DD298428A5 - Verfahren zur herstellung von 6-desmethyl-alborixin - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Antibiotikums vom Typ der Polyether-Antibiotika mit der chemischen Bezeichnung 6-Desmethyl-alborixin. Das Antibiotikum wird ueberwiegend als Einzelkomponente durch einen neuen Mikroorganismenstamm als Produktionsorganismus, Streptomyces umbrinus AM4805 (IMET 43898), im Verlauf der submersen Kultivierung gebildet. 6-Desmethyl-alborixin wird aus dem Myzel extrahiert und durch chromatographische Verfahren in reiner Form gewonnen. 6-Desmethyl-alborixin ist ein Antibiotikum mit antibakterieller und kokzidiostatischer Wirksamkeit.{Polyether-Antibiotikum; 6-Desmethyl-alborixin; submerse Kultivierung eines Mikroorganismus; Produktionsstamm Streptomyces umbrinus AM4805; Bildung als Einzelkomponente; Gewinnung in reiner Form; antibakterielle und kokzidiostatische Wirksamkeit}

Description

Hierzu 3 Seiten Zeichnungen

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines Antibiotikums der Polyether-Gruppe mit der chemischen Bezeichnung 6-Desmethyl-alborixin. Vertreter der Strukturklassse der Polyether-Antibiotika sind für die Prävention und Therapie von tierischen Kokzidien-Erkrankungen sowie für die Anzucht von Nutztieren als Ergotropikum (Pansenfermoregulator) von potentiellem Nutzen. Das Anwendungsgebiet der Erfindung liegt somit in der mikrobiologisch-pharmaze !tischen Forschung und Industrie.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Polyether-Antibiotika werden vorwiegend von Streptomyceten gebildet und besitzen ionophore Eigenschaften, indem sie den passiven Transport von Ionen durch biologische Membranen ermöglichen. Die ionophoren und membranotropen Eigenschaften sind die Urst ehe für antibakterielle Wirkungen gegen grampositive Keime, für die kokzidiostatische Aktivität und für die pansenfermoregulatorische Beeinflussung polygastrischer Nutztiere. Einige Vertreter der Gruppe der Polyether-Antibiotika haben aufgrund dieser Eigenschaften breite Anwendung in der Tierhaltung sowohl als Kokzidiostatikum wie als Ergotropikum gefunden (J. W.Westley, Polyether Antibiotics, Vol. 1, Biology, Marcel Dekker, 1982). Aufgrund von Nebenwirkungen bei den bisher eingesetzten Polyether-Antibiotika (Toxizität), der Konkurrenz durch ökonomisch günstiger herstellbare Präparate (größere Wirkung bei niedrigeren Konzentrationen) und bestehender Schutzrechte wird die Suche nach neuen Polyetherlonophoren sowie die Ermittlung ihrer Anwendungseigenschaften nach wie vor fortgesetzt.

Das Polyether-Antibiotikum 6-Desmethyl-alborixin wurde unter der Bezeichnung X-206 bereits 1951 als Produkt eines nichtidentifizierten Stammes, Streptomyces spec. X-206, isoliert (Berger et al., J.Amer.Chem.Soc.73,5295 (1951)). Die Strukturaufklärung mittels Röntgenstrukturanalyse erfolgte 1975 (Blount u. Westley, Chem. Commun. 333,1975). Ein Verfahren zur fermentativen Herstellung dieses Antibiotikums im technischen Maßstab ist bisher noch nicht angegeben worden. Weitere Bildner von 6-Desmethyl-alborixin sind bisher nicht bekannt; auch die kokzidiostatische Wirksamkeit (in vivo) dieser Substanz ist bisher noch nicht ausgewiesen worden (Westley, J. W., Polyether Antibiotics, a. a. 0., 1982).

Ziel der Erfindung Die Erfindung verfolgt das Ziel, das Polyether-Antibiotikum 6-Desmethyl-alborixin in verbesserter Weise herzustellen. Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein mikrobiologisches Verfahren zu beschreiben, mit dem das Polyether-Antibiotikum 6-Desmethyl-alborixin im technischen Maßstab aus leicht zugänglichen Einsatzstoffen in guten Ausbeuten hergestellt werden kann.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß unter aeroben und sterilen Kulturbedingungen in einem flüssigen Nährmedium mit Kohlenstoff- sowie Stickstoffquellen und Mineralsalzen eine Population des Mikroorganismus Streptomyces umbrlnus AM4805 gezüchtet wird. Eine biologisch reine Probe von Stamm Streptomyces umbrinus AM4805 ist in der Hinterlegungsstelle für Mikroorganismen der DDR, Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie, Beutenbergstraße 11, Jena, DDR-6900 unter dem Registrierzeichen IMET 43898 deponiert werden. Stamm Streptomyces umbrinus AM 4805 ist ein literaturbekannter Mikroorganismus; seine taxonomische Bestimmung erfolgte bereits vor geraumer Zeit (T.G.Pridham et al., Applied Microbiology, β, 52-79,1958). Bisher ist nicht bekannt geworden, daß in mikrobiologischen Verfahren irgendwelche Leistungen dieses Stammes genutzt worden wären.

