaz de se ligar a ICAM-2.

A invenção também se refere a um processo para o tratamento de inflamações provenientes de uma resposta do sistema de defesa específico num mamífero paciente, que compreende fornecer-se a um paciente que necessita este tra6

tamento uma quantidade de um agente anti-inflamatório suficiente para suprimir a inflamação, caracterizado pelo facto de o agente anti-inflamatório ser escolhido do grupo que consiste em um anticorpo capaz de se ligar a ICAM-2, um fragmento do anticorpo, fragmento esse que é capaz de se ligar a ICAM-2; ICAM-2; um derivado funcional de ICAM-2? e a um antagonista nã imunoglobulínico de ICAM-2 diferente de ICAM-2 ou um membro da família de moléculas CD-13.

A invenção também se refere a um processo para suprimir a metástese cie uma célula de tumor hematopiélico, tendo a célula um mambro da família CD-18 (especialmente LFA-1) para migração, processo esse gue compreende fornecer-se a um paciente que necessita o tratamento uma quantidade de um agente suficiente para suprimir a metástase; caracterizado pelo facto de o referido agente ser escolhido do grupo que consiste em um anticorpo capaz de se ligar a ICAM-2; um anticorpo derivado derivatizado com toxina capaz de ligar-se a ICAM-2; um fragmento de um anticorpo, fragmento esse que é capaz de ligar-se a ICAM-2; um fragmento derivatizado com toxina de um anticorpo, sendo o referido fragmento capaz de se ligar a ICAM-2; ICAM-2; um derivado funcional de ICAM-2; uma ICAM-2 derivatizada com toxina; e um derivado funcional derivatizado com toxina de ICAM-2; um antagonista diferente de imunoglobulina de ICAM-2 diferente de ICAM-2 ou um membro da família de moléculas CD-18.

A invenção também se refere a um processo para suprimir o desenvolvimento de um<a célula de tumor que expresse ICAM-2, que compreende fornecer-se a um paciente que necessita esse tratamento uma quantidade de um agente suficiente para suprimir o crescimento, caracterizado pelo facto de o agente ser escolhido do grupo que consiste num anticorpo capaz de se ligar a ICAM-2; um anticorpo derivatizado com toxina capaz de se ligar a ICAM-2; um fragmento de um anticorpo, sendo esse fragmento capaz de se ligar a ICAM-2; um fragmento derivatizado com toxina de um anticorpo, sendo o frag7

mento capaz de se ligar a ICAM-2; ICAM-2; um derivado funcional de ICAM-2; um antagonista diferente de imunoglobulina de ICAM-2 e diferente de ICAK-I ou um membro da família CD-18 de moléculas; um membro derivado com toxina da família CD-18 da moléculas; um derivado funcional derivado com toxina de um membro da família de moléculas CD-18.

A invenção também se refere a um processo para detectar a presença de uma célula que expressa ICAM-2, o qual compreende

a) incubar-se a célula ou um extraeto da célula na presença de uma molécula de ácido nucleico, sendo a molécula de ácido nucleico capaz de hibridizar-se com mARN de ICAM-2; e

b) determinar-se se a molécula de ácido nucleico se tornou hiyridizada com uma molécula de ácido nucleico

--complementar presente na referida célula ou no mencionado extraeto da citada célula.

A invenção também se refere a uma composição farmacêutica que compreende

a) um agente anti-inflamatório escolhido do grupo que consiste num anticorpo capaz de se ligar a ICAM-2;

um fragmento de um anticorpo, sendo o fragmento capaz de se ligar a ICAM-2; ICAM-2; um derivado funcional de ICAM-2; e um antagonista diferente de imunoglobulina de ICAM-2 e diferente de ICAM-1 ou um membro da família CD-18 de moléculas, ou sozinho ou em combiunação com

b) um agente imuno-supressor.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

A Figura 1 representa a ligação de células C2DS transfectadas que expressam ICAM-1 e IGAM-2 para plástico revestido com LFA-1;

A) - células CDS transfectadas com cADN de ICAM-1 foram inseridas em placas revestidas com LFA-1 e analisou-se a expressão de ICAM-1 por citometria de passagem com imunofluorescência indirecta com anticorpo monoclonal anti-ICAM-1 RRl/1 como primário Mab. (células não fixadas (linhas ponteada), células não aderentes (linha tracejada), células aderentes (linha contínua):

t 51

B) - células CDS transfectadas marcadas com Cr que exprimem ICAM-1 ou ICAM-2 foram ligadas a plástico revestido com LFA-1 na presença de Mab.

A Figura 2 representa a sequência de nucleótidos e de aminoácidos de ICAM-2. A sequência de aminoácidos é numerada a começar do primeiro resíduo a seguir ao sítio de clivagem previsto do péptido de sinal. O péptido de sinal putativamente hidro fóbico e as sequências de transmembrana (TM) encontram-se sublinhados. Os sítios potenciais de glicosilação N-ligados estão dentro de uma caixa. 0 sinal de poli-adenilação putativo, AATACA, está sublinhado. Os sátios potenciais de glicosilação N-ligados estão dentro de uma caixa. 0 sanai de poli-adenilação putativa, AATACA, está sublinhado. Os sítios potenciais de glicosilação N-ligados estão dentro de uma caixa. 0 sinal de poli-adenilação putativo, AATACA, está sublinhado. Ambas as cadeias de cADN de ICAM-2 foram sequenciadas com CDM8 por síntese sequencial de primários de oligonucleótidos complementares e pelo sequenciamento de terminação da cadeia de di-desóxinucleótido (F. Sanger e col., Proc. Natl. Aead. Sei. USA 74 : 5463 - 5467 (1977)) de acordo cora as recomendações do fabricante (Sequenase, U.S. Biochemical).

A Figura 3 mostra os resultados das análises de hibridização de ARN e de ADN. A_s manchas de Northern (A e B) e de Southern í:C) foram ’'ibridizadas com o cADN de 32

ICAM—2 marcado de 1,1 kb ρ (A e C) e re-hibridizadas com o cADN de ICAM-1 marcado com °^ρ de 3 kb (B) (A e B) 6 microgramas de poli (A) ARN da linha de células de linfoma de Burkiqq, Ramos (pista l), células endoteliais (pista 2), células endoteliais estimuladas durante três horas com LPS (pista 3), uma linha de células 3-linfoblastóides imortalizadas com EBV, BBN (pista 4), células de carcinoma epitelial HeLa (pista 5), linhas de células de linfoma T, Jurkat (pista 6) e SKW-3 (pista 7) e linhas de células de promonócitos U937 (pista 8) ;

(C) - 6 microgramas de ADN genómico de linhas de células BLr-2 (pistas 1 e 4), SR-LCL (pistas 2 e 5) e Raji (pistas 3 è 6 digeridas com EcoRI (pistas 1 a 3) ou com HindIII (pistas 4 a 6) .

Os mARN de ICAM-2 e de ICAM-1 são indicados por setas.

A Figura 4 mostra a homologia entre ICAM-2 com ICAM-1, A sequência extracelular completa de duzentos e um resíduo de ICAM-2 foi alinhada com resíduos de ICAM-1 1 - 185, usando o programa ALIGN (Μ. O. Dayhoff e col.,

Methods Enzymol. 91 : 524 - 545 (1983)) e por inspecção. Os resíduos de ICAM-2 estão numerados. As identidades estão dentro de caixas. Dl e D2 indicam a fronteira dos domínios sene lhantes a Ig de ICAM-2 e de ICAM-1. As previsões da cadeia beta (ρ. Y. Chou e col., Biochemistry 13 ,· 211 - 245 (1974)) de ICAM-2 estão sublinhados na parte superior e de ICAM-1 estão sublinhados.

DESCRIÇÃO DAS FORMAS DE REALIZAÇÃO PREFERIDAS

Um aspecto da presente invenção refere-se à descoberta de uma ligando de ligação natural a LFA-1. Mo10

léculas tais como as da família CD-18 que são envolvidas no processo de adesão celular são referidas como moléculas de;

adesão.

I. LFA-1 e ICAM-1

A molécula de adesão de leucócitos LFA-1 medeia uma larga gama de linfócitos. monócitos. células naturais de destruição e interacções de granulócitos com outras células na imonidade e inflamação (T. A Springer e col., Ann. Rev. Immunol. .5, 223 - 252 (1987)).

LFA-1 é um receptor para a molécula de adesão intercelular 1 (ICAM-1), uma molécula superficial constutivamente expressa em alguns tecidos e induzida em outros por inflamação (S. D. Marlin e col., Cell 51 813 - 819 (1987); M. L. Dustin e col., J. Immunol.

137, 245 - 254 (1986); M. L. Dustin e col., Immunol Today j) : 213 - 215 (1983); Pedido de P_atente de I_nvenção Norte-Americana com o número de Serie 07/019 440, depositado em 26 de Fevereiro de 1987 e Pedido de Patente de Invenção N_orte-Americana com o Numero de série 07/250 446, depositado em 28 de Setembro de 1988, sendo ambos estes pedidos incorporados na presente memória descritiva como referencia).

A célula LFA-1 funciona tanto em interacções específicas de antigenes como independentemente de antigenes com citótóxicos T, T-auxiliadores, destruidores de células naturais, granulócitos e monócitos com,outros tipos de células (T. A. Springer e col., Ann. Rev. Immunol. J5 : 223 - 252 (1987); T. K. Kishimoto e col; Adv. Immunol. (1988, em impressão)). A LFA-1 é uma integrina de leucócitos com sub-unidades de alfa-glicoproteína e beta-glicoproteína.não covalentemente associadas de 180 e 95 kD.

ICAM-1 é uma glicoproteína de cadeia única que varia de massa atómica em diferentes tipos de células de 76 a 114 KD e é um membro da superfamília de Ig com cinco domínios semelhantes a C (M. L. Dustin e col., Immunol Todev 9 : 213 - 215 (1988); D. E. Staunton e col., Ce11 52 : 925 - 933 (1988); D. Simmons e col·., Nature 331 : 624 - 627 (1988) ) .

ICAM-1 é fort emente indutível com citoquinas incluindo IFN-gama, TNF e Tl-1 numa larga variedade de tipos de células (M. L. Dustin e col./ Immunol. Today 9 : 213 - 215 (1988)). A indução de ICAM-1 em células epiteliais, células endoteliais e fibroblastos medeia a adesão de IFA-1 dependente de linfocitos (M. L. Dustin e col.,

J. Immunol, 137 : 245 - 254 (1986); M. L. Dustin e co 1.,

J. Cell, Biol. 107 : 321 - 331 (1988); M. L. Dustin e col., J. Exo. Med. 167, 1323 - 1340 (1988). A adesão é bloqueada por tratamento prévio dos linfocitos com LFA-1 Mab ou pré-tratamento das outras células com ICAM-1 Mab (M. L. Dustin e col., J. Immunol. 13 7 : 245 - 254 (1986); M. L>. Dustin e col.,J. Exp. Med. 167 ; 1323 -1340 (1988)).

Resultados idênticos com ICAM-1 purificada em membrana artificiais ou em cápsulas de Petri demonstram que LFA-1 e ICAM-1 são receptores uma da outra (S. D. Marlin e col., Cell 51 í 813 - 819 (1987); M. W. Makgoba e col., Nature 331 : 86-88 (1988)). Para clareza, elas são referidas na presente memória descritiva como receptores e ligando, respectivamente.

Outras descrições de ICAM-1 são proporcionadas nos Pedidos de Patente de Invenção Norte-Americanas com os Numeros de Serie 07/045 963; 07/115 798;

07/155 943; 07/189 815; ou 07/250 446, todos os quais se incorporam na presente memória descritiva como referência na sua totalidade.

II.

ICAM-2

Um segundo ligando de LFA-1, distinto de ICAM-1, foi postulado (R. Rothiein e coi., J. Immunoi. 137 ,

1270 - 1274 (1986); M. W. Makgoba e col., Eur. J. Immunoi.

: 637 - 640 (1988): M. L. Dustin e col.,J. Cell. Biol.

107, 321 - 331 (1988)). A presente invenção refere-se a este segundo ligando, designado ICAM-2 (como atreviaturas de molécula de adesão intercelular-2).

A ICAM-2 difere da ICAM-1 na distribuição pelas células e pela falta de indução de citoquina. A ICAM-2 é uma proteína da membrana integral com 2 domínios semelhantes a Ig, enquanto ICAM-1 tem cinco domínios semelhantes a Ig (D. E. Staunton e col., Cell 32 : 925 - 933 (1988); D. Simcaons e col., Nature 331 :

624 - 627 (1988)). Acentuadamente, ICAM-2 está muito mais relacionado com os dois domínios mais terminais N de ICAM-1 (34% de identidade) do que ICAM-1 ou ICAM-2 está para outros membros da superfamília de Ig, demonstrando uma subfamíàia de ligandos semelhantes a Ig que se ligam à mesma família receptora de integrina.

III. Clonação de cADN de ICAM-2

Pode utilizar-se uma qualquer de uma variedade de maneiras de proceder para clonar 0 gene ICAM-2.

