DE3147130A1

DE3147130A1 - Verfahren zur reinigung und abtrennung von vitamin b12

Info

Publication number: DE3147130A1
Application number: DE19813147130
Authority: DE
Inventors: Noboru Tokyo Endoh; Tatsuo Kawasaki Kinoshita; Ichiro Yokosuka Kojima; Kenji Yokohama Maruhashi; Yutaka Oguchi; Tetsuo Yokohama Satoh
Original assignee: Nippon Oil Corp
Current assignee: Eneos Corp
Priority date: 1980-11-29
Filing date: 1981-11-27
Publication date: 1982-07-01
Also published as: GB2088383B; GB2088383A; FR2495161B1; CH646716A5; US4383110A; FR2495161A1

Description

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- 3 B'e s ch reibung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Abtrennung von Vitamin B₁₂ in reiner Form aus einer Vitamin B₁₂ enthaltenden Flüssigkeit mit einem Gehalt an Verunreinigungen, beispielsweise eine Vitamin B₁₂ enthaltende Flüssigkeit, die man bei einem Fermentationsverfahren erhält, und einer Vitamin B₁₂ enthaltenden Flüssigkeit, die man bei einem zellularen Extraktionsverfahren erhält. Die Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zur Abtrennung von Vitamin B₁₂ in reiner Form, gemäß dem Vitamin B₁₂ in hoher Reinheit abgetrennt und in hoher Ausbeute in einem hohen Wiedergewinnungsverhältnis von beispielsweise mehr als etwa 98% und manchmal so hoch wie 100% gemäß einem einfachen und leichtem Adsorptions- und Eluierungsverfahren erhalten wird. Weiterhin sind keine Vorrichtungen für zusätzliche Verfahrensstufen, wie zusätzliche Reinigungsoder Vorreinigungsstufen, erforderlich, während die schnellen Geschwindigkeiten bei der Adsorption und Elution und die gute Beständigkeit des Adsorptionsmittels beibehalten werden.

Die Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zur Abtrennung von Vitamin B₁₂ in reiner Form, gemäß dem eine Vitamin B₁₂ enthaltende Flüssigkeit mit einem Gehalt an Verunreinigungen in Kontakt mit einem Harz gebracht wird, welches aus der Gruppe ausgewählt wird, die (A) ein Divinylbenzol/Styrol-Copolymerisat mit einem häufigsten Porendurchmesser von mindestens etwa 200 A und einem Gesamtporenvolumen über 0,6 ml/g und (B) ein Copolymerisat von Divinylbenzol/Styrol/ungesättigtem Alkylester einer aromatischen Polycarbonsäure der FormelK-H C^OOR)_n umfaßt, worin R eine ungesättigte Alkylgruppe mit 3 bis 10 Kohlenstoffatomen mit einer Kohlenstoff-Kohlenstoff-

Doppelbindung bedeutet und η für 2 oder 3 steht, wobei das Copolymerisat (B) eine Oberfläche von mindestens etwa 700 m /g aufweist, und gemäß dem das Vitamin B₁₂ an dem Harz adsorbiert und das Vitamin B₁₂ ^m^ einem Eluierungsmittel eluiert und das aktive Eluat gesammelt wird.

Es ist bekannt, Vitamin B₁₂ ^v°n einer Vitamin B₁₂ enthaltenden Flüssigkeit mit einem Gehalt an Verunreinigungen gemäß einem Adsorptions-Eluierungs-Verfahren unter Verwendung von Adsorbentien, wie Aktivkohle, aktiviertes Aluminiumoxid, Sephadex und Ionenaustauschharzen, abzutrennen. Es hat sich jedoch gezeigt, daß ein solches Verfahren bei der industriellen Durchführung ungeeignet ist, da die Menge an Vitamin B₁₂, die an den Adsorbentien adsorbiert wird, gering ist und die "selektive Adsorptionsfähigkeit der Adsorbentien niedrig ist. Weiterhin ist der Reinigungsgrad des Vitamin B₁₂ in der aktiven Fraktion niedrig, und wendet man zusätzliche Reinigungsverfahren an, ist es trotzdem schwierig, das Vitamin B₁₂ in ausreichender Reinheit abzutrennen. Weiterhin hat ein Reinigungsverfahren, bei dem mehrere Stufen kombiniert werden, den Nachteil, daß sich der Verlust an Vitamin B₁₂ während des Reinigungsverfahrens erhöht. Die physikalische Festigkeit der bei solchen Verfahren verwendeten Adsorbentien ist ebenfalls niedrig. Bei einer Wiederholung des Adsorptions-Eluierungs-Vorgangs ist es wahrscheinlich, daß die Adsorbentien blockiert bzw. verbraucht sind,und die gewünschte Strömungsrate kann daher nicht aufrechterhalten werden.

Bei einem Versuch, diese Nachteile zu beseitigen, hat man Verfahren zur Reinigung von rohem Vitamin B₁₂ entwickelt, bei denen Harze der Amberlite XAD-Reihe (Styrol/Vinylbenzo1-Harze, hergestellt von Rohm & Haas Co.) verwendet werden. Die Verwendung von Harzen dieser Art ist jedoch ebenfalls nicht zufriedenstellend.

