DD298882A5 - Einen spezifischen inhibitor enthaltendes arzneimittel und dessen verwendung in der tumorbehandlung - Google Patents
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Abstract
Es wird ein Verfahren und eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Abtoetung von Tumorzellen von Saeugern beschrieben, wobei das Verfahren darin besteht, dasz die Zellen in Gegenwart eines durch Licht aktivierbaren Tetrapyrrols dem Licht ausgesetzt werden, wobei die Verbesserung darin besteht, dasz diese Zellen mit einer Verbindung behandelt werden, die die enzymatische Umwandlung von Protoporphyrinogen in Protoporphyrin IX durch Protoporphyrinogen-Oxidase in diesen Zellen inhibiert, wodurch in diesen Zellen der Aufbau von Protoporphyrin IX bewirkt wird. Es wird weiterhin ein Verfahren zur Erzeugung von Protoporphyrin IX beschrieben, das darin besteht, eukaryontische Mikroalgen in Gegenwart eines Protoporphyrinogen-Oxidase-Inhibitors zu zuechten. Fig. 1{Verfahren, pharmazeutisch; Zusammensetzung; Abtoetung; Tumorzellen; Saeugern; Licht, aktivierbar; Tetrapyrrol; Protoporphyrinogen; Protoporphyrin IX; Protoporphyrinogen-Oxidase, eukaryotisch; Mikroalgen; Inhibitor}
Description
Hierzu 1 Seite Zeichnungen
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Arzneimittel, das einen spezifischen Inhibitor der enzymatischen Umwandlung des Protoporphyrinogens in Protoporphyrin IX durch Protoporphyrinogen-Oxidase und gegebenenfalls einen pharmazeutisch geeigneten Trager enthalt, seine Herstellung und seine Verwendung zum Abtoten von Tumorzellen. Weiterhin betrifft sie ein Verfahren zur Erzeugung von Protoporphyrin IX unter Verwendung einer eukaryontischen Mikroalge.
Es ist inzwischen gut bekannt, in Tumorzellen von Saugern ein Hamatoporphyrinderivat oder ein Gemisch von Porphyrinen, die sich davon ableiten (z. B. Photofnn IIR), einzuführen und anschließend diese Zellen Licht einer geeigneten Wellenlange auszusetzen, um die Zerstörung der Zelle zu bewirken. Diese photodynamische Therapie ist Gegenstand einer Reihe von Arbeiten, die eine Sonderausgabe von „Photochemistry and Photobiology", Band 46, Nummer 5, November 1987 (im folgenden hierin als „P & P 46-5" bezeichnet), darstellen. Wie in diesen Arbeiten gezeigt wird, wurde diese photodynamische Therapie zur Behandlung einer Vielzahl von Krebserkrankungen (einschließlich Krebs der Bronchialwege, der Blase, der Speiserohre, der Lunge, der Haut, des Kopfes und des Nackens, des Gehirns und von Dickdarm- sowie Innenaugen- und gynäkologischen Krebserkrankungen) eingesetzt Es wurde festgestellt, daß die biochemischen Wirkungen dieser Photosensitivierung durch Porphyrine die Vernetzung von Membranproteinen, die Peroxidierung von Lipiden, die Inhibierung des Transports einiger essentieller Metabohten, die Lyse von lysosomalen und mitrochondrischen Membranen, die Inaktivierung mehrerer Enzyme und die erhöhte Aufnahme von Porphyrinen durch die Zelle einschließen (P & P 45-6, Seite 695) Die Porphyrine werden im allgemeinen injiziert (z B intravenös oder intraperitonal), wobei eine typische Dosis bei ungefähr 2 mg Photofnn Il je kg Korpergewicht liegt
Das Porphyrinderivat kann auch in ein Liposom eingearbeitet und injiziert (z B intraperitonal) werden, wie es ζ B bei Spikes et al in „Photodynamic Behavior of Porphyrins in Model Cell, Tissue and Tumor Systems", in Photodynamic Therapy of Tumors and Other Diseases, Herausgeber G Jon und CA Perria, Seiten 45-53, Libreria Progetto, Padua (1985), und in dann zitierten Literaturstellen beschrieben worden ist
Die Fachliteratur zeigt, daß die Einfuhrung von Protoporphyrin in Zellen, ζ B in humane Erythrozyten (Dubbelmanetal, Biochimica et Biophysica Acta, 511 [1978], 141-151) oder in Leukamiezellen von Mausen (Kessel, Cancer Research 42 [Mai 1982],
1703-1706), zu einer ausgeprägten photosensitivierenden Wirkung führt. Die Arbeit von Kessel zeigt, daß es das Mittel mit der größten photosensitivierenden Wirkung von den untersuchten war. Als jedoch Kessel und andere (z. B. Berenbaum et al., Br. J. Cancer [1982], 45,571-581) Protoporphyrin in Tiere injizierten, wurde in den Tumoren kein nachweisbares Protoporphyrin gefunden, was darauf hinweist, daß Portoporphyrin, wenn es als solches in den Körper eingeführt wird, leicht an den Kreislauf verloren gehen kann.
Es ist weiterhin bekannt, daß Hämatoporphyrin-Derivate und ähnliche Stoffe zum Nachweis und zur Lokalisierung von Tumoren, z. B. beim Blasen- oder Lungenkrebs (z. B. P & P 46-5, Seite 759) verwendet werden.
In der vorliegenden Erfindung ist das Mittel zur Behandlung der Zellen bei der photodynamischen Behandlung oder bei den bekannten Verfahren zum Nachweis und zur Lokalisation von Tumoren kein Porphyrin, oder es ist nicht allein ein Porphyrin. Im Gegensatz dazu besteht dieses Mittel aus einem Enzym-Inhibhor-Mittel, das die einzymatische Umwandlung von Protoporphyrinogen in HSm in diesen Zellen inhibiert und dadurch den Aufbau von endogenem Protoporphyrin IX in diesen Zellen bewirkt.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit ein Arzneimittel, das einen spezifischen Inhibitor der enzymatischen Umwandlung des Protoporphyrinogens in Protoporphyrin IX durch Protoporphyrinogen-Oxidase und gegebenenfalls einen pharmazeutisch geeigneten Träger enthält.