Um desses métodos prevê a análise da biblioteca de vectores vaivém de insertos de cADN (derivados de uma célula que expressa ICAM-2) pela presença de um inserto que contém um gene de ICAM-2. Esta análise pode realizar-se transfectando células com o vector de em seguida ensaiando relativamente à expressão de ICAM-2.

cADN de ICAM-2 é preferivelmente identificado quando se emprega uma nova modificação da maneira de proceder de Aruffo e Seed (B. Seed e col., Proc.

Natl. Acad. Sei. USA 84 : 3365 - 5369 (1987)) para identificar ligandos da molécula de adesão.

Neste método, prepara-se uma biblioteca de cADN a partir de células que expressam ICAM-2 (tais como células endoteliais ou linhas de células de Ramos, de linfoblástãides BBN B, de monócitos U937 ou de linfoblastéides SKW3). Preferivelmente a biblioteca de cADN prepara-se a partir de células endoteliais. Esta biblioteca é utilizada para transfectar células que não expressam normalmente ICAM-2 (tais como células CBS).

As células transfectadas são introduzidas numa placa de Petri que foi previamente revestida com LPA-1. As células CDS que foram transfectadas com as sequências que codificam ou ICAM-1 ou ICAM-2 e que expressam qualquer destes ligandos na sua superfície celular, aderem à LPA-1 existente na superfície da placa de Petri. As células não aderentes são lavadas e as aderentes são em seguida removidas da placa de Petri e cultivadas. As sequências recombinantes que expressam ICAM-1 ou ICAM-2 nestas células são em seguida removidas e sequenciadas para determinar se codificam ICAM-1 ou ICAM-2.

Numa forma de realização preferida do processo acima descrito, adiciona-se anticorpo anti-ICAM-1 à placa de Petri a fim de se evitar a aderência de células que expressam ICAM-1. A ligação de células CDS transfectadas com ICAM-2 para LPA-1 é inibida por EDTA e anticorpo monoclonal anti-LPA-1 (Mab), mas não é inibida por Mab anti-ICAM-1. Assim, nesta forma de realização, as células que expressam ICAM-1 são capazes de aderir à placa de Petri através de ICAM-1 e são, por consequência, na sua maior parte, lavadas com todos as outras células não aderentes. Como resultado, só as células que expressam ICAM-2 são

capazes de aderir à placa de Petri.

Assim, os clones de cADN são escolhidos por expressão em células CDS e por ligação para as células CDS que possuem ligando usando LFA-1 purificado cuncionalmente activo que foi previamente ligado às placas de Petri de plástico. Depois de ligação, as células não ade rentes são isentadas de células de ICAM-2⁺, enquanto que as células aderentes, libertadas do plástico revestido com LFA-1 por EDTA, são quase completamente ICAM-2+. A aderência de células de ICAM-1⁺ a plástico revestido com LFA-1 pode ser inibida com RRl/1 anti-ICAM-1 Mab.

Assim, de acordo com este processo para a clonação de cADN para ICAM-2, prepara-se uma biblioteca de cADN a partir de células endoteliais, que demonstram possuir tanto as componentes dependentes de ICAM-1 como independentemente de ICAM-1 de adesão dependente de LFA-1 (M. L. Dustin e col., J. Cell. Biol. 107, 321 - 331 (1988)) usando um plasmídeo apropriado, tal como o vector de plasmídeo CDMB.

As células CDS transfectadas são incubadas em placas de Petri revestidas com LFA-1 com Mab anti-ICAM-1 presente para diminuir a probabilidade de se isolar o cADN do ICAM-1. As células aderentes são eluídas com EDTA e o plasmídeos são isolados e amplificados em E. coli. Depois de aproximadamentetrês ciclos de transfecção, aderência e isolamento do plasmídeo e um fraccionamento do tamanho, os plasmídeos podem ser analisados por digestão com endonuclease de restrição. Aproximadamente 1/3 de plasmídeos que tem insertos maiores do que 1,0 kb, quando são introduzidos em células de CDS por transfecção, originando a aderência a LFA-1.

Como variante, pode obter-se um clone cADN de ICAM-2 usando o código genético (J. D. Watson em ___>

Molecular Biology of the Gene, 3^ã Edição, U. A. Benjamin, Inc., Menlo Perk, CA (1977), páginas 356 - 357) para determinar a sequência de um polinucleótido capaz de codificar a proteína ICAM-2.

Pode também obter-se um clone de cADN de ICAM-2 identificando a sequência de aminoácidos de fragmentos de péptidos da proteína ICAM-2 e usando então o código genético para construir moléculas de amostras de aligonucleétidos capazes de codificarem o péptido ICAM-2.

As amostras são então utilizadas para detectar (por meio de hibridação) os membros da biblioteca de cADN (preparados a partir de cADN de células que expressam ICAM-2) que codifica a proteína ICAM-2,

Técnicas como as acima descritas ou semelhantes permitiram com êxito a clonação de genes para desidrogenases de aldeídos humanas (L. C. Hsu e col.,

Proc. Natl Acad. Sei. USA 82 : 3771 - 3775 (1985), fibronec tina (S. Suzuki e col., Eur. Mol. Biol. Qrgan. J. 4 :

: 2519 - 2524 (1985)), 0 gene receptor de estrogénio humano (P. Walter e col., Proc. Natl. Acad. Sei, USA 82 :

: 7889 - 7893 (1985)), activador de piasmínogénio do tipo de tecido (D. Pennica e col·., Nature 501 : 214 - 221 (1983) e AON complementar de fosfatase alcalina de placenta humana (W. Kam e col., Proc. Natl. Acad. S ci USA 82 :

8715 - 8719 (1985)).

De acordo com ainda uma maneira de proceder alternativa de clonação do gene de ICAM-2, prepara-se uma biblioteca de vectores de expressão clonando ADN ou, mais preferivelmente. cADN de uma célula capaz de expressar ICAM-2 num vector de expressão. A biblioteca é então seleccionada de maneira a obterem-se os seus membros capazes de expressarem uma proteína que liga 0 anticorpo anti-ICAM-2 e que tem uma sequência de nucleótidos que são capazes de codificar polipeptidos que tem as mesmas sequên16

cias de aminoácidos que ICAM-2 ou fragmentos de ICAM-2.

gene de ICAM-a clonado, obtido por intermédio do uso de qualquer dos métodos acima descritos, pode ser operavelmente ligado a um vector de expressão e introduzido em células de bactérias ou células eucarióticas para produzir a proteína .ICAM-2. As técnicas para estas manipulaçães são referidas por T. Maniatis e col·., supra e são bem conhecidas na técnica.

IV. AGENTES DE ACORDO COM A PRESENTE INVENÇÃO:

ICAM-2 E SEUS DERIVADOS FUNCIONAIS, AGONISTAS E ANTAGONISTAS

A presente invenção dirige-se especialmente a ICAM-2, aos seusderivados funcionais e aos seus agonistas e aos seus antagonistas.

A. Derivados Funcionais de ICAM-2

Um derivado funcional de ICAM-2 é um composto que possui uma actividade biológica (ou funcionai ou estrutural) que é substancialmente semelhante a uma actividade biológica de ICAM-2. A expressão derivados funcionais pretende-se que inclua os ffagmentos, variantes, análogos ou derivados químicos de uma molécula.

Um fragmento de uma molécula tal como ICAM-2 pretende-se que se refira a qualquer subconjunto de polipéptidos da molécula. Os fragmentos de ICAM-2 que tem actividade de ICAM-2 e que são soláveis (isto é, não são ligados à membrana) são especialmente prefèridos.

Uma variante de uma molécula tal como ICAM-2 pretende-se que se refira a uma molécula substancial.

- 17 mente semelhante molécula inteira

em estrutura e função a um ou ou a um seu fragmento.

uma

Um análogo de uma molécula tal como ICAM-2 pretende-se que se refira a uma molécula substancial mente semerTEante-s om função ou a uma molécula inteira ou a um seu fragmento.

Uma molécula diz-se que é substancial mente semelhante a outra molécula se ambas as moléculas tiverem estruturas substancialmente semelhantes ou se ambas possuirem actividade biológica semelhante. Assim, desde que duas moléculas possuam actividades semelhantes, elas são consideradas variantes tal como o termo é utilizado na presente memória descritiva, mesmo que a estrutura de ambas as moléculas não for encontrada na outra ou se a sequência da residaos de aminoácidos não for idêntica.

Tal como é utilizado na presente memória descritiva, uma molécula diz-se ser um derivado químico de outra molécula quando contém agrupamentos quími cos adicionais que não fazem normalmente parte da molécula. Estes agrupamentos podem melhorar a solubilidade da molécu la, a sua absorção, o seu semiperíodo da duração biológica, etc. Os agrupamentos podem, como alternativa, diminuir a toxicidade da molécula, eliminar ou atenuar quaisquer efeitos secundários indesejáveis da molécula, etc. Os agrupamentos capazes de mediarem estes efeitos são descritos em Remington's Pharmaceutical Sciences (198o).

As moléculas derivatizadas com toxinas constituem uma classe especial de derivados químicos. Uma molécula derivatizada com toxina é uma molécula (tal como ICAM-2 ou um anticorpo) que contém um agrupamento de toxina. A ligação dessa molécula a uma célula traz o agrupamento da toxina à proximidade apertada da célula e, quer agrupamento de toxina, portanto, provoca a

morte da célula. Pode empregar-se qualquer agrupamento de toxina apropriado; no entanto, é preferível empregar toxinas tais como, por exemplo, a toxina do rícino, a toxina da cólera, a toxina da difteria, as toxinas de rádio-isótopos, as toxinas que formam canal através da membrana, etc. As maneiras de proceder para aoojfLar..· .tais agrupamentos tos à molécula são bem conhecidas na técnica.

Podem empregar-se derivados funcionais de ICAM-2 tendo até ccerca de 100 resíduos convenientemente por síntese in vitro. Caso assim se pretenda, estes fragmentos podem ser modificados fazendo reagir resíduos de aminoácidos pretendidos da proteína purificada ou bruta com um agente de derivatização orgânica capaz de reagir com cadeias lateriais escolhidas ou com resíduos terminais. Os derivados covalentes resultantes podem ser utilizados para identificar os resíduos importantes pela sua actividade biológica.

Os resíduos de cisteinilo são normalmente feitos reagir com alfa-halogeno-acetatos (e corresponaen temente aminas), tais como ácido cloro-acético ou cloro-acetamida, para originarem derivados de carboximetilo ou da carboxiamidometilo. Os resíduos de cisteinilo são também derivatizados por reacção com bromotriflúor-acetona, ácido aifa-bromo-beta-(5-imidazoii)-propiónico, fosfato de cloro-acetilo, N-alquil-maleimidas, dissulfureto de 3-nitro-2-piridilo, dissulfureto de metil-2-piridilo, p-cloro-mercuri-benzoato. 2-cloro-mercuri-4— nitrofenol ou cloro-7-nitro-benzo-2-oxa-l,3-diazol.

Os resíduos de histidilo são derivadizados por reacção com procarbonato de dietilo a pH 5,5 - 7.0 porque este agente é relativamente específico em relação à cadeia lateral da histidilo. 0 brometo de para-bromofenacilo é também útil; a reacção realiza-se preferivelmente em cacodilato de sódio 0,1 M a pH 6.0.

Os resíduos de lisinilo e de amino terminal são feitos reagir com anidridos do ácido succínico ou de outros ácidos carboxílicos. A derivatização com estas agentes tem o efeito de trocar a carga dos resíduos de lisinilo. Outros agentes apropriados para derivatizar os resíduos que contém alfa-amino são imido-ésteres, tais como picolinimidato de metilo; fosfato de piridoxal; piridoxal; cioroboro-hidreto; ácido trinitro-benzeno-sulfónico; 0-metil-iso-ureia; 2,4-pentanodiona; e reacção com glioxilato catalisada por trans-aminase.

Os resíduos de arginilo são modificados por reacção com um ou vários reagentes convencionais, entre os quais fenil-glioxal, 2,3-butanodiona, 1,2-ciclo-hexanodiona e ninidrina. A derivatização dos resíduos de arginina necessita que a reacção seja realizada em condições alcalinas por causa do valor elevado do pK do grupo funcional de quanidina. Além disso, estes reagentes podem reagir com os grupos da lisina, assim como o grupo de argininaépsilon-amino.

A modificação específica do resíduo de tirosiio per se foi estudada extensivamente, com particu lar interesse na introdução de marcadores espectrais nos resíduos de tirosiio por reacção com compostos aromáticos de diazónio ou de tetranitrometano. Mais vulgarmente, utilizam-se N-acetil-imidazol e tetranitrometano para formar a espécie O-acetil-tirosilo e os derivados de 3-nitro, respectivamente. Os resíduos de tirosiio são iodados usando ou ^^^1 para preparar proteínas marcadas para utilização em ensaios de rádio-imunidade, sendo apropriado o método da cloramina I.

Os grupos laterais de carboxilo (aspertilo ou glutamilo) são selectivamente modificados por reacção com carbo-di-imidas (R'-N-C-N-R') tais como i-ciclo-h.exil-3-/^- 2-morf olinil-(4-etil)_7-carbo-diimida

ou l-etil-3-(4-azonio-4,4-dimetil-pentil)-carbo-di-imida.

Além disso, os resíduos de aspartilo e de glutamilo são transformados em resíduos de asparaginilo e de glutaminilo por reacção com iões amónio.