Untersuchungen der Anmelderin haben gezeigt, daß die Harze der Amberlite XAD-Reihe einen häufigsten Porendurchmesser von etwa 50 bis 100 2. und ein Gesamtporenvolumen von 0,3 bis 0,6 ml/g aufweisen, daß aber ihre Kapazität für die Adsorption von Vitamin B₁₂ nicht so hoch ist, wie es wünschenswert ist, und dieser Nachteil tritt noch stärker hervor bei Vitamin B₁₂ enthaltenden Flüssigkeiten mit einem Gehalt an relativ großen Mengen von Verunreinigungen, wie eine Vitamin B₁₂ enthaltende Flüssigkeit, die gemäß einem Fermentationsverfahren erhalten wird, und eine Vitamin B₁₂ enthaltende Flüssigkeit, die bei einem zellularen Extraktionsverfahren erhalten wird. Hierbei beobachtet man eine stark verschlechterte Adsorptionskraft für diese rohes Vitamin B₁₂ enthaltende Flüssigkeiten. Die Untersuchungen haben weiter gezeigt, daß diese Harze nichtionische, adsorptionsfähige Harze mit hoher

Porosität sind, was durch ihre Oberfläche von etwa 700 m / g offensichtlich ist. Da die adsorptionsfähige Oberfläche der Harze hydrophobe oder nicht-polare Moleküle aufweist, ist es vermutlich nur der hydrophobe Teil des Vitamin B₁₂, das sowohl einen hydrophoben Teil als auch einen hydrophilen Teil in seiner Molekülstruktur aufweist, welcher an der Adsorption teilnimmt. Es ist daher sehr schwierig, die obigen Nachteile der verringerten Adsorptionskapazität zu beseitigen.

Die Anmelderin hat Untersuchungen vorgenommen, um die zuvor erwähnten technischen Schwierigkeiten, die bei der Abtrennung von gereinigtem Vitamin B₁₂ bei Adsorptionsund Eluierungsverfahren aus einer Vitamin B₁₂ enthaltenden Flüssigkeit mit einem Gehalt an Verunreinigungen auftreten, zu beseitigen und ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, gemäß dem Vitamin B₁₂ mit hoher Reinheit in hoher Ausbeute mit industriellem Vorteil aus einer rohes Vitamin B₁₂ enthaltenden Flüssigkeit abgetrennt werden kann.

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Diese Untersuchungen haben zu der Erfindung geführt, daß ein Harz, welches aus der Gruppe ausgewählt wird, die enthält: (A) ein Divinylbenzol/Styrol-Copolymerisat mit einem häufigsten Porendurchmesser von mindestens 200 2. und einem Gesamtporenvolumen von mehr als 0,6 ml/g und (B) ein Copolymerisat von Divinylbenzol/Styrol/ungesättigtem Alkylester einer aromatischen Polycarbonsäure der Formel

, worin R einen C^_{-1 Q} ungesättigten Alkyl-

rest mit einer Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung bedeutet und η für 2 oder 3 steht, wobei das Harz (B) eine Oberfläche von mindestens etwa 700 m /g besitzt, eine ausgezeichnete Fähigkeit aufweist, die selektive Adsorption großer Mengen an Vitamin B₁₂ ^aus einer Vitamin B₁₂ enthaltenden Flüssigkeit mit einem Gehalt an Verunreinigungen zu ermöglichen. Es wurde weiterhin festgestellt, daß Vitamin B₁₂ in einem hohen Wiedergewinnungsverhältnis von mehr als 98% und selbst 100% gemäß einem einfachen und leichten Adsorptionsverfahren und einer Vorrichtung abgetrennt werden kann, ohne daß zusätzliche Reinigungsmaßnahmen und/oder vorläufige Reinigungsmaßnahmen erforderlich sind.

Es wurde weiterhin gefunden, daß mit dem erfindungsgemäßen, spezifizierten Harz-Adsorptionsmittel zufriedenstellende Adsorptions-Eluierungs-Strömungsgeschwindigkeiten bei der Behandlung einer Vitamin B₁₂ enthaltenden Flüssigkeit mit einem Gehalt an Verunreinigungen erhalten werden und daß bei wiederholten Verfahren die Schwierigkeiten des Verbrauchs des Harz-Adsorptionsmittels bzw. des Blockierens vermieden werden und daß das Harz eine hohe Dauerhaftigkeit bzw. Stabilität und Beständigkeit aufweist und mit Vorteil zur Verbesserung bei der industriellen" Reinigung und Abtrennung von Vitamin B₁₂ aus Vitamin B₁₂ und Verunreinigungen enthaltenden Flüssigkeiten führt.

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Erfindungsgemäß wurde weiterhin gefunden, daß Vitamin B₁₂ mit hoher Reinheit abgetrennt werden kann, ohne daß es erforderlich ist, zusätzliche Reinigungsmaßnahmen und/oder Vorreinigungsmaßnahmen durchzuführen. Man erhält ein sehr hohes Wiedergewinnungsverhältnis von mehr als 98% und manchmal bis zu 100%, was im Gegensatz zu dem Vitamin B₁₂" Wiedergewinnungsverhältnis von 75 bis 90% bei bekannten Wiedergewinnungsverfahren steht, bei denen organische Lösungsmittel, wie Phenol, verwendet werden, oder einem Vitamin B₁₂-Wiedergewinnungsverhältnis von 63 bis 95% gemäß einem bekannten Adsorptions-Eluierungs-Verfahren, bei dem übliche Adsorbentien, wie Aktivkohle, aktives Aluminiumoxid oder lonenaustauschharze, verwendet werden. Es wurde weiterhin gefunden, daß das erfindungsgemäße Harz die zuvor erwähnten, ausgezeichneten Reinigungs- und Abtrennungswirkungen selbst in 100 Zyklen bei einem Dauerhaftigkeitstest aufweist.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein verbessertes Verfahren zur Abtrennung von Vitamin B₁₂ in reiner Form zur Verfügung zu stellen.