Wir haben sichergestellt, daß Mittel, wie bestimmte Typen von Herbiziden, die die enzymattsche Umwandlung von Protoporphyrinogen in Chlorophyll in Pflanzenzellen, auch die enzymatische Umwandlung von Protoporphyrinogen in Harn in Säugerzellen inhibieren. Von uns wird angenommen, daß die Inhibierung durch solche Verbindungen wahrscheinlich die Stufe der Umwandlung von Protoporphyrinogen in Protoporphyrin IX durch ein Enzym (Protoporphyrinogenoxidase, EC 1.3.3.4) beeinflußt, so daß das Protoporphyrinogen nicht den normalen Stoffwechsel zu Protoporphyrin verfolgen kann, sondern an dessen Stelle in der Zelle (z. B. im Plasma) oxidiert wird, was jedoch außerhalb des normalen enzymatischen Stoffwechselweges erfolgt (z. B. außerhalb der Organellenmembranen), so daß das Ergebnis eine Ansammlung des Protoporphyrins IX an Orten ist, wo es für die normale Umwandlung in Harn nicht zur Verfügung steht, mit dem Ergebnis, daß, wenn die Zellen dem Licht ausgesetzt werden, das akkumulierte Protoporphyrin IX eine zeilzerstörende Wirkung wie dienenige hat, die bei der oben beschriebenen photodynamischen Behandlung ausgeübt wird. Die erfindungsgemäßen Inhibierungsmittel für Enzyme sind spezifische Inhibitoren der Protoporphyrinogenoxidase in dem Sinne, daß sie nicht als allgemeine Enzymgifte wirken und z. B. Vernetzungsmittel (z. B. SuIfhydrylverbindungen) denaturieren; vorzugsweise sind es nicht solche Stoffe, die die Oxidationsbedingungen beeinflussen, wie es Elektronenakzeptoren sind. So haben die bevorzugten erfindungsgemäßen Mittel Redoxpotentiale, die negativer als -50OmV sind, z. B. solche, die negativer als -80OmV sind (gemessen z. B. auf übliche Art und Weise in einem aprotischen Lösungsmittel für das Mittel, z. B. durch cyclische Voltametrie oder polarographisch). Es ist weiterhin ein bevorzugter Fall, daß das Mittel kein Tetrapyrrol ist und daß sein I50-We(I für Protoporphyrinogenoxidase unter ungefähr 1 μΜ liegt, z. B. unterhalb 0,3 μΜ, und z. B. dieser I60-WeIt ungefähr 0,1 oder 0,03 oder 0,01 μΜ oder darunter betragt Das enzyminihibierende Mittel ist vorzugsweise ein solches, das eine hohe Kapazität für die Spaltung des Plasmalemmas von pflanzlichem Material aufweist. Eine Versuchsanordnung zur Bestimmung dieser Kapazität ist das Efflux-Experiment, das in der Arbeit von Hailing und Peters in Plant Physiology, 84,1114-5 (1987) beschrieben worden ist In solch einer Versuchsanordnung (detallierter im Anhang A weiter hinten beschrieben) weisen bevorzugte Mittel einen totalen Efflux von wenigstens 50% bei einer Konzentration in der Behandl ung von 100 μΜ, vorzugsweise bei einer Konzentration von 1 μΜ oder darunter, z. B. bei 10OnM, auf. Hochaktive Stoffe, z. B. i-M-Chlor^-fluor-S-propargyloxyphenyD-S-methyM-difluormethyl-A^I^Atriazolin-S-on oder Lactophen (weiter unten beschrieben), weisen Gesamteffluxraten von über 90% bei einer Konzentration von 10OnM auf. Eine weitere Versuchsanordnung zur Bestimmung der Fähigkeit eines Stoffes zur Spaltung des Plasmalemmas von pflanzlichem Material ist das durch Licht induzierte Experiment, bei dem die Inhibierung desGrüηwerdensgemessen wird und das detaillierter im Anhang B weiter unten beschrieben wird. Durch diese Versuchsanordnung wird die Kapazität zur Inhibierung des Grünwerdens durch Licht an gebleichten Chlamydomonas reinhardi, Mutante y-1, (eine Algenart, die, wenn sie im Dunkeln gezogen wird, kein Chlorophyll produziert, so daß die Algenmasse gebleicht ist auf Grund der Anwesenheit neuer, nicht grüner Zellen, und die wieder Chlorophyll produziert, wenn sie dem Licht ausgesetzt wird) gemessen. Eine Vielzahl der bevorzugten Verbindungen (Mittel), die innerhalb dieser Erfindung verwendet werden, weisen eine Fähigkeit zur Inhibierung des G rü nwerdens im Licht von wenigstens 50% auf, wenn die Verbindung mit einer Konzentration von 10-5 M, bevorzugter mit einer Konzentration von 10"eM oder darunter, z.B. bei einer Konzentration von 10"7M, angewendet wird. Zusätzlich dazu sollte die Verbindung so ausgewählt werden, daß sie, wenn sie bei der angegebenen Konzentration in der Versuchsanordnung zur Inhibierung des Grünwerdens im Licht verwendet wird, einen Überstand ergibt, der einen Lichtabsorptions-Peak von ungefähr 405 nm aufweist, welcher dann größer als der Chlorophytl-Peak ist (der Peak bei ungefähr 668 nm in diesem System), z. B. weist der Überstand einen Peak bei 405 nm auf, dessen Höhe 2-, 3- oder4mal die Höhe des Peaks bei 668 πm aufweist. Unter den enzyminhibierenden Mitteln, die zur Durchführung dieser Erfindung verwendet werden können, befinden sich als Herbizide wirksame Verbindungen der folgenden Klassen (A bis D); A: Herbizide, die Aryl- und heterocyclische Gruppen aufweisen, der allgemeinen Formel
Ph-NHet
worin Ph eine substituierte Phenylgruppe, vorzugsweise eine 2,4-disubstituierte Phenylgruppe, noch bevorzugter eine 2,4,5-trisubstituierte Phenylgruppe bedeutet und worin NHet ein 5- oder 6gliedriger heterocyclischer Ring mit ein bis vier Stickstoffatomen ist, der die Formel
if не? --·ν:-γ_Γι;-4 cd*=" -N- Γ— "!
· O-r_-R Q-C-R
aufweist, worin Q die Differenz zum Ausbalancieren des heterocyclischen Ringes bedeutet und R Wasserstoff oder eine Substituentengruppe darstellt. Diese Klasse von Verbindungen schließt solche Stoffe ein, wie diejenigen, die als die Klasse der „cyclischen Imid-Herbizide" in der Arbeit von Wakabayashi et al., J. Pesticide Sei. 11,635-640 (1986) bezeichnet worden sind, worin in der Abb. 1 die folgenden Verbindungen dargestellt sind:
F Cl
F О
werden z.B. in den USP 3.385.862,3.836.539 und 3.876.413 beschrieben.
tetrahydro-2H-indazof. Weitere 3-substituierte-2-(2,4,5-trisubstituierte PhenyJMetrahydro-indazole, die innerhalb dieser
dieser Erfindung verwendet werden können, werden z. B. in den USP 4.431.822,4.670.046,4.670.042 und 4.439.229 und in derveröffentlichten Internationalen Patentanmeldung (PCT) WO 87/07.602 beschrieben. In den zuletzt genannten zwei
in den Internationalen Patentanmeldungen (PCT) WO 85/01.637, WO 85/04.307, WO 87/00.730, WO 87/03.782, WO 86/04.481und WO 88/01.133 beschrieben worden sind,
01.939 und WO 87/03.873 beschrieben worden sind,
folgenden, im Handel zur Verfügung stehenden Stoffe:
5-(2-Chlor-4-trifluormethyl- 5-(2,4-Dichlorphenyoxy)-2-
phenoxy-2-nitro-N-methylsul- nitrobenzoesäure-methylester
fonyl-benzamid (Fomesafen) (Bifenox)
5-(2-Chlor-4-trifluormethylphenoxy-2-n itrobenzoesäu re, Natriumsalz (Acifluorfen)
F.
2-Chlor-1-(3-ethoxy-4-nhrophenoxy)-4-trifluormethyl-benzen
(Oxyfluorfen)
Q-C8H,
O O'
Lactophen: 1-Carbethoxy)ethyl-5-(2-chlor-4-trifluormethylphenoxy)-2-nitrobenzoat, Fluoroglykofen: (Carbethoxy)methyl-5-(2-chlor-4-trifluormethy!phenoxy)-2-nitrobenzoat, Fromesofen: S-tChlor^-trifluormethyl-phenoxyJ-N-methylsulfonyl^-nitro-benzamid.
Chloronitrofen: г^.б-ТгісЫоМ-пИгорЬепоху-Ьепгеп,
Fluorodifen: г-ЫіігорЬепоху-^гіЯиогтеіНуІ-Ьепгеп,
Nitrofen: 2,4-Dichlor-1-(4-nitrophenoxy)benzen,
Chlomethoxyfen:4-(2,4-Dichlorphenoxy)-2-methoxy-1-nitrobenzen.
Ein weiteres, geeignetes Diphenylether-Herbizid ist 5-(2-Chlor-4-trifluormethyl-phenoxy)-2-nitroacetophenon-oxim-0-essigsäure-methylester.
