DD298263A5 - Verfahren zur flockung von bakterienbiomasse aus suspensionen - Google Patents

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DD298263A5 DD30913587A DD30913587A DD298263A5 DD 298263 A5 DD298263 A5 DD 298263A5 DD 30913587 A DD30913587 A DD 30913587A DD 30913587 A DD30913587 A DD 30913587A DD 298263 A5 DD298263 A5 DD 298263A5
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Waldemar Grau
Petra Schmidt
Johann Huber
Winfried Kansy
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Fzb Biotechnologische Forschungsgesellschaft Mbh Berlin,De
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  • Separation Of Suspended Particles By Flocculating Agents (AREA)

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Flockung von Bakterienbiomasse aus Suspensionen. Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Flockung fermentativ hergestellter Biomasse zur Verbesserung ihrer Abtrennbarkeit mit herkoemmlichen Einrichtungen unter Beibehaltung der biokatalytischen Wirksamkeit dieser Stoffe. Erfindungsgemaesz werden der Bakterienbiomassesuspension Loesungen kationischer polymerer Flockungsmittel, bevorzugt Polydimethyldiallylammoniumchlorid, und anionischer Polyelektrolyte, wie vorzugsweise Carboxymethylzellulose bzw. deren Na-Salze, in Mengen von je 0,1 bis 1% zugegeben.{Flockung von Bakterienbiomasse; Verbesserung der Abtrennbarkeit; herkoemmliche Stofftrennung; anionische Polyelektrolyte; Carboxymethylzellulose; kationische Flockungsmittel; Polydimethyldiallylammoniumchlorid; Agglomeratstabilitaet}

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Flockung fermentativ erzeugter Biomasse aus Bakterien, die in der Lage sind, intrazellulär bzw. extrazellulär Wirkstoffe zu bilden, deren Einsatz in der pharmazeutischen Industrie, der chemischen Industrie sowie der Landwirtschaft erfolgt.
Charakteristik der bekannten technischen Lösungen
Es ist bekannt, daß die Syntheseleistungen von Bakterien die Grundlage biotechnologischer Verfahren zur Gewinnung von Einzellerprotein, Antibiotika, Enzymen und anderen Produkten bilden. Dabei treten nach der Zollsubstanzsynthese im Fermenter bei der Abtrennung der Biomasse (sog. Primärtrennung) technologische Schwierigkeiten auf, die die Folge der geringen Partikelgröße der Bakterien, der Konsistenz des Mediums sowie der Oberflächeneigenschaften der Zellen sind.
Die Lösung dieser trenntechnischen Probleme erfordert eine spezielle Verfahrenstechnik, die unter dem Begriff „Medienvorbehandlung" zusammengefaßt werden kann. Während die effektive Gewinnung der flüssigen Phase bei der Herstellung von Primärmetaboliten die Trennaufgabe charakterisiert, ist es das Ziel bei der Gewinnung der Biomasse bzw. der intrazellulär gebildeten Enzyme, die Zellsubstanz in hoher Ausbeute und Reinheit zu gewinnen.
Es ist weiterhin bekannt, daß der Trennaufgabe und der Verwendung des Zielproduktes angepaßt, unterschiedliche Verfahren der mechanischen Fest-Flüssig-Trennung zum Einsatz kommen (vgl. Atkinson und Mavituna: Biochemical Engineering and Biotechnology Handbook, Mac Milian 1983; Weide, Placa und Knorro: Biotechnologie, G.Fisch-Verlag 1987).
Bevorzugte Lösungen stellen die Filtration bzw. die Sedimentation im Zentrifugalfeld (Zentrifugation) dar. Kennzeichnend für die Probleme bei der Sedimentation ist die sehr geringe Dichtedifferenz zwischen den Bakterien und der umgebenden Flüssigkeit; die Sedimentationsgeschwindigkeit von Bakterien liegt in der Größenordnung 1 mm/h.
Dieser Sachverhalt ist kennzeichnend für bakterielle Suspensionen und wird durch die Flockung (Überführung der feindispersen Teilchen in Partikel mit grobdispersen Abmessungen) ganz oder teilweise aufgehoben.
Das wird nach bekannten Verfahren dadurch erreicht, daß den Fermenterabläufen vor der Fest-Flüssig-Trennung Hydrokolloidbildner zugesetzt werden, welche die Zellen ganz oder teilweise einhüllen (DE-OS 2039752, DE-OS 2334463, SU-UR 652 210). Die Anwendbarkeit ist durch die stark adsorptiv wirkende feste Phase der Hydrokolioide für viele Enzyme eingeschränkt.