Das bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Harz (A) ist ein Divinylbenzol/Styrol-Copolymerisat mit einem häufigsten Porendurchmesser von mindestens etwa 200 2. und einem Gesamtporenvolumen von mehr als 0,6 ml/g. Das adsorptionsfähige Harz (A), welches die Bedingungen hinsichtlich des häufigsten Porendurchmessers und des Gesamtporenvo lumens einheitlich erfüllt, besitzt eine makroretikulare Struktur und ist hoch porös und zeigt eine etwa 2- bis etwa 4fach bessere Fähigkeit, Vitamin B₁₂ zu adsorbieren als die früher verwendeten, nichtionischen, adsorptionsfähigen Harze, wie Amberlite XAD-2.

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Der häufigste Porendurchmesser beträgt mindestens etwa 200 &, bevorzugt mindestens 250 ft, beispielsweise etwa 200 bis 1200 2., bevorzugt 250 bis 1200 Ä, und das Gesamtporenvolumen beträgt mehr als 0,6 ml/g bis etwa 1,2 ml/g, bevorzugt 0,68 bis 1,2 ml/g*

Zusätzlich zu den obigen Parametern sollte das Harz (A), das bei der vorliegenden Erfindung verwendet wird, bevorzugt die Forderung erfüllen, daß Poren mit einem Porendurchmesser von mindestens etwa 200 £ in ihm ein Porenvolumen von mindestens 0,1 ml/g, bevorzugt 0,2 bis 1,0 ml/g, aufweisen.

Das bei- dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Harz (B) ist ein Copolymer! sat von Divinylbenzöl/Styrol/ungesättigtem Alkylester einer aromatischen Polycarbonsaure mit der zuvor erwähnten Formel und einer Oberfläche von mindestens etwa 700 m/g. Während die üblichen Harze der Amberlite XAD-Reihe keine polare Oberfläche aufweisen, besitzt das Harz (B) eine mäßige polare Oberfläche, die sich von dem ungesättigten Alkylester der aromatischen Polycarbonsaure ableitet. Das Harz (B) weist eine etwa 4- bis 8fach bessere Fähigkeit auf* Vitamin B^ zu. adsorbieren, verglichen mit den bekannten Harzen* Die Oberfläche des Harzes (B) beträgt mindestens etwa 700 m /g, bevorzugt mindestens etwa 800 m/g, beispielsweise etwa 700 bis etwa 1200 m /g» bevorzugt etwa 8ÖÖ bis etwa 1200 m²/g.

Die Form der bei der vorliegenden Erfindung verwendeten Harze (A) und (B) kann frei gewählt werden* Beispielsweise können sie in Form eines Pulvers, als Granulat, als Pellets und dergl* vorliegen*

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Der häufigste Porendurchmesser und das Gesamtporenvoluraen des Harzes (A) und die Oberfläche des Harzes (B) werden nach den folgenden Verfahren bestimmt.

Jedes der Harze (A) und (B) wird in eine Säule mit einem Durchmesser von 8 mm und einer Länge von 500 mm gegeben. Eine Chloroformlösung von jeweils zehn Arten Polystyrol mit bekannten Molekulkettenlängen und eine Chloroformlösung von Styrol werden jeweils durch die mit Harz gefüllte Säule geleitet. Das Volumen des jeweiligen eluierten Polystyrols Vi (ml) wird gemessen.

Jedes Polystyrol besitzt eine Molekülkettenlänge von 10 A bis 10²A und die Molekülkettenlängen-Verteilung ist sehr eng.

Unter Verwendung der Molekülkettenlänge (X) und des Eluierungsvolumens Vi (ml) und des Gewichts W (g) eines in eine Säule gefüllten Harzes werden das Gesamtporenvolumen (V ml/g), das Porenvolumen (V200 ml/g) der Poren mit einem Porendurchmesser von mindestens etwa 200 A und die Oberfläche (S m /g) aus den folgenden Gleichungen berechnet:

(1) Vi (ml/g) = (V_m - V_n)/W

(2) Si (m²/g) = 8-Vi-10⁴/(m + n)

i=8000

(3) V (ml/g) = £Vi

i=15

i=8000

(4) V₂₀₀ (ml/g) = 1 Vi

²⁰⁰ i=200

₀ i=8000

(5) S (nr/g) = Σ Si

i=15

Darin bedeuten:

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Vi = das Porenvolumen von mA bis nA Vm = das eluierte Volumen von Polystyrol von mA Vn = das eluierte Volumen von Polystyrol von nA Si = die Oberfläche von mA bis nA m und η = die Molekülkettenlänge.

Der häufigste Porendurchmesser ist als Volumen von (m + n)/2 bei einem maximalen Wert von Vi in einem Histogramm definiert, welches hergestellt wird, indem man Vi auf der Ordinate und (m + n)/2 auf der Abszisse aufträgt. Der Ausdruck "häufigster Porendurchmesser"entspricht dem angelsächsischen Ausdruck "mode pore diameter"; als "häufigster Porendurchmesser" könnte man auch den Ausdruck "tatsächlicher Porendurchmesser" oder "Modusporendurchmesser" verwenden.

Die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Harze (A) und (B) können nach an sich bekannten Suspensions-

Polymerisations-Verfahren in wäßrigen Medien hergestellt werden. Das Harz (A) ist im Handel unter den Warenzeichen Diaion HP-10, HP-20, HP-30, HP-40 und HP-50 (Produkte der Mitsubishi Chemical Co., Ltd.) erhältlich.