D: Arylpyrazol-Herbizide wie diejenigen, die in den US-PS 4.563.210,4.496.390 und 4.459.150 sowie in der Deutschen Offenlegungsschrift 35 20327 A1 beschrieben worden sind
E: Verbindungen der Formel
worin Xb O oder S bedeutet und „Ph" die Bedeutung aufweist, die oben beschrieben worden ist, sowie Verbindungen, die in der Europäischen Patentanmeldung 273.417 oder Derwent Abstracts Zugriffs-Nr. 87-040749 beschrieben worden sind. Die Behandlung mit den erfindungsgemäßen Verbindungen kann durch intravenöse oder intraperitonale Injektion erfolgen. Das Mittel kann als sterile Zusammensetzung verwendet werden, die aus dem Mittel besteht, das in einem pharmazeutisch geeigneten Trägermittel gelöst oder dispergiert ist, z.B. als wäßrige, isotonische Lösung, z.B. als wäßrige Kochsalzlösung (z.B. 0,9% NaCI) oder Dulbeccos durch Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit einer Konzentration von z. B. 2,5mg/ml, oder die das Mittel in einem liposomalen System enthält, z.B. einem Phospholipid-Grundkörper auf eine Art und Weise, wie sie auf den Seiten 1659-1660 von Remingtons Pharmaceutical Sciences 1985 (17. Auflage), herausgegeben von der Mack Publishing Company, beschrieben worden ist, z. B. analog der Rezeptur, die von Jori et al., Br. J. Cancer (1983), 48, S. 307, beschrieben worden ist, nach der 51,4mg Dipalmitoyldiphosphatidyl-cholin in 10ml einer 1 mM Lösung des Mittels in Chloroform:Methanol wie 9:1 (Volumenteile) gelöst werden können und nach gründlicher Durchmischung das Lösungsmittel im Vakuum bei 300C wieder abgezogen werden kann, wodurch ein Feststoff erhalten wird, der in 10 ml 0,01 M Phosphatpuffer bei einem pH-Wert von 7,4, der 15OmM NaCI enthält, resuspendiert und die getrübte Lösung dann 30 Minmuten bei 500C beschallt wird. Die enzyminhibierenden Mittel, die zur Durchführung dieser Erfindung verwendet werden können, können an geeignete tumorspezifische monoklonale Antikörper (MABs) gebunden oder gekoppelt werden, wobei die Kopplungstechnik verwendet wird, die nach dem Stand der Technik bekannt ist, so daß das enzyminhibierende Mittel zielgerichtet an spezielle Tumororte geführt werden kann.
Die enzyminhibierenden Mittel, die innerhalb dieser Erfindung verwendet werden, können auch angewendet werden, indem sie einfach oral in den Verdauungstrakt gegeben werden, vorzugsweise in verdünnter Form zusammen mit einem pharmazeutisch geeigneten Trägermittel, z. B. indem sie der Nahrung beigegeben werden, wie es im Beispiel 6 weiter unten illustriert wird. Es kann wünschenswert sein, insbesondere bei der oralen Verabreichung, enzyminhibierende Mittel zu verwenden, die wasserlösliche Salze sind oder die eine Säure sind und wasserlösliche Natrium- oder Kaliumsalze bilden, z. B. saure Sulfonamide der Art, wie sie der Internationalen Patentanmeldung (PCT) WO 87/03.782 (z. B. das Mittel 6c im unten stehenden Beispiel 6) oder WO 85/00.1939 und WO 87/03.7873 beschrieben worden sind, oder wasserlösliche Salze davon, oder Carbonsäuren oder wasserlösliche Salze davon, z. B. das Natriumsalz, das als Acifluorfen bekannt ist.
Die enzyminhibierenden Mittel, die erfindungsgemäß verwendet werden können, können in herkömmliche pharmazeutische Zusammensetzungen eingearbeitet werden, z. B. in Tabletten (z. B. verpreßte Tabletten, die beschichtet werden können, z. B. mit Zucker, Pasten und/oder Sirup), Zäpfchen, Kapseln (z.B. Hartgelatinekapseln), Suspensionen, Lösungen, Pulver oder Ampullen. In diesen Zusammensetzungen kann das Mittel in Abmischung mit pharmazeutisch geeigneten festen und/oder flüssigen Trägern vorliegen, die, wenn es gewünscht wird, ein Nahrungsmittel sein können. So können sie z. B. Feststoffe wie Maisstärke oder ein flüssiges Verdünnungsmittel wie Wasser oder ein als Nahrungsmittel verwendbares Öl, ein Mineralöl oder ein Lösungsmittel wie Dimethylsulfoxid sein. Es können auch Gemische von enzyminhibierenden Mitteln verwendet werden, z. B. ein Gemisch der Mittel 6c aus Beispiel 6 weiter unten und Acifluorfen in z. B. ungefähr gleichen Anteilen. Die Dosierung, die angewendet werden soll, kann durch Routine-Versuche ermittelt werden, die nach dem Stand der Technik bekannt sind, z. B. durch Versuche der Art, wie sie für Photofrin Il in dem Artikel von Dougherty über die „Photodynamische Therapie (PDT) von schädlichen Tumoren" in CRC Critical Reviews in Oncology/Hematology, Band 2, Ausgabe 2 (1984), Seiten 83 bis 116, beschrieben worden sind
Die folgenden Beispiele werden zur weiteren Erläuterung dieser Erfindung zur Verfugung gestellt.
Ausführungsbeispiele
HeLa-Zellen (eine humane Tumorzell-Linie, die zur Tumorforschung verwendet wird und von der American Type Culture Collection zur Verfugung gestellt wird) in der logarithmischen Wachstumsphase (nachdem sie fünf Tage bei 37°C in 11-Falcon-Gewebekulturflaschen kultiviert worden sind) wurden mit durch Phosphat gepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen. Dazu wurden 2 ml einer 0,25%igen Lösung von Trypsin in PBS zugegeben und nach mehreren Minuten die Zellen vorsichtig aus der Flasche entnommen und in 100ml einer 25nM Lösung von HEPES in Essentiellem Minimalmedium (MEM), dem 10Vol.-%
inaktiviertes Kälberserum, 1,1 ml einer 20OmM Lösung von Glutamin in 0,85%iger Kochsalzlösung und 11000 Einheiten Penicillin/11000 meg Streptomycin zugesetzt worden waren, gegeben.
Danach wurden jeweils 5,0ml Aliquots derso erhaltenen, resuspendierten Zellkultur in 50-ml-Falcon-Zellkulturflaschen gegeben und, ausgenommen im Falle der Kontrolle, mit dem zu untersuchenden Mittel vermischt. Die Aliquots wurden dann im Dunkeln drei Tage bei 370C inkubiert. Danach wurden die Zellen abgetrennt und auf die folgende Art und Weise unter grünem Licht extrahiert:
Unter Hinzufügen von 0,8 ml einer 0,25%igen Lösung von Trypsin in PBS wurden die Zellen vom Flaschenboden entfernt.
Nachdem eine Stunde im Dunkeln inkubiert worden war, wurden Zellen und Medium aus den Flaschen entnommen, in Zentrifugengläser mit rundem Boden gegeben und zweimal eingefroren und wieder aufgetaut, um die Zellen zu zerstören und die Extraktion zu ermöglichen.
Nach diesem Verfahren des Aufbrechens der Zellen wurden in den Zellsuspensionen keine intakten Zellen mehr beobachtet. Es wurden zu jedem Zentrifugenröhrchen 10ml basisches Aceton (90% Aceton, 10% 0,1 N NH4OH) zugegeben. Anschließend wurden die Röhrchen zentrifugiert, um Proteine und Zelltrümmer zu entfernen. Zu dem Überstand wurden 5 ml Wasser und danach 0,5ml einer gesättigten wäßrigen Kochsalzlösung gegeben. Dann wurde der pH-Wert durch tropfenweise Zugabe von 2 M KH2PO4 auf 6,8 eingestellt. Danach wurde der wäßrig-acetonische Extrakt auf eine C8-Baker-Prep-Säule gegeben. Die Tetrapyrrole wurden mit 2x 1,5ml Volumina von CH3OHtH2O wie 90:10 eluiert.
Die Extrakte wurden dann mittels eines Spektrofluorometers quantitativ bestimmt.
Die bei diesem Versuch verwendeten Mittel zur Behandlung waren:
A: 5-Aminolaevulinsäure, eine bekannte Vorstufe von Tetrapyrolen.
B: Acifluoren-methyl mit der Formel
C: Ein Herbizid der Formel
D: Ein Herbizid der Formel
O wC=CH E: Ein Herbizid der Formel
Das Mittel A wurde als filtersterilisierte, 25OmM Lösung in Wasser, pH = 6,5, zur Verfügung gestellt. Die Mittel B, C, D und E wurden als 5OmM Lösungen in Aceton angewendet. Zu der Kontrolle wurde ebenfalls Aceton hinzugegeben, so daß darin eine Konzentration von 0,2 Vol.-% eingestellt wurde. Die den Zellkulturen zugesetzten Mengen der Mittel waren solcherart, daß sie zu den in der Tabelle 1 unten aufgelisteten Konzentrationen führten. In dieser Tabelle werden die Mengen des Tetrapyrrols Protoporphyrin IX (Proto IX), die erzeugt wurden, angegeben.