A derivatização com agentes bifuncionais é util para a reticulação de uma molécula derivada funcional de ICAM-2 com uma matriz de suporte insolúvel em água ou uma superfície para utilização no processo para a clivagem de um polipéptido de fusão com derivados funcionais de ICAM-2 para libertar e recuperar o polipéptido clivado.

Os agentes de reticulação vulgarmente utilizados incluem, por exemplo, l,l-bis-(diazo-acetil)-2-fenil-etano, aldeído glutárico, ésteres de N-hidroxi-succinimida, por exemplo, ésteres de ácido 4-azido-salicílico, imido-ésteres homobifuncionais incluindo ésteres de di-succinimidilo, tais como 5,3'-ditio-bis-(succinimidil-propionato) e maleimidas bifuncionais, tais como bis-N-maleimido-1,8-octano. Os agentes de derivatização tais como 3-/^-(p-azidofenil)-ditio/Z-propio-imidato de metilo originam produtos intermediários que são capazes de formar reticulações na presença de luz.

Como variante, empregam-se para a mobilização da proteína matrizes insolúveis em água reactivas tais como hidratos de carbono activados com brometo de cianogénio e os substratos reactivos descritos nas Patentes de Invenção Norte-Americanas Números 3 969 287: 3 691 016;

195 128; 4 247 642; 4 229 537; e 4 330 440.

Os resíduos de glutaminilo e de asparaginilo são frequentemente desamidados com obtenção dos correspondentes resíduos de glutamilo e de aspartilo. Como variante, destes resíduos são desamidados sob condições ligeiramente ácidas. Qualquer forma destes resíduos pertence ao âmbito da presente invenção»

Outras modificações incluem a hidroxilação de prolina e de lisina, fosforilação de grupos hidroxilo de resíduos de serilo ou de teonilo, metilação do grupos alfa-amino de cadeias laterais de lisina, arginina e histidona (T. E. Oreighton, Proteins ; Structure and Molecule Properties, W. H. Preeman & Co., São Prancisco, pá ginas 79 - 86 (1983)), acetilação da amina da extremidade N e, em alguns casos, a amidação dos grupos carboxilo da extremidade C.

Podem também preparar-se derivados fun cionais de ICAM-2 tendo as sequências de aminoácidos altera das por mutações no ADN. A sequência de nucleótidos que codifica o gene de ICAM-2 está representada na Pigura 2. Estas variantes incluem, por exemplo, eliminação ou inserções ou substituições de resíduos dentro da sequência de aminoácidos representada na Figura 2. Qualquer combinação de eliminação, inserção e substituição pode também fazer-se para se chegar à construção final, desde que a construção final possua a actividade pretendida. Obviamente, as mutações que são feitas no ADN que codificam os variantes não devem colocar a sequência fora da estrutura de leitura e, preferivelmente, não criar regiões complementares que podem produzir uma estrutura de mAPN secundária (veja-se Pedido de Patente de Invenção Europeia Publicada Número 75 4-44).

A nível genético, estes derivados funcionais preparam-se geralmente por mutagénese dirigida ao sítio de nucleótidos no ADN que codifica a molécula de ICAM-2, produzindo assim ADN que codifica o derivado funcional e, em seguida, exprimindo o ADN em cultura de células recombinantes. Os derivados funcionais apresentam tipicamente a mesma actividade biológica qualitativa que o análogo de ocorrências natural. No entanto, podem diferir substancialmente nessas características em relação à molécula de ICAM-2 produzida normalmente.

Enquanto o sítio para introdução de uma variação na sequência de aminoácidos é prá-determinada, a mutação per se não precisa de ser pré-determinada. Por exemplo, para optimizar o comportamento de uma mutação em um determinado sítio, pode efectuar-se a mutagénese eleatória no codâo ou na região prtendida e os derivados funcio nais de ICAM-2 expressados serem escolhidos de acordo com a combinação óptima de actividade pretendida. As técnicas para fazer as mutações de substituição em sítios predeterimnados em ADN que tem uma sequência conhecida são bem conhecidos, por exemplo, a mutagénese específica de um sítio.

A preparação de uma molécula derivada de ICAM-2 funcional de acordo com a presente invenção realiza-se preferivelmente por mutagénese específica de um sítio de ADN que codifica um derivado funcional previamente preparado ou uma versão não variante da proteína. A mutagSoese específica do sítio permite a produção de derivados funcionais de ICAM-2 por intermédio da utilização de sequências de oligonucleótidos específicos que codificam a sequência de ADN da mutação pretendida, assim como um número suficiente de nucleótidos adjacentes para proporcionar uma sequência de primário de tamanho suficiente e uma complexidade da sequência suficiente para formar um duplex estável de ambos os lados da junção de eliminação que é atravessada. Tipicamente, prefere-se um primário com cerca de 20 a 25 nucleótidos de comprimento, com cerca de cinco a dez resíduos em ambos os lados da junção da sequência a serem alterados. Em geral, a técnica de mutagénese específica do sítio é bem conhecida na técnica, como é exemplificada peias publicações tais como Adelman e col.,

DNA 2 : 183 (1983), cuja descrição se incorpora na presente memória descritiva a título de referência.

Como é apreciado, a técnica de mutagéneses especifica do sítio emprega tipicamente um vector

fago gue existe tanto sob a forma de cadeia única como sob a forma de cadeia dupla. Os vectores típicos úteis na mutagénese dirigida para o sítio incluem vectores tais como o fago M13, por exemplo, como é descrito por Messing e col., Thlrd Cleveland Symposinm on Macromoléculas and Recombinant DNA, editor A. Walton, Elsevier, Amesterdão (1981), cujas indicações se incorporam na presente memória descritiva como referência. Estes fagos estão facilmente comercialmente à disposição e a sua utilização é geralmente bem conhecida pelos peritos no assunto. Como variantes podem empregar-se vectores de plasmídeo que contém um fago de cadeia única como origem de replicação (Veira e col., Meth. Enzymol, 153 :

: 3 (1987) para se obter ADN de cadeia única.

Em geral, a mutagénese dirigida ao sítio de acordo com a presente invenção realiza-se obtendo em primeiro lugar um vector de cadeia única que inclui dentro da sua sequência uma sequência de ADN que codifica a proteína relevante. 3?_repara-se um primário de oligonucleótido que possui a sequência mutada desejada, em geral sinteticamente, por exemplo, pelo processo de Crea e col., Proc.

Natl. Acad. Sei. USA 75 : 5765 (1978).

Este primário é em seguida anelizado com um vector gue contém a sequência de proteína de cadeia simples e submetido a acção de enzimas de polimerização de ADN tal como um fragmento de Klenow I de E. coll polimerase para completar a síntese da cadeia que possui a mutação. Assim, uma sequência mutada e a segunda cadeia possuem a mutação pretendida. Este vector hetero-duplex é então utilizado para transformar células apropriadas tais como células JMlOl e escolhem-se os clones que incluem vectores recombinantes que possuem o arranjo da sequência mutada.

Depois de se ter seleccionado este clone, a região da proteína mutada pode ser removida e colocada num vector apropriado para a produção da proteína, geralmente um vector de expressão do tipo que pode ser empregado para a transformação de um hospedeiro apropriado.

As eliminações das sequências de aminoácidos estão compreendidas, geralmente, entre cerca de um e trinta resíduos, mais preferivelmente entre um e dez resíduos e tipicamente são contíguas. As eliminações podem também compreender um domínio de imunoglobulina como, por exemplo, os domínios 1 e 2 de ICAM-2.

As inserções de sequência de aminoácidos incluem fusões da extremidade amino e/ou carboxilo de um resíduo com polipeptídos de comprimento essencialmente não restringido, assim como inserções dentro da sequência de resíduos de aminoácidos simples ou múltiplos. As inserções dentro da sequência (isto é, inserções dentro da sequência da molécula completa de ICAM-2) podem variar geralmente desde cerca de um até dez resíduos, mais preferivelmente entre um e cinco resíduos. Um exemplo de ama inserção na extremidade inclui uma fusão de uma sequência de sinal quer heteróloga quer homóloga na célula hospedeira na extremidade N da molécula para facilitar a secreção do derivado funcional de ICAM-2 de hospedeiros recombinantes.

O terceiro grupo de derivados funcionais são aqueles em que pelo menos um resíduo de aminoácido na molécula de ICAM-2 e preferivelmente apenas um foi removido e um resíduo diferente foi inserido em seu lugar. Esta substituições são feitas, preferivelmente, de acordo com a seguinte Tabela quando se pretende modular finamente as características da molécula de ICAM-2.

TABELA 1

Resíduo Original_ Substituições como Exemplos

Ala	gly?	ser
Arg	lys
Asn	gin?	his
Asp	glu
Cys	Ser	1
Gin	asn
Glu	asp
Gly	ala?	pro
His	asn?	gin
Ile	leu?	vai
Leu	ile?	vai
Lys	arg?	gin;	glu
Met	leu?	tyr?	ile
Phe	met?	leu?	tyr
Ser	thr
Thr	ser
Trp	tyr
Tyr	trp;	phe
Vai	ile?	leu

Mudanças substanciais da identidade funcional ou jimunológica são feitas escolhendo substituições que são menos conservativas do que as indicadas na Tabela 1, isto é, escolhendo resíduos que diferem mais significativamen te no seu efeito sobre a conservação de

a) a estrutura da cadeia do polipeptído na área de substituição, por exemplo, com a conformação de folha ou de hélice;

b) a carga ou hidrofobicidade da molécula do sítio pretendido; ou

c) o iconjunto da cadeia lateral.

A_s substituições gue, em geral, são esperadas são aquelas em que (a) a glicina e/ou a prolina são substituidas por outro arninoácido ou são retiradas ou inseridas; (b) um resíduo bidrofílico, por exemplo, serilo ou treonilo, é substituido para se introduzir (ou por) um resíduo hidrofóbico, por exemplo, leucilo, isoleucilo, fenil-alanilo, valilo ou alanilo; (c) um resíduo de cisteína é substituido para se obter (ou por) qualquer outro resíduo;

(d) um resíduo que tem uma c adeia lateral electropositiva, por exemplo, lisilo, arginilo ou histidilo, é substuido para obtenção de (ou por) um resíduo que tem uma carga electronegativa, por exemplo, glutamilo ou aspartilo; ou (e) um resíduo que tem uma cadeia lateral volumosa, por exemplo, fenil-alanina, é substituido para obtenção de (ou por) um resíduo que não tem essa cadeia lateral, por exemplo, glicina.

A maior parte das eliminações e das inserções e, de maneira particular, das substituições, não se espera que produza alterações radicais nas características da molécula de ICAM-2. No entanto, quando é difícil prever o efeito exacto da substituição, da eliminação ou da inser ção em avanço pelo facto de se fazer isso, qualquer perito no assunto aprecia que o efeito pode ser avaliado por ensaio de selecção de rotina.

For exemplo, tipicamente um derivado fun cional é feito por mutagénese específica do local do ácido nucleico que codifica a molécula natural de ICAM-2, a expres27

Γ\ f'.

são do ácido nucleico variante na cultura de células recornbinantes e, opcionalmente, a purificação da cultura de células, por exemplo, por adsorção de imuno-afinidade numa coluna de anticorpos da molécula anti-ICAM-2 (para absorver o derivado funcional ligando-o a pelo menos um epítopo imune restante) .

As mutações concebidas para aumentar a afinidade de ICAM-2 podem ser guiadas pela introdução de resíduos de aminoácidos que se encontram presentes em posições homólogas em ICAM-1. De maneira semelhante, estas moléculas de ICAM-2mutantes podem ser preparadas com falta de CHO ligado a N nas posições homólogas na molécula de ICAM-1.

A actividade do lisato das células ou do derivado funcional da molécula ICAM-1 purificado é em seguida selectionado num ensaio de selecção apropriado relativamente à característica pretendida. Por exemplo, uma alteração no carácter imunológico do derivado funcional tal como afinidades a determinado anticorpo, é medida por um ensaio de imunidade do tipo competitivo. Medem-se as alterações da actividade de imunodulação pelo ensaio apropriado. Modificações das propriedades da proteína tais como estabilidade redox ou térmica, período de tempo de semitransformação biológica, hidrofobi cidade, susceptibilidade à degradação proteolítica ou tendência para agregar com substâncias veiculares ou com formação de múltiperos são ensaiados por métodos conhecidos dos peritos correntes no assunto.

B. Aqonistas e Antagonistas de ICAM-2

Um agonista de ICAM-2 é um composto que melhora ou aumenta a estabilidade de ICAM-2 para realizar qualquer das suas funções biológicas. Um exemplo de um tal agonista é um agente que aumenta a capacidade de ICAM-2 para se ligar a um receptor celular ou a uma proteína de vírus.

Um antagonista de ICAM-2 é um compos to que diminui ou evita a capacidade de ICAM-2 para realizar qualquer das suas funções biológicas. Exemplos destes antagonistas incluem ICAM-1, derivados funcionais de ICAM-1 anticorpo anti-ICAM-2, anticorpo anti-LFA-1, etc.