Das Harz (A) kann sich von Divinylbenzol und Styrol oder seinen funktioneilen Derivaten ableiten. Das Harz (B) kann sich von Divinylbenzol, Styrol oder seinen funktionellen Derivaten und dem ungesättigten Alkylester einer aromatischen Polycarbonsäure ableiten. Beispiele von funktioneilen Derivaten von Styrol umfassen alkylsubstituierte Derivate mit C., g-Alkylgruppen, wie Methylstyro.l, Äthylstyrol, Dimethylstyrol und Propylstyrol. Beispiele ungesättigter Alkylester einer aromatischen Polycarbonsäure sind Di- oder TrI-C^₁₀-alkenylester, wie Triisopropenyl, 1,2,4-Benzoltricarboxylat und Diisopropenylterephthalat. Bei der Herstellung des Harzes (B) können ein oder mehrere

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Styrolmonomere, ausgewählt unter Styrol und seinen funktioneilen Derivaten, und ein oder mehrere ungesättigte Alkylester der aromatischen Polycarbonsäuren verwendet werden.

In den Harzen (A) oder (B) können die Gehalte an Styrolmonomerem oder ungesättigtem Alkylester einer aromatischen PoIycarbonsäure auf geeignete Weise ausgewählt und geändert werden. Die Menge an Styrolmonomerem beträgt bevorzugt etwa 30 bis etwa 80 Gew.%, besonders bevorzugt etwa 45 bis etwa 70 Gew.%, bezogen auf die Gesamtmenge an Styrolmonomerem und Diviny!benzol. Die Menge an ungesättigtem Alkylester einer aromatischen Polycarbonsäure beträgt vorzugsweise bis zu etwa 30 Gew.%, bevorzugter etwa 0,1 bis etwa 30 Gew.% und besonders bevorzugt etwa 1 bis etwa 10 Gew.%, bezogen auf die Gesamtmenge an Divinylbenzol, dem Styrolmonomeren und dem ungesättigten Alkylester der aromatischen Polycarbonsäure.

Im Handel erhältliches Divinylbenzol enthält etwa 40 bis etwa 70 Gew.% m- und p-Divinylbenzole und etwa 30 bis etwa 60 Gew.% o-, m- und p-Äthylstyrol. Dieses im Handel erhältliche Divinylbenzol kann ebenfalls als solches, wie das zuvor erwähnte Divinylbenzol und Styrolmonomere, verwendet werden.

Die Copolymerisationsreaktion kann nach per se bekannten Verfahren erfolgen. Beispielsweise können die Harze (A) oder (B) duich Copolymerisation in Suspension von Divinylbenzol und Styrol oder seinen funktioneilen Derivaten und weiter dem ungesättigten Alkylester einer aromatischen Polycarbonsäure in Anwesenheit eines Polymerisationsinitiators hergestellt werden.

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Bekannte Radikalpolymerisationsinitiatoren, die in den zuvor erwähnten Monomeren löslich sind, können bei der obigen Copolymerisationsreaktion verwendet werden. Beispiele sind Benzoylperoxid, Lauroylperoxid, tert.-Butylperacetat, tert.-Butylperpivalat und Azo-bis-isobutyronitril. Die Menge an Polymerisationsinitiator kann auf geeignete Weise gewählt werden und beträgt beispielsweise etwa 0,1 bis etwa 10 Gew.%, bevorzugt etwa 0,5 bis etwa 3 #

Bevorzugt wird bei der wäßrigen Suspensionscopolymerisation ein Dispersionsmittel verwendet, um ein granuläres Copolymerisat zu erhalten. Beispiele solcher Dispersions mittel sind schwer lösliche Metallsalze anorganischer Säuren, wie Bariumsulfat, Calciumcarbonat und Tricalcium phosphat; schwer lösliche Tonmineralien, wie Bentonit und Ton; und natürliche oder synthetische, wasserlösliche, polymere Materialien, wie Stärke, Methylcellulose, Gelatine, Polyvinylalkohol, teilweise verseifter Polyvinylalkohol und Salze von Polyacrylsäuren, wie PoIy-(natriumacrylat) oder Poly-(kaliumacrylat). Die Menge an Dispersionsmittel kann auf geeignete Weise ausgewählt werden und beträgt beispielsweise etwa 0,1 bis etwa 10 Gew.%, bevorzugt etwa 0,5 bis etwa 7 Gew.%, bezogen auf die Gesaratmenge an monomerem Gemisch.

Bei der Durchführung der wäßrigen Suspensionsoopolymerisation kann auch ein Dispersionsstabilisator verwendet werden. Der Dispersionsstabilisator kann beispielsweise Natriumdodecylbenzolsulfonat und andere verschiedene, oberflächenaktive Mittel enthalten. Die Verwendung eines Dispersionsmittels mit oder ohne Dispersionsstabilisator verhindert die Zunahme der Größe des Gels, welche durch Koaleszieren des Lösungsmittels und der Monomeren teilweise bei der Suspensionspolymerisation auftritt,

land erlaubt die leichte Bildung des Copolymerisats aus Divinylbenzol/Styrol oder des Copolymerisats aus Divinylbenzol/Styrol/ungesättigtem Alkylester einer, aromatischen Polycarbonsäure mit einheitlicher Teilchengröße. Als Ergebnis wird die Teilchengrößenverteilung der entstehenden Harzteilchen verbessert und Harzteilchen (A) oder Harzteilchen (B) mit ausgezeichneter Fähigkeit, Vitamin B^₂ ^zu adsorbieren, werden erhalten.

Gegebenenfalls kann ein Gemisch aus Lösungsmitteln, die für mindestens eine der Verbindungen (Divinylbenzol und ungesättigter Alkylester der aromatischen Polycarbonsäuren) ein gutes Lösungsmittel sind, verwendet werden.