Tetrapyrrol-Akkumulation in behandelten HeLa-Zellen
| Mittel | Konzentration | Fluoreszenz- | Menge an Proto IX |
| des Mittels | Emission (cps) | (pMol) | |
| (μΜ) | 400/630 | ||
| A | 5000 | 41842 | 4,2 |
| B | 100 | 12921 | 1,3 |
| C | 100 | 33477 | 3,5 |
| D | 100 | 10551 | 1,1 |
| E | 100 | 8967 | 0,9 |
| Kontrolle | 2795 | 0,3 |
HeLa-Zellen, die in der logarithmischen Wachstumsphase 6 Tage in sechs 1-l-Falcon-Gewebekulturflaschen bei 37°C gezogen wurden, wurden mit durch Phosphat gepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen. Es wurde eine 0,25%ige Lösung von Trypsin in PBS zugegeben, nach mehreren Minuten wurden die Zellen vorsichtig entnommen und in 110 ml einer 25-nM-Lösung von HEPES in Essentiellem Minimalmedium (MEM), dem 10Vol.-% inaktivierten Kälberserums, 1,1 ml einer 200-mM-Lösung von Glutamin in 0,85%iger Kochsalzlösung und 11000 Einheiten Penicillin/11 OOOmcg Streptomycin zugesetzt worden waren, gegeben.
Jeweils 5,0-ml-Aliquots der resuspendierten Zellkultur wurden in 50-ml-Falcon-Gewebekulturflaschen mit oder ohne Herbizid gegeben und im Dunkeln 4 Tage bei 37 CC inkubiert, wobei das Herbizid in verdünnter Acetonlösung zugegeben wurde, wie es im Beispiel 1 beschrieben worden ist. Auch zu den Kontrollen wurde Aceton zugegeben, so daß darin eine Aceton-Konzentration von 0,2 Vol.-% eingestellt wurde. Die Herbizidmenge war so groß, daß die in der Tabelle 2, weiter unten, angegebene Konzentration erreicht wurde.
Die Mittel zur Behandlung waren:
B: wie in Beispiel 1,
C: wie in Beispiel 1,
F: Ein Herbizid der Formel
Extraktion: Die Medien aus jeder Flasche wurden in Glasröhrchen mit rundem Boden gegeben, und die Zellen, die am Boden der Flaschen festgesetzt waren, wurden mittels Zugabe von 0,5 ml einer 0,25%igen Lösung von Trypsin in PBS gelöst, wobei mehrere Minuten bei 37°C gehalten wurde, dann aus den Kolben ausgewaschen und zu ihren Medien zugegeben. Von jeder Zellsuspension wurden dann Aliquots von 0,100 ml entnommen, um die Zelldichte zu bestimmen. Die verbleibenden 5,4 ml der Zellsuspension wurden 30 Minuten beschallt, um die Zellen aufzubrechen.
10ml basisches Aceton (90% Aceton:10% 0,1 N NH4OH) wurden zu jedem Röhrchen zugegeben. Die Röhrchen wurden zentrifugiert, um Proteine und Zelltrümmer zu entfernen. Zu dem Überstand wurden 5ml Wasser zugegeben, danach noch 0,5 ml einer gesättigten, wäßrigen Kochsalz-Lösung. Anschließend wurde der pH-Wert durch tropfenweise Zugabe von 2 M KH2PO4 auf 6,8 eingestellt. Dann wurde der wäßrige Acetonextrakt auf eine preparative Baker CB-Säule aufgetragen. Die Säulen wurden getrocknet und mit 2 ml Wasser gewaschen. Die Tetrapyrrole wurden mit 3 ml 90:10 Methanol :Wassereluiert. Wie in Beispiel 1 beschrieben, wurden alle diese Extraktionsschritte im wesentlichen vollständig unter Lichtverhältnissen durchgeführt, durch die Protoporphyrin IX nicht angeregt wird (z. B. in Behältnisse, die mit lichtstreuenden Materialien umhüllt wurden). Die Fluoreszenz der Extrakte wurde dann mittels eines Spektrofluorometers vom Typ SPEX bestimmt. Die Akkumulierung von Protoporphyrin IX (Proto IX) wurde unter Verwendung vorher bestimmter Extinktionskoeffizienten quantitativ bestimmt. Die Ergebnisse sind weiter unten in der Tabelle 2 aufgeführt.
Durchschnittliche Inhibierung des Wachstums und Akkumulation von Proto IX
| Mittel | Konzentration | % Inhibierung | Mengean | Relative % an |
| des Mittels | des Wachstums | Proto IX | Proto IX*·* | |
| (μΜ) | (pMol)** | |||
| B | 100 | 99 | 5,20 | 2 364 |
| F | 100 | 106 | 2,71 | 1232 |
| C | 100 | 52 | 4,41 | 2 005 |
| C | 10 | -15* | 0,57 | 259 |
| C | 1 | -26* | 0,19 | 86 |
Negative Werte für die „Inhibierung des Wachstums" zeigen an, daß Wachstum beobachtet wurde. Durchschnittliche Menge je 106Zellen
Prozent Unterdrückung.
Ein weiterer Gegenstand dieser Erfindung betrifft die Herstellung von Protoporphyrin IX (hierin im folgenden als „Proto IX" bezeichnet). Bei dieser Ausführung der Erfindung werden eukaryontische Mikroalgen im Dunkeln (oder in Licht, das nicht zur Bildung von Proto IX führt) in einem Medium, das ein Mittel (wie es oben beschrieben worden ist) enthält, das die enzymatische Umsetzung von Protoporphyrin zu Proto IXinhibiert, heterotroph gezüchtet. Anschließend werden sowohl das Medium als auch die Algen oder beides so behandelt, daß das Proto IX extrahiert und vom Chlorophyll, von Carotenoiden, Zelltrümmern usw. abgetrennt wird. Die Trennung kann auf eine beliebige, günstige Art und Weise erfolgen, z.B. durch Flüssigphasen-Chromatographie einschließlich Umkehrphasen-Flüssigchromatographie, oder durch Lösungsmittelextraktion, oder durch Fällung des Proto IX durch Chelatbildung, z. B. mit einem der folgenden Metalle: Fe, Zn, Mg, wobei die so hergestellte Chelatverbindung abgetrennt wird und, wenn es gewünscht wird, das Proto IX wieder erzeugt wird, wie es z. B. durch die bekannte Umsetzung der Chelate mit verdünnter Säure erfolgt.
Die Trennstufen werden unter Licht ausgeführt, bei dem Proto IX nicht angeregt wird (z.B. wie bei dem grünen Licht, das im Anhang A unter der Überschrift „Dunkelheit" beschrieben wird), oder in Dunkelheit. Die Chelatverbindung mit Eisen ist gegenüber Licht nicht so empfindlich, so daß diese Verbindung dem Licht eher ausgesetzt werden kann, wenn mit diesem Material gearbeitet wird.
Die Mikroalgen werden vorzugsweise als Zellsuspensionen bei einer Temperatur im Bereich von ungefähr 15 bis 300C gezogen. Die Konzentration des inhibierenden Mittels kann z. B. 10~5 bis 10"7 Mol betragen. Beispiele für Mikroalgen, die hierfür verwendet werden können, sind Scenedesinus sp., Chlamydomonas reinhardi, Euglena sp. und Bumilleriopsis filiformis.
Kulturen von Chlamydomonas reinhardi (Wildtyp) werden in einem Reaktor aus rostfreiem Stahl (z. B. 3001) subkultiviert, wobei das Kulturmedium verwendet wird, das weiter unten beschrieben wird. Eine Lösung von 5-(2-Chlor-4-trifluormethy!phenoxy)-2-nitrobenzoesäure-(1-carbethoxy-ethylester) (Lactophen, ein handelsübliches Herbizid auf Phenyletherbasis) in Aceton wird hinzugegeben, so daß eine Konzentration von W5M und eine Aceton-Endkonzentration von 0,1 % eingestellt werden. Das Gemisch wird sieben Tage bei 25°C im Dunkeln bei leichter Bewegung und/oder Belüftung wachsen gelassen. Der Inhalt des Reaktors wird noch im Dunkeln filtriert und das Filtrat so behandelt, daß das darin enthaltene Protoporphyrin IX gewonnen wird. Ein Verfahren zur Gewinnung des Protoporphyrin IX besteht darin, den Inhalt des Reaktors (wobei dieser im Dunkeln verbleibt) zu filtrieren und dem Filtrat Aceton zuzusetzen. Dieses Gemisch wird mit Petrolether extrahiert. Das Gemisch in Wasser/Aceton wird dann mit Diethylether extrahiert. Der Diethylether wird abgedampft, wodurch ein Rückstand erhalten wird. Der Rückstand wird in Methanol gelöst und der Umkehrphasen-Chromatographie unterworfen, wodurch Protoporphyrin IX erhatten wird. Es können auch die Gewinnungsverfahren der Beispiele 1 und 2 angewendet werden.