Die Fermentation des Stammes AM 4805 erfolgt in den Stufen Vor· und Hauptkultur. Für die Vorkultur werden in 5%iger Glucose-Gelatine-Lösung lyophil getrocknete Myzelfragmente dieses Stammes in Glucose-Sojamehl-Nährmedien mit Mineralsalz-Zusätzen, vorzugsweise in solchen mit Phosphationen-Zusatz, eingeimpft und pro Vorzuchtstufe jeweils 48 Stunden bei Temperaturen im Bereich von 25⁰C bis 37⁰C sowie bei Aciditäten zwischen pH 6,0 und pH 6,5 unter Schütteln inkubiert. Die Hauptkultur wird in gerührten Glasfermentoren oder in belüftbaren V2A-Stahltanks in Glucoso-Fleischextrakt-Mineralsalz-Nährmedien mit Hafermehl-Anteil, die jedoch frei von Phosphationen sind, während einer Dauer von 48 Stunden bis 192 Stunden durchgeführt. Hierbei werden

• die Temperatur bei Werten von 25⁰C bis 37⁰C und

• die Acidität im Bereich von pH 6,0 bis pH 8,5 belassen.

Die Gewinnung von 6-Desmethyl-alborixin erfolgt durch Separation der Biomasse am Ende der Fermentation, durch Extraktion mit organischen Lösungsmitteln, vorzugsweise mit Methanol oder Aceton, gefolgt von einer Konzentration des Extraktes, durch Reextraktion mit wasserunlöslichen organischen Lösungsmitteln, vorzugsweise mit Chloroform, und durch abschließende chromatographische Auftrennung der Bestandteile des eingeengten Extraktes unter Verwendung an sich bekannter Adsorbentien (Kieselgel und organophile Dextrangele). Durch schrittweise chromatographische Abtrennung von antibakteriell inaktiven Verunreinigungen (ermittelt unter Verwendung des Testkeims Bacillus subtitle ATCC 6633) wird letztlich chromatographisch reines 6-Desmethyl-alborixin gewonnen, dessen chemische Struktur in Abb. 1 dargestellt ist. Nach dem voranstehend beschriebenen Verfahren mit biologischer Prozeß- und extraktiv-chromatographischer Aufarbeitungsstufe wird das reine Zielprodukt in Ausbeuten bis zu 25mg/l Fermentationslösung gewonnen.

Die chemische Identität des durch Streptomyces umbrlnus AM 4805 gebildeten 6-Desmethyl-alborixins mit der in Abb. 1 angegebenen Struktur sowie des seit Berger et al. (1951) bekannten Antibiotikums X-206 konnte durch Hochfeld-NMR-Untersuchungen (400 MHz ¹H COSY NMR; 100 MHz ¹³C 2 D NMR; Varian XLAA 400) bestätigt werden. Das in Abb. 2 gezeigte 100MHz ¹³C NMR-Spektrum entspricht in allen Details den für Antibiotikum X-206 publizierten Angaben (Seto u. Otake, Polyether Antibiotics, Vol.2, Chemistry, S.335, Marcel Dekker, 1983). Abb.3 zeigt das 400MHz ¹H NMR-Spektrum von 6-Desmethylalborixin aus Streptomyces umbrinus AM 4805.

Verfahrensgemäß erhaltenes Rein-6-Desmethyl-alborixin zeigt die in Tabelle 1 ausgewiesene antikokzidiale Wirkung gegen Stamm Elmerla tenella WCAM (bei Verwendung von intraallantoisch infizierten Hühnerembryonen). Die Vorteile der Erfindung werden in erster Linie darin gesehen, daß

- ein für die 6-Desmethyl-alborixin-Herstellung neuer Mikroorganismus erschlossen wird,

- durch die Verfahrensführung in der biologischen Prozeßstufe die Gewinnung des Zielprodukts auch bei Einsatz eines insgesamt unaufwendig bereitstellbaren Nährmediums in guten Ausbeuten gelingt und

- im vorgeschlagenen Verfahren das Zielprodukt als Einzelkomponente erhalten wird, d. h. eine Mit-Synthese von Metaboliten anderer antibiotisch wirksamer Strukturklassen ausgeschaltet werden konnte.

Ausführungsbeispiel

Schrägagar-Eprouvetten mit in 5%iger Glucose-Gelat'ne-Lösung lyophil getrockneten Myzelfragmenton des Stammes Streptomyces umbrlnus AM 4805 dienen zur Beimpfung eines Vorzuchtmediums folgender Zusammensetzung (g/l) in 500-ml-Steilbrustflaschen (80ml Inhalt, 25⁰C, Rotationsschüttler, 48 Stunden Kultivierungszeit): Glucose 15; Sojamehl 15; NaCI 5; CaCO₃1; KH₂PO* 0,3; pH 6,3. Die zweite Vorzucht wird auf dem gleichen Vorzuchtmedium in 5-l-Flaschen mit 400ml Inhalt durchgeführt (48 Stunden, 25⁰C, Rotationsschüttler 240UpM). Für die Maßstabvergrößerung auf 201 und die Hauptkultur wird ein Medium folgender Zusammensetzung verwendet (g/i): Glucose 20; Fleischextrakt 3; Hafermehl 20; NaCI 3; CaCO₃ 3; Fe₂(SO₄J₃ 0,4; MnCI₂ · 4 H₂/0,6; pH 7,0; Sterilisation: 30 Minuten bei 120°C; 29⁰C. Die Hauptkultur wird in 500-I-V2A-Tankfermentoren während 144 Stunden durchgeführt bei 500I Lufteintrag pro Minute.

Anschließend wird das Myzel abgetrennt und mit dem dreifachen Anteil des Feuchtge'/vichtes des Myzels mit Methanol 24 Stunden lang unter Rühren bei Rb'. temperatur extrahiert. Nach Abtrennung des extrahierten Myzels wird der methanolische Extrakt im Vakuumrotationsverdampfer konzentriert. Der wäßrige Rückstand wird mit 101 Chloroform reextrahiert und der getrocknete Extrakt eingeengt. Das eingeengte Produkt wird durch Chromatographie an Kieselgel 60 portionsweise (10g Rückstand pro 200g) unter Verwendung von CHCI₃ und CHCI₃/Methanol (95:5, v/v) als Laufmittel vorgereinigt. Die durch die antibiotische Wirksamkeit gegenüber dem Testkeim Bacillus subtilus ATCC 6633 ausgezeichneten Fraktionen werden gesammelt und der Säulenchromatographie an organophilen Dextrangelen (Methanol als Laufmittel) unterworfen. Die Feinreinigung der bioaktiven Fraktionen erfolgt durch Kieselgelchromatographie (Säulen, Dünnschichtplatten) unter Verwendung von CHCI₃/MeOH (95:5, v/v) als Laufmittel. Nach der Elution der bioaktiven Zonen wird reines 6-Desmethylalborixin (Rf 0,7; DC-Folie Kieselgel; CHCI₃/MeOH; 9:1, v/v) erhalten; Ausbeute 10g aus400I Fermentationslösung.

Legenden zu den Abbildungen Abb. 1; Chemische Struktur von 6-Desmethyl-albot ixin Abb. 2: 100MHz ¹³C NMR-Spektrum von 6-Desrrelhyl-alborixin (chemische Verschiebung in ppm; TMS als interner Standard) Abb.3: 400MHz ¹H NMR-Spektrum von 6-Desmethyl-alborixin (chemische Verschiebung in ppm; TMS als interner Standard) Tabelle 1 Antikokzidiale Wirksamkeit von 6-Desmethyl-alborixin im In-vitro-Modellversuch (intraallantoisch mit Eimeria tenella WCAM

infizierten Hühnerembrvonen; LD₆₀Ca. 14 Mg)

Konzentration	Gruppenstärke	Letalität	Letalität	Test
(Mg/Embryo)	(n)	im Experiment	Kontrollgruppe	ergebnis
10	24	0%	52,2%	++ +
3,3	24	0%	52,2%	+ + +
1,1	24	0%	52,2%	+ + +
0,33	22	0%	100%	+ + +
0,11	22	10,5%	100%	+ + +
0,04	22	90,9%	100%	n.s.

+++ = ρ 0,001 (Vierfeldertest nach Fisher), n.s. = nicht signifikant.

Claims (3)

1. Verfahren zur Herstellung von 6-Desmethyl-alborixin mittels aerober Submersfermentation in flüssigen Nährmedien mit Kohlenstoff- sowie Stickstoffquellen und Mineralsalzen, gekennzeichnet dadurch, daß man

- den Mikroorganismus Streptomyces umbrlnus AM 4805 für die Dauer von 48 Stunden bis 192 Stunden kultiviert und

- das Zielprodukt aus dem Myzel isoliert.

2. Verfahren gemäß Anspruch !,gekennzeichnet dadurch, daß man

- Stamm Str. umbrinus AM 4805 während 144 Stunden kultiviert und

- das Zielprodukt aus dem Myzel mit organischen Lösungsmitteln extrahiert sowie durch anschließende Chromatographie an Kieselgel und organophilem Dextrangel rein gewinnt.

3. Verfahren gemäß Anspruch 2, gekennzeichnet dadurch, daß man zur Extraktion Methanol bzw. Aceton einsetzt.