Auch auf dem Wege der Struktur- bzw. Konsistenzänderung der Bakterienzellen bzw. Zellsuspensionen läßt sich eine bedeutende Erhöhung der Sedimentationsgeschwindigkeit erzielen. Bei Einsatz von elektrischen Feldern (DE-AS 2137043) steht offensichtlichen Vorteilen der Nachteil zusätzlicher Energiekosten und der möglichen Inaktivierung von Enzymsystemen gegenüber. Der Zusatz in Wasser wenig löslicher organischer Lösungsmittel (DE-OS 3433611) zu Fermenterabläufen ist an die Realisierung von Bedingungen füi den Explosionsschutz gebunden und führt bei vielen intrazellulären Enzymen zur Inaktivierung bzw. zu Aktivitätsverlusten. Die Volumenvergrößerung (bis zu 100%) ist beträchtlich und erfordert zusätzliche Aufwendungen für die Aufbereitung.
Weiterhin ist bekannt, daß die technisch verwertbare Teilchenvergrößerung in Fermenterabläufen mit Hilfe der Flockulation, einem Flockungsprozeß unter Einsatz wasserlöslicher synthetischer Polymere, erzielt werden kann. Entscheidend für das Wirkprinzip der Brückenbildung über eine Makromolekülkette ist dabei die optimale Wahl der Molmasse des Polymers, der Konzentration sowie die Auswahl nach Ladung und Anzahl der dissoziationsfähigen Gruppen.
Bevorzugte Flockungsmittel sind als Folge o'er Lsdungsverhältnisse der Bakterienbiomassen kationische Flockungsmittel (FM) (DE-OS 21 59058, DE-OS 2001902, DE-AS 1952012, DE-OS 2037647, DE-OS 2046E96, DD-WP 213690). Allgemein liegen die Einsatzkonzentrationen im Bereich von 0,1 bis 5%.
Die technologischen Schwierigkeiten der Primärtrennung von Fermenterabläufen werden unter optimaler Anpassung an das Stoffsystem (Makromotakülmenge proportional zur Teilchenoberfläche der Bakteriensuspension) teilweise überwunden, jedoch bestehen zwei grundsätzliche Nachteile:
- kationische FM bewirken bei Überdosierung einen Rückgang der Flockungswirksamkeit und der Beständigkeit der gebildeten Flocken bei Scherbeanspruchunp (Restabilisierung)
- die kationischen FM zeigen oftmals fällende Wirkung auf gelöste Proteine z. B. Enzymproteine in Abhängigkeit von der Molmasse, dem chemischen Aufbau und insbesondere der Einsatzkonzentration (vgl. Bell, Hoare und Dunnill in Downstream Processing, Akademie Verlag Berlin 1983, S. 14, Hrsg. A. Flechter).
Ziel der Erfindung
Ziel dsr Erfindung ist es, für bakterielle Biomasse eine Flockungsmittelkombination zu finden, die in geringer Konzentration ohne technologisch bedeutsame Nachteile anwendbar ist und den Prozeß der Abtrennung von Bakterienzellsubstanz durch Sedimentation, Zentrifugation oder andere bekannte Verfahren der Biomasseabtiennung intensiviert.
Darlegung des Wesens der Erfindung
Es wurde gefunden, daß der Zusatz von Lösungen kationischer polymerer Flockungsmittel und anionischer Polyelektrolyte zu Bakterienzellsuspensionen. wozu auch mechanisch aufgeschlossene Bakterienzeilen gehören, zu dem gewünschten Ziel führt.
Dio Zugabe dieser Stoffe erfolgt in der Weise, daß die Endkonzentration 0,01 bis 1 %, bevorzugt jedoch 0,01 bis 0,5% bezogen auf die Bakteriensuspension beträgt. Das Verhältnis zwischen kationischem Flockungsmittel und anionischem "-Olyelektrolyt beträgt bevorzugt 1:1.
Die Reihenfolge der Zugabe ist beliebig. Auch der Einsatz als Gemisch ist möglich.
Für die Verbesserung der Abtrennung der Bakterienzeilsuspension ist es zweckmäßig, anorganische Dispersoide wie SiO2, Kaolin, Bentonit oder mineralische Filterhilfsmittel vor der Flockung zuzusetzen Vorzugsweise werden als kationische FM hochmolekulare Tetraalkylammoniumr alogenide vom Typ des Polydimethyldiallylammoniamchlorids eingesetzt. Als anionische Polyelektrolyte, die nicht selbst flockende Wirkung nuf Bakterien haben müssen, können Polymere wie Polyacrylsäure, teilverseiftes Polyacrylamid sowie voizugsweise Karboxymethylzellulose (CMC) (bzw. deren Na-SaIz) einaesetzt werden.