Zusammensetzung des Mediums:
| Salze | Molarität | Vorratslösung | mlVorratsl./l |
| Na-citrat · 6H2O | 1,7 x 10""3 | 10% | 5 |
| Spurenmetalle | wie unten | wie unten | 10 |
| FeCI3 · H2O | 0,37 x 10'3M | 1% | 1 |
| CaCI2-2H2O | 0,36 x 10"3M | 5,3% | 1 |
| MgSO4-7H2O | 1,2 x 10"3M | 10% | 3 |
| NH4NO3 | 3,7 x 10"3M | 10% | 3 |
| KH2PO4 | 2,2 x 10"3M | 10% | 3 |
| K2HPO4 | 1,7 x 10"3M | 10% | 3 |
| CH3COONa | 7,5 x 10"3M | 10% | 10 |
| Stammlösung der Spurenmetalle: | |||
| H3BO3 | lOOmg/l | ||
| ZnSO4-7H2O | 100 mg/1 | ||
| MnSO4-4H2O | 40 mg/1 | ||
| CoCI2 6H2O | 20 mg/1 | ||
| NaMoO4-2H2O | 20 mg/1 | ||
| CuSO4 | 4 mg/1 |
Eine Alternative zur Verwendung von Chlamydomonas reinhardi ist die Verwendung von Scendesmus sp., die in dem oben beschriebenen Medium kultiviert werden, wobei das Natrtiumacetat jedoch durch Glucose ersetzt wird.
Dieses Beispiel wird genauso ausgeführt wie Beispiel 3, ausgenommen, daß als Herbizid 1-(4-Chlor-2-fluor-5-propargyloxyphenyl)-3-methyl-4-difluormethyl-A2-1,2,4-triazolin-5-on an Stelle des Lactophens verwendet wird.
Bestimmung des Iso-Wertes
Protoporphyrinogen IX (Protogen IX). Proto IX wurde von Porphyrin Products, Logan, UT, USA, bezogen und gereinigt, wie es von T.P. Fuesleret al.. Plant Physiol. 67,246-249, (1981), beschrieben worden ist. Protogen IX wurde durch Reduktion von Proto IX mit Na/Hg-Amalgam frisch hergestellt, wie es von N. J. Jacobs und J. M. Jacobs, Enzyme 28,206-219 (1982) beschrieben worden ist, wobei das gereinigte Proto IX mit einer Konzentration von 300μΜ verwendet wurde.
Pflanzen-Material. Gurken (Cucumis sativus L., Sorte Wisconsin SMR18) wurden in einem dunklen Treibhaus auf Vermicullit, berieselt mit einem handelsüblichen (9-45-15)-Dünger aufgezogen. Die Keimlinge wurden bei 25°C und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 80 bis 90% aufgezogen. Die Beleuchtung erfolgte intermittierend mit einer Dauer von einer Minute in einem
Zyklus von 60 Minuten mit einer gemessenen Intensität von 25μΕ m"2sec"1 (PAR) mittels einer Leuchte vom Typ „Bright Stick" der General Electric, die durch einen elektronischen Zeitgeber gesteuert wurde. Durch dieses Verfahren wurde Gewebe zur Verfügung gestellt, in dem eine schnelle Chlorophyllsynthese möglich war, während die Stärkereserven und die Ausgangswerte für Chlorophyll minimal gehalten wurden.
Chloroplasten-Isolierung. Die sich entwickelnden Chloroplasten wurden so isoliert, wie es von T. P. Fuesler et al.. Plant Physiol. 75,662-664 (1984) beschrieben worden ist, ausgenommen, daß in der Endstufe der Reinigung die Plastide durch ein 40%iges (Vol.-%) und nicht durch ein 45%iges Percoll-Kissen zentrifugiert wurden. Die Chloroplasten wurden in einem Puffer für diese Testanordnung, bestehend aus 0.5M Mannit, 2OmM TES, 1OmM HEPES,pH = 7,7,1 mM EDTA, 1 mM MgCI2,1 Vol.-% Rinderserumalbumin und 1 mM Dithioerythrol bis zu einer Endkonzentration von 2 mg Protein/ml, resuspendiert. Testanordnung für Protoporphyrinogen-Oxidase. Diese Versuche wurden durchgeführt, wie es von J. M.Jacobs und N. J. Jacobs, Arch. Biochem. Biophys. 229,312-319 (1984), beschrieben worden ist. Proben von 0,2ml der Chloroplasten-Suspension wurden im Dunkeln mit verschiedenen Konzentrationen an Acifluorfen-methyl („AFM") oder mit 0,2 Vol.-% Aceton als Kontrolle 15 Minuten vorinkubiert. Danach wurden 50μΙ frisch hergestelltes Protogen (ungefähr 15nM) zu der Suspension zugegeben, um die Reaktion zu starten. Die Versuche wurden durch Zugabe von 2,75ml des Fluorometrie-Mediums von N.J.Jacobs und J. M.Jacobs, Enzyme28,206-219 (1982), das aus 1 Vol.-%Tween 20 (Polyoxyethylen-sobit-monolaurat), 5OmM Tris-HCI, pH = 8,5,1 mM EDTA und 5 nM Gluthathion an Stelle von 1mM Dithioerythrit bestand, gestoppt. Anschließend wurden die Suspensionen direkt mit einem Spektrofluorometer vom Typ SPEX Flurolog-2, das mit einer Fluoreszenz-Meßeinrichtung an der Frontseite für die Messung getrübter biologischer Proben ausgerüstet ist, gemessen. Die produzierte Menge Proto IX wurde mit Hilfe einer Eichkurve (der Menge an Proto IX gegen die Emission bei 630 nm bei einer Anregung bei 400nm), die mittels gereinigtem Proto IX in Fluoreszenz-Medium erstellt wurde, quantitativ bestimmt.
Zur Bestimmung des Anteils nichtenzymatischer Oxidschicht in Proto IX in der oben beschriebenen Versuchsanordnung wurde die gleiche Versuchsanordnung dergestalt durchgeführt, daß an Stelle der Suspension aktiver Chloroplasten eine Suspension verwendet wurde, in der die Chloroplasten durch 15minütiges Erwärmen auf 85°C inaktiviert worden waren. Durch die Subtraktion der so erzeugten Menge von Proto IX von der Menge an Proto IX, das in Gegenwart der aktiven Chloroplasten erzeugt worden war, wurde die enzymatisch hergestellte Menge an Proto IX bestimmt. Die Ergebnisse werden in der Abbildung 1 grafisch dargestellt (worin LSD die kleinste signifikante Differenz anzeigt, wie es üblich ist). In der Abbildung 1 wird auch gezeigt, daß der I50-WeIt (die Konzentration, durch die eine Inhibierung von 50% erreichtwird) unterhalb 0,1 μΜ ist, d.h. ungefähr 0,03 μΜ beträgt.
Versuchsanordnungen, die zur Demonstration der Wirkung von 10 μΜ AFM auf die Umsetzung von Proto IX in Magnesium-Proto IX in der Chloroplasten-Suspension (in Gegenwart von ATP) durchgeführt wurden, zeigten, daß AFM keine inhibierende Wirkung auf diese Umsetzung hatte.