Beispiele solcher guten Lösungsmittel sind alky!substituierte Benzole, wie Diäthylbenzol, Trimethylbenzol und Methylisopropylbenzol, als gute Lösungsmittel für Divinylbenzol; und aliphatische Alkohole, wie tert.-Isoamylalkohol und tert.-Butylalkohol, als gute Lösungsmittel für die ungesättigten Alkylester aromatischer Polycarbonsäuren. Wenn beispielsweise ein Gemisch aus tert.-Isoamylalkohol und Diäthylbenzol als Lösungsmittel verwendet wird, wirkt es als gutes Lösungsmittel für eines der Monomeren, jedoch als schlechtes Lösungsmittel für das andere Monomere. Dementsprechend dient es dazu, den entstehenden Harzteilchen eine gleichmäßige makroretikulare Struktur zu verleihen, und erhöht somit die Porosität des gesamten Harzes. Dies ist für die Verringerung des Quellgrads der Adsorbensharze, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden, wirksam und dient dazu, den Harzen eine bessere Fähigkeit, Vitamin B₁₂ ^zu trennen, zu verleihen.

Bevorzugt wird die wäßrige Suspensionscopolymerxsation normalerweise in Inertgasatmosphäre, wie Stickstoff,

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durchgeführt. Die Copolymerisationstemperatur und -zeit können auf geeignete Weise, abhängig von der Art des Polymerisationsinitiators etc., ausgewählt werden. Beispielsweise können eine Temperatur von etwa 0 bis etwa 110⁰C, bevorzugt etwa 50 bis etwa 10O⁰C, und eine Zeit von etwa 8 Stunden bis etwa 16 Stunden als Beispiele aufgeführt werden.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wird eine Vitamin B^p enthaltende Flüssigkeit mit einem Gehalt an Verunreinigungen in Kontakt mit dem Harz (A) und/oder dem Harz (B) gebracht, wodurch eine Adsorption des Vitamins B^₂ an dem Harz stattfindet. Das Vitamin B₁₂ wird mit einem Eluierungsmittel eluiert und das aktive Eluat wird gesammelt. Als Ergebnis kann hochreines Vitamin B₁₂ in hoher Ausbeute gemäß einem einfachen und leichten Adsorptions- und Eluierungsverfahren und einer einfachen Vorrichtung abgetrennt werden, ohne daß zusätzliche Reinigungsmaßnahmen und/oder Vorreinigungsmaßnahmen erforderlich sind, während bei der Adsorption und Eluierung ausreichende Strömungsgeschwindigkeiten erhalten werden und das Adsorbensharz eine hervorragende Beständigkeit aufweist.

Die Vitamin B₁₂ enthaltende Flüssigkeit mit einem Gehalt an Verunreinigungen, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gemäß einer Adsorption und Eluierung behandelt wird, ist z.B. eine rohes Vitamin B₁₂ enthaltende Flüssigkeit, die man erhält, indem man Vitamin B₁₂, das in der Kulturbrühe akkumuliert ist, oder gezüchtete Mikrobenzellen, erhalten durch Züchten eines Vitamin B₂ erzeugenden Mikroorganismus in einem Nährmedium,mit Wasser oder einem Alkohol, wie Methanol, Äthanol oder Isopropanol, extrahiert; eine rohes Vitamin B₁₂ enthaltende Flüssigkeit, die man erhält, indem man die zellularen Membranen

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von Vitamin B₁₂ enthaltenden, gezüchteten Mikrobenzellen durch Mahlen und andere mechanische Maßnahmen oder Ultraschall zerstört; oder eine rohes Vitamin B₁₂ enthaltende Flüssigkeit, die man bei der Extraktion mit Wasser oder einem Alkohol der zuvor erwähnten, rohes Vitamin B₁₂ enthaltenden Flüssigkeit erhält, die man durch zellulare Membranzerstörung hergestellt hatte.

Die Herstellung von Vitamin B₁₂ gemäß einem Fermentationsverfahren und die Vitamin B₁₂ erzeugenden Mikroorganismen sind bekannt und können für die Bildung der rohes Vitamin B₁₂ enthaltenden Flüssigkeiten, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren behandelt werden, verwendet werden.

Beispiele bekannter Vitamin B₁₂ erzeugender Mikroorganismen sind Mikroorganismen, die zu den Genera Propionibacterium, Streptomyces, Arthrobacter, Corynebacterium, Rhodopseudomonas, Mycobacterium und Pseudomonas gehören. Spezifische Beispiele dieser bekannten Mikroorganismen werden im folgenden aufgeführt. Sie sind von den angegebenen Hinterlegungsstellen für Mikroorganismen erhältlich.

Propionibacterium freudenreichii (ATCC 6207); Propionibacterium shermanii (ATCC 8262); Streptomyces olivaceus (ATCC 3335); Arthrobacter hyalinus (ATCC 31263); Arthrobacter simplex (ATCC 6946); Rhodopseudomonas spheroides (ATCC 11167); Rhodopseudomonas capsulata (ATCC 11166); Corynebacterium sp. (IFO 12320); Mycobacterium smegmatis (IFO 3082); und Pseudomonas denitrificans (ATCC 13867).

Ein Verfahren zur Erzeugung von Vitamin B₁₂ durch Fermentation unter Verwendung bekannter, Vitamin B₁₂ erzeugender Mikroorganismen, wie sie oben als Beispiele aufgeführt

wurden, ist bekannt und wird beispielsweise in Microbial Technology, 2. Edition, Band 1, Seiten 497-519, 19791 Academic Press, Inc., beschrieben.

Das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt das In-Kontakt-Bringen der zuvor erwähnten, rohes Vitamin B₁₂ enthaltenden Flüssigkeit mit dem Harzadsorbens (A) und/oder dem Harzadsorbens (B), wodurch eine Adsorption des Vitamins B₁₂ &ⁿ dem Harz stattfindet, Eluieren des adsorbierten Vitamins B₁₂ von dem Harz mit einem Eluierungsmittel und Sammeln des aktiven Eluats.