Os ensaios de agregação celular descritos nos Pedidos de Patente de Invenção Norte-Americanas com os Números de Série 07/045 963; 07/115 798; 07/155 943; 07/189 815 ou 07/250 446, que foram todos incorporados na presente memória descritiva como referência na sua totalidade, são capazes de medir a agregação dependente de LFA-1 e podem ser empregados para identificar agentes que afectam a extensão da agregação de ICAM-2/LFA-1. Assim, esses ensaios podem ser empregados para identificar agonistas e antagonistas de ICAM-2,

Os antagon .istas podem actuar atenuando a capacidade de LFA-1 ou de ICAM-2 para medir a agregação. Adicionalmente, podem examinar-se agentes que não são imunoglobulinas (isto é, agentes químicos) utilizando o ensaio acima descrito para determinar se são agonistas ou antagonistas da agregação de ICAM-2/LFA-1.

G. Anticorpo Anti-ICAM-2 aatagonista de imunoglobulina preferi do de acordo com a presente invenção é um anticorpo em rela ção a ICAM-2. Os anticorpos apropriados podem ser obtidos por uma qualquer de uma variedade de maneiras de proceder.

Uma molécula antigénica, tal como ICAM-2, é naturalmente expressa nas superfícies de linfócitos. Assim, a introdução dessas células no animal apropriada como, por exemplo, por injecção intraperitonial, etc., tem como resultado a produção dos anticorpos capazes de se ligarem a ICAM-2 ou a outros membros da família CD-18 da mo·

- 29 léculas. Caso assim se pretenda, o soro desse animal pode ser retirado e utilizado como fonte de anticorpos policlonais capazes de ligarem essas moléculas.

Como variante, os anticorpos anti-ICAM-2 podem ser produzidos por meio de adaptação do método de R. P. Selden (Publicação do Pedido de Patente de Invenção Europeia Número 280 034) ou R. P. Selden e col., (Science 236 : 714 - 718 (1987)).

De acordo com essa adaptação, as células do animal apropriado (isto é, por exemplo, o rato, etc), são transfectadas com um vector capaz de expressar ou a molécula de ICAM-2 intacta ou um fragmento de ICAM-2. A produção de ICAM-2 nas células transfectadas do animal origina uma resposta imune do animal que conduz à produção de anticorpos anti-ICAM-2 pelo animal.

Como variante, os anticorpos anti-ICAM-2 podem ser obtidos introduzindo ICAM-2 ou os seus fragmentos de péptidos no animal apropriado. 0 animal imunizado pro duz anticorpo policlonal em resposta a essa exposição. A utilização de fragmentos de péptidos de ICAM-2 permite que se obtenham anticorpos específicos da região que são r eactivos apenas com o epítopo ou com os ipítopos contidos nos fragmentos do péptidos usados para imunizar os animais.

No entanto, é preferível remover esplenécitos de animais (imunizados de acordo com qualquer das maneiras acima descritas) para fundir essas células de baço com uma linha de células de mieloma e permitir que essas células da fusão formam uma célula de hibridoma e que segrega anticorpos monoclonais capazes de ligarem ICAM-2.

As células de hibridoma., obtidas de acordo com a maneira de proceder acima descrita, podem ser seleccionadas por uma variedade de métodos para identificar

as células de hibridoma pretendidas que segregam anticorpo capaz de se ligar a ICAM-2. Num ensaio de selecção preferido, essas moléculas são identificadas pela sua capacidade para inibir a agregação de expressão de ICAM-2, células de não expressão de ICAM-1.

Os anticorpos capazes de inibirem essa agregação são em seguida seleccionados novamente para determinar se inibem ou não essa agregação por ligação a ICAM-2 ou a um membro da família de moléculas CD-18.

Nesse ensaio de selecção podem empregar-se quaisquer meios capazes de distinguir ICAM-2 da família de moléculas DC-18. Assim, por exemplo, o antigene ligado pelo anticorpo pode ser analisado, por exemplo, por imunoprecipi tação e por electroforese em gel de poliacrilamida. E possível distinguir entre os anticorpos que se ligam a membros da família de moléculas CD-18 e os anticorpos que se ligam a ICAM-2 seleccionados a acapacidade do anticorpo para se ligar a células que expressam LFA-l, mas não ICAM-2 (ou vice versa) A capacidade de um anticorpo para se ligar a uma célula que expressa LFA-1 mas não ICAM-2 pode detectar-se por meios vulgarmente empregados por peritos de conhecimentos vulgar. Esses meios incluem imuno-ensaios (especialmente os que utilizam imunofluorescência), aglutinação celular, estudos de ligação a filtros, precipitação de anticorpos, etc.

Além dos derivados funcionais acima descritos de ICAM-2, outros agentes que podem ser utilizados de acordo com a presente invenção no tratamento de infecçSes ou de inflamações provocadas por vírus incluem anticorpos em relação a ICAM-2, anticorpos anti-idiotípico s' em relação a anticorpos anti-ICAM-2 e moléculas receptoras ou fragmentos dessas moléculas que são capazes dse ligar ã ICAM-2.

Os anticorpos para ICAM-2 (ou os derivados funcionais de ICAM-2) que podem ser hibridados podem ser policlonais ou monoclonais.

Os anticorpos anti-idiotípicos de interesse de acordo com a presente invenção são capazes de se ligarem em competição com (ou com exclusão de) ICAM-2. Estes anticorpos podem obter-se, por exemplo, subindo o anticorpo para o anticorpo anti-ICAM-2 e em seguida seleccionando o anticorpo relatívamente à sua capacidade de se ligar a um ligando de ligação natural de ICAM-2.

Como as moléculas da família CD-18 são capazes de se ligarem a ICAM-2, a administração destas moléculas (por exemplo, sob a forma de hétero-dímeros que tem sub-unidades tanto alfa como beta ou sob a forma de moléculas compostas apenas por uma sub-unidade alfa ou por uma sub-unidade beta ou sob a forma de moléculas que tem fragmentos de qualquer ou das duas sub-unidades) é capaz de competir com (ou excluir) HPV de se ligar a ICAM-21 presente nas células.

Os anticorpos de anti-agregação de acor do com a presente invenção pode ser identificadas e titulados de acordo com uma qualquer de uma variedade de maneiras de proceder. Por exemplo, pode medir-se a capacidade dos anticorpos para se ligarem diferencialmente a células que expressam ICAM-2 (tais como células endoteliais activadas) e a sua incapacidade para se ligarem a células que não conseguem expressar ICAM-2. Os encaios de agregação celular são os descritos nos Pedidos de Patente de Invenção Norte-Americanas com os Números de Série 07/045 965; 07/115 798; 07/155 945; 07/189 815 ou 07/250 446, que foram todos incorporados na sua globabilidade como referência na presente memória descritiva.

Gomo variante, pode medir-se a capacidade de os anticorpos para se ligarem a ICAM-2 ou a fragmentos de péptidos da ICAM-2. Como é facilmente apreciado por todos aqueles que tem conhecimentos comuns sobre o assunto, os ensaios acima referidos podem ser modificados

ou realizados por ordem sequencial diferente para proporcionar uma variedade de ensaios de selecção potencial, cada um dos quais é capaz de identificar e de discriminar entre anticorpos capazes de ligarem a ICAM-1 em comparação com membros da família de moléculas CD-18.

De acordo com um método especialmente preferido, o anticorpo pode ser seleccionado pela sua capacidade de se ligar a células CDS que expressam ICAM-2, mas não a células CDS que não expressam ICAM-2.

D. Preparação de Agentes de Acordo com a Presente Invenção

Os agentes de acordo com a presente invenção podem obter-se por processos naturais (tais como, por exemplo, induzindo um animal, planta, fungo, bactéria, etc., a produzir um antagonista diferente de imunoglobulina de ICAM-2 ou por induzir um animal a produzir anticorpos policlonais capazes de se ligarem a ICAM-2); por métodos sintéticos (como, por exemplo, utilizando o método de Merrifield para sintetizar polipéptidos para sintetizar ICAM-2, derivados funcionais de ICAM-2 ou antagonistas de proteína de ICAM-2 (ou imunoglobulina ou diferentes de imun globulina); por tecnologia de hibridoma (como, por exemplo, produzir anticorpos monoclonais capazes de se ligarem a ICAM-2): ou por tecnologia recombinante (como, por exemplo, para produzir os agentes de acordo com a presente invenção em diversos hospedeiros (isto é, fermentos, bactérias, fungos, células cultivadas de mamíferos, etc.) ou a partir de plasmídeos recombinantes ou vectores de vírus).

A escolha do método a empregar depende de factores tais como conveniência, rendimento pretendido, etc. Não é necessário empregar apenas um dos métodos, proce ssos ou tecnologias acima referidos para produzir um agente anti-inflamatório particular: os diferentes métodos, pro

cessos e tecnologias, acima referidas pode ser combinados a fim de se obter um agente particular.

V. UTILIZAÇÕES DE ICAM-2 E DOS SEUS DERIVADOS FUNCIONAIS, AGONISTAS E ANTAGONISTAS

A. Supressão da Inflamação

Um aspecto da presente invenção deriva da capacidade de ICAM-2 e dos seus derivados funcionais para interactuarem com receptores da família de moléculas CD-18, especiaimente LFA-1 ou proteínas de vírus (tais como as proteínas de rinovírus, etc.). Em virtude ca capacidade de ICAM-2 de interactuar com membros da família CD-18 de glicoproteínas, ela pode usar-se para suprimir (isto é, para evitar ou atenuar) a inflamaç.ão.

termo inflamação, tal como é utilizado na presenèe memória descritiva, pretende-se que inclua tanto as reacções do sistema específico de defesa comc as reacções do sistema de defsa não específico.

Tal como é utilizado na presente memória descritiva, a expressão sistema de dêfesa específico pretende-se que se refira ao componente do sistema imune que reage na presença de antigenes específicos.

A inflamação diz-se que resulta de uma resposta do sistema de defesa específico se a inflamação for provocada por, mediada por um associado com uma reacção do sistema de difesa específico. Os exemplos de inflam^ ção resultantes de uma resposta do sistema de defesa específico incluem a resposta a antigenes tais como vírus da rubéoia, doenças auto-imunes, resposta da hipersensibilidade do tipo retardado mediada por células T (como se observa, por exemplo, em indivíduos que tem reacção positiva no ensaio de Nantaux), etc. As doenças inflama- 34 -

tórias crónicas e a rejeição dos tecidos e de órgãos transplantados são exemplos de reacções inflamatórias do sistema de defesa específico.

Tal como se utiliza na presente memória descritiva, uma reacção do sistema de defesa não específico pretende-se que se refira a uma reacção mediada por leucócitos incapazes de memória imunológica. Essas células incluem granulócitos e macrófagos.

Tal como é utilizado na presente memória descritiva, diz-se que a inflamação resulta de uma res posta do sistema de defesa não específico se a inflamação f provocada por, mediada por ou associada com a reacção do sistema de defesa não específico. São exemplos de inflamação que resultam, pelo menos, parcialmente, de uma reacção do sistema de defesa não específico as que se incluem a inflamação associada a condições tais como o sindroma da deficiência respiratória dos adultos (ARDS) ou os síndromas de perturbação múltiploa de órgãos secundários à septicémia ou ao trauma; as perturbações provocadas por reperfusâo do miocárdio ou de outros tecidos; glomerolonefrite aguda; artrite reactiva, dermatosas com componentes inflamatórios agudos; meningite purulenta aguda ou outras perturbações inflamatórias do sistema nervoso central; perturbações térmicas; hemodiálise; leucoforese; colite ulcerativa; doença de Crohn; enterooolite necrotizante; síndromas associados com a transfusão de granulócitos; e toxicidade provocada por citoquina.

Como se referiu acima, a ligação dè molé cuias ICAM-2 aos membros da família de moléculas CD-18 é de importância fulcral na adesão celular. Através do processo de adesão, os linfócitos são capazes de controlarem continu mente um animal relativamente à presença de antigenes estra nhos. Muito embora estes processos sejam normalmente desejáveis, são também a causa da rejeição das transplantações de órgãos, rejeição de enxertos de tecidos e de muitas doen

ças auto-imunes. Por ccn sequência, quaisquer meios capazes de atenuarem ou de inibirem a adesão celular são altamente desejáveis em pacientes recipientes de transplantações de órgãos (especialmente transplantação de rins), enxertos de tecidos ou de pacientes com doenças auto-imunes.

Os anticorpos monoclonais relativamente a membros da família CD-18 inibem muitas funções dos leucócitos dependentes de adesão incluindo a ligação ao endotélio (D. Haskard e col., J. Immunoi. 137 : 2901 - 2906 (1986), adesões homotípicas (R. Rothiein e col., J. Ex.

Med. 163 : 1132 - 1149 (1986), proliferação de linfócitos provocada por antigenes e mitogenes (D. Davignon e col. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78 : 4535 - 4539 (1981)), formação de anticorpos (A. Eischer e col. , J. Immunoi. 136 : 3198 - 3203 (1986)), e funções efectuadoras de todos os leucócitos tais como a actividade lítica de células T citotóxicas (A. M. Krensky e col., J. Immunoi. 132 : 2180 - 2182 (1984), macrófagos (G. Strassman e col., J. Immunoi 136 : 4328 - 4333 (1986)) e todas as células envolvidas em reacções de citotoxicidade celular dependente de anticorpos (E. Kohl e col., J. Immunoi. 133 : 2972 - 2978 (1984)).