Bei der Durchführung dieses Beispiels wurden die enzyminhibierenden Mittel zur Nahrung von Mäusen mit Tumoren zugesetzt. Bei einigen Mäusen, die als Kontrolle verwendet wurden, wurde kein Mittel zur Nahrung zugegeben. Die Mäuse wurden dann getötet und ihre Nieren, Verdauungstrakte, Milz, Leber und Tumoren entnommen und hinsichtlich ihres Gehaltes an Proto IX analysiert. Es wurden dabei die folgenden enzyminhibierenden Mittel verwendet:
F yP
C=CH
F α
Genauer gesagt, waren die Mäuse vom Stamm DBA/2Ha, die am Tage 0 in die rechte Schulter mit SMT-F Tumoren subcutan injiziert worden waren. Die Mäuse in Einzelkäfigen erhielten unbehandeltes Futter vom Typ Purina Rodent Chow 5001 Mash am Tage 1, danach an den Tagen 2 bis 10 die gleiche Futtermischung, die mit 2 000 ppm des inhibierenden Mittels, das untersucht werden sollte, versetzt worden war (oder, im Falle der Kontrollen, die gleiche unbehandelte Futtermischung). Die Behandlung der Futtermischung wurde durch Vermischen derselben mit einer Menge einer Aceton-Lösu ng des zu untersuchenden Mittels vorgenommen. Am Tage 10 wurden die Mäuse dann getötet, außer die Maus, die mit dem Mittel, das als 6j bezeichnet wird, behandelt worden war; diese wurde am Tage 7 getötet. Die Gewebe wurden über Nacht bei 4°C kühl gelagert, dann getrocknet und das Frischgewicht jeder Probe bestimmt. Anschließend wurden die Gewebeproben in 5 ml, oder in 10 ml im Falle der Gedärme und der Leber, Aceton-0,1 Nh^OH-Gemisch (9:1, per Volumen) homogenisiert. Die Homogenisate wurden bei 1 500g zentrifugiert und die Überstände mit einem Spektofluorometer vom Typ SPEX FA 112 untersucht, die Anregung erfolgte bei einer Wellenlänge von 400 nm, die Emission bei einer Wellenlänge von 630 nm, das Optimum für Proto IX. Die Akkumulation von Proto IX wurde als CPS (emittierte Fluoreszenz-Impulse je Sekunde) je Gramm Gewebe bestimmt. Die Ergebnisse sind weiter unten tabelliert (die Ergebnisse sind Durchschnittswerte für zwei Mäuse bei jeder Behandlung, ausgenommen bei der Behandlung mit den Mitteln 6f, 6h, 6i und 6j, bei denen jeweils nur eine Maus behandelt wurde):
Mittelwert der CPS für Proto IX je Gramm Ж 103*
| Mittel | Tumor | Leber | Niere | Milz | Magen | Tumormasse (mg) | 424** |
| 6a | 1203 | 4291 | 10817 | 6572 | 5870·1 | • 143 | |
| 6b | 1520 | 1261 | 2441 | 2 529 | 5 577»' | * 90 | |
| 6c | 14336 | 2739 | 16186 | 13790 | 9 937·1 | " 157 | |
| 6d | 2006 | 1581 | 12 865 | 443 | 5 565*' | ♦ 294 | |
| 6e | 837 | 876 | 915 | 1331 | 2069*' | 165 | |
| 6f | 449 | 1170 | 661 | 5611 | 1157 | 69 | |
| 6g | 166 | 803 | 606 | 1984 | 466 | 250 | |
| 6h | 298 | 914 | 585 | 2 259 | 584 | 192 | |
| 6i | 932 | 1510 | 4014 | 36940 | 3454 | 20 | |
| 6j | 1251 | 538 | 315 | 491 | 572 | 11 | |
| Kontrolle | 239 | 536 | 494 | 1504 | 233 | 200 | |
* Die Angaben in der Tabelle sind gleich den Rohdaten χ 103
** Die Messungen wurden an Proben durchgeführt, die mit 3 Teilen basischen Acetons je ein Teil der Probe verdünnt worden waren.
Diese Zahlen entsprechen den folgenden Konzentrationen Proto IX in den jeweiligen Gewebeproben, dargestellt als цд Proto IX je Gramm Gewebe:
| Mittel | Tumor | Leber | Nieren | Milz | Verdauungsorgane |
| 6a | 11 | 39 | 99 | 60 | 54 |
| 6b | 14 | 12 | 22 | 23 | 51 |
| 6c | 131 | 25 | 148 | 126 | 91 |
| 6d | 18 | 14 | 117 | 4 | 51 |
| 6e | 8 | 8 | 8 | 12 | 19 |
| 6f | 4 | 11 | 6 | 51 | 11 |
| 6g | 2 | 7 | 6 | 18 | 4 |
| 6h | 3 | 8 | 5 | 21 | 5 |
| 6i | 9 | 14 | 37 | 337 | 32 |
| 6j | 11 | 5 | 3 | 4 | 5 |
| Kontrolle | 2 | 5 | 5 | 14 | 2 |
| 4 |
In dem Artikel von Dougherty, der weiter oben zitiert wurde, wird eine Zahl von 3,6цд/д als Konzentration des Porphyrins in der gleichen Tumorart (SMT-F) nach der Injektion von 10 mg/kg des Hämatoporphyrin-Derivates bei der gleichen Mäuserasse (DBA/2 Ha) angegeben. In weiteren Arbeiten der Fachliteratur (Moan et al., P & P 46-5, Seiten 713-721; beachte Abbildung 2 auf Seite 716) wird gezeigt, daß eine Porphyrin-Konzentration von ungefähr 12цд/д in Tumoren (C3H/Tif Mamma-Carcinom) bei DBA/H2-Mäusen nach intraperitonaler Injektion von 25mg/kg Photofrin II, dem weitverbreiteten Sensibilisator für die photodynamische Behandlung und den Nachweis von Krebs, erreicht wird.
Die Gesamtmenge an das Mittel enthaltender Nahrung, die von den Mäusen aufgenommen wurde, war wie folgt: 6a: 22 und 35g,6b: 37und35g,6c: 25und22g,6d: 41 und32g,6e: 40und44g,6f: 27g,6g: 33und40g,6h: 36g,6i: 10g,6j: 20g. Bei der Durchführung der in diesem Beispiel 6 beschriebenen Versuche wurden die folgenden Routine-Stufen ausgeführt, wobei (wenn nichts anderes angegeben wird) das Mittel, das in diesem Beispiel mit 6c bezeichnet worden ist, bei Tieren, die keine Tumoren aufweisen, verwendet wird:
a) Die LD60-DoSiS des Mittels wurde mit einem Wert von über 2600 mg/kg (d.h. mg des Mittels je kg Körpergewicht) bei Ratten (bestimmt innerhalb einer Zeitspanne von 14 Tagen nach einer einzigen oralen Dosis, die aus Maisöl mit 15% des Mittels bestand) und über 700mg/kg bei Mäusen (bestimmt innerhalb einer Zeitspanne von 14 Tagen nach einer einzigen oralen Dosis, die aus Maisöl und 5% des Mittels bestand) bestimmt.
b) Bei der Untersuchung der Trägermittel zur intraperintonalen Injektion ohne das Mittel wurde festgestellt, daß die Mäuse eine Injektion einer 0,5-ml-Dosis eines Gemisches gleicher Teile DMSO (Dimethylsulfoxid) und Wasser tolerierten.
c) Bei Versuchen, bei denen das Mittel in einem Gemisch aus 60% Maisöl und 40% DMSO intraperitonal injiziert wurde, wurde festgestellt, daß die Mäuse eine Dosis von 100 mg/kg tolerierten.
d) Die folgenden Versuche wurden mit Mäusen durchgeführt:
i) Tägliche Verabreichung von 50mg/kg (unter Verwendung einer 1%igen Lösung des Mittels in Aceton) innerhalb eines Zeitraumes von acht Tagen;
ii) tägliche Injektion i. p. von 50mg/kg (unter Verwendung einer 1 %igen Dispersion des Mittels in Mineralöl, hergestellt durch Auflösen des Mittels in einem Tropfen DMSO und Mischung der so erhaltenen Lösung mit dem Mineralöl) innerhalb eines Zeitraumes von acht Tagen;
iii) tägliche, äußerliche Anwendung von 50 mg/kg (unter Verwendung einer 1 %igen Lösung des Mittels in DMSO) auf die Haut innerhalb eines Zeitraumes von acht Tagen;
iv) Fütterung eines Standard-Futters, dem 2000ppm des Mittels, bezogen auf die Masse des Futters, beigemischt worden waren, innerhalb eines Zeitraumes von acht Tagen;
v) tägliche Injektion i. v. von 50 mg/kg (unter Verwendung einer 2%igen Lösung des Mittels in DMSO) innerhalb eines Zeitraumes von vier Tagen.