Für die Kontaktierungsstufe kann man irgendeine Maßnahme, die einen vollständigen Kontakt der beiden Bestandteile sicherstellt, verwenden. Beispielsweise kann man ein diskontinuierliches Verfahren verwenden, bei dem das adsorbierende Harz mit der Vitamin B₁₂ enthaltenden Flüssigkeit vermischt wird .und gegebenenfalls das Gemisch gerührt wird, um einen Kontakt der beiden Bestandteile zu bewirken. Man kann ebenfalls ein Säulenchromatographie-Verfahren verwenden, gemäß dem das adsorbierende Harz in eine geeignete Säule gefüllt wird und die Vitamin B₁₂ enthaltende Flüssigkeit durch die gefüllte Harzschicht geleitet wird. Bei dem diskontinuierlichen Verfahren wird der pH-Wert der Vitamin B₁₂ enthaltenden Flüssigkeit auf einen geeigneten Wert, z.B. etwa 5 bis etwa 8, bevorzugt etwa 7, eingestellt und eine geeignete Menge (z.B. etwa 1 bis etwa 50 Vol-Teile/Vol-Teil rohes Vitamin B₁₂ enthaltender Flüssigkeit) des Adsorbens wird zugesetzt. Dann wird das Gemisch mäßig während etwa 10 min bis etwa 2 h, normalerweise etwa 20 min bis etwa 1 h, gerührt. Die bei dem Adsorptionsvorgang verwendete Temperatur kann Zimmertemperatur sein, sie ist jedoch so niedrig wie möglich und beträgt beispielsweise etwa 10 bis etwa 30°C.

Das Säulenchromatographie-Verfahren kann ebenfalls durchgeführt werden, indem man die Vitamin B₁₂ enthaltende Flüssigkeit durch eine Schicht aus dem gefüllten Adsorptionsmittel bei ähnlichen pH- und Temperaturbedingungen leitet, wie man sie bei dem diskontinuierlichen Verfahren anwendet.

Nach der Adsorptionsbehandlung wird das Harz gewaschen. Dann wird es mit einem Eluierungsmittel eluiert. Beispielsweise ist es bevorzugt, daß das adsorbiertes Vitamin B₁₂ enthaltende Harz mit Wasser oder einem wasserhaltigen Alkohol mit niedriger Konzentration, wie mit 5?Sigem wäßrigem Methanol, 2%igem wäßrigem Äthanol oder 1%igem wäßrigem Isopropanol, gewaschen und dann mit dem Eluierungsmittel eluiert wird.

Durch die Elution von Vitamin B₁₂ aus dem adsorbierenden Harz mittels eines Eluierungsmittels erhält man ein aktives Eluat, das gereinigtes Vitamin B₁₂ enthält.

Übliche Eluierungsmittel können verwendet werden und Beispiele sind wäßrige Lösung von niederen aliphatischen Alkoholen, Säuren, Alkalien und Salzen. Spezifische Beispiele umfassen niedere aliphatische Alkohole, wie Methanol, Äthanol und Isopropanol; Säuren, z.B. anorganische Säuren, wie Phosphorsäure, Borsäure und Chlorwasserstoffsäure, und organische aliphatische Carbonsäuren, wie Essigsäure; Alkalien, wie Natriumhydroxid, Monoammoniumphosphat, Diammoniumphosphat und Ammoniumnitrat; sowie Salze, wie Natriumcarbonat, Natriumacetat, Natriumphosphat und Kaliumphosphat. Das Eluierungsmittel kann auf geeignete V/eise, abhängig von der Art und der Menge an Verunreinigungen und dem Typ des adsorbierenden Harzes, ausgewählt werden. Wäßrige Lösungen von niederen aliphatischen Alkoholen sind bevorzugt. Beispielsweise können wasserhaltige Aiko-

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hole mit einer Alkoholkonzentration von weniger als etwa 50%, wie 25- bis 50#iges Methanol, 15- bis 40%iges Äthanol und 6- bis 20%iges Isopropanol, verwendet werden.

Der Eluierungsvorgang kann bei Zimmertemperatur durchgeführt werden und Erhitzen oder Kühlen ist nicht besonders erforderlich. Gegebenenfalls kann man ein Erhitzen oder ein Kühlen durchführen. Beispielsweise kann der Eluierungsvorgang bei etwa 30 bis etwa 80⁰C durchgeführt werden.

Bei dem obigen Verfahren wird ein aktives Eluat erhalten, und gegebenenfalls kann dieses konzentriert, umkristallisiert oder auf andere Art und Weise aufgearbeitet werden.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

100 ml granuläres Divinylbenzol/Styrol-Copolymerisat mit einem häufigsten Porendurchmesser von 320 2. und einem Gesamtporenvolumen von 0,91 ml/g, welches gemäß einem wäßrigen Suspensionspolymerisationsverfahren unter Verwendung von industriellem Divinylbenzol (Reinheit etwa 5556» wobei der Rest Äthylvinylbenzol ist) erhalten wurde, wird in eine Glassäule gefüllt.

Poren mit einem Porendurchmesser von mindestens etwa 200 2. in diesem Harz besitzen ein Porenvolumen von 0,50 ml/g.

Ein gemahlenes Produkt aus Mikrobenzellen, die Vitamin B₁ ρ enthalten, welches durch Zentrifugenabtrennung von einer Kulturbrühe aus Propionibacterium shermanii (IFO 12391), einem Vitamin B₁₂ erzeugenden Mikroorganismus, erhalten wurde, wird mit 80$>igem wäßrigem Äthanol mit einem Gehalt

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an KCN extrahiert. Die entstehende, Vitamin B₁₂ enthaltende Flüssigkeit mit einem Gehalt an Verunreinigungen wird auf das 1Ofache konzentriert und mit Wasser in einer Menge, die um das 1Ofache größer ist als das Konzentrat, verdünnt, wobei man eine Flüssigkeit erhält, die Vitamin B^₂ und Verunreinigungen (Vitamin B^-Gehalt = 23 ppm) enthält.