Em todas as funções acima mencionadas, os anticorpos inibem a capacidade dos leucócitos para aderir ao substrato celular apropriado que, por sua vez, iniba a saída final. Estas funções, na medida em que envolvem interaeções ICAM-2/LEA-1, podem ser suprimidas com anticorpo anti-ICAM-2.

Assim, os anticorpos monoclonais capazes de se ligarem a ICAM-2 podem ser empregados como agentes anti-inflamatórios em pacientes mamíferos. Significativamen te, estes agentes diferem dos agentes anti-inflamatórios gerais na medida em que são capazes de inibirem selectivamente a adesão e não oferecerem outros efeitos secundários tais como nefrotoxicidade que se encontram nos agentes con- 36 vencionais.

Como ICAM-2, particularmente sob a forma solúvel, é capaz de actuar da mesma maneira que um anticorpo em relação a membros da família CD-18, pode ser utilizado para suprimir a inflamação. Além disso, os derivados funcionais e antagonistas de ICAM-2 podem ser também empregados para suprimir a inflamação.

1. Supressoras da Hipersensibilidade do Tipo Retardado

As moléculas de ICAM-2 medeiam, parcialmente, os casos de adesão necessários para haver reacções inflamatórias tais como se reacções de hipersensibilidade do tipo retardado. Assim, anticorpos (especialmente anticorpos monoclonais) capazes de se ligarem a moléculas de ICAM-2 tem um potencial terapêutico na atenuação ou na eliminação dessas reacções.

Como variante, visto que ICAM-2 é um antagonista da interacção ICAM-2/LEA-1, ICAM-2 (particularmente sob a forma solubilizada) ou os seus derivados funcionais podem ser usados para suprimir as reacções de hipersensibilidade do tipo retardado.

Estas utilizações terapêuticas potenciais podem ser exploradas de acordo com uma qualquer de duas maneiras. Em primeiro lugar, pode administrar-se uma composição que contém um anticorpo monoclonal contra ICAM-2 a um paciente que experimenta reacções de hipersensibilidade do tipo retardado. Por exemplo, essas composições potem ser administradas a um indivíduo que tenha estado em contacto com antigenes tais como veneno de hera, veneno de carvalho, etc.

Na segunda forma de realização, o anticorpo monoclonal capaz de se ligar a ICAM-2 é administrado

ao paciente em conjugação com um antigene a fim de evitar uma reacção inflamatória subsequente. Assim, a administração adicional de um antigene com um anticorpo monoclonal que se liga a ICAM-2 pode temporariamente tornar tolerável o organismo do individuo à apresentação subsequente, àquele antigene,

2. Terapia de Doenças Inflamatórias Crónicas

Como os pacientes de LAD a que falta LFA-1 não conseguem realizar uma resposta inflamatóris, acredita-se que o antagonismo do ligando natural LFA-1, ICAM-2, também inibe uma resposta inflamatória. A capacidade de anticorpos contra ICAM-2 de inibirem a inflamação proporciona a base para a sua utilização terapêutica no tratamento de doenças infLamatórias crónicas e de doenças auto-imunes, tais como lupus eritematoso, tiroidite auto-imune, encefalomielite experimental alérgica (EAE), esclerose múltipla, algumas formas de diabetes, sindroma de Reynaud, artrite reumatóide, etc. Estes anticorpos podem também empregar-se como terapia no tratamento da psoríase. Em geral, podem empregar-se anticorpos monoclonais capazes de se ligarem a ICAM-2 do tratamento dessas doenças correntemen te tratáveis por terapia com esteróides.

De acordo com a presente invenção, essas respostas inflamatórias e de rejeição imunes podem ser suprimidas (isto é, evitadas ou atenuadas) administrando ao paciente que necessita esse tratamento uma quantidade de um agente anti-inflamatório suficiente para suprimir a referida inflamação.

Os agentes anti-inflamatórios apropriados incluem anticorpos capazes de se ligarem a ICAM-2; fragmentos de anticorpos, farmentos esses-que são capazes de se ligarem a ICAM-2; ICAM-2; derivados funcionais de ICAM-2; antagonistas diferentes de imunoglobuiina de ICAM-2

diferentes de ICAM-1 ou um antagonista diferente de imunoglobulina de ICAM-2 e diferentes de LEA-1. São especialmente preferidos os agentes anti-inflamatórios constituídos por derivados funcionais solúveis de ICAM-2.

Este tratamento anti-inflamatório pode incluir a administração adicional de um agente escolhido do grupo que consiste em anticorpos capazes de se ligarem a LPA-1; derivados funcionais de anticorpos, tendo os meneio nados derivados funcionais capazes de se ligarem a LEA-1; e antagonistas diferentes de imunoglohulina de LPA-1.

A presente invenção inclui ainda os métodos acima descritos para suprimir uma resposta inflamatória do sistema de defesa específico em que um agente imuno-supressor é adicionalmente fornecido ao paciente.

Esse agente é preferivelmente administrado a uma dose menor (isto é, uma dose sub-óptima) do que a que normalmente seria necessária. A utilização de uma dose sub-óptima é possível por causa do efeito sinórgico dos agentes de acordo com a presente invenção. Os exemplos de agentes imuno-supressores apropriados incluem dexametazona, azatioprina, ICAM-1, ciclosporina A, etc.

3. Terapia de Inflamação não Especifica

A presente invenção deriva parcialmente da descoberta de que a aderência de células granulócito-endoteliais resulta da interacção de glicoproteínas da famí lia CD-18 com o endotélio.

Como a adesão celular é necessária a fim de que os leucóicitos possam migrar para os sítios da inflamação e/ou transportar para fora várias funções efectuaioras que contribuim para a inflamação, os agentes que inibem a adesão celular atenuam ou evitam essas inflamações. Essas reacções inflamatórias são devidas a reacções do sistema de

- 39 defesa não específica, que são mediados por leucócitos incapazes de memória imunológica. Essas células incluem granulócitos e macrófagos.

Tal como é usado na presente memória descritiva, o termo inflamação pretende referir-se ao resultado de uma resposta do sistema de defesa não específica, se a inflamação for provocada por, mediada por ou associada com uma reacção do sistema de defesa não específica. Os exemplos de inflamação que resulta, pelo menos parcialmente, de uma reacção do sistema de defesa não específico incluem a inflamação associada com condições tais como o síndroma da perturbação respiratória de adultos (ARES) ou os síndromas de perturbações múltiplas de órgãos em consequência de septicémia ou de traumas; prejuízos de reperfusão de tecidos do miocárdio ou de outros tecidos; glomerulonefrite aguda; artrite reactiva; dermatoses com componentes inflamatórios agudos; menigite purulenta aguda ou outras perturbações inflamatórias do sistema nervoso central; perturbações térmicas; hemodiálise; leucofereses; colites ulceraiiva; doença de Crohn; enterocolite necrotizante; síndromas associados com a transfusão de granulóciL t os; e toxicitade provocada por citoquina.

Os agentes anti-infiamatórios de acordo com a presente invenção são compostos capazes de antagonizarem especificamente a interacção do complexo CD-18 em granulócitos com células endoteliais. Esses antagonistas compreendem ICAM-2; um derivado funcional de ICAM-2; e um antagon ista diferente de imunoglobulina de ICAM-2 e diferentes de ICAM-1 ou um membro da família de molécula 'CD-18.

B. Supressores da Rejeição de Órgãos e de Tecidos

Como a ICAM-2, particularmente sob a forma solúvel, é capaz de actuar da mesma maneira que um anticorpo em relação aos membros da família CD-18, ela pode ser

- 4-0 utilizada para suprimir a rejeição de órgãos ou de tecidos provocada por qualquer das funções celulares dependentes da adesão. Além disso, o anticorpo anti-ICAM-2 e os derivados funcionais e antagonistas de ICAM-2 podem também ser empregados para suprimir essa rejeição.

ICAM-2 e os anticorpos capazes de se ligarem a ICAM-2 podem ser utilizados para evitar a rejeição de órgãos ou de tecidos ou para modificar as respostas auto-imunes sem o perigo de efeitos secundários nos mamíferos tratados com ele.

De maneira importante, a utilização de anticorpos monoclonais capazes de reconhecerem ICAM-2 pode permitir que se realizem transplantações de órgãos mesmo entre individuos que tem incompatibilidade de HLA.

C. Adjunção Simultânea com a Introdução de Material

Aptigénico Administrado para Finalidades Terapêuticas ou de Diagnóstico

As respostas imunes aos agentes terapêuticos ou de diagnóstico tais como, por exemplo, insulina bovina, interferão, activador de plasminogénio do tipo de tecido ou anticorpos monoclonais de murina, atenuam substancialmente o valor terapêutico ou de diagnóstico de tais agentes e podem, de facto, provocar doenças tais como a doença do soro. Esta situação pode ser remediada mediante a utilização dos anticorpos de acordo com a presente invenção .

Nesta forma de realização, estes anticorpos são administrados em combinação com o agente terapêutico ou agente de diagnóstico. A adição dos anticorpos evita que o recipiente reconheça o agente e, portanto, evita que o recipiente inicie uma resposta imune contre ele. A ausência de resposta imune tem como resultado a possibilidade

de o paciente receber administrações adicionais do agente terapêutico ou de diagnóstico.

ICAM-2 (particularmente sob a forma solubilizada) ou os seus derivados funcionais podem ser empregados intermutavelmente com ICAM-i ou com anticorpos capazes de se ligarem a LPA-1 no tratamento de doenças. Assim, sob a forma de solubilizada, estas moléculas podem ser empregadas para inibir a rejeição de órgãos ou de enxertos. ICAM-2 ou os seus derivados funcionais podem ser utilizados da mesma maneira que os anticorpos anti-ICAM-2 para diminuir a imunogenicidade de agentes terapêuticos ou de diagnóstico.

D. Supressores de Metástases de lumores

Os agentes de acordo com a presente invenção podem também ser empregados para suprimir a metástase de células de tumores hematopiéticos, que necessitam de um membro funcional da família CD-18 para migração. De acordo com esta forma de realização da presente invenção, um paciente com necessidade de uma tal· tratamento recebe uma quantidade de um agente (tal como um anticorpo capaz de se ligar a ICAM-2; um anticorpo derivatizado com toxina capaz de se ligar a ICAM-2; um fragmento de um anticorpo, sendo o citado anticorpo capaz de se ligar a ICAM-2; ICAM-2; um deri vado funcional de ICAM-2; um antagonista de ICAM-2 diferente de imunoglobulina diferente de ICAM-1, suficiente para suprimir a referida metástase.

A invenção refere-se também a um processo para suprimir o desenvolvimento de uma célula de tumor que expressa ICAM-2, que compreende fornecer-se a um paciente com necessidade desse tratamento uma quantidade de um agente suficiente para suprimir o mencionado crescimento.

Os agentes apropriados incluem um anticorpo capaz de se ligar a ICAM-2; um anticorpo derivatizado

com toxina capaz de se ligar a ICAM-2; um fragmento de anticorpo, que é capaz de se ligar a ICAM-2; um fragmento derivatizado com toxina de um anticorpo, que é capaz de se ligar a ICAM-2; ICAM-2; um derivado funcional de ICAM-2; um antagonista de ICAM-2 diferente de imunoglobulina e diferente de ICAM-1; um membro derivatizado com toxina da família de moléculas CD-18; e um derivado funcional derivatizado com toxinas de um membro da família de moléculas CD-18.

A invenção também se refere a um processo para suprimir o desenvolvimento de células de tumor que expressa DPA-1, caracterizado por compreender fornecer-se a um paciente que necessita desse tratamento uma quantidade de toxina suficiente para suprimir o citado desen volvimento. As toxinas apropriadas incluem ICAM-2 derivatizada com toxina ou um derivado funcional de ICAM-2 deriva-tizado com toxina.

E. Supressores de Infecções por Vírus

Verificou-se recentemente que a ICAM-1 é subvertida como um receptor pelo grupomais importante de rinovírus (J. M. Greva e col. , Cell 56 : 839 - 847 (1989): D. E. Staunton e col., Call 56 : 849 - 853 (1989);

J. E. Tomassini e col., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86 :

4907 - 4911 (1989)), que se incorporam na presente memória descritiva a título de referência.

Os rinovírus membros da família dos pequenos picornavírus encapsulados com proteína contendo ARN, provocam 40 a 50% das constipações vulgares (R. B. Rueckert, em Eields Virology, Β. N. Pields e col (Ed.),

Raven Press, NY (1985), páginas 705 - 738; S. J. Sperber e col., Antimicr. Agents Chemo. 32 : 4©9.- 419 (1988), que se incorporam na presente memória descritiva a título de referência. Definiram-se mais de cem rinovírus não reac-tivos cruzados imunologicamente, dos quais 90% se ligam

a ICAM-1.

Além de ICAM-1, verificou-se recentemente que a molécula de adesão de células CD4 e o receptor complementar CR2 são subvertidos como receptores de vírus pelos vírus HIV e EBV, respectivamente (p. J. Maddon,

Cell 47, 333 - 348 (1986); J. D. Pingeroth e col., Proc. Natl. Acad. Sei, USA 81 : 4510 - 4514 (1984)), que se incorporaram na presente memória descritiva a título de referência.

Além disso, uma molécula com uma estrutura no domínio de Ig semelhante a ICAM-1 e que pode funcionar na adesão celular é um receptor de vírus da poliomielite (C. L. Mendelshon e col, Cell· 56 : 855 - 865 (1989)).

A ICAM-2 e os derivados funcionais podem actuar como receptores para ligação ou infecção por vírus (particularmente por rinovírus e, particularmente, rinovírus do serotipo menor). Assim, o anticorpo para ICAM-2 (ou os seus fragmentos), ICAM-2 ou os derivados funcionais de ICAM-2 podem ser empregados para bloquear essa ligação ou infecção e, dessa forma, suprimir a infecção pelo vírus.

P. Aplicações no Diagnóstico e Prognóstico

Anticorpos monoclonais capazes de se ligarem a ICAM-2 podem ser empreguados como meios para fornecer imagens e vizualizar os sítios da expressão de ICAM-2 e a inflamação num paciente. Para esta utilização, os anticorpos monoclonais são detectavelmente marcados por intermédio da utilização de rádio-isótopos, marcadores de afinidade (tais como biotina, avidina, etc.), marcadores fluorescentes, átomos paramagnéticos, anticorpo anti-ICAM-2 marcado, etc.

As maneiras de proceder para realizar essa marcação são bem conhecidas na técnica. A aplicação clínica de anticorpos na formação de imagens de diagnóstico é revista por Η. B. Grossman, Urol. Clin. North Amer.

: 465 - 474 (1986); E. C. Unger e col. , Invest. Radiol.

: 693 - 700 (1985) e Β. A. Khaw e col., Science 209 :

295 - 297 (1980).

A presença de expressão de ICAM-2 pode também ser detectada por intermédio do emprego de ligandos de ligação tais como mARN, cADN ou ADN que se ligam às sequências do gene ICAM-2 ou às sequências de mARN de ICAM-2, de células que expressam ICAM-2. As técnicas para realizar estes ensaios de hibridização são escritas por T. Maniatis e col., em Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Goldspring Harbor, NY (1982) e por B. D. Haymes e col. , em Nucleic Acid Hybridization, a Rractical Approach, IRL Press, Washington CD (1985), que se incorporam na presente memória descritiva como referência.

A detecção de focos destes anticorpos marcados deteetavelmente é indicativa de um sítio de expressão de ICAM-2 ou de desenvolvimento de tumores. Numa forma de realização, este exame relativamente à expressão é efectuado retirando amostras de tecido ou de sangue e incubando essas amostras na presença de anticorpos que são ou que podem ser detectavelmente marcados.

Numa forma de realização preferida, esta técnica é efectuada de maneira não invasiva por intermédio da utilização de formação de imagens magnéticas, fluorografia, etc. Este ensaio de diagnósticos de transplantações de órgãos para sinais precoces de potencial rejeição de tecido. Estes ensaios podem também realizar-se como um e sforço para determinar uma predilecção do indivíduo pela artrite reumatóide ou por outras doenças inflamatórias crónicas.

Por exemplo, marcando radioactivamente os anticorpos ou os fragmentos de anticorpos, é possível detectar o antigene por intermédio da utilização de ensaios de rádio-imunidade. Pode encontrar-se uma boa descrição de um ensaio de radio-imunidade (RIA) em Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology, por T. S. Work e col. North Holland Publishing Company, MY (1978), com particular referência ao capítulo intitulado An Introduction to Radioimmune Assay and Related Techniques, por T. Chard, que se incorpora na presente memória descritiva como referência. Como variante, podem empregar-se marcadores fluore centes, enzimáticos ou outros apropriados.

Os exemplos de tipos de marcadores que podem ser utilizados de acordo com a presente invenção incluem, mas não se limitam a marcadores enzimáticos, marcadores rádio-isotópicos, marcadores isotópicos não radioactivos, marcadores fluorescentes, marcadores de toxinas e marcadores de bioluminiscência.

Os exemplos de marcadores enzimáticos incluem malato desidrogenase, estafilococos nucleases, delta-5-esteróide isomerase, fermento-álcool desidragenase, alfa-glicerol-fosfato desidrogenase, triose-fosfato isomerase, peroxidase, fosfatase alcalina, asparaginase, glucose oxidase, beta-galactosidase, ribonuclease, urease, catalase, glcuose-6-fosfato desidrogenase, glucoamilase, acetil-coiina esterase, eto.

Os exemplos de marcadores rádio-isotó. , . . 3tt 1H_t toc 131_t 32 picos apropriados incluem 'h, In, 125_γ, I, p, ⁵⁵S, ¹⁴C, ⁵¹Cr, ⁵⁷To, ⁵⁸Co, ⁵⁹Pe, 75 ~ , ⁱ⁵²Eu, ⁹°Y, ⁶⁷Cu, 2%, ^i«, p,, «se, _109píi

Os exemplos de marcadores não radio157 55 162 52 56 activos apropriados incluem Gd, Mn, Dy, Tr, Pe, etc. ,

Os exemplos de marcadores fluorescen152 tes apropriados incluem o marcador de Eu, um marcador de fluoresceina, um marcador de rodamina, um marcador de fico-eritrina, um marcador de picociamina, um marcador de aloficocianina, um marcador de o-ftaldeido, um marcador de fluorescamina, etc.

Os exemplos de marcadores quimioluminescentes incluem um marcador de luminal, um marcador de isoluminal, um marcador de éster aromático de acridínio, um marcador de imidazol, um marcador de sal de acridínio, um marcador de éster de oxalato, um marcador de luciferina, um marcador de luciferase, um marcador de equorina, etc.

IV. ADMINISTRAÇÃO DAS COMPOSIÇÕES DE ACORDO COM A PRESEN TE INVENÇÃO

Os efeitos terapêuticos de ICAM-2 podem obter-se fornecendo a um paciente a molécula de ICAM-2 completa ou quaisquer dos seus fragmentos peptídicos terapeu ticamente activos. Tem especial interesse os fragmentos peptídicos terapêuticos de ICAM-2 que sao solúveis.

ICAM-2 e os seus derivados funcionais podem obter-se ou sinteticamente por intermédio do uso de te enologias de ADN recombinante ou por proteólise ou por uma combinação destes métodos. As vantagens terapêuticas de ICAM-2 podem ser aumentadas por intermédio da utilização de derivados funcionais de ICAM-2 que possuem resíduos de amino ácidos adicionais adicionados para melhorar o acoplamento à substância veicular ou para melhorar a actividade da ICAM-2.

Pretende-se que o âmbito da presente in venção inclua ainda derivados funcionais de ICAM-2 que apresentem falta de certos resíduos de aminoácidos ou que contém resíduos de aminoácidos alterados, na medida em que estes derivados possuem ou afectam uma actividade biológica

ou farmacológica cie ICAM-2.

Tanto os anticorpos de acordo com a presente invenção como a molécula de ICAM-2 nela referida diz-se que são substancialmente isentos de contaminantes naturais se as preparações que os contém são substancialmente isentas de materiais com que esses produtos se encontram normal e natuialmente associados.

A presente invenção estende-se a anticorpos e seus fragmentos, biologicamente activos (quer sejam policlonais quer sejam monoclonais) que são capazes de se ligar a ICAM-2. Estes anticorpos podem ser produzidos ou por um animal ou por cultura de tecidos ou por meio de AI recombinante.

Ao fornecer a um paciente anticorpos ou seus fragmentos capazes de se ligarem a ICAM-2 ou quando se fornece ICAM-2 (ou um seu fragmento, variante ou derivado) a um paciente recipiente, a dosagem do agente administrado varia dependendo de vários factores, tais como idade do paciente, peso, altura, sexo, estado médico geral, história médica anterior, etc.

Em geral, é desejável fornecer ao recipiente uma dosagem de anticorpo que está compreendida dentro do intervalo desde cerca de 1 pg/kg a 10 mg/kg (peso corporal do paciente), muito embora se possam administrar doses menores ou maiores.

Quando se fornecem moléculas de ICAM-2 ou os seus derivados funcionais ao paciente, é preferível administrar essas moléculas numa dosagem que também está compreendida desde cerca de 1 pg/kg até 10 mg/kg (de peso corporal do paciente), muito embora se possam também administrar doses menores ou maiores.

κ

Como se refere mais abaixo, a dose terapeuticamente activa pode ser diminuída se o anticorpo anti-ICAM-2 for adicionaimente administrado com o anticorpo anti-LFA-1. Como se utiliza na presente memória descritiva, um composto diz-se que é administrado adicionaimente com um segundo composto quando a administração dos dois compostos se faz com uma tal proximidade de tempo que ambos os compostos podem ser detectados ao mesmo tempo no soro do paciente.

Tanto o anticorpo capaz de se ligar a ICAM-2 como o ICAM-2 propriamente dita podem ser administrados a pacientes intravenosamente, intramuscularmente, subcutaneamente, antericamente ou parentericamente. Quando se administra anticorpo ou ICAM-2 por injecção, a administração pode fazer-se por infusão contínua ou por doses únicas ou múltiplas.

Os agentes de acordo com a presente invenção pretende-se que sejam administrados a pacientes recipientes numa quantidade suficiente para suprimir a inflamação. Uma quantidade diz-se que é suficiente para suprimir a inflamação se a dosagem, via de administração, etc. do agente forem suficientes para atenuar ou evitar a inflamação.

anticorpo anti-ICAM-2 ou um seu fragmento podem ser administrados sozinhos ou em combinação com um ou mais agentes imuno-supressores adicionais (especialmente a um recipiente de uma transplantação de órgãos ou de tecidos). A administração desse composto ou desses compostos pode fazer-se ou com finalidade profilática ou terapêutica. Quando são administrados profilaticamente, o composto imuno-supressor ou os compostos imuno -supressores são administrados em avanço.do aparecimento de qualquer resposta ou sintoma inflamatórios (por exemplo, antes de, durante ou muito pouco depois) do momento em que

se faz transplantação de órgãos ou de tecidos, mas antes de qualquer sintomas de rejeição de órgãos). A administração profilática do composto ou dos compostos serve para evitar ou atenuar qualquer resposta inflamatória subsequente (tal como, por exemplo, rejeição de um órgão ou de um tecido transplantado, etc.).

Quando administrados terapeuticamente, o composto ou os compostos imuno-supressores são administrados por (ou imediatamente depois) aparecimento dos sintomas de inflamação real (tal como, por exemplo, rejeição de órgãos ou de tecidos). A administração terapêutica do composto ou dos compostos serve para atenuar qualquer inflamação existente (tal como, por exemplo, rejeição de um órgão ou deum tecido transplantado).

Os agentes anti-inflamatórios de acordo com a presente invenção podem, assim, ser administrados ou antes do aparecimento da inflamação (de maneira a suprimir antecipadamente a inflamação), oudepois do início da inflamação.

Uma composição diz-se que é farmacologicamente aceitável se a sua administração puder ser tolera da por um paciente recipiente. Diz-se que um agente é administrado numa quantidade terapeuticamente eficaz se a quantidade administrada for fisiologicamente significativa. Um agente é fisiologicamente significativo se a sua presença tiver como resultado uma alteração detectável na fisiologia de um paciente recápiente.

As moléculas de anticorpo e de ICAM-2 de acordo com a presente invenção podem ser formuladas de acordo com métodos conhecidos, com o fim de preparar composições farmaceuticamente úteis, por meio das quais estes materiais ou os seus derivados funcionais são combinados em mistura com um veículo farmaceuticamente aceitável.

Os veículos apropriados e as suas formulações inclusive de outras proteínas humanas, por exemplo, albumina de soro humano, são descritos, por exemplo, em Remington's Pharmaceutical Sciences (16^ Edição, A. Osol, Mack, Easton pA (1980)). A fim de se preparar uma composição farmaceuticamente aceitável, apropriada para a administração eficaz, estas composições contém uma quantidade efectiva de anticorpo anti-ICAM-2 ou de molécula de ICAM-2 ou dos seus derivados funcionais, em conjunto com uma quantidade apropriada de uma substância veicular.

Podem empregar-se métodos farmacêuticos adicionais para controlar a duração da acção. Podem conseguir-se preparações com libertação controlada através da utilização de polímeros para complexar ou absorver anticorpo anti-ICAM-2 ou ICAM-2 ou os seus derivados funcionais. A libertação controlada pode realizar-se escolhendo macromoléculas apropriadas (por exemplo, poliésteres, poliaminoácidos, polivinil-pirrolidona, etileno/acetato de vinilo, metil-celulose, carboximetil-celulose ou sulfato de protamina) e a concentração de macroraoléculas assim como os métodos de incorporação a fim de controlar a libertação.

Outro métodos possível para controlar a duração da acção por preparações de libertação controlada consiste em incorporar anticorpo anti-ICAM-2 ou moléculas de ICAM-2 ou os seus derivados funcionais em partículas de material polimérico, tal como poliésteres, poliaminoácidos, hidrogeles, poli-(ácido láctico) ou copolímeros de etileno/acetato de vinilo.

Como variante, em vez de se incorporarem esses agentes em partículas polimêricas, é possível encerra-los em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de co-acervação ou por polimerazação interfacial, por exemplo, microcápsulas de hidroximetil-celulose ou de

gelatina e microcápsulas de poli-(metacrilato de metilo), respectivamente, ou em sistemas de libertação de fármacos coloidais, por exemplo, lipossomas, microsferas de albumina, micro-emulsões, nanopartículas, nanocápsulas ou um macro-emulsões. Estas técnicas são descritas em Remington's Pharmaceutical Sciences (1980).

A presente invenção inclui ainda uma composição farmacêutica que compreende

a) um agente anti-inflamatério, tal como um anticorpo capaz de se ligar a ICAM-2; um fragmento de um anticorpo, sendo o referido fragmento capaz de se ligar a ICAM-2; ICAM-2; um derivado funcional de ICAM-2; e um antagonista diferente de imunoglobulina de ICAM-2 e diferente de ICAM-1, e

b) pelo menos um agente imuno-supressor.

Os exemplos de agentes imuno-sapressores apropriados incluem dexametesona, azatiopirina e ciclosporina A.

Tendo até agora descrito geralmente a invenção, a mesma será mais facilmente compreendida por referência aos Exemplos seguintes, que são apresentados a título de ilustração e não se destinam a limitar o âmbito da presen te invenção, a não ser que isso seja especificado.

EXEMPLOS

Exemplo 1

Clonação de ICAM-2 cADN

A fim de clonar cADN capaz de codificar

ICAM-2, empregou-se uma modificação da maneira de proceder de Aruffo e Seed (B. Seed e col. Proc. Natl. Acad. Sei. USA

: 3365 - 3369 (1987)) para seleccionar cADIi por expressão em células de CDS para ligar células de CDS que possuem ligando em LFA-1 purificada funcionalmente activa ligada a placas de Petri de plástico.

Pormenorizadamente, purificou-se LFA-1 de lisato SKU-3 por cromatografia de imuno-afinidade em Sepharose contendo TS2/4 LFA-1 Mab e eluiu-se a pH 11,5 na presença de MgCl₂ 2 mM e 1% de octil-glucósido. Ligou-se LFA-1 (10 _xug/200 ,ul/chapa de 6 cm a cápsulas de Petri bacteriológicas diluindo octil-glucósido a 0,1% com PBS e com MgCl₂ 2 mM e incubando durante a noite a 4°C. As placas foram bloqueadas com BSA a 1% e guardaram-se em PBS/2 mM de MgCl₂/0,2% de BSA/0,025% de azida / 50 <ug/ml de gentamicina,,

Realizou-se a síntese de uma biblioteca de cADN a partir de células endoteliais da veia umbilical estimuladas com LPS pelo método de Cubler e Hoffman, como é descrito por Staunton e col. (D. E. Staunton e col., Cell 52 : 925 - 933 (1988)). A seguir à sintese da segunda cadeia, ligou-se 0 cADN a adaptadores RstXI (B. Seed e col., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84 : 3365 - 3369 (1987)) e seleccionaram-se os cADN 600 pb por electroforese em gel de agarose de baixo ponto de fusão (LMP).

Ligou-se então o cADN a CDMB (B. Seed, Nature 329 : 840 - 842 (1987)), introduziu-se no hospedeiro Ξ. coli MC106l/p3 e placou-se para se obterem 5 x 10^ colónias. Suspenderam-se as colónias em meio de LB, reuniram-se e praparou-se o plasmídeo pelo método de lise 'alcali na normal (T. Maniatis e col. , em Molecular Cloning : a Laboratory Manual, Golde Spring Harbor Laboratory (1982)).

Transfectaram-se dez chapas de 10 centímetros de células CDS com a confluência de' 50% com 10 micro gramas/chapa de biblioteca do plasmídeo de cADN usando

DEAE-dextrano (R. E. Kingston, em Current Protocols in

Molecular Biology, 9.0.1 - 9.9.6, Greens Publishing Associates (1987//. ICAM-2 é resistente à tripsina em células endoteiiais e células SKU-3. Suspenderam-se células de CDS três dias depois da transformação e tratamento com 0,025^ de tripsina/1 mM de EDTA/HBSS (Gibco) e placou-se (B. Seed e col., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84 : 3365 - 3369 (1987)) em placas revestidas com LFA-1 como se descreveu mais aaian51 te para células CDS marcadas com Cr. As células aderentes foram libertadas por adição de EDTA a 10 mM.

Recuperou-se o piasmídio da população aderente de células CDS nos sobrenadantes de Hirt (B. J.

Hirt, J. Mol. Biol. 26 :365 - 369 (1967)). Transformou-se então a estirpe MC106l/p3 de E. coli com o plasmídeo, suspenderam-se as colónias existentes nas chapas em meio de LB, reuniram-se e preparou-se o plasmídeo pelo método da lise alcalina. Repetiu-se a selecção de células de CDS transfectadas aderentes a LFA-1 e a recuperação do plasmídeo durante mais dois ciclos. Cultivaram-se as colónias obtidas depois do terceiro ciclo até à saturação em 10 ml de meio de LB com 18 microgramas/mililitro de tetraciclina e 20 microgramas/mililitro de ampicilina.

Preparou-se o plasmídeo e fracoionou-se por electroforese em gel de agarose com 1/ de LMP e transformou-se MC106l/p3 separadamente com plasmídeo de nove fraeções de tamanho diferente. Examinaram-se os piasmídeos individuais da fracção com maior actividade em promover a adesão de células CDS a LFA-1 relativamente ao tamanho dos insertos por digestão com Xbal e ensaiou-se pelo ensaio de aderência a células CDS. Isso originou um plasmídeo com um inserto de cADN de ICAM-2 com 1,1- kb, pCDIC2.27.

Para os ensaios de adesão, introduziu-se o plasmídeo pCDIC2.27 de ICAM-2 ou um constructo de ICAM-1 contendo o fragmento Kpnl de 1,8 kb Sall (D. Ξ. Staunton e coli, Cell 52 : 925 - 933 (1988)) em CDM8 (2 microgramas/

placa de 10 centímetros) em células CDS usando DEAE-dextrano Suspenderam-se as células CBS com 0,025$ de tripsina/l mM de EDTA/HBSS três dias depois da transfecção e marcaram-se

5 com Cr. Incubaram-se aproximadamente 2 x 10 células de CDS marcadas com Cr em 2 ml de P3S/5% de ECS/2 mM de MgC^/O,025% de azida (tampão) com 5 microgramas/ml de Mab indicado em chapas de 6 cm revestidas com LFA-1 a 25°C durante uma hora. Removeu-se as células não aderentes por meio de suave sacudimento e três lavagens com tampão. Sluiram-se as células aderentes com adição de EDTA até 10 mM e contaram-se as radiações gama.

Demonstrou-se a exequaibilidade deste processo usando células de CDS transfectadas com o cADN de ICAM-1 previamente clonado (Figura IA). Expressou-se ICAM-1 em 25$ das células de CDS transfectadas. Depois da placagem, eliminaram-se as células não aderentes de células de ICAM-1⁺, enquanto as células aderentes libertadas do plástico revestido com LFA-1 por EDTA foram quase completamente ICAM-1⁺. A aderência de células de ICAM-1⁺ a plástico revestido com LFA-1 foi medido com RRl/l ICAM-1 Mab. LFA-1 revestido em placas de Petri era estável até V 5 ciclos de aderência de células CDS e eluição com EDTA; lavaram2+ o

-se as placas com Mg a 4· C entre as utilizações.

Para clonar ICAM-2, preparou-se uma biblioteca de cADN no vector de plasmídio CDM8 de células e ndo teliais que demonstra tanto a adesão dependente de ICAM-1 e dependente de LFA-1 de componentes independentes de ICAM-1 (M. L. Dustin e col·., J. Ceil. Bioi. 107 : 321 - 331 (1938).

Incubaram-se as células de CDS transfectadas em cápsulas de Petri revestidas com LFA-1 cora Mab de ICAM-1 presente para evitar o isolamento de cADN de ICAM-1. As células aderentes foram eluídas com EDTA e isolaram-se os plasmídeos e amplificaram-se em E. coli. A seguir a três ciclos de transfecção, aderência e isolamento de plasmídio

e um fraccionamento de tamanho, analisaram-se trinta plasmídeos por digestão com endonncleose de restrição. De três insertos 1,0 kb, um plasmídeo foi introduzido em células de CDS por transfecção e originou a aderência a LFA-1.

plasmídeo isolado conferia aderência a LFA-1 numa percentagem elevada de células transfectadas, semelhante à percentagem observada com transfecção de ICAM-1 (Figura 18).

A aderência foi bloqueada por mAb de LFA-1, mas, em contraste com os transfectantes de ICAM-1, não por mAb de ICAM-1 (Figura 18). Além disso, as células transfectadas com este plasmídeo não reagiram com um painel de quatro mAb de ICAM-1. Assim, foram satisfeitos todos os critérios funcionais para um segundo ligando LFA-1 que codifica cADN e o ligando foi designado como ICAI-I-2.

Exemplo 2

Caracterização da Sequência de cADN de ICAM-2

A sequência de cADM de ICAM-2 de 1052 pb (Figura 2) contém uma região não traduzida de 62 pb 5' e 167 pb 3'· Um sinal de poli-adenilação AATACA na posição 10 que, em contraste com AATAAA, ocorre em aproximadamente 2% do mARN dos vertebrados (M. Wickens e col., Science 226 : 1045 - 1051 (I984)), é seguido em 1058 pb por uma cauda poli-(A). A. estrutura aberta mais comprida começa com a primeira ATG na posição 63 e termina com um codão de terminação TAG na posição 885. A análise com um codão de terminação TAG na posição 885. A análise de hidrofobicidade (Kyte e col., J. Mol. Biol. 157 : 105 - 132 (1982)) e a utilização de aminoácidos em volta dos sítios de clivagem (G. von Heijne, Nucleic Acids Res. 14 : 4683 - 4690 (1986) prevêm um péptido de sinal constituído por vinte e um resíduos (Figura 2)

A sequência madura prevista contém desde o aminoácido 1 a 201 um domínio extracelular putativo seguido por um domínio de trans-membrana hidrofóbico putativo de vinte e seis resíduos e um domínio citoplasmico de vinte e seis resíduos.

Quatro voltas do segmento de trans-membrana da hélice alfa são anfipáticos, com resíduo de treomina e serina a cairem num lado, sugrindo a possibilidade de auto-associação ou associação com outras proteínas da membrana no plano da membrana. 0 domínio citoplásmico é invulgarmente básico e em contraste com a maior parte dos domínios citoplásmicos que são hidrofílicos, é de hidrofobicidade média. A massa prevista de polipéptido maduro é de 28,176 dalton que, se se utilizarem os seis sítios de glicosilação ligadas a ΙΊ previstos, terá como resultado uma glicoproteína de ICAM-2 com aproximadamente 46 kd.

Exemplo 5

Análise de Hibridização de ADN e de ARN

Os clones de cADN de ICAM-2 isolados foram analisados utilizando tanto hibridização de Northern como de Southern. As manchas de Northern usaram 6 microgramas de poli-(A)⁺ ARN que foi desnaturado e submetido a electroforese através de gel de agarose/aldeído fórmico a 1% (T. Maniatis e col., em Molecular Cloning : A Baboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)) e electrotransferiu-se para uma membrana de nylon (Zeta Probe, BioRad). 0 completamento da transferência foi confirmado por trans-iluminação com ultravioletas do gel e fotografia fluorescente da mancha.

Os ADN genómicos foram digeridos com cinco vezes a quantidade recomendada pelo fabricante das endonucleoses EcoRI e HinlII (New England Biolabs). A seguir

à electroforese através de gel de agarose 0,8%, os ADN foram transferidos para Zeta Probe. As manchas de ARN e de ADN foram pré-hibridizadas e hibridizadas segundo as maneiras de proceder normais (I. Maniatis e ool. em Molecular Cloning : A Laborator.y Manual, Gold Spring Karbor Laboratory (1982)) usando cADN de ICAM-2 ou de ICAM-1 marcados com gó / p_J7 d χτρ por primagem aleatória (Boehringer Mannheim).

cADN de 1,1 kb de ICAM-2 hibridiza-se com um mARN poli-(A)⁺ de 1,4 kb e fracamente a um mARN de 3 kb (Pigura 3A) distinto do mARN de 3,3 kb e de 2,4 kb de ICAM-1 (Pigura 3B).

mARN foi examinado em células que tinha sido caracterizadas funcionalmente para ligação dependente de ICAM-1 e do segundo ligando a LFA-1. mARN de ICAM-1 é fortemente induzido em células endoteliais por LPS (Figura 33, pistas 2 e 3). Pelo contrário mARN de ICAM-2 é fortemente expresso basalmente em células endoteliais e não é induzido posteriormente por LPS (Figura 3A), pistas 2 e 3). Esta correlação com a expressão basal forte e não induzível de percurso dependente de LFA-1 e inpendente de ICAM-1 em células endoteliais e a indutibilidade do percurs o dependente de ICAM-1 (M. L. Dustin e col., J. Cell. Biol. 107 : 521 - 331 (1988).

o mARN de ICAM-2 está presente em larga variedade de tipos de células incluindo células de Ramos e linfoblastóides BBN B, linhas de células monocíticas U937 θ linhas de células linfoblastóides SKW3 (Figura 3A, pistas 1, 4, 6 e 8), como é demonstrado por moderada ou longa exposição do auto-radiograma. Destas,

SKW3, U937 e BBN mostraram exibir adesão dependente de LFAe independente de ICAM-1 a células LFA-1⁺- (R. Rothiein e col. , J. Immunoi. 137 : 1270 - 1274 (1986); M, W, Makgoba e col., Eur. J. Immunoi. 18 : 637 - 640 (1988)) e a plas58 -

tico revestido com LFA-1. A linha de células epiteliais HeLa, que exibe apenas o componente dependente de ICAM-1 da adesão dependente de LFA-1 (M. W. Kakgoba e col,.

Eur, J. Immunol. 18 _ 637 - 640 (1988)), não apresenta qualquer mARN de ICAM-2 (Figura 3A, pista 5), mesmo depois de prolongada exposição a auto-radiograma. A distribuição de células de ICAM-2 é assim consistente com o eom— ponente independente de ICAM-1 da adesão dependente de LFA-1.

As manchas de Southern de ADN ganómico (Figura 3D) hibridizadas com o cADN de ICAM-2 apresentaram um fragmento único de EcoRI predominante de 8,2 kb e um fragmento HindIII de 14 kb, sugerindo um único gene com a maior parte da informação de codificação presente em 8 kb.

Exemplo 4

Comparação das Sequências de Aminoácidos de ICAM-1 e de

ICAM-2

For causa da sua semelhança funcional como ligandos de 1FA-1, compararam-se as sequências de aminoácidos de ICAM-2 e ICAM-1, ICAM-1 é um membro da super família de Ig e o seu domínio extracelular consiste inteiramente em cinco domínios semelhantes a C. 0 domínio extracelular de 201 aminoácidos de ICAM-2 consiste em dois domínios Ig semelhantes a C, com cisteínas ligadas a dissulfureto no intradomínio putativo distanciadas 43 a 56 resíduos e uma estrutura da cadeia beta prevista (Figura 4).

Acentuadamente, os dois domínios semelhantes a Ig de ICAM-2 são 34% idênticos da sequência de aminoácidos aos dois domínios semelhantes a Ig mais na extremidade N de ICAM-1 (Figura 4), com uma classifioação de ALIGN 15 s. d. acima da média a 27% idênticos a domínios 3 e 4 de ICAM-1, com uma classificação de ALIGN de 3 s.d.

acima da média.

A procura dos dados de base das proteínas N3RF e SWISS-PROT forneceu apenas homólogos de domínio parcial com outros membros da superfície superfamília de Ig, primariamente com os antigenes HLA da Ciasse II. A ICAM-2 mostra menos resíduos conservados característicos dos domínios de Ig do que ICAM-I. ICAM-2 é 17% e 19% idêntica aos dois domínios N-terminais das moléculas de adesão NCAM (B.A. Cunningham e col. , Science 236 : 799 - 806 (1987),) e MAG (J. L. Salzer e col., J. Cell. Biol·. 104 : 957 - 965 (1987)) respectivamente, enquanto ICAM-1 é 19% e 20% idêntica, respectivamente.

antigene de função associada 1 de linfócitos (LFA-1) e a molécula de adesão intercalar 1 (ICAM-1) foram identificados escolhendo Mab que bloqueou a morte mediada por linfócitos T e a adesão homotípica, respectivamente (R. Rothiein e col., J. Immunoi. 157 :

: 1270 2 1274 (1986); D. Davigon e col., Proc. Natl, Acad. Sei USA 78 : 4535 - 4539 (1981)). Peio contrário. ICAM-2 foi definido usando uma maneira de proceder de seiecção de cALN funcionai que não necessita da preíia identificação da proteína por técnicas bioquímicas ou imunoiógicas.

isolamento de um cADN para ICAM-2 confirma a existência postulada de um ligando LFA-1 alternativo. A distribuição de mARN para ICAM-2 num número limitado de células que foram caracterizadas por adesão dependente de ICAM-1 e indepenátentemente de ICAM-1 e LFA-1 sugere que ICAM-2 podia ser responsabilizado por toda a adesão independente de ICAM-1 e dependendo de LFA-I observada.

ICAM-2 e os dois qomínios N-terminais de

ICAM-1 são muito mais semelhantes mas com os outros do que outros elementos semelhantes da superfamília Ig, demonstrando uma subfamília de molécula semelhantes Ig que se li60

gam a LPA-1. Significativa mente, a região de ligação de LPA-1 de ICAM-1 foi mapeada com os números 1 e 2 pela eliminação do domínio e a substituição sistématica aminoácid Assim, há homologia tanto estrutral como funcionai. ICAM-2 é o segundo exemplo de um membro da família Ig que se liga a uma integrina. Muito embora haja uma pequena precedência entre os receptores de adesão de células, entre as integrinas, um certo número de receptores para os componentes da matriz extracelular mostrou reconhecer ligandos múltiplos (R. 0. Hynes, Cell 48 : 549 - 554 (1987): E. Rouslati e col. Science 238 _ 491 - 498 (1987)).

Nem ICAM-1 nem ICAM-2 contém uma sequência RGD e assim o modo de reconhecimento por LPA-1 pode diferir das integrinas que ligam componentes da matriz extra celular. (R. 0. Haynes, Cell 48 : 549 - 554 (1987); E. Rouslahti e col♦,Science 258 : 491 - 497 (1987)).

Os ligandos celulares reconhecidos por Mac-1 e pl5O,95, as integrinas de leucócitos apertadamente relacionadas com LPA-1, podem pertencer à mesma subfamíiia de Ig. Demonstrou-se recentemente qàe ICAM-1 é um receptor para 0 maior grupo de reinovírus que provoca 50/ de constipações comuns. ICAM-2 pode também funcionar como receptor para reinovírus ou outros picenavírus. Assim, pode ser usada na terapia para supremir (isto é, evitar ou atenuar) a infecção provocada por esses vírus.

Uma família de ligandos para LPA-1 reforça a importância deste método de reconhecimento e pode ser um mecanismo para conferir especificidade apertada e diversidade funcional. Um certo número de diferenças entre ICAM-1 e ICAM-2 são de importância potencial. ICAM-1 é indutível na maior parte das células, enquanto a expressão de ICAM-2 não é efectuada por citoquinas nas células até ao presente easaiadas. Os três domínios adicionais de ICAM-1 espera-se que projectem 0 seu sítio de ligação a LPA-1 para

além da superfície da célula do que ICAM-2, sugerindo que o contacto mais apertado de célula a célula será necessário para a interacção LFA-l/lCAM-2 do que para LFA-l/lCAM-1.

As células de CDS transfectadas com ICAM-2 são mais facilmente destacadas do que as células de CDS transfectadas com ICAM-1 de plástico revestido com LFA-1 quando a força de corte de lavagem é aumentada. Esse facto pode ser devido ao mais pequeno tamanho de ICAM-2 que pode torná-lo menos acessível a LFA-1 existente no substracto artif ciai ou a diferenças entre selquências que originam diferenças de afinidades.

Os domínios c itoplásmicos distintos de ICAM-1 e de ICAM-2 podem fornecer sinais diferentes ou podem causar uma localizaçãodm.if erente na superfície das células; de igual maneira, a sinalização ou a interacção com o cito-esqueleto por LFA-1 pode diferir dependendo de se encontrar ligada ou a ICAM-1 ou a ICAM-2.

ICAM-1 e um segundo contra-receptor de LFA-1, a ICAM-2, constituida assim uma subfamília da subfamília de imunoglobulina (Ig) (D. E. Staunton e col.,

Cell 52, 925 - 933 (1988)), referencia que se incorpora na presente memória descritiva a título de referência.

ICAM-1 possui cinco domínios C semelhantes a Ig enquanto ICAM-2 possui dois que são mais homólogos c os domínios terminais da extremidade amino de ICAM-1. ICAM-1 e ICAM-2, expressadas numa variedade de tipos de células, suportam várias funções dependentes da adesão de leucótitos incluindo funções de indução e de afectuador da resposta imune. A expressão de ICAM-1 é altamente induzível por citoquinas e assim 0 sistema de adesão LFA-1/ICAM-1 é capaz de guiar a migração de leucócitos e a sua localização durante a inflamação (R. Rothlein, J. Immunol. 157 : 1270 - 1274 (1986); S. D. Marlin e col., Cell 51 : 813 - 819 (1987);

om

T. K. Kishimoto e col. , Adv. Immunol. 46 : 149 - 182 (1989)· M.L. Dustin e col. , Immunol. Today 9. ·' 213 - 215 (1988)), que se incorporam todos na presente memória descritiva como referência.

Os resíduos de ICAM-1 que foram definidos acima como sendo importantes para a ligação de LFA-1 são conservados em outras ICAM (D. F. Staunton e col., Nature 559 : 61-64 (1989), que se incorpora na presente memória descritiva a título de referência.

ICAM-1 humana é 50% idêntica a ICAM-1 murina e 35% idêntica a ICAM-2 humana (D. E. Staunton e col Nature 359 : 61-64 (1989)). Os resíduos que são mais críticos para a ligação com LFA-1, E34 e Q73, são conserva dos tanto em ICAM-1 de rato como em ICAM-2 humana. Este facto é consistente com a capacidade tanto de ICAM-1 do rato como ICAM-2 humana (D. E. Staunton e col. , Nature 559 : 61-64 (1989) para se ligarem a LFA-1 humana. Um sítio de glicosilação ligado a N D2 em N156, que influencia a ligação de LFA-1, é conservado em ICAM-2. Vários resíduos que são importantes para a ligação do reinovifus que são importantes para a ligação do reinovírus 14, Q58, G46, D71, K77 e R166 não são conservados em ICAM-1 do rato nem em ICAM-2 humana (D. E. Staunton e col., Cell 56 : 849 - 853 (1989), que se incorpora na presente memória descritiva a título de referência, 0 que é consistente com a imcapacidade aparente das células de rato (R. J. Colonno e col., J. Virol. 57 7 - 12 (1986) e de ICAM-2 e de se ligar a rinovírus-14.

Enquanto a invenção foi descrita em ligação com formas de realização específicas, deve compreender-se que ela é capaz de outras modificações e 0 presente pedido de patente destina-se a cobrir quaisquer variações, utilizações ou adaptações da invenção, em geral, os prins da invenção e incluindo esses afastamentos da presente memó- 63 -

ria descritiva como dentro da prática conhecida e habitual da técnica à qual a invenção pertence a que se pode aplicar às características essenciais anteriormente referidas e que se seguem como o âmbito das reivindicações anexas.

Claims (1)

1. REIVINDICAÇÕES

   - ia Processo para a preparação de células de hibridomas produzindo anticorpos ligáveis a moléculas de adesão intercelular 2 (ICAM-2) que possuem pelo menos uma das seguintes sequências de aminoácidos (a) -S-S-F-G-Y-R-T-L-T-V.A.L-;

   (b) -D-E-K-V-E-E-V-H-V-R-P-K-:

   (c) -G-S-L-E-V-N-C-S-T-T-C-N-;

   (d) -H-Y-L-V-S-N-I-S-H-T-D-V-;

   (e) -3-M-N-S-N-V-3-V-Y-Q-P-P-;

   (f) -F-T-I-E-C-R-V-P-T-V-E-P-;

   (g) -G-N-E-T-L-H-Y-E-T-F-G-K-;

   (h) -T-A-T-P-N-S-T-A-D-R-E-D-;

   (i) -K-R-N-F-S-C-L-A-V-L-D-L-;

   (j) -M-V-I-I-V-T-V-V-S-V-1-L-;

   (k) -3-L-F-V-T-S-V-L-L-C-F-I-;

   (l) -M-G-T-Y-G-V-R-A-A-W-R-R-.

   caracterizado por compreender as operações que consistem na

   a) imunização de um animai com uma célula que exprime

   ICAM-2;

   b) fusão de células de baco do animal com uma linha de células de mieloma;

   c) formação de células de hidridoma que segregam o anti corpo mediante desenvolvimento das células de baco e de mieloma fundidas; e

   64 d) selecção das células de hibridoma que são capazes de produzir um anticorpo capaz de se ligar a ICAM-2.

   - 2ê Processo para a preparação de composições farmacêuticas para o tratamento de inflamações em mamíferos especialmente provocadas por reacções de hipersensibilidade tetardada, psoriase, doenças autoimunes, rejeição de transplantes de órgãos ou de enxertos de tecidos, caracterizado por se incorporar um agente escolhido do grupo que consiste em um anticorpo capaz de se ligar a ICAM-2; um fragmento de um anticorpo; o qual é susceptível de se ligar a ICAM-2; e um antagonista não imunoglobulínico de ICAM-2 diferente de ICAM-1 ou de um membro de família de CD-18 numa substância veicular farmaceuticamente aceitável .

   - 3§ Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por se empregar adicionalmente um agente imunossupressor.

   _ 4ê _

   Processo para a detecção da presença de uma célula que expressa ICAM-2, caracterizado por compreender

   a) a incubação da referida célula ou de um extracto da mencionada célula na presença de uma molécula de ácido nucleico, sendo a citada molécula de ácidr nucleico capaz de se hibridizar com ICAM-2 mARN: e

   - 65 b) a verificação se a referida molécula de ácido nucleico se hibridizou com uma molécula de ácido nucleico complementar presente na mencionada célula ou no citado extracto da referida célula.