Vorteile der Erfindung:
- Es ist keine optimale Anpassung der Flockungsmitielmenge an die Oberfläche der Zellsuspension erforderlich.
- Der Mengenanteil der zusätzlich zur Bakterienrellsuspension erzeugten festen Phase ist sehr gering.
- Die biokatalytische Wirksamkeit der komplex zusammengesetzten Agglomemte bleibt überraschenderweise praktisch vollständig erhalten, wobei die Abtrennung mit herkömmlichen Verfahren der Stofftrennung wie Sc imentation, Zentrifugation, Vakuumfiltration und Membranfiltration erfolgen kann.
Diese hinsichtlich der Verknüpfung von verbesserter Abtrennbarkeit mit Erhaltung der biokatalytischen Wirksamkeit und Stabilität der Agglomerate nicht voraussehbaren Effekte sind von großer technologischer Bedeutung.
Beispiel 1
20CmI einer E. coli-Bakteriensuspension (1 % Bakterientrockensubstanz) mit Penicillin G-Acylase-Aktivität werden bei pH 7,5 und 25°C mit 20ml einer 1%igen CMC-Na-Salz-Lösur.g versetzt und danach mit 20rnl einer 1%igen Lösung von Polydimethyldiallylammoniumchlorid geflockt. Die Zugabe des anionischen b;:w. kationischen Polymeren erfolgt unter starker Durchmischung, wobei die Schnellrührphase jeweils 5 Minuten nach Polymer'.ugabe fortgeführt wird. Danach wird nochmals 10 Minuten langsam gerührt.
Abgetrennt wird die geflockte Bakteriensuspension auf einer Becherzentrifuge.
Der Vergleich der Abscheidegrade, der spezifischen Aktivität bzw. der Gesamtaktivität liefert folgende Werte:
Abscheidegrad spez. Aktivität Gesamtaktivität
(%) (E/mg BTS) (E)
E.coli
Biomasse 75,1 19,5 39·103
E.coli
Biomasse, geflockt 98,5 18,5 39-103
Die Aktivität der Penicillin G-Acylase wurde durch enzymatische Spaltung von Benzylpenicillin zu 6-APS ermittelt (vgl.
Balasingham et al.: Biochem. Biophys. Acta 276, 250,1972).
Die Gesamtaktivität ist die enzymatische Aktivität bei 100%igem Abscheidegrad der Biomasse.
Beispiel 2
51E.coli-Suspension (Schleuderwert 5% & 1,3% BTS, pH7,85, Zellzahl/ml == 2280-107) mit Penicillin G-Acylase-Aktivität werden unter starker Durchmischung mit einem Laborrührwerk mit 710ml einer 1%igen CMC-Lösung und nachfolgend mit 710ml Polydimethyldiallylammoniumchlorid-Lösung (1%ig) versetzt und nach weiteren 10 Minutfin der Separation mit Hilfe eines Laborseparators (SA 1-01-175,9700UZmIn"1, Fa. Westfalia) bei einem Durchsatz von V = · 17 l/h unterworfei Das Trennergebnis im Vergleich zur ungeflockten Suspension bei gleichem Durchsatz zeigt die folgende Übersicht:
Zellzahl/ml Abscheidegrad Gesamtaktivität
im Klarlauf (%) Sedimentin106E
E.coli-Biomasse 62x10" 73 24,6
ungeflockt
E.coli-Biomasse 2,1 χ 10" 99,1 23,8
geflockt
Beispiel 3
600ml E. coli-Suspension (pH6,4, Schleuderwert 5% £ 1,3% BTS) werden in drei Versuchen zu je 200ml entsprechend den Rührbedingungen des Beispiels 1 geflockt.
Die Einsatzkonzentrationen von CMC betrug 1 %, das kationische Flockungsmittel Polydimethyldiallylammoniumchlorid wurde in 1%iger Lösung angewandt.
Variiert wurden die zugesetzten Mengen
Versuch 1 jeweils 10Vol.-% der genannten Polymerlösungen Versuch 2 jeweils 20Vol.-% Versuch 3 jeweils 30Vol.-%.
Nach Abschluß der Flockung wurde die Suspension in ein Sedimentationsgefäß überführt und der Anteil der Klarzone bezogen auf die Höhe der Flüssigkeitssäule ermittelt. Die nachfolgende Tabelle zeigt das Ergebnis. Die ungeflockte E.coli-Suspension zeigt nach 215 Minuten keine Klarzone. Der erhöhte Polymereinsatz beschleunigt die Sedimentation und verringert das Sedimentvolumen.
Tabelle
Anteil der Klarzone in % der Flüssigkeitssäule in Abhängigkeit von der Sedimentationszeit
Zeit (min) O Anteil der Anteil der Anteil der
t 6 Klarzone Klarzone Klarzone
12 Versuch 1 Versuch 2 Versuch 3
18 0 0 0
24 6,7 12,5 27,2
30 14,6 33,9 34,4
60 23,3 46,4 59,4
120 32,1 54,7 65
215 40 58,9 68,5
61,2 69,3 75
71,2 75 79,7
77,5 78,6 85,9
Beispiel 4
Eine Bac. subtilis-Schüttelkultur (100ml, pH6,5, Zellzahl 1950 · 107/ml), die zur Gewinnung von Bakterienbiomasse mit antifugaler Wirkung gegen phytopathogone Pilze dient (Stamm ZIMET Nr. 11095) wird bei Zimmertemperatur mit 1CmI einer CMC-Na-Salz-Lösung (17oig) unter Rühren (5Min.) versetzt, danach werden unter Rühren 10ml einer 1%ig?n Polydimethyldiallylammoniumchlorid-Lösung hinzugefügt und weitere 5 Minuten gerührt. Die Abtrennung erfolgt mit Hilfe einer Laborzentrifuge (T23,5000U/min~\ 5Min. Fugat I). Den Vergleich der Fugate bei Einsatz unbehandelter Biomasse (Fugat II) zeigt folgende Übersicht:
Zellzahl/ml Zellzahl/ml Abscheidegrad (%) Abscheidegrad (%)
Fugat I Fugat Il Fugati Fugat Il
20x107 210 x 107 99 89,2
Beispiel 5
200ml einer Serratia marcescens-Kultur (Exoenzymbildner von Chitinase, Zellzahl 120 χ 108/ml mit Plattenverdünnungstest nach KOCH auf Standardagar bestimmt) werden in o.g. Weise bei pH6,5 mit 20ml CMC-Lösung (2%ig) und 20ml 2%iger Polydimethyldiallylammoniumchlorid-Lösung versetzt und wie oben zentrifugiert.
Die Ergebnisse zeigt die nachfolgende Übersicht (Fugat Il entspricht dem Trennergebnis der unbehandelten Biomasse):
Zellzahl/ml Zellzahl/ml Abscheidegrad (%) Abscheidegrad (%)
Fugat I Fugat Il Fugat I Fugat Il
1,5 X108 27X10" 98,7 77,5
Beispiel 6
Unter den Bedingungen gemäß Beispiel 1 werden 500 ml E.coli-Suspension (1 % BTS) zunächst mit 50ml einer 1%igen Polydimethyldiallylammoniumchlorid-Lösung und danach mit 50ml einer CMC-Alkalisalz-Lösung (1 %) versetzt. Die Bewertung des abgetrennten Sedimentes im Vergleich zur ungeflockten Biomasse zeigt folgende Tabelle:
Abscheidegrad spez. Aktivität Gesamtaktivität (%)_ (E/mg BTS) (E)
E.coli-Qiomasse 75,5 19,5
E.coli-Biomasse,
geflockt 98,3 18,5

Claims (5)

1. Verfahren zur Flockung von Bakterienbiomasse aus Suspensionen, dadurch gekennzeichnet, daß der Bakteriensuspension anionische Polyelektrolyte und kationische polymere Flockungsmittel in Lösungen geringer Konzentration zugesetzt werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Endkonzentration des anionischen und kationischen Polymers jeweils 0,01 bis 1 %, bevorzugt jedoch 0,01 bis 0,5% bezogen auf die Bakteriensuspension beträgt und der pH-Wert der Lösung zwischen pH4 und pH8 frei wählbar ist.
3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Wirksubstanzmengen des anionischen Poiyelektrolyten und des kationischen Flockungsmittels in festen, jedoch hinsichtlich der Konzentration frei wählbaren Verhältnissen zueinander stehen.
4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß als anionischer Polyelektrolyt vorzugsweise Karboxymethylzellulose Verwendung finde '.nd daß als kationisches Flockungsmittel Polydimethyldiallylammoniumchlorid eingesetzt wird.
5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Wirksubstanzmengen Karboxymethylzellulose zu Polydimethyldiallylammoniumchlorid bevorzugt 1:1 betragen.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003102184A1 (en) * 2002-05-31 2003-12-11 Dna Research Innovations Limited Methods, compositions and kits for cell separation
EP1765976A4 (de) * 2004-05-18 2007-10-03 Biomass Proc Technology Inc Ausflockungsverfahren und ausgeflockter organismus

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