1 1 der Vitamin B₁₂ enthaltenden Flüssigkeit kann durch die granuläre Harzschicht der Säule mit einer Strömungsrate von 4 ml/min fließen und wird an dem Harz adsorbiert. Kontinuierlich werden 2 1 entionisiertes Wasser durch das Harz geleitet, damit die Verunreinigungen in die Adsorptionsabfallflüssigkeit gehen.

Dann werden 3 1 4O?6iges wäßriges Methanol durch die Säule zur Eluierung des Vitamins B₁₂ geleitet. Die Strömungsrate beträgt 3 ml/min. 1 1 aktives Aluat wird gesammelt, und die Konzentration an Vitamin B₁₂ in dem aktiven Eluat wird mittels eines mikrobiologischen Analyseverfahrens bestimmt. Sie beträgt 23 ppm. Das Wiedergewinnungsverhältnis des Vitamins B₁₂ aus der Vitamin B₁₂ und Verunreinigungen enthaltenden Flüssigkeit beträgt somit 100$ό.

Beispiel 2

100 ml eines technischen Divinylbenzol/Styrol-Copolymerisats (Diaion HP-20; häufigster Porendurchmesser = 460 2.; Gesamtporenvolumen = 1,08 ml/g) werden in eine Glassäule gefüllt und 1 1 der gleichen Flüssigkeit, wie sie in Beispiel 1 verwendet wurde, die Vitamin B₁₂ und Verunreinigungen enthält (Vitamin B_i2-Gehalt = 23 ppm), wird auf die Säule gegeben und kann durch die Harzschicht in einer Strömungsrate von 4 ml/min fließen, wobei eine Adsorption von Vitamin B₁₂ stattfindet. Kontinuierlich v/erden 2 1

entionisiertes Wasser abwärts durch die Säule in einer Rate von 4 ml/min geleitet, wobei die Verunreinigungen in die Abfallflüssigkeit gehen. Dann wird Vitamin B₁₂ niit 4O?4igem wäßrigem Methanol verdünnt bzw. eluiert. 1 1 aktives Eluat wird gesammelt, und die Konzentration an Vitamin B₁₂ wird gemäß einem mikrobiologischen Analysenverfahren bestimmt. Sie beträgt 23 ppm, wie in Beispiel 1. Das Wiedergewinnungsverhältnis von Vitamin B₁₂ aus der Vitamin B₁₂ und Verunreinigungen enthaltenden Flüssigkeit beträgt somit 100%.

Beispiel 3

In einen 150 1 Rührtank gibt man 5,0 kg industrielles Divinylbenzol (Reinheit etwa 55%', wobei der Rest Äthylvinylbenzol ist), 1 kg Tripropenyl-1,2,4-benzoltricarboxylat, 6,0 kg Diäthylbenzol, 3,0 kg Isoamylalkohol, 80 kg Benzoylperoxid, 100 1 Wasser, 4 kg Tricalciumphosphat und 6 g Natriumdodecylbenzolsulfonat, und unter Rühren wird das Gemisch der Suspensionspolymerisation bei 90°C während 8 h unterworfen, wobei ein granuläres, vernetztes Polymerisat erhalten wird.

Das entstehende, granuläre Polymerisat wird filtriert, mit Methanol und Chloroform in einer Säule gewaschen und erneut filtriert und unter verringertem Druck bei 60 bis 80⁰C getrocknet, wobei man 5,3 kg weißes, nicht-transparentes, granuläres Polymerisat erhält.

Das Polymerisat besitzt eine Oberfläche von 874 m /g und ein Gesamtporenvolumen von 1,7 ml/g.

Poren mit einem Porendurchmesser von mindestens etwa 200 8. in dem Harz besitzen ein Porenvolumen von 0,30 ml/g.

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Dieses Harz zeigt eine Infrarot-Absorption bei 1740 cm , die für die Carbonylgruppe charakteristisch ist. Diese Tatsache zeigt, daß Tripropenyl-1,2,4-benzoltricarboxylat wirksam in das Polymerisat durch Copolymerisation einverleibt ist.

Ein Vitamin B₁₂ enthaltendes Produkt, das durch Kultivieren von Propionibacterium shermanii (IFO 12391), eines Vitamin B₁₂ liefernden Mikroorganismus, erhalten wird, wird zentrifugiert und Vitamin B₁₂ wird zusammen mit den Verunreinigungen von den abgetrennten Mikrobenzellen unter Verwendung von 80%igem wäßrigem Äthanol mit einem Gehalt an KCN extrahiert. Die entstehende Lösung wird auf das 1Ofache mittels eines Eindampfungsvorgangs konzentriert, wobei eine rohe Vitamin B₁₂-KuIturflüssigkeit (Vitamin B₁₂~Gehalt = 500 ppm) erhalten wird. 100 ecm der Kulturflüssigkeit werden durch eine Säule geleitet, die mit 3 1 der obigen Harzteilchen gepackt ist, wobei man eine Rate von 200 ccm/min und ein absteigendes Verfahren verwendet, wodurch Vitamin B₁₂ adsorbiert wird. Kontinuierlich werden 10 1 einer 1%igen wäßrigen Lösung von Essigsäure durch die Säule geleitet, wodurch die Verunreinigungen in die Abfallflüssigkeit fließen. Dann wird Vitamin B₁₂ mit 30%igem wäßrigem Methanol eluiert, und 8000 ecm des aktiven Eluats werden gesammelt und getrocknet, wobei man Vitamin B₁₂-Pulver erhält. Das pulverförmige Vitamin B₁₂ besitzt eine Reinheit von 80%. Die Ausbeute an Vitamin B₁₂ aus der Kulturflüssigkeit zu Eluat beträgt 100%.