Die in diesen Versuchen verwendeten Mäuse wurden nach deren Abschluß getötet und ihre Gewebe auf eine Akkumulation von Proto IX hin untersucht.
In einem anderen Versuch wurde eine männliche Ratte von der Rasse Fisher 344 verwendet, die 27 Tage lang mit einem Futter gefüttert wurde, das 5000 ppm des Mittels 6c enthielt. Anschließend wurde die Ratte getötet. In den Geweben dieser Ratte wurden erhöhte Konzentrationen an Proto IX im Vergleich zu einem Kontrollversuch festgestellt, wobei besonders deutliche Konzentrationserhöhungen in der Niere, im Verdauungstrakt, im Magen und Gehirn festgestellt wurden, während im Muskelgewebe nur eine kleine Erhöhung der Konzentration bestimmt wurde.
In den oben beschriebenen Versuchen wurden die Ratten und Mäuse einem Standard-Zyklus von 12 Stunden Dunkelheit und 12 Stunden Licht unterworfen.
In einer Reihe von Versuchen, die analog denen ausgeführt wurden, die in den Beispielen 1 und 2 beschrieben worden sind, wurden Kulturen von HeLa-Zellen in Gegenwart von 100 μΜ der verschiedenen Mittel zur Behandlung, die unten aufgeführt sind, inkubiert. Die Prozentangaben, die zu jedem Mittel der Behandlung angegeben werden, zeigen die Erhöhung der Menge an Proto IX an, die in Gegenwart des betreffenden Mittels zur Behandlung in Bezug zu der Menge, die mit einer Kontrolle im gleichen Experiment erzielt worden ist, erzeugt wurde.
Mittel, die in den Beispielen 6 verwendet worden sind: 6a: 337%, 6b: 366%, 6c: 297%, 6d: 1200%, 6e: 1210%, 6f: 280%, 6g: 326%, 6h: 431%,6i: 544%, 6j: 469%. Andere Mittel:
7b.
7c.
136%
T Ψ2 „=1
20%
F Q
C=CH
229%
115%
7f.
O F O ^
C=CH
122%
CH3
C=CH
303% Anhang A
In dem Versuch zur Bestimmung der Ausflußmenge werden Keimblätter verwendet, die von gebleichten Gurkenkeimlingen erhalten wurden. In der ersten Stufe wird eine Masse der Keimblätter im Dunkeln mit einer wäßrigen Pufferlösung behandelt, die radioaktiv markierten Zucker enthält. Danach wird die Menge an Zucker, die durch die Keimblätter aufgenommen wird, gemessen (durch Zählung, wie weiter unten beschrieben). Die Gesamtmenge der Keimblätter wird dann in zwei Teile geteilt; ein Teil der Keimblätter wird im Dunkeln mit einer wäßrigen Pufferlösung behandelt, die die zu untersuchende Verbindung enthält, während der andere Teil der Keimblätter auf die gleiche Art und Weise im Dunkeln mit einer ansonsten identischen Lösung behandelt wird, die jedoch nicht die zu untersuchende Verbindung enthält (Kontrolle). Die Keimblätter werden dann im Kontakt mit den wäßrigen Lösungen 16 Stunden belichtet und dann von den wäßrigen Lösungen abgetrennt. Diese Lösungen werden dann gemessen (durch Zählen), um den Gehalt an radioaktivem Material zu bestimmen. Die Ergebnisse werden als Prozent Ausfluß angegeben, der wie folgt berechnet wird (dabei ist S der Zählwert des radioaktiven Materials je Keimblatt, das von den Keimblättern bei ihrer Erstbehandlung aufgenommen worden ist, Sj ist der Zählwert an radioaktivem Material je Keimblatt in der wäßrigen Lösung, die die zu untersuchende Verbindung enthält, nach der Belichtung und Sc ist der Zählwert von radioaktivem Material je Keimblatt in der wäßrigen Lösung der Kontrolle nach der Belichtung):
Prozent Ausfluß =
minus Sc
Insbesondere wurden die folgenden Stoffe und Bedingungen im Versuch zur Bestimmung der Ausflußmenge angewendet.
handelsüblichen (9-45-15)-Kunstdünger beregnet wurde, zum Keimen gebracht und aufgezogen. Die Keimlinge wurden bei 25 0Cund 80 bis 90% relativer Luftfeuchtigkeit in einer abgedunkelten Inkubationskammer aufgezogen. Die Keimblätter wurden fünf
von 600 nM desselben in der Losung führte, gegeben. Der Kolben wurde 24 Stunden mit 125 U/min auf einem Rotationsschuttierim Dunkeln geschüttelt. Anschließend wurden die Keimblätter auf einem Nylonsieb abgetrennt und dreimal mit je 20 ml1 mM CaCI2-Losung gespült. Die Aufnahme an radioaktiv markiertem Zucker wurde gemessen, indem drei Proben von je fünf
analogen Bestimmungen waren, die mittels der Verbrennung der Keimblatt-Proben in einem Autoxydator durchgeführt wurden.
35mm Durchmesser schwimmen gelassen Dann wurde die zu untersuchende Verbindung (als Losung in Aceton) in einersolchen Menge zugegeben, daß eine vorher festgelegte Konzentration der zu untersuchenden Verbindung in der Pufferlosungeingestellt wurde (weiter unten diskutiert). Die Acetonkonzentration in der Pufferlosung betragt dann 0,1 Vol.-% sowohl in der
verwirbelt, indem die Schalchen 16 Stunden auf einem Schüttler mit 90 U/min geschüttelt wurden.
vier GE F20T12-CW-Fluoreszenz-Lampen mit einer gemessenen Intensität von 150pE/m2sec in dem fur die Photosyntheseaktiven Bereich des Spektrums (PAR) (gemessen auf der Oberflache der Keimblatter) verwendet wurden, während die Schalchengeschüttelt wurden.
abgetrennt und dann in einem Flüssigkerts-Szintillations-Spektrometer gemessen.
durchgeführt (d.h. Licht, das durch ein Grunf liter aus Kunststoff, das Licht der Wellenlange von 450 bis 600 nm durchlaßt, gefiltert wurde)
Anhang B Kulturmedium: Medium M
| Na-citrat-6H2O | 1,7 χ 10"3M | 10% | 5 |
| Spurenmetalle | wie unten | wie unten | 10 |
| FeCI3 · 6H2O | 0,37 x 10"3M | 1% | 1 |
| CaCI2-2H2O | 0,36 x 10"3M | 5,3% | 1 |
| MgSO4 7H2O | 1,2 x 10"3M | 10% | 3 |
| NH4NO3 | 3,7 x 10"3M | 10% | 3 |
| KH2PO4 | 2,2 x 10"3M | 10% | 3 |
| K2HPO4 | 1,7 x10~3M | 10% | 3 |
H3BO3 100 mg/1
ZnSO4 7H2O 100 mg/1
MnSO4 4H2O 40 mg/1
CoCI2-6H2O 20 mg/1
NaMoO4 2H2O 20 mg/1
CuSO4 4 mg/1
11 Medium M hinzugefugt werden
15 Minuten autoklaviert
Die Vorratskulturen der y-1 -Zellen wurden axial in flussiger Kultur auf Medium A oder M, vorzugsweise auf Medium M, bei einem Dunkel-Hell-Zyklus von 10 14 Stunden bei 25°C in Erlenmeyer-Kolben, die mit Polyurethan-Stopfen verschlossen wurden, gehalten Die Vorratskulturen wurden ohne zusatzliche Belüftung auf Rotationsschuttlern bei 125 U/mm inkubiert Die Lichtintensität auf dem Kulturniveau betrug 120 pE/m2sec (PAR) Unter diesen Bedingungen befinden sich die Kulturen in einem halbsynchronen Wachstumsmodus, bis sie eine stationäre Phase von 2 bis 4 χ 106 Zellen/ml erreichen
Zelten aus der stationären Phase der Vorratskulturen, die in Gegenwart von Licht gezogen wurden (7,5ml) wurden in 750ml des Mediums A in Erlenmeyer-Kolben gegeben. Die Zellen wurden drei bis vier Tage bei 25°C im Dunkeln inkubiert, wobei mittels eines in die Flüssigkeit eintauchenden Rohres belüftet wurde. Während dieses Zeitraumes gehen diese Kulturen der y-1-Zellen sieben bis acht Zellteilungen ein, verlieren das gesamte sichtbare Chlorophyll. Die Konzentration beträgt darm 2—3 x 10s Zellen/ml.
Zellen werden aus 750 ml einer frisch hergestellten, im Dunkeln gezogenen Kultur durch Zentrifugieren bei niedriger Geschwindigkeit, d.h. ungefähr 2000U/min innerhalb ungefähr 5 Minuten bei 20°C, geerntet. Die Zellen werden vorsichtig in 50 ml des Mediums A resuspendiert. Eine Probe dieser Suspension (ungefähr 0,25ml) sollte hinsichtlich ihrer Bewegungsfähigkeit untersucht werden und nach der Fixierung mit einer 1 %igen wäßrigen Glutaraldehydlösung eine Zellzählung durchgeführt werden, um die Anzahl der Zellen je ml zu bestimmen. Eine übliche Zahl von Zellen beträgt ungefähr 5 χ 107 Zellen/ml. Aliquots von 1 ml (107 Zellen/ml) werden in Untersuchungsgefäße gegeben (z. B. Falcon® Gewebekufturplatten mit 24 Bohrungen). Zu diesem Zeitpunkt sind die Zellen sehr beweglich und weisen «ine gelb· färbung auf. Die zu untersuchende Verbindung wurde in einem Lösungsmittel (Aceton, Ethanol, Dimethylsulfoxid oder Wasser, vorzugsweise Aceton) gelöst, so daß eine Konzentration eingestellt wurde, die das 10OOfache der Endkonzentration beträgt. 1 ml dieser zu untersuchenden Lösung wird mittels einer Mikroliterspritze von 5 oder 10μΙ zu jeder von zwei Bohrungen zugegeben. Es werden je Gewebekulturplatte vier Kontroll-Bohrungen auf die oben beschriebene Art und Weise ohne di· zu untersuchende Verbindung hergestellt. Die Gewebekulturplatten wurden mh einer durchsichtigen KunstÄoff-Abdeckung bedeckt und 13 bis 16 Stunden bei 25*C in ein Gewachshaus bei einer Lichtintensität von 70 bis 90 uE/m2sec gestellt. Wenn der Inhalt der jeweiligen Bohrungen gelb erscheint, werden diese extrahiert, wie es im Abschnitt ,Auswertung der Ergebnisse" weiter unten beschrieben wird. Wenn der Inhalt der Testbohrungen durchsichtig oder hellgrün erscheint, werden sie auf einen Rotationscehuttler bei ungefähr 125U/min gestellt und zwei Stunden mit einer Lichtintensität von ungefähr 600pE/m2sec vor der Extraktion bestrahlt.
250 μΙ einer 10%igen wäßrigen Lösung von Natriumdodecylsulfat und 1 ml Methanol wurden zu jeder Testbohrung zugegeben und der Inhalt gut durchmischt. Diese Gemische wurden dann drei bis vier Stunden im Dunkeln stehengelassen. Die Gewebekulturplatten wurden fünf Minuten bei Zimmertemperatur mit niedriger Geschwindigkeit (ungefähr 2000 U/min) zentrifugiert. Die Überstände wurden abgezogen und in einem Spektrophotometer vom Typ Beckmann Modell 35 zwischen 350 und 500 nm hinsichtlich des Auftretens von Protophorphyrin IX, bei 668nm, was den Absorptionspeak von Chlorophyll in diesem Lösungsmittelsystem darstellt, und bei 720nm zur Feststellung des Untergrundwertes durch Trübung gemessen.
Für jede Bohrung wird ein Grünwert erhalten, indem der Wert bei 720 nm von dem Wert bei 668 nm subtrahiert wird. Von diesen Werten wird der Mittelwert bei jeder Konzentration der zu untersuchenden Verbindung und für die Kontrollen gebildet. Die Prozent Inhibierung werden dann wie folgt errechnet:
_ Durchschnittlicher Grünwert für eine gegebene Konzentration \ Durchschnittlicher Grünwert für die Kontrolle /
In diesem Beispiel wurde der Enzymhemmstoff 6c von Beispiel 6 an Ratten verfüttert, Tumore wurden in Ratten implantiert und die tumortragende Zone wurde mit Licht bestrahlt, was eine Regression der Tumoren bewirkte.
3 Sprague-Dawley-Ratten mit einem Durchschnittsgewicht von 120g wurden 6 Tage auf eine Diät mit einer Nahrung, die 2 000 ppm des Mittels enthielt, gesetzt. Am Tag 3 wurden Chondrosarkoma in den rechten hinteren Schenkel jeder Ratte implantiert, indem 0,3 ml einer Suspension der Tumorzellen (1 Million Tumorzellen) injiziert wurden. Am Tag 6 wurde der rechte hintere Schenkel jeder Ratte rasiert und enthaart, die Größe jedes Tumors gemessen und die Tumorfläche und die umgebende Haut wurden dann mit nicht-thermischen Dosen von Licht der Wellenlänge 630 nm mit insgesamt 270 J/cm2 bestrahlt. Am nächsten Tag waren zwei Ratten offensichtlich frei von Tumoren (d. h. keine tastbare Tumormasse) und die dritte Ratte zeigte eine fast vollständige Regression des Tumors. Die umgebende Haut und das Muskelgewebe der RatterTwaren leicht gebleicht und zeigten eine leichte Schwellung, die deutlich geringer war als die mit der Photofrin Il vermittelten photodynamischen Therapie einhergehende.
Claims (15)
- Patentansprüche:1. Arzneimittel, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen spezifischen Inhibitor der enzymatischen Umwandlung des Protoporphyrinogens in Protoporphyrin IX durch Protoporphyrinogen-Oxidase und gegebenenfalls einen pharmazeutisch geeigneten Träger enthalten.
- 2. Arzneimittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Inhibitor einen I5o-Wert für Protoporphyrinogen-Oxidase von weniger als 1 μΜ aufweist.
- 3. Arzneimittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Inhibitor kein Tetrapyrrol ist.
- 4. Arzneimittel nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Inhibitor ein Redoxpotential aufweist, das negativer als —500mV ist.
- 5. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zum Abtöten von Tumorzellen in Säugern.
- 6. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur photodynamischen Behandlung von Tumoren in Säugern.
- 7. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Erhöhung des Gehaltes an Protoporphyrin IX in Tumorzellen von Saugern.
- 8. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zum Nachweis und zur Lokalisierung von Tumorzellen bei Säugern.
- 9. Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels, dadurch gekennzeichnet, daß man einen spezifischen Inhibitor der enzymatischen Umwandlung des Protoporphyrinogens in Protoporphyrin IX durch Protoporphyrinogen-Oxidase mit einem pharmazeutisch geeigneten Träger vermischt.
- 10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Inhibitor einen I5o-Wertfür Protoporphyrinogen-Oxidase von weniger als 1 μΜ aufweist.
- 11. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Inhibitor kein Tetrapyrrol ist.
- 12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Inhibitor ein Redoxpotential aufweist, das negativer als —50OmV ist.
- 13. Verfahren zur Erzeugung von Protoporphyrin IX, dadurch gekennzeichnet, daß eine eukaryontische Mikroalge im Dunkeln oder unter Lichtverhältnissen, unter denen Protoporphyrin IX nicht angeregt wird, in Gegenwart einer wirksamen Menge eines Aryltriazolinons, eines Aryltetrazolinons oder eines Aryltriazindions, die einen Inhibitor für das Enzym Protoporphyrinogen-Oxidase darstellen, gezüchtet wird.
- 14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikroalge vom Stamm Chlamydomonas ist.
- 15. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß der Inhibitor 1 -^СЫог-г-тІиог-б-propargyloxyphenyl)-3-methyl-4-difluormethyl-A2-1,2,4-triazolin-5-on ist.
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