Beispiel 4

In einen 150 1 Rührtank gibt man 5,0 kg industrielles Divinylbenzol (Reinheit etwa 55%; wobei der Rest Äthylvinylbenzol ist), 0,25 kg Tripropenyl-1,2,4-benzoltricarb-

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oxylat, 4,0 kg Diäthylbenzol, 2,0 kg Isoamylalkohol, 80 g Benzoylperoxid, 100 1 Wasser, 4 kg Tricalciumphosphat und 45 g polymeres oberflächenaktives Mittel vom Polycarbonsäure-Typ (Caribon-B, Warenbezeichnet), und unter Rühren wird das Gemisch der Suspensionspolymerisation bei 90⁰C während 8 h unterworfen, w< res, vernetztes Polymerisat erhält.

bei 90⁰C während 8 h unterworfen, wobei man ein granula-

Das Polymerisat wird filtriert, mit Methanol und Chloroform in einer Säule gewaschen, erneut filtriert und bei 60 bis 80⁰C unter verringertem Druck getrocknet, wobei man 4,9 kg eines weißen, nicht-transparenten, granulären Polymerisats erhält.

Das Polymerisat besitzt eine Oberfläche von 905 m /g und ein Gesamtporenvolumen von 1,6 ml/g.

Poren mit einem Porendurchmesser von mindestens etwa 200 in dem Harz besitzen ein Porenvolumen von 0,JO ml/g.

Dieses Harz .zeigt gegenüber Wasser eine Affinität, wenn Wasser durch die Säule fließt, und somit wird ein Säulenharz für die Säulenchromatographie leicht erhalten.

Ein Vitamin B₁₂ enthaltendes Produkt, das durch Züchten von Propionibacterium shermanii (IFO 12391)» einem Vitamin B^p liefernden Mikroorganismus, erhalten wurde, wird zentrifugiert und Vitamin B₁ ρ zusammen mit Verunreinigungen wird mit 80%igem wäßrigem Äthanol mit einem Gehalt an KCN aus den abgetrennten Mikrobenzellen extrahiert. Die entstehende Lösung wird auf das 1Ofache durch Verdampfen konzentriert, wobei man eine rohes Vitamin B₁₂ enthaltende Züchtungsflüssigkeit (enthaltend 500 ppm Vitamin B₁₂) erhält. 100 ecm dieser Lösung werden durch eine Säule ge-

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leitet, die mit 3 1 der obigen Harzteilchen gefüllt ist. Man verwendet eine Geschwindigkeit von 200 ccm/min und das absteigende Verfahren, wobei eine Adsorption des Vitamins B^p stattfindet. Kontinuierlich werden 10 1 einer 1%igen wäßrigen Lösung von Essigsäure durch die Säule geleitet, wodurch die Verunreinigungen in die Abfallflüssigkeit strömen.

Dann wird Vitamin B^ ^mit 20%igem wäßrigem Isopropanol eluiert. 6000 ecm des aktiven Eluats werden gesammelt und getrocknet; man erhält ein Vitamin B.p-Pulver. Die Ausbeute aus der Züchtungsflüssigkeit zu dem Eluat beträgt 98%.

Ende der Beschreibung.

Claims

KRAUS & WHISERT 3U7130 PATENTANWÄLTE DR WALTER KRAUS DIPLOMCHEMIKER ■ DR.-ING. ANNEKÄTE WEISERT DIPL.-ING. FACHRICHTUNG CHEMIE IRMGARDSTRASSE 15 · D-8OOO MÜNCHEN 71 · TELEFON 089/797077-797078 · TELEX 05-212156 kpatd TELEGRAMM KRAUSPATENT 3133 AW/My NIPPON OIL COMPANY, LTD. Tokyo, Japan Verfahren zur Reinigung und Abtrennung von Vitamin Patentansprüche

1. Verfahren zur Abtrennung von Vitamin B₁₂ in reiner Form, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Vitamin B^₂ enthaltende Flüssigkeit mit einem Gehalt an Verunreinigungen in Kontakt mit einem Harz bringt, welches aus der Gruppe ausgewählt wird, die (A) ein Divinylbenzol/Styrol-Copolymerisat mit dem häufigsten Porendurchmesser von mindestens etwa 200 A und einem Gesamtporenvolumen über 0,6 ml/g und (B) ein Copolymerisat von Divinylbenzol/ Styrol/ungesättigtem Alkylester einer aromatischen Polycarbonsäure der FormelΓ<-Η—(- COOR)_n umfaßt, worin R für einen

Cv₁Q-ungesättigten Alkylrest mit einer Kohlenstoff-Kohlenstoff -Doppelbindung steht und η für 2 oder 3 steht, wobei das Copolymerisat (B) eine Oberfläche von mindestens etwa 700 m /g aufweist, damit das Vitamin B₁₂ von dem Harz adsorbiert wird, das Vitamin B₁₂ mit einem Eluierungsmittel eluiert und das aktive Eluat sammelt.

2. Verfahren nach. Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Vitamin B₁₂ enthaltende Flüssigkeit einen pH-Wert von etwa 5 bis etwa 8 besitzt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Eluierungsmittel ein wäßrige Lösung verwendet, die eine Verbindung aus der Gruppe niedrige aliphatische Alkohole, Säuren, Alkalien und Salze